CN106754950A - 一种调节肝再生的c9orf116基因及其siRNA干扰靶点和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调节肝再生的c9orf116基因及其siRNA干扰靶点和应用，属于分子生物学及生物医药技术领域。本发明的技术方案要点为：调节肝再生的c9orf116基因的拮抗剂在制备促进肝再生用的药物中的应用，该c9orf116基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，调节肝再生的c9orf116基因的拮抗剂是特异性干扰c9orf116基因表达的siRNA干扰靶点，该siRNA干扰靶点的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明的c9orf116基因有促进肝细胞增殖的作用，表明该基因在细胞增殖过程中具有重要作用，在细胞增殖与分化、肿瘤治疗以及抗肿瘤药物研发等方面有着潜在应用价值。

Description

一种调节肝再生的c9orf116基因及其siRNA干扰靶点和应用

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医药技术领域，具体涉及一种调节肝再生的c9orf116基因及其siRNA干扰靶点和应用。

背景技术

肝脏是机体的重要器官，具有储存、代谢、生物转化、解毒、造血、合成胆色素、分泌和再生等功能。研究肝再生相关基因对肝细胞增殖和肝再生的作用，对揭示肝再生机制、构建人工肝、建立治疗和预防肝病的方法等都有重要的理论意义和应用价值。目前，已有大量报道指出，应用RNAi技术特异性地向哺乳动物和人类细胞中导入siRNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，最终达到高效特异性的基因治疗作用。

c9orf116基因全长为4351bp，含有3个外显子和2个内含子，其中3个外显子分别位于该基因的1-211、951-1029、3764-4351bp处，其mRNA全长为878bp，共编码136个氨基酸。比较大鼠、小鼠和人的c9orf116基因序列发现，三者基因结构相似，CDS区长度基本一致。进一步通过Cluster X软件比对大鼠、小鼠和人的c9orf116氨基酸序列发现，它们的氨基酸序列相似性可达到90.74%，其保守结构域是DUF4490，属于DUF4547超家族，是个未知功能的结构域，首先在真核生物中发现具有这个结构域家族的蛋白是典型的101-220个氨基酸长度。在小鼠中，其家族成员由P53诱导表达，在DNA损伤应答中起一定作用。然而，在大鼠体内，c9orf116基因还是一个功能不详的基因，能否促进体外培养的大鼠肝细胞增殖尚不明确。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种调节肝再生的c9orf116基因及其siRNA干扰靶点和应用，该c9orf116基因在细胞增殖与分化、肿瘤治疗及抗肿瘤药物研发等方面具有潜在的应用价值。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案：

一种调节肝再生的c9orf116基因，其特征在于该c9orf116基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

进一步优选，所述的调节肝再生的c9orf116基因在制备促进肝再生用的物质中的应用。

进一步优选，所述的调节肝再生的c9orf116基因在制备促进肝再生用的物质中的应用，其特征在于：通过调节转录因子JUN调节CCNA2、CCND1及MYC基因的表达共同促进肝细胞增殖。

进一步优选，所述促进肝再生用的物质为c9orf116蛋白的特异性抗体。

进一步优选，所述调节肝再生的c9orf116基因的拮抗剂在制备促进肝再生用的药物中的应用。

进一步优选，所述调节肝再生的c9orf116基因的拮抗剂是特异性干扰c9orf116基因表达的siRNA干扰靶点，该siRNA干扰靶点的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明首次提出了一种调节肝再生的c9orf116基因的功能及其应用，采用分子生物学手段首次确证基因c9orf116与肝再生有显著相关性，筛选了一条siRNA干扰靶点，为进一步的研究奠定基础。

附图说明

图1为c9orf116 siRNA转染BRL-3A细胞后c9orf116 mRNA水平表达情况图，其中C9-NC表示阴性对照，C9-S1、C9-S2和C9-S3表示c9orf116的3个siRNA片段；

