CN111607595B - 一种dbf4p1基因的靶向抑制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种DBF4P1基因的靶向抑制剂及其用途。一种DBF4P1基因的靶向抑制剂，具有抑制DBF4P1基因表达的作用，该抑制剂的靶向序列为：5’‑GATATAACGGTGATAGAGCAG‑3’(SEQ ID No.1)。所述的DBF4P1基因靶向抑制剂在制备用于靶向治疗人脑胶质母细胞瘤药物中的应用。本发明通过RNA干扰技术研制一种DBF4P1基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂能通过特异性结合DBF4P1基因，发挥抑制DBF4P1基因表达的作用，进而抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，从而发挥抑制胶质母细胞瘤生长的靶向治疗作用。DBF4P1基因靶向抑制剂的应用在胶质母细胞瘤基因治疗领域能发挥重要作用，为临床上胶质母细胞瘤的基因治疗提供新的分子靶向治疗药物。

Description

一种DBF4P1基因的靶向抑制剂及其用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种DBF4P1基因的靶向抑制剂及其用途。

背景技术

胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性程度最高的原发性肿瘤，增殖速度快，侵袭性强。现阶段的手术治疗辅以放化疗，以及抗血管生成治疗等综合治疗方法已成为治疗胶质母细胞瘤的重要手段，但治疗效果仍不理想，患者复发率高，病死率高，中位生存期仅约15个月。近期研究发现，与非编码RNA功能相似的假基因在多种恶性肿瘤中异常表达并发挥重要调控作用。其中假基因在胶质母细胞瘤中的作用机制研究引起研究者的关注。因此，深入研究假基因在胶质母细胞瘤肿的功能和作用具有重要理论意义与应用价值，同时也为胶质母细胞瘤的发生发展提供新的分子靶标。

假基因是与编码基因序列相似，但不存在编码潜能的DNA片段，来源于亲本基因碱基突变和错误复制，由于无法产生功能性蛋白质而不能发挥生物学作用。近期的研究表明，假基因与非编码RNA的功能类似，在转录和转录后等水平上发挥重要调控作用。近期研究发现，假基因在多种恶性肿瘤中异常表达，并具有重要的生物学功能，如竞争性结合miRNA进而调控靶基因的表达；假基因还能生成内源性小干扰RNA抑制靶基因表达；假基因能通过开放阅读框编码功能性多肽发挥调作用。

DBF4P1基因定位于人10号染色体长臂21.3，其亲本基因DBF4定位于人7号染色体长臂21.12。编码的mRNA序列最长2025bp，编码674个氨基酸。目前尚未见胶质母细胞瘤与假基因DBF4P1以及其亲本基因DBF4相关的研究报道。RNA干扰又称转录后基因沉默，是通过将与mRNA高度同源的特异性双链RNA导入后，结合靶基因mRNA诱导其降解，进而抑制目的基因表达的过程，已在基因功能探索、基因治疗等多领域发挥重要作用。其中shRNA包括两个短反向重复序列，可在在细胞内可以持续产生shRNAs，相比于siRNA，当需要维持较长时间的基因沉默时，shRNA更具有优势，能有效减少脱靶效应，保证基因表达沉默的有效性。

目前尚未见假基因DBF4P1在恶性肿瘤中表达水平以及作用机制的相关研究报道。同时，假基因DBF4P1在胶质母细胞瘤中的调控作用尚不明确。因此，研制一种DBF4P1基因相关的基因治疗药物成为亟待解决的关键问题。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种DBF4P1基因的靶向抑制剂及其用途。本发明实验证明假基因DBF4P1在胶质母细胞瘤组织和胶质瘤细胞系(A172、U87、U251和U373)中高表达，通过使用DBF4P1抑制剂(shRNA)抑制DBF4P1基因的表达表达水平，并进一步发现能抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为。本发明利用RNA干扰技术shRNA研制了一种DBF4P1基因的靶向抑制剂，所述靶向抑制剂能通过特异性结合DBF4P1，发挥抑制DBF4P1基因表达的作用，进而对胶质母细胞瘤起到基因治疗的目的。DBF4P1基因的靶向抑制剂在胶质母细胞瘤基因治疗与分子靶向治疗领域发挥重要作用，为胶质母细胞瘤的临床治疗提供新的靶向治疗药物。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种DBF4P1基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的序列为：5’-GATATAACGGTGATAGAGCAG-3’(SEQ ID No.1)。

所述的DBF4P1基因的靶向抑制剂具有抑制DBF4P1基因的表达的作用，所述DBF4P1基因靶向抑制剂的shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：

