CN111763670B - 一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂及其用途。一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂，该抑制剂的靶向序列为：5’‑CAGATATTAGGACACTGGGGT‑3’(SEQ ID No.1)。所述hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂在制备用于治疗人脑胶质母细胞瘤药物中的应用。本发明利用RNA干扰技术研制一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂，该抑制剂可与hsa_circ_0008821基因特异性结合，使hsa_circ_0008821基因沉默，从而抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，达到治疗胶质母细胞瘤的目的。hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂在胶质母细胞瘤基因治疗领域发挥重要作用，为临床治疗胶质母细胞瘤提供新的靶向治疗药物。

Description

一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂及其用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂及其用途。

背景技术

胶质母细胞瘤是颅内最常见的、恶性程度最高的原发性肿瘤，具有高发病率和高病死率的特点。目前，胶质母细胞瘤最主要的治疗方案是手术结合放疗、化疗的综合治疗，但疗效不佳，患者中位生存期不超过15个月。近年来，非编码RNA在胶质母细胞瘤的发生发展中发挥的重要调控作用引起越来越多人的重视。因此，深入研究非编码RNA调控胶质母细胞瘤细胞生物学行为的作用与机制，可能为胶质母细胞瘤的治疗提供新靶标。

circRNAs是一类由mRNA前体反向剪接产生的共价闭合环状非编码RNA，无5’帽端和3’多聚腺苷酸尾结构，广泛存在于真核细胞中，能够作为microRNA的分子海绵发挥生物学功能，还能够在RNA可变剪接、转录和转录后水平发挥重要调控作用。研究表明，circRNAs与胶质母细胞瘤、胃癌、结肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤密切相关，在肿瘤的发生发展、治疗以及预后中发挥了重要的作用。

hsa_circ_0008821基因定位于chr18:9775274-9815219，由宿主基因RAB31的1-5号外显子组成，基因序列长为341bp。目前尚未检索到hsa_circ_0008821在胶质母细胞瘤中相关的研究报道。RNA干扰技术的原理是利用Dicer酶切割RNA分子，形成RNA沉默复合体，靶向结合目标RNA分子进而降解RNA分子的过程，可在医学应用中起治疗作用。其中shRNA是一种茎环间隔的两个短反向互补序列组成的人工RNA，作为一种常用的RNA干扰工具，shRNA和靶基因mRNA结合发挥作用。由于siRNA存在脱靶效应，或影响对正常基因表达，因而目前shRNA技术更为安全和可靠。

目前，hsa_circ_0008821在胶质母细胞瘤发生发展中的作用以及相关机制还未见报道，关于hsa_circ_0008821在胶质母细胞瘤基因治疗方面的应用目前还不明确。因此，研制一种hsa_circ_0008821相关的药物成为目前亟待解决的问题。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂及其用途。经本发明实验证明hsa_circ_0008821基因在胶质母细胞瘤的组织中高表达，通过抑制hsa_circ_0008821基因的表达从而抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力。本发明利用RNA干扰技术研制一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂，该抑制剂可与hsa_circ_0008821基因特异性结合，使hsa_circ_0008821基因沉默，从而抑制hsa_circ_0008821对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，达到治疗胶质母细胞瘤的目的。hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂在胶质母细胞瘤基因治疗领域发挥重要作用，为临床治疗胶质母细胞瘤提供新的靶向治疗药物。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂，该抑制剂的靶向序列为：5’-CAGATATTAGGACACTGGGGT-3’(SEQ ID No.1)。

进一步地，所述的hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂能够抑制hsa_circ_0008821基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：

正义链：

5’-CACCCAGATATTAGGACACTGGGGTTTCAAGAGAGCATCACAAACTCCCTGCGGCTTTT TTG-3’(SEQ ID No.2)；

反义链：

5’-GATCCAAAAAAGCCGCAGGGAGTTTGTGATGCTCTCTTGAAACCCCAGTGTCCTAATAT CTG-3’(SEQ ID No.3)。

进一步地，一种转录上述的shRNA的转录产物，序列为：

5’-CAGATATTAGGACACTGGGGTTTCAAGAGAACCCCAGTGTCCTAATATCTGTT-3’(SEQ IDNo.4)。

所述的hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂在制备用于治疗人脑胶质母细胞瘤药物中的应用。

进一步地，所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型。

优选的，所述药物的剂型为注射剂。

进一步地，所述药物的剂量为任何药物治疗学上可接受的剂量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

1)本发明提供的hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂特异性强，沉默效率高，脱靶率低，抑制hsa_circ_0008821基因的表达。

2)本发明涉及通过hsa_circ_0008821基因的抑制剂抑制人hsa_circ_0008821基因的表达，从而抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，为胶质母细胞瘤的基因治疗提供全新的治疗方法。