图2为重组慢病毒在BRL-3A细胞中对c9orf116基因mRNA和蛋白水平的影响图；

图3为c9orf116对细胞活力的影响图，其中A为MTT法检测c9orf116干涉后对细胞活力的影响，B为MTT法检测c9orf116过表达后对细胞活力的影响；

图4为c9orf116对细胞周期的影响图，其中A为流式细胞术检测c9orf116干涉后对细胞周期变化，B为流式细胞术检测c9orf116过表达后对细胞周期变化；

图5为c9orf116对细胞增殖相关基因表达的影响，其中c9orf116-PCDH为过表达c9orf116后细胞增殖相关基因的mRNA水平的表达变化，c9orf116-SIRNA为干涉c9orf116后细胞增殖相关基因的mRNA水平的表达变化。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

BRL-3A细胞培养：大鼠BRL-3A肝细胞株购自北京医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，培养基为DMEM培养基（Invitrogen公司），其中含体积分数为10%的胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）和200U/mL青霉素和链霉素（Invitrogen公司），于37℃、体积分数为5%的CO₂及饱和湿度条件下进行细胞培养。

c9orf116的siRNA序列设计、合成：用Ambion、Qiagen、Dharmacon等多种siRNA设计软件，根据GenBank获取大鼠的c9orf116 mRNA序列（NM_019165.1）搜索AA序列并记录每个AA 3’端相邻的19个核苷酸，筛选出GC含量在30%-55%之间的siRNA。再根据siRNA基本设计原则进行进一步筛选，并将筛选出的siRNA序列在GenBank的基因组数据库中用BLAST检索其同源性，选用与非同源基因有3个以上的碱基错配的序列，以排除非特异性抑制的可能，在满足以上条件的基础上，最终确定3条c9orf116的siRNA序列（Tab.1）。siRNA序列由广州锐博生物科技有限公司合成，同时合成一个杂乱的不识别任何哺乳动物基因的序列作为阴性对照。

Tab 1. the sequence of siRNA targeting c9orf116

细胞转染：取对数生长期的BRL-3A细胞，质量体积比（g/mL）0.25%的胰酶（Invitrogen公司）消化，按0.3×10⁴个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，于37℃继续培养12h，按脂质体转染试剂（LipofectamineTM 2000，Invitrogen, USA）操作说明书进行细胞转染。分别将50nM的siRNA和0.2μL转染试剂加入5μL OPTI-MEM培养基，室温静置5min。将上述溶液轻轻混匀，形成转染复合物，室温静置20min，加入到含0.1mL OPTI-MEM培养基的细胞中，于37℃孵育4h，换完全培养基。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次。

有效c9orf116 siRNA的筛选：c9orf116 siRNA转染BRL-3A细胞，48h后收集细胞，提取总RNA，其中28S:18S的条带为2:1，提取RNA的OD260:280为1.9-2.1。用qRT-PCR检测c9orf116的表达情况，结果表明转染c9orf116 siRNA的BRL-3A细胞中，c9orf116表达量明显低于阴性对照NC组（比值分别为0.81、0.23、0.67）（图1）。用SPSS 13.0软件的单因素方差分析（one-way ANOVA）的最小显著性法（least significance difference, LSD）进行统计学分析，结果表明，S3与NC（对照）比差异显著（p＜0.05），S1 组、S2组与NC对照比差异极显著（p＜0.01），为此，后续试验均用S2。

分子克隆和慢病毒包装：根据NCBI中c9orf116基因序列，用慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP构建包含c9orf116基因 cDNA全长的过表达载体，将穿梭质粒和包装质粒共转染HEK293细胞，包装产生慢病毒。再用慢病毒感染大鼠BRL-3A肝细胞，用 RT-PCR和Western Blotting方法检测c9orf116的表达。

慢病毒的制备和鉴定：重组慢病毒质粒pCDH-c9orf116转染293T细胞24h, 过滤病毒液，浓缩后测定病毒滴度为1.5×108TU/mL，用于后续实验研究。慢病毒转染BRL-3A细胞后，RT-PCR和Western blot方法检测3A-pCDH和3A-pCDH-c9orf116组细胞中c9orf116的表达，mRNA和蛋白水平均显著提高（图2A/B）（p<0.01）。