正义链：

5’-GAAGATGATATAACGGTGATAGAGCAGAATTTCCTGTATAAAGAGACCCAGGAAACTGAAAAAAACTT-3’(SEQ ID No.2)。

反义链：

5’-AAGTTTTTTTCAGTTTCCTGGGTCTCTTTATACAGGAAATTCTGCTCTATCACCGTTATATCATCTTC-3’(SEQ ID No.3)。

进而按所述shRNA模板序列获得的转录产物序列：

5’-GATATAACGGTGATAGAGCAGAATTTCCTGTATAAAGAGACCCAGGAAACTG-3’(SEQ IDNo.4)。

所述的DBF4P1基因的靶向抑制剂在制备用于靶向治疗人脑胶质母细胞瘤药物中的应用。

进一步地，所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型。

优选的，所述药物的剂型为注射剂。

进一步地，所述药物的剂量为任何药物治疗学上可接受的剂量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

1)本发明提供的DBF4P1基因的靶向抑制剂特异性强，沉默效率高，持续有效性长，脱靶效率低，能有效发挥抑制DBF4P1基因表达的作用。

2)本发提供的DBF4P1基因的靶向抑制剂能有效抑制DBF4P1基因的表达，进而抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为。对胶质母细胞瘤起到基因治疗的目的，在基因治疗与分子靶向治疗领域发挥重要作用，为胶质母细胞瘤的临床治疗提供新的靶向治疗药物。

3)本发明提供的DBF4P1基因的靶向抑制剂的在基因治疗胶质母细胞瘤中的应用能有效解决患者对传统治疗药物的耐药性问题，治疗效果显著。

4)本发明提供的DBF4P1基因的靶向抑制剂已在体外细胞学水平上进行应用研究，通过系列实验明确了DBF4P1基因的靶向抑制剂对胶质母细胞瘤的基因治疗效果，并且研究发现无不良反应的发生。

附图说明

图1为应用Quantitative real-time PCR检测发现DBF4P1基因在胶质母细胞瘤组织中的表达水平显著增高以及检测发现DBF4P1基因在胶质母细胞瘤细胞(A172、U87、U251、U373)中的表达水平显著增高的统计图。

图2为应用Quantitative real-time PCR检测发现，应用DBF4P1基因靶向抑制剂后胶质母细胞瘤细胞中的DBF4P1的表达水平显著降低的统计图。

图3为应用CCK-8细胞活力检测法检测发现，应用DBF4P1基因靶向抑制剂后显著抑制胶质母细胞瘤细胞增殖能力的统计图。

图4为应用Transwell细胞迁移实验检测发现，应用DBF4P1基因靶向抑制剂后显著抑制胶质母细胞瘤细胞迁移能力的照片和统计图。

图5为应用Transwell细胞侵袭实验检测发现，应用DBF4P1基因靶向抑制剂后显著抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的照片和统计图。

具体实施方法

下面结合具体实施例内容以及附图详细介绍本发明的技术研究方案及效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验方案条件，例如教科书、实验指南以及产品说明书中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域相关技术研究人员掌握或易于获取，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的相关技术研究人员来说，本发明可以有各种条件和方案上的选择与优化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例一shRNA设计与相应干扰载体的制备以及DBF4P1基因靶向抑制剂的应用。

一、细胞培养。

研究中使用的正常人脑星形胶质细胞(NHA)以及人胶质母细胞瘤细胞系A172、U87、U251和U373均购自上海研究院生命科学细胞资源中心。使用添加了10％胎牛血清的DMEM高糖培养液在100mm细胞培养皿中培养NHA、A172、U87、U251和U373细胞，每个培养皿加入6ml上述培养液，每2天使用PBS进行一次清洗，同时更换培养液，一般细胞约2-3天可长至单层。

二、实时荧光定量PCR技术检测DBF4P1的表达水平。

1.Trizol法提取细胞中的总RNA。

弃去细胞培养液，使用预冷的PBS清洗3次，加入1ml Trizol反复轻柔吹打并收集细胞，镜下观察细胞成油滴状(裂解充分)后转移至高压处理的1.5ml EP管中，静置5-10分钟使其裂解充分；进一步加入0.2ml氯仿，摇动混匀后在室温下静置5分钟；提前预冷超速离心机(4℃)，进一步离心15分钟(12000g)后吸取上层离心液加入至新1.5ml EP管中；加入0.5ml异丙醇，摇动混匀后室温下静置10分钟；进一步离心15分钟(4℃，12000g)后弃去上清液保留沉淀；加入1ml 75％乙醇清清洗涤沉；进一步离心5分钟(4℃，7500g)后弃去上清液保留沉淀；于通风橱中进行干燥15分钟后加入40-80μl DEPC水充分溶解；在水浴锅中煮样5分钟后测量RNA浓度并将样品储存于-80℃冰箱。