3)本发明提供的hsa_circ_0008821基因的抑制剂的靶向治疗能显著降低传统治疗药物的耐药问题。

4)本发明提供的hsa_circ_0008821基因的抑制剂已在体外细胞学水平上进行应用，实验证明hsa_circ_0008821基因的抑制剂的靶向治疗效果确切，并且无不良反应发生。

附图说明

图1是应用Realtime PCR检测hsa_circ_0008821基因在胶质母细胞瘤组织和细胞中的表达水平显著增高的柱状图。

图2是应用Realtime PCR检测应用hsa_circ_0008821基因抑制剂后，胶质母细胞瘤细胞中的hsa_circ_0008821表达水平显著下调的柱状图。

图3是CCK-8细胞活力法检测应用hsa_circ_0008821基因抑制剂后，抑制胶质母细胞瘤细胞增殖能力的统计图。

图4是Transwell细胞迁移实验检测应用hsa_circ_0008821基因抑制剂后，抑制胶质母细胞瘤细胞迁移能力的照片和统计图。

图5是Transwell细胞侵袭实验检测应用hsa_circ_0008821基因抑制剂后，抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的照片和统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例一shRNA的设计和干扰载体的制备及hsa_circ_0008821基因抑制剂应用。

一、细胞培养。

人胶质母细胞瘤细胞系U87、U251、U373和人星形胶质细胞(HA)购自上海研究院生命科学细胞资源中心。在100mm细胞培养皿中用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液(星形胶质细胞培养基AM)培养U87、U251、U373、HEK293和HA细胞，每2天更换一次培养液，约2-3天细胞可长至单层。

二、实时定量PCR检测hsa_circ_0008821的表达。

1.Trizol法提取细胞中的总RNA。

冷PBS洗涤收集的细胞，加入1ml Trizol试剂吹打数次，镜下观察细胞成油滴状(充分裂解)，后移入1.5ml EP管中，静置5min，使其充分裂解；样品中加入0.2ml氯仿，手动剧烈震荡室温下静置3分钟；于4℃12000g离心15分钟，取上层水相到新的EP管中，再加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10分钟；4℃12000g离心15分钟后弃上清，加入1ml75％乙醇；4℃7500g离心5分钟，干燥15分钟后加入40μl DEPC水，样品可冻存于-80℃冰箱。

2.一步染料法qRT-PCR检测hsa_circ_0008821的表达。

测定CT值，以B-ACTIN为内参照，以2^(-△△Ct)计算hsa_circ_0008821的相对表达量。检测hsa_circ_0008821基因在胶质母细胞瘤组织和细胞中的表达水平显著增高的统计图，如图1所示。

三、hsa_circ_0008821基因抑制剂的制备和应用。

设计hsa_circ_0008821基因的干扰序列，选定靶向人hsa_circ_0008821基因并特异性抑制hsa_circ_0008821基因表达的抑制剂靶向序列如下：

5’-CAGATATTAGGACACTGGGGT-3’。

在NCBI的同原序列比对分析nucleotide blast中输入CAGATATTAGGACACTGGGGT序列进行比对分析，结果表明该序列和人的其它mRNA基因没有高度同源性，可作特异性干扰hsa_circ_0008821基因的特异性序列。

一步设计该靶向抑制剂的shRNA序列，如下，包括正义链和反义链。

此shRNA正义链序列为：

5’-CACCCAGATATTAGGACACTGGGGTTTCAAGAGAGCATCACAAACTCCCTGCGGCTTTTTTG-3’。

此shRNA反义链序列为：

5’-GATCCAAAAAAGCCGCAGGGAGTTTGTGATGCTCTCTTGAAACCCCAGTGTCCTAATATCTG-3’。

所述的shRNA的转录产物，序列为：

5’-CAGATATTAGGACACTGGGGTTTCAAGAGAACCCCAGTGTCCTAATATCTGTT-3’。

序列信息设计并合成相应质粒，作为hsa_circ_0008821基因抑制剂。

hsa_circ_0008821基因抑制剂转染：sh-NC、sh-hsa_circ_0008821的质粒U6/GFP/Neo，使hsa_circ_0008821表达沉默，不含有hsa_circ_0008821序列或shRNA的空质粒为实验阴性对照；应用24孔培养板培养胶质母细胞瘤细胞，当细胞生长达到80％左右时进行转染；配置转染需要的质粒、