MTT法：在含细胞的培养基中加入MTT（Geneview, USA），使其最终浓度达0.5mg/mL，于37℃避光培养4h，彻底弃去培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO，Geneview，USA），轻轻震荡10min，充分溶解甲瓒晶体。最后，用Biotek reader酶标仪检测490nm处各孔的吸光值。每个实验组设置5个复孔，实验重复3次。

c9orf116对BRL-3A细胞活力的影响：体外培养的BRL-3A细胞干涉和过表达c9orf116后24h、48 h、72h，MTT检测细胞活力发现转染c9orf116 siRNA后，细胞活力与阴性对照（NC）相比，明显低于NC组（图3A），而过表达c9orf116后，细胞活力与空载（pCDH）相比，明显高于PCDH组（图3B），SPSS 13.0软件用单因素方差分析（one-way ANOVA）的LSD法进行组间差异性的统计学分析，结果表明，c9orf116 siRNA组/过表达组与NC组相比，24h差异不明显，但48 h、72h差异显著（p＜0.05），表明c9orf116能够通过提高BRL-3A细胞活力促进大鼠BRL-3A细胞增殖。

流式细胞术：体积质量比（g/mL）0.25%胰蛋白酶消化细胞后收集材料，于体积分数为90%乙醇中-20℃固定过夜。然后，用PBS洗和400目筛网过滤细胞，再用含0.2mg/mL RNaseA的PI染色液（20μg/mL）重悬细胞，室温避光孵育15min，最后流式细胞仪测定细胞周期分布情况。

c9orf116对BRL-3A细胞周期的影响：流式细胞术检测细胞周期发现，siRNA处理后，实验组的细胞增殖率（S+G2/M %）为29.50±2.3%，阴性对照组的细胞增殖率为32.56±3.1%，并且c9orf116 S2组与NC组相比，S+G2/M期细胞数显著降低（p＜0.05），c9orf116过表达后与PCDH组相比，实验组细胞增殖率（S+G2/M %）为40.38±2.5%，PCDH组的细胞增殖率为38.92±3.5%，c9orf116过表达组与PCDH组相比，S+G2/M期细胞数显著增高（p＜0.05）（图4）。

实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）：细胞总RNA抽提按Trizol试剂操作说明书进行（Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA），分光光度计检测其纯度（A260/280吸光值）。然后，以2µg RNA为模板，按照AMV反转录试剂盒（Promega，USA）操作说明进行反转录，得到第一链cDNA。最后取1µL cDNA，按PCR试剂盒（Promega，USA）扩增基因，检测基因的扩增产物荧光信号值，并以β-actin（NM_031144）为内参计算基因的相对表达量（Ratio值）。每个样品做3个复孔，实验重复3次。根据基因在GenBank登录的序列号，用primer express 2.0软件设计其相应引物，并由上海生工有限公司合成（Tab. 2）。

Tab 2. The primer sequences of genes for qRT-PCR

c9orf116对BRL-3A的细胞增殖相关基因表达的影响：用qRT-PCR和Western Blot检测干涉和过表达c9orf116后细胞增殖相关基因的mRNA和蛋白水平表达变化。结果表明，干涉c9orf116后大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关基因CCNA2、CCND1和MYC等3个基因表达下调，过表达c9orf116后大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关靶基因CCNA2、CCND1和MYC等3个基因表达上调（图5））。用qRT-PCR和Western Blot检测干涉和过表达c9orf116后对细胞增殖相关基因的表达变化。结果表明，干涉c9orf116后大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关基因CCNA2、CCND1和MYC等3个基因表达下调，过表达c9orf116后大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关靶基因CCNA2、CCND1和MYC等3个基因表达上调。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南师范大学