2.一步法染料法Quantitative real-time PCR检测DBF4P1基因的表达。

设计并合成DBF4P1基因的特异性引物，使用一步法染料法PCR检测试剂盒检测DBF4P1基因的相对表达量，测定CT值，以GAPDH作为内参照，以2^{^(-△△Ct)}计算DBF4P1的相对表达量。应用Quantitative real-time PCR方法检测发现，DBF4P1基因在胶质母细胞瘤组织和胶质母细胞瘤细胞中的表达水平显著增高，统计图如图1所示。

三、DBF4P1基因靶向抑制剂的制备和应用。

设计DBF4P1基因的干扰序列，选定靶向人DBF4P1基因，设计特异性结合并抑制DBF4P1基因表达的靶向抑制剂，具体序列如下：5’-GATATAACGGTGATAGAGCAG-3’。

使用NCBI对比分析所述DBF4P1基因的同原序列，使用Nucleotide Blast输入5’-GATATAACGGTGATAGAGCAG-3’特异性序列进行比对，分析结果表明，所述的特异性序列和人的其它mRNA基因不存在高度同源性，可以作为DBF4P1基因特异性干扰序列。进一步设计所述的DBF4P1基因靶向抑制剂的shRNA序列，所述的shRNA序列包括正义链和反义链，具体序列如下。

所述的shRNA正义链序列为：

5’-GAAGATGATATAACGGTGATAGAGCAGAATTTCCTGTATAAAGAGACCCAGGAAACTGAAAAAAACTT-3’。

所述的shRNA反义链序列为：

5’-AAGTTTTTTTCAGTTTCCTGGGTCTCTTTATACAGGAAATTCTGCTCTATCACCGTTATATCATCTTC-3’。

所述的DBF4P1基因的靶向抑制剂shRNA模板序列的转录产物序列为：

5’-GATATAACGGTGATAGAGCAGAATTTCCTGTATAAAGAGACCCAGGAAACTG-3’。

根据序列信息设计并合成相应特异性质粒，作为DBF4P1基因靶向抑制剂。

DBF4P1基因靶向抑制剂转染：应用Lipo3000转染试剂(Life TechnologiesCorporation，Carlsbad，CA，USA)进行转染，使用pIRES-EGFP-Neo表达载体。将胶质母细胞瘤细胞均匀接种在24孔板中进行培养，当每孔细胞密度在70％-80％时使用Lipo3000转染试剂进行转染。配置转染需要的质粒(sh-NC和sh-DBF4P1)、Opti-MEMI、Lipo3000和P3000转染试剂。A管：每孔按照1μg质粒溶解于50μl Opti-MEMI+1μl P3000，混匀后室温静置5min，B管：每孔按照1μl Lipo3000溶解于50μl Opti-MEMI中，混匀后室温静置5min，B管；将A、B两管混匀后再静置5min。在每个细胞孔中加入100μl转染混合液以及400μl细胞培养液；24-48h后使用倒置显微镜观察每孔中细胞带光情况以反映转染效果。进一步使用浓度为0.4mg/ml抗生素G418(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)加药筛选(每500μl中加入1μl-10μl)，转染筛选约4周后获得稳定沉默DBF4P1的胶质母细胞瘤细胞系。在后续实验中分为3组，具体分组如下：无任何处理因素的空白对照组(Control组)；转染DBF4P1沉默空质粒的阴性对照组(sh-NC组)；转染DBF4P1沉默质粒的实验组(sh-DBF4P1组)。使用DBF4P1基因靶向抑制剂后，应用Quantitative real-time PCR方法检测发现，胶质母细胞瘤细胞中DBF4P1的表达水平显著降低，统计图如图2所示。

实施例二应用DBF4P1基因靶向抑制剂显著抑制胶质母细胞瘤增殖、迁移和侵袭等生物学行为。

一、CCK-8细胞活力检测法检测DBF4P1基因靶向抑制剂对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响。

使用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力，将细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。细胞计数，以每孔2000个细胞的密度将不同分组的细胞分别接种培养于96孔板中(每组三个复孔)。将接种细胞后的96孔板放入恒温细胞培养箱中培养24小时(37℃、5％CO₂)，加入10ul CCK-8试剂后在30min、60min、90min、120min的不同时间点应用酶标仪在450nm OD值时检测各接种孔的光吸收值。使用DBF4P1基因靶向抑制剂后，应用CCK-8细胞活力检测法检测发现，胶质母细胞瘤细胞的增殖能力显著降低，统计图如图3所示。

