CN110144347A - 干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物 - Google Patents

干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物，属于分子生物技术与基因工程领域。本发明提供干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物，通过在细胞中转染该小干扰RNA，能调控和干扰Clhc1基因表达，抑制细胞活力和细胞增殖；因此将干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA应用到制备降低细胞活力、抑制细胞增殖和抑制细胞增殖相关基因表达的药物中，具备很高的实际应用的价值。

Description

干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物
技术领域
本发明涉及分子生物技术与基因工程领域，具体而言，涉及干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物。
背景技术
肝脏是机体的重要器官，有储存、代谢、生物转化、解毒、造血、合成胆色素、分泌、再生等功能。研究肝再生相关基因对肝细胞增殖和肝再生的作用，对揭示肝再生机制、构建人工肝、建立治疗和预防肝病方法等都有重要理论意义和应用价值。应用RNAi技术特异性地向哺乳动物和人类的细胞中导入小干扰RNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，达到高效特异性的基因治疗作用。
Clhc1基因全长为39453bp，含12个外显子，其外显子分别位于该基因的8-118，11167-11426，14111-14328，15470-15603，16222-16423，16523-16635，17110-17194，19660-19766，25530-25704，27957-28159，36515-36694，39135-39453bp处，其mRNA全长为2101bp，共编码585个氨基酸。其保守结构域是pfam15739(TSNAXIP1_N；Translin-associated factor X-interacting N-terminus)，该结构域位于易位相关因子X相互作用蛋白的N末端，该蛋白可能在精子发生中起作用。然而，在大鼠的体内，Clhc1还是一个功能不详的基因。
发明内容
本发明的目的在于提供了干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物，本发明提供干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，通过在细胞中转染该小干扰RNA，能调控和干扰Clhc1基因表达，抑制细胞活力和细胞增殖等。
本发明的第一方面的实施例中，提供了干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，小干扰RNA包括小干扰RNA1、小干扰RNA2和小干扰RNA3至少一种；小干扰RNA1的碱基序列如SEQ IDNO.1所示，小干扰RNA2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，小干扰RNA3的碱基序列如SEQ IDNO.3所示。
在上述的实施例中，小干扰RNA1的靶序列为CCAAAGCAATTCAATTACA；小干扰RNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1：5’CCAAAGCAAUUCAAUUACA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdT GGTTTCGTTAAGTTAATGT5’。
小干扰RNA2的靶序列为CTCCCTTGGTGAATATGAA；小干扰RNA2的碱基序列如SEQ IDNO.2所示，SEQ ID NO.2：5’CUCCCUUGGUGAAUAUGAA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdTGAGGGAACCACUUAUACUU5’。
小干扰RNA3的靶序列为CCAAGGACATTAACACTGA，小干扰RNA3的碱基序列如SEQ IDNO.3所示，SEQ ID NO.3：5’CCAAGGACAUUAACACUGA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdTGGUUCCUGUAAUUGUGACU5’。
上述三种小干扰RNA均可以干扰Clhc1基因表达。
本发明的第二方面的实施例中，提供了上述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在干扰Clhc1基因表达中的应用。
在上述的实施例中，将上述干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA应用到干扰Clhc1基因表达中，能起到干扰Clhc1基因表达，起到研究Clhc1基因功能以及肝细胞增殖的作用和目的。
本发明的第三方面的实施例中，提供了上述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在制备降低细胞活力的药物中的应用。