<120> 一种调节肝再生的c9orf116基因及其siRNA干扰靶点和应用

<130> 2017

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 878

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacaggacg ccctgccgca gtagccacag acttgactgt cctgggctag tttcctgtgg 60

gaggccaaat gtctgaagaa aacccccaag agtgcgccga gccggtggag cccaaggcta 120

agcctgcccc agagaaaacg agcgactact accgcattag cgagaagctc ccagacaggt 180

tcaacaaccc ggggtggttt catggctaca gtaccaatga agctgtttcc atgtacagga 240

ccagtaacca aacctatggg agcagagctc ccacagcgca tgagatgccg aaagcatatt 300

atccatcttc aaataagttt tccacacaac acgcagcttt cggaatgttc cggagacata 360

atatgaatgt ctgcctggat aagagcctag tgactgggcc ggacaatcac gtcacccact 420

acgacccctt aaactttcac cccagttaca atgtcaacag gccatccatc tgtgactaag 480

gaagctggct gcctgtcgtc ggggctgtcc tgactcaggg ctgctgtagg gagcacggat 540

gcccctgatt ctggacaagt gccccattct aaaggcacgg agctcactgc cttctcagaa 600

aacacttttc ctttccagag gagaaaatta tgtaaatagg gccataatgt cttgtgttct 660

gcatttcaca caggaaggat gctgacagaa tctttgtttt attaaaaagt tgccacggct 720

tcaatttctg tcgtgcttca tatttgtcct gaagtagcag gggacccgca catcttggaa 780

cccgagtctt ggtttgcaat gtggggtgtt ctagggagtg ccacaaagca tctttatttg 840

ggagctgttg ccatgtgtgt gactgttact gggataaa 878

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAATGTTCCG GAGACATAA 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCATGAGATG CCGAAAGCA 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCAATGAAGC TGTTTCCAT 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAAUGUUCCG GAGACAUAA 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CUUACAAGGC CUCUGUAUU 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCAUGAGAUG CCGAAAGCA 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CGUACUCUAC GGCUUUCGU 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCAAUGAAGC UGUUUCCAU 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGUUACUUCG ACAAAGGUA 19

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCCAAATGTC TGAAGAAAAC C 21

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GTACTGTAGC CATGAAACCA CC 22

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GTGCTGGGCC AAGGAAAATG 20

<210> 14

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGAGTTCAGC TGAGGGATCG 20

<210> 15

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CAGCCCACTC TGGTCTCCTC 20

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCATCTTATT CCTTTCCCTT CG 22

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

TGCAAAGATG GAAACGACCT T 21

<210> 18

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCCGTAGGCG CCACTCT 17

<210> 19

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CGCTCTTCAC GAAACCCAG 19

<210> 20

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCATCCATAG CCAGCCATT 19

<210> 21

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCGTCAACAG GGAGATGTCA 20

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

TTCCACAAAG GCATCCCAGC 20

<210> 23

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CTTTTAGTGC CGCTGTCTCT TT 22

<210> 24

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCCCGCATAC TGTTAGTGAT GT 22

<210> 25

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ACAACGGTGA ATGGACACCA 20

<210> 26

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCCACGGTTC ACCATGACTA 20

<210> 27

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ACCCAACATC AGCGGTCG 18

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CGTGACTGTC GGGTTTTCCA 20

<210> 29

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

AAAATGCCAG AGGCGGATGA 20

<210> 30

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAAAGTGCGT TGTGCGGTAG 20

Claims (6)

1.一种调节肝再生的c9orf116基因，其特征在于该c9orf116基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的调节肝再生的c9orf116基因在制备促进肝再生用的物质中的应用。

3.根据权利要求2所述的调节肝再生的c9orf116基因在制备促进肝再生用的物质中的应用，其特征在于：通过调节转录因子JUN调节CCNA2、CCND1及MYC基因的表达共同促进肝细胞增殖。

4.根据权利要求2所述的调节肝再生的c9orf116基因在制备促进肝再生用的物质中的应用，其特征在于：所述促进肝再生用的物质为c9orf116蛋白的特异性抗体。

5.权利要求1所述的调节肝再生的c9orf116基因的拮抗剂在制备促进肝再生用的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的调节肝再生的c9orf116基因的拮抗剂在制备促进肝再生用的药物中的应用，其特征在于：所述调节肝再生的c9orf116基因的拮抗剂是特异性干扰c9orf116基因表达的siRNA干扰靶点，该siRNA干扰靶点的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。