Ⅰ和LTX and Plus reage(Life Technologies)转染试剂。A管：一个孔按照1μg质粒DNA溶解于50μl />

Ⅰ+1μl p3000，放置5min，B管：孔按照1μl LTX and Plus溶解于50μl />

Ⅰ中；将A、B两管混匀后静置5min；吸出培养液，每孔加入转染混合液100μl，再加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液400μL；48h后用含有浓度为0.4mg/mL抗生素G418的培养基进行筛选，不断增加G418的浓度，大约4周后得到能够稳定沉默hsa_circ_0008821的胶质母细胞瘤细胞系。在后续实验中分为3组，分别是：不加任何处理的空白对照组(Control)；转染hsa_circ_0008821沉默空质粒的阴性对照组(sh-NC)；转染hsa_circ_0008821沉默质粒的实验组(sh-hsa_circ_0008821)。

hsa_circ_0008821基因抑制剂后，胶质母细胞瘤细胞中的hsa_circ_0008821表达水平显著下调的统计图，如图2所示。

实施例2应用hsa_circ_0008821基因抑制剂显著抑制胶质母细胞瘤的恶性生物学行为。

一、CCK-8细胞活力法检测hsa_circ_0008821基因抑制剂对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响。

U87细胞用胰蛋白酶消化，分别用正常培养液制成单细胞悬液。计数细胞，以2000个/孔的浓度接种于96孔细胞培养板。每组设5个复孔，每孔共计200μl。24h后加入10μlCCK-8。2小时后用酶标仪测定波长450nm时各孔光吸收值。CCK-8细胞活力法检测应用hsa_circ_0008821基因抑制剂后，抑制U87细胞增殖的统计图，如图3所示。

二、Transwell细胞迁移实验检测hsa_circ_0008821基因抑制剂对胶质母细胞瘤细胞迁移能力的影响。

检测细胞迁移能力：在24孔板中各孔添加600μl含有血清的培养液，之后放上Transwell小室；将不同组的U87细胞用胰酶消化后轻轻吹散后离心，加入不含血清的培养液将细胞进行重悬，各个小室里添加100μl细胞悬液，均匀地铺在上室，大概有10⁵个细胞。放置于37℃细胞培养箱中培养24h；24h后拿出小室，使用棉签轻轻把上室里面擦干净，使用PBS清洗小室并晾干。之后配置固定液，根据甲醇∶冰乙酸＝3∶1的配比进行配置，即750μl的甲醇+250μl的冰乙酸吹打混匀；把小室浸没到固定液中固定细胞30min；使用PBS清洗小室并晾干，把吉姆约200μl萨染料铺于倒置小室底部，染色至少30min；使用PBS清洗小室两次，放于倒置显微镜下，在400×镜下观察，随机选择5个视野进行细胞个数统计，体现细胞迁移能力。

Transwell细胞迁移实验检测应用hsa_circ_0008821基因抑制剂后，U87细胞迁移数目显著减少，如图4所示。

三、Transwell细胞侵袭实验检测hsa_circ_0008821基因抑制剂对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的影响。

检测细胞侵袭能力：在24孔板中各孔添加600μl含有血清的培养液，之后放上Transwell小室，在小室中加入50μl的Matrigel胶原液，37℃细胞培养箱中培养30min；将不同组的U87细胞用胰酶消化后轻轻吹散后离心，加入不含血清的培养液将细胞进行重悬，各个小室里添加100μl细胞悬液，均匀地铺在上室，大概有10⁵个细胞。放置于37℃细胞培养箱中培养24h；24h后拿出小室，使用PBS清洗小室并晾干。之后配置固定液，根据甲醇∶冰乙酸＝3∶1的配比进行配置，即750μl的甲醇+250μl的冰乙酸吹打混匀；把小室浸没到固定液中固定细胞30min；使用PBS清洗小室并晾干，把约200μl吉姆萨染料铺于倒置小室底部，染色至少30min；使用PBS清洗小室两次，放于倒置显微镜下，在400×镜下观察，随机选择5个视野进行细胞个数统计，体现细胞侵袭能力。

Transwell细胞侵袭实验检测应用hsa_circ_0008821基因抑制剂后，抑制U87细胞迁移数目显著减少，如图5所示。

统计学方法：以上所有的实验都单独重复三次，数据都用平均值±标准差来表示。多组数据间利用统计软件SPSS 19.0，使用单因素方差分析(ANOVA)法进行分析是否有组间差异，当P值<0.05则认为有统计学意义。IC50应用Graphpad软件进行计算。

Claims (4)

1.一种hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂在制备用于治疗人脑胶质母细胞瘤药物中的应用，其特征在于，所述的hsa_circ_0008821基因的靶向抑制剂为能够抑制hsa_circ_0008821基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：

正义链：

5’-CACCCAGATATTAGGACACTGGGGTTTCAAGAGAGCATCACAAACTCCCTGCGGCTTTTTTG-3’；

反义链：

5’-GATCCAAAAAAGCCGCAGGGAGTTTGTGATGCTCTCTTGAAACCCCAGTGTCCTAATATCTG-3’。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂量为任何药物治疗学上可接受的剂量。

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