在上述的实施例中，由于小干扰RNA干扰Clhc1基因表达，进而影响细胞的活力，因此可以将上述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA应用在制备降低细胞活力的药物中。
本发明的第四方面的实施例中，提供了上述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在制备抑制细胞增殖的药物中的应用。
在上述的实施例中，由于小干扰RNA干扰Clhc1基因表达，进而影响细胞的增殖，所以可以将上述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA应用在制备抑制细胞增殖的药物中。
本发明的第五方面的实施例中，提供了上述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在制备抑制细胞增殖相关基因表达的药物中的应用。
在上述的实施例中，由于小干扰RNA干扰Clhc1基因表达，进而影响细胞的相关的基因的表达，其中包括细胞增殖相关基因表达；因此可以将上述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA应用在在制备抑制细胞增殖相关基因表达的药物中。
在上述的第五方面的一些实施例中，细胞增殖相关基因为JUN基因、BCL2基因和CCND1基因。
JUN基因是编码c-jun蛋白的基因，是转录因子AP-1家族的一个成员，可以相互之间形成同源二聚体，也可以和FOS家族的蛋白形成异源二聚体发挥转录因子的作用；是AP-1上游的调控因子。
在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员起着至关重要的作用。它们具有较高的同源性；它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上，与膜的结合对于其发挥功能是极其重要的。实验表明，失去膜定位能力的Bcl-2蛋白抗凋亡能力减弱了许多。在细胞凋亡中，线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器，Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞内的氧化还原电位，来抑制细胞凋亡。
CCND1基因能编码细胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)，人类的CCND1基因位于11q13，含有13388bp，编码295个氨基酸。其主要功能在于调节细胞周期从DNA合成前期(G1期)向DNA合成期(S期)的过渡过程。CCND1基因过度表达会影响正常细胞周期，从而引发多种肿瘤疾病。
本发明的第六方面的实施例中，提供了一种干扰Clhc1基因表达的方法，包括以下步骤：
用不含血清的培养基稀释上述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，得到小干扰RNA溶液；用不含血清的培养基稀释脂质体，得到脂质体溶液；
将小干扰RNA溶液和脂质体溶液混合，得到脂质体-小干扰RNA复合物溶液；
在培养板中进行细胞培养，当细胞覆盖40％-60％的板底时，吸弃培养基，用无血清的DMEM培养基清洗；加入无血清培养基和脂质体-小干扰RNA复合物溶液培养转染；
吸弃无血清培养基，加入含有胎牛血清的DMEM培养基培养；
收集细胞并检测Clhc1基因表达。
在上述的实施例中，通过脂质体转染法，将针对Clhc1基因的小干扰RNA转染进细胞中，干扰Clhc1基因的表达。脂质体转染法是指阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将小干扰RNA分子包裹入内，形成小干扰RNA与脂质体的复合体，被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合作用，偶尔也通过直接渗透作用，将包裹的小干扰RNA传递到细胞内，形成包涵体或进入溶酶体，而其中的一小部分小干扰RNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录并表达。
在上述的第六方面的一些实施例中，细胞的含量为1×105-2×105个/mL。
在上述的实施例中，控制细胞的接种量，能提高培养的效率并且保证细胞的活力。
在上述的第六方面的一些实施例中，将小干扰RNA溶液和脂质体溶液混合的时间为10-15min。
在上述的实施例中，脂质体作为细胞内外输送载体的工具，通过融合的方式进入细胞，可以将小干扰RNA带入细胞内。
在上述的第六方面的一些实施例中，加入脂质体-小干扰RNA复合物溶液培养转染的时间为6-24h，温度为35-38℃。
在上述的实施例中，在温度35-38℃条件下，加入脂质体-小干扰RNA复合物溶液培养转染的时间为6-24h，使得脂质体携带的小干扰RNA能尽可能的进入细胞内，与靶基因结合，实现干扰Clhc1基因表达的目的。
相较于目前的技术，本发明的有益效果体现在：本发明提供的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物，通过在细胞中转染该小干扰RNA，能调控和干扰Clhc1基因表达，抑制细胞活力和细胞增殖；因此将干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA应用到制备降低细胞活力、抑制细胞增殖和抑制细胞增殖相关基因表达的药物中，具备很高的实际应用的价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的3种小干扰RNA干扰Clhc1基因表达的结果图；