二、Transwell细胞迁移实验检测DBF4P1基因靶向抑制剂对胶质母细胞瘤细胞迁移能力的影响。

Transwell细胞迁移实验检测细胞的迁移能力：使用24孔板在下室中加入600μl有血清的细胞，将3422型号小室放入对应孔中，将不同分组的胶质母细胞瘤细胞用胰蛋白酶消化后重悬于无血清的细胞培养液中。应用细胞计数板计数悬液中的细胞数，按每个小室的上室中2×10⁴个细胞的量加入100μl无血清培养液重悬的细胞悬液，将处理好的24孔板放入恒温细胞培养箱中培养24小时(37℃、5％CO₂)。24h后取出小室，使用37℃预温的PBS轻柔洗涤小室，并用棉签轻柔擦拭上室多余细胞和残留培养液。配置细胞固定液(冰乙酸：甲醇＝1:3)，另取24孔板，每孔加入1ml配置好的固定液，将处理好的小室放入固定液中进行固定(30min)。固定完成后，使用37℃预温的PBS清洗小室3次，晾干小室后使用配置好的吉姆萨染液(染色液：稀释液＝1:4)避光染色2-3h，流水清洗小室。使用倒置显微镜镜下观察小室随机选择3个视野并计数细胞数量进行统计，以此反映细胞迁移的能力。使用DBF4P1基因靶向抑制剂后，应用Transwell细胞迁移实验检测发现，胶质母细胞瘤细胞的迁移能力显著降低，统计图如图4所示。

三、Transwell细胞侵袭实验检测DBF4P1基因靶向抑制剂对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的影响。

Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力：使用24孔板在下室中加入600μl有血清的细胞，将3422型号小室放入对应孔中，并在小室中加入50μl Matrigel基质胶，置于37℃恒温细胞培养箱中30min。将不同分组的胶质母细胞瘤细胞用胰蛋白酶消化后重悬于无血清的细胞培养液中。应用细胞计数板计数悬液中的细胞数，按每个小室的上室中2×10⁴个细胞的量加入100μl无血清培养液重悬的细胞悬液，将处理好的24孔板放入恒温细胞培养箱中培养24小时(37℃、5％CO₂)。24h后取出小室，使用37℃预温的PBS轻柔洗涤小室，并用棉签轻柔擦拭上室多余细胞和残留培养液。配置细胞固定液(冰乙酸：甲醇＝1:3)，另取24孔板，每孔加入1ml配置好的固定液，将处理好的小室放入固定液中进行固定(30min)。固定完成后，使用37℃预温的PBS清洗小室3次，晾干小室后使用配置好的吉姆萨染液(染色液：稀释液＝1:4)避光染色2-3h，流水清洗小室。使用倒置显微镜镜下观察小室随机选择3个视野并计数细胞数量进行统计，以此反映细胞侵袭的能力。使用DBF4P1基因靶向抑制剂后，应用Transwell细胞侵袭实验检测发现，胶质母细胞瘤细胞的迁移能力显著降低，统计图如图5所示。

统计学方法：以上所有的实验都单独进行三次重复实验，数据均通过平均值±标准差来表示。多组数据之间，应用统计学软件SPSS 22.0，使用单因素方差分析(ANOVA)法进行分析，以明确组间是否存在差异，当P值<0.05时认为统计数据具有统计学意义，反之则统计数据的变化不具有统计学意义。应用Graphpad软件计算IC50。

序列表

<110> 中国医科大学附属盛京医院

<120> 一种DBF4P1基因的靶向抑制剂及其用途

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatataacgg tgatagagca g 21

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaagatgata taacggtgat agagcagaat ttcctgtata aagagaccca ggaaactgaa 60

aaaaactt 68

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagttttttt cagtttcctg ggtctcttta tacaggaaat tctgctctat caccgttata 60

tcatcttc 68

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatataacgg tgatagagca gaatttcctg tataaagaga cccaggaaac tg 52

Claims (4)

1.一种DBF4P1基因的靶向抑制剂在制备用于靶向治疗人脑胶质母细胞瘤药物中的用途，其特征在于，所述DBF4P1基因的靶向抑制剂为能够抑制DBF4P1基因表达的shRNA序列，所述shRNA序列针对的抑制剂的靶向序列为：5’-GATATAACGGTGATAGAGCAG-3’。

2.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型。

3.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。

4.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，所述药物的剂量为任何药物治疗学上可接受的剂量。

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