图2为本发明实验例提供的3种小干扰RNA干扰Clhc1蛋白表达的结果图；
图3为本发明实验例提供的转染小干扰RNA3的BRL-3A细胞的活力检测图；
图4为本发明实验例提供的转染小干扰RNA3的BRL-3A细胞增殖结果图；
图5为本发明实验例提供的转染小干扰RNA3的BRL-3A细胞增殖相关基因表达量检测结果图；
图6为本发明实验例提供的转染小干扰RNA3的BRL-3A细胞增殖相关蛋白表达量检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。例如，实施例中如无特殊说明，未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器如无特殊说明，未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
第1实施例
本实施例提供干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，该小干扰RNA包括小干扰RNA1、小干扰RNA2和小干扰RNA3至少一种；小干扰RNA1的碱基序列请参见SEQ ID NO.1所示出的序列，小干扰RNA2的碱基序列请参见SEQ ID NO.2所示出的序列，小干扰RNA3的碱基序列请参见SEQ ID NO.3所示出的序列。
小干扰RNA1的靶序列为CCAAAGCAATTCAATTACA；小干扰RNA1的碱基序列，如SEQ IDNO.1，为：5’CCAAAGCAAUUCAAUUACA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdTGGTTTCGTTAAGTTAATGT5’。
小干扰RNA2的靶序列为CTCCCTTGGTGAATATGAA；小干扰RNA2的碱基序列，如SEQ IDNO.2，为：5’CUCCCUUGGUGAAUAUGAA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdTGAGGGAACCACUUAUACUU5’。
小干扰RNA3的靶序列为CCAAGGACATTAACACTGA，小干扰RNA3的碱基序列如，SEQ IDNO.3，为：5’CCAAGGACAUUAACACUGA dTdT3’。阴性对照序列为：3’dTdTGGUUCCUGUAAUUGUGACU5’。
第2实施例
本实施例提供了一种干扰Clhc1基因表达的方法，包括以下步骤：
S1.用不含有血清的培养基稀释干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，得到小干扰RNA溶液。
S2.用不含有血清的培养基稀释脂质体，得到脂质体溶液；
S3.将小干扰RNA溶液和脂质体溶液混合10min，得到脂质体-小干扰RNA复合物溶液；
S4.在6孔培养板的培养孔中加入2mL的DMEM细胞培养基，每个培养孔中细胞的含量为1×105个/mL；
S5.在37℃，5％的CO2条件下培养至细胞覆盖40％-60％的板底；
S6.吸弃培养孔中的培养基，用无血清的DMEM培养基清洗1-2次；
S7.清洗后加入脂质体-小干扰RNA复合物溶液在35℃的温度下进行6h的转染培养；
S8.转染培养后，吸取无血清培养基，加入含有胎牛血清的DMEM培养基培养；
S9.收集细胞检测Clhc1基因表达。
第3实施例
本实施例提供了一种干扰Clhc1基因表达的方法，包括以下步骤：
S1.用不含有血清的培养基稀释干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，得到小干扰RNA溶液。
S2.用不含有血清的培养基稀释脂质体，得到脂质体溶液；
S3.将小干扰RNA溶液和脂质体溶液混合15min，得到脂质体-小干扰RNA复合物溶液；
S4.在6孔培养板的培养孔中加入2mL的DMEM细胞培养基，每个培养孔中细胞的含量为2×105个/mL；
S5.在37℃，5％的CO2条件下培养至细胞覆盖40％-60％的板底；
S6.吸弃培养孔中的培养基，用无血清的DMEM培养基清洗1-2次；
S7.清洗后加入脂质体-小干扰RNA复合物溶液在38℃的温度下进行24h的转染培养；
S8.转染培养后，吸取无血清培养基，加入含有胎牛血清的DMEM培养基培养；
S9.收集细胞检测Clhc1基因表达。
第4实施例
本实施例提供了一种干扰Clhc1基因表达的方法，包括以下步骤：
S1.用不含有血清的培养基稀释干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，得到小干扰RNA溶液。
S2.用不含有血清的培养基稀释脂质体，得到脂质体溶液；
S3.将小干扰RNA溶液和脂质体溶液混合15min，得到脂质体-小干扰RNA复合物溶液；
S4.在6孔培养板的培养孔中加入2mL的DMEM细胞培养基，每个培养孔中细胞的含量为2×105个/mL；
S5.在37℃，5％的CO2条件下培养至细胞覆盖40％-60％的板底；
S6.吸弃培养孔中的培养基，用无血清的DMEM培养基清洗1-2次；
S7.清洗后加入脂质体-小干扰RNA复合物溶液在38℃的温度下进行15h的转染培养；
S8.转染培养后，吸取无血清培养基，加入含有胎牛血清的DMEM培养基培养；
S9.收集细胞检测Clhc1基因表达。
实验例
本实验例以第3实施例的转染方法进行转染，同时将第1实施例中3种小干扰RNA即小干扰RNA1(siR1)、小干扰RNA2(siR2)和小干扰RNA3(siR3)分别转染大鼠BRL-3A肝细胞；大鼠BRL-3A肝细胞株购自北京医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，培养基为DMEM培养基(Invitrogen公司)，其中含10％的胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)和200U/mL青霉素和链霉素(Invitrogen公司)，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下进行细胞培养。
细胞转染：取对数生长期的BRL-3A细胞，0.25％胰酶(Invitrogen公司)消化，按0.3×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃继续培养12h，按脂质体转染试剂(LipofectamineTM 2000，Invitrogen,USA)操作说明进行细胞转染。分别将50nM的小干扰RNA和0.2μL转染试剂加入5μLOPTI-MEM培养基，室温静置5min。将上述溶液轻轻混匀，形成转染复合物，室温静置20min，加入到含0.1mL OPTI-MEM培养基的细胞中，37℃孵育4h，换完全培养基。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次。
1、转染小干扰RNA对Clhc1基因及蛋白的表达量的影响
转染后，48h收集细胞，提取总RNA和总蛋白，其中28S:18S的条带为2:1，提取RNA的OD260:280为1.9-2.1。用qRT-PCR检测Clhc1基因的表达情况，并通过western blot检测蛋白的表达量。
基因表达量的结果如图1所示，转染小干扰RNA的BRL-3A细胞实验组中的Clhc1基因的表达量明显低于对照组；进行统计学分析，结果表明，小干扰RNA1和小干扰RNA2与对照组的差异显著(p＜0.05)，小干扰RNA3组与对照组的差异极显著(p＜0.01)，为此，后续试验均用小干扰RNA3组。
蛋白表达量的结果如图2所示，可以看出，与对照组比较，转染小干扰RNA1(siR1)、小干扰RNA2(siR2)和小干扰RNA3(siR3)的实验组的Clhc1蛋白的表达量逐渐降低，从蛋白的相对表达量数据与能清楚得看出，转染小干扰RNA3的实验组对Clhc1蛋白表达的干扰最大，效果最好。
因此可以将干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在干扰Clhc1基因表达中的应用。
2、对细胞活力的影响
使用小干扰RNA3转染BRL-3A细胞，在含细胞的培养基中加入MTT(Geneview,USA)，使其最终浓度达0.5mg/mL，于37℃避光培养4h，彻底弃去培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO，Geneview，USA)，轻轻震荡10min，充分溶解甲瓒晶体。最后，用Biotek reader酶标仪检测490nm处各孔的吸光值。每个实验组设置5个复孔，实验重复3次。
结果如图3所示，体外培养的BRL-3A细胞干涉Clhc1后24h、48h、72h，MTT检测细胞活力发现转染Clhc1小干扰RNA后，细胞活力与阴性对照(NC)相比，明显低于NC组，单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD法进行组间差异性的统计学分析，结果表明，Clhc1小干扰RNA组与NC组相比，24h差异不明显，48h细胞活力明显低于对照组(p＜0.05)，表明Clhc1能够通过提高BRL-3A细胞活力促进大鼠BRL-3A细胞存活，即通过小干扰RNA3转染BRL-3A干扰Clhc1基因，能降低细胞的活力。
3、验证转染小干扰RNA3后对BRL-3A细胞增殖的影响
使用小干扰RNA3转染BRL-3A细胞，转染48h后的细胞于取材前2h加入EdU溶液，使其终浓度为50μmol/L。操作步骤按EdU试剂盒说明书进行(锐博，广州)。首先用4％多聚甲醛固定30min，然后再在2g/L的甘氨酸中脱色孵育5min，再在0.5％TritonX-100中脱色10min。接着，在1×Apollo中孵育30min，再于0.5％TritonX-100中孵育10-30min，并于1×DAPI标记细胞核10min，上述每一个步骤，均用PBS洗3次。最后，用荧光显微镜进行观察和拍照，并用Image-Pro Plus 6.0软件对EdU阳性细胞和相应视野下的细胞核分别进行计数。
结果如图4所示，通过小干扰RNA3转染BRL-3A干扰Clhc1基因的表达后48h，EdU检测细胞增殖发现转染Clhc1小干扰RNA后，EdU阳性细胞数与阴性对照(NC)相比，明显低于NC组，利用单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD法进行组间差异性的统计学分析，结果表明，Clhc1小干扰RNA干扰的实验组与NC组相比，EdU阳性细胞数显著降低(p＜0.05)，表明Clhc1能够促进大鼠BRL-3A细胞增殖，即通过小干扰RNA3转染BRL-3A干扰Clhc1基因，能抑制细胞的增殖。
4、对细胞增殖相关基因JUN、BCL2和CCND1表达以及相关蛋白表达量的影响
使用小干扰RNA3转染BRL-3A细胞，48h后细胞总RNA抽提按Trizol试剂操作说明书进行(Invitrogen Corporation,Carlsbad,California,USA)，分光光度计检测其纯度(A260/280吸光值)。然后，以2μg RNA为模板，按照AMV反转录试剂盒(Promega，USA)操作说明进行反转录，得到第一链cDNA。最后，取1μLcDNA，按PCR试剂盒(Promega，USA)扩增基因，检测基因的扩增产物荧光信号值，并以β-actin(NM_031144)为内参计算基因的相对表达量(Ratio值)。每个样品做3个复孔，实验重复3次。检测引物如表1所示。
表1 qRT-PCR检测的引物
用Neuhoff方法测定蛋白浓度，并取20μg进行SDS-PAGE电泳、转硝酸纤维素膜(PALL公司)。转膜后，将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中37℃封闭1h。然后用一抗(武汉博士德，一抗:TBS-T为1:500)进行标记，用碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗(用TBS-T稀l:1000稀释，北京鼎国)进行再标记；用ECL底物发光法进行(上海生工)显色。最后，用图像分析软件Image QuantTMTL进行灰度扫描和蛋白含量分析。
荧光定量分析结果如图5所示，可以看出，与对照组相比较，细胞增殖相关基因JUN、BCL2和CCND1表达量均明显下调；即通过小干扰RNA干涉Clhc1基因后，大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关基因JUN、BCL2和CCND1表达下调。
蛋白实验结果如图6所示，JUN、BCL2和CCND1蛋白表达量也明显下调；即通过小干扰RNA干涉Clhc1基因后，大鼠BRL-3A细胞中细胞增殖相关蛋白JUN、BCL2和CCND1表达量随细胞增殖相关基因JUN、BCL2和CCND1表达下调而同步下调。
因此，可以将小干扰RNA1、小干扰RNA2和小干扰RNA3应用到制备降低细胞活力、抑制细胞增殖以及抑制细胞增殖相关基因表达的药物中。
综合上述来说，本发明实施例提供的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA及其应用与药物，通过小干扰RNA干扰Clhc1基因表达，能调控细胞活力、细胞增殖等，具有较好的应用前景。
以上所记载的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而并不是全部的实施例。本发明的实施例中的详细描述的部分并非旨在限制所要求保护的本发明的范围，仅仅是用作表示本发明的一部分选定的实施例。基于本发明中所记载的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，其特征在于，所述小干扰RNA包括小干扰RNA1、小干扰RNA2和小干扰RNA3中的至少一种；所述小干扰RNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述小干扰RNA2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，所述小干扰RNA3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在干扰Clhc1基因表达中的应用。
3.如权利要求1所述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在制备降低细胞活力的药物中的应用。
4.如权利要求1所述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在制备抑制细胞增殖的药物中的应用。
5.如权利要求1所述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在制备抑制细胞增殖相关基因表达的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA在制备抑制细胞增殖相关基因表达的药物中的应用，其特征在于，所述细胞增殖相关基因为JUN基因、BCL2基因和CCND1基因。
7.一种干扰Clhc1基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
用不含血清的培养基稀释如权利要求1所述的干扰Clhc1基因表达的小干扰RNA，得到小干扰RNA溶液；用不含血清的培养基稀释脂质体，得到脂质体溶液；
将所述小干扰RNA溶液和所述脂质体溶液混合，得到脂质体-小干扰RNA复合物溶液；
在培养板中进行细胞培养，当细胞覆盖40％-60％的板底时，吸弃培养基，用无血清的DMEM培养基清洗；加入无血清培养基和所述脂质体-小干扰RNA复合物溶液培养转染；
吸弃所述无血清培养基，加入含有胎牛血清的DMEM培养基培养；
收集细胞并检测Clhc1基因表达。
8.根据权利要求7所述的干扰Clhc1基因表达的方法，其特征在于，在培养板中进行细胞培养时，所述细胞的含量为1×105-2×105个/mL。
9.根据权利要求7所述的干扰Clhc1基因表达的方法，其特征在于，将所述小干扰RNA溶液和所述脂质体溶液混合的时间为10-15min。
10.根据权利要求7所述的干扰Clhc1基因表达的方法，其特征在于，加入所述脂质体-小干扰RNA复合物溶液培养转染的时间为6-24h，温度为35-38℃。
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