CN110241196A - circRNA PRKD3在牙周膜干细胞成骨分化中的应用 - Google Patents

Abstract

本公开属于牙周膜干细胞成骨分化领域，具体涉及circRNA PRKD3在牙周膜干细胞成骨分化中的应用。为了明确牙周膜干细胞成骨分化的机制，发明人在先研究启示了特异性lncRNA和circRNA可能作为ceRNA调节牙周膜干细胞成骨分化和影响牙周再生。为了进一步确认circRNA与牙周膜干细胞成骨分化的关系，本公开通过生物信息学方法预测了与miRNA‑21相关的circRNA，并筛选确认circRNA PRKD3在牙周膜干细胞成骨分化中具有调节作用，可以诱导hPDLSCs中成骨关键基因的表达、增加细胞中矿化结节的数量，促进hPDLSCs成骨诱导分化。

Description

circRNA PRKD3在牙周膜干细胞成骨分化中的应用

技术领域

本公开属于牙周膜干细胞成骨分化领域，具体涉及一种circRNA PRKD3对牙周膜干细胞成骨分化的诱导作用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

牙周病是成年人牙齿丧失的主要原因，对于牙周组织丧失的患者，缺失组织的再生较为困难。目前的牙周引导性组织再生术(guided tissue regeneration,GTR)、牙周植骨术或骨替代品的植入术和使用生长因子等生物活性药物是牙周组织再生的几种主要临床方法。然而，单独或联合使用这些治疗方法，还无法实现完全的、可预测的再生。随着干细胞治疗技术和组织工程学的发展，研究人员发现利用干细胞促进牙周组织再生是一种很有前途的牙周缺损的治疗方法。

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)具有自我更新和多向分化潜能，是牙周组织再生工程中良好的种子细胞。为了更好的应用于牙周组织再生工程以促进牙周组织的再生，学者们对于牙周膜干细胞成骨分化的调控机制持续关注并研究。发明人认为已公开的研究主要在转录和翻译水平研究牙周膜干细胞成骨分化调控机制，目前已经有许多miRNA被证实能够调控牙周膜干细胞成骨分化，如miRNA-21、miRNA-22、miRNA-214和miRNA-543。在发明人之前的研究中，通过生物信息学分析，对lncRNA和circRNA的差异表达进行识别和整合分析，发现牙周膜干细胞成骨分化过程中存在复杂的竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)网络。发明人认为这些结果提示，特异性lncRNA和circRNA可能作为ceRNA 调节牙周膜干细胞成骨分化和影响牙周再生，并且通过寻找与 miR-21功能相关的lncRNA进行验证，证实了lncRNA TUG1通过与 Lin28A相互作用促进牙周膜干细胞的成骨分化。

发明内容

针对上述研究背景，发明人对circRNA与人牙周膜干细胞(human periodontalligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化之间的关系展开了研究。基于starbase数据库预测与miRNA-21相关的circRNA，通过 qRT-PCR检测成骨诱导前后的牙周膜干细胞，从中筛选到circRNA PRKD3具有显著的表达差异。经本公开进一步研究确认，circRNA PRKD3沉默后的hPDLSCs中成骨关键表达基因ALP(alkaline phosphatase)、Runx2(runt-relatedtranscription factor 2)表达降低，矿化结节数量减少，成骨分化能力降低，证明circRNAPRKD3对于牙周膜干细胞的成骨分化具有促进作用，为牙周膜干细胞的成骨分化机制提供了更进一步的研究进展。

为了实现上述技术效果，本公开提供以下技术方案：

本公开第一方面，提供circRNA PRKD3作为牙周膜干细胞成骨分化诱导剂的应用。

本公开第二方面，提供circRNA PRKD3沉默试剂作为牙周膜干细胞成骨分化抑制剂的应用。

本公开第三方面，提供circRNA PRKD3检测试剂在制备牙周膜干细胞成骨分化水平试剂盒中的应用。

本公开第四方面，提供circRNA PRKD3作为牙周膜干细胞成骨分化能力评判标志物的应用。

本公开第五方面，提供一种治疗牙周缺损方法，所述方法通过将 circRNA PRKD3转入缺损部位的牙周膜中。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

现有技术中有相关研究表明circRNA广泛参与组织再生和干细胞分化过程，如大鼠肝脏再生，大鼠神经再生，circIGSF11等环状RNA 可能参与人骨髓间充质干细胞的成骨分化。但截至目前，circRNA在牙周膜干细胞成骨向分化过程中作用的相关研究还很少。本公开提供了circRNA PRKD3对牙周膜干细胞成骨分化的诱导作用，填补了该领域的空白，进一步明确了牙周膜干细胞成骨分化的机制，为牙周疾病的治疗提供了新的研究思路。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例1中组织块法分离培养的人牙周膜干细胞 (hPDLSCs)；

其中，图1A为原代培养的从组织块爬出并呈放射状生长的 hPDLSCs；

图1B为传代培养的第三代处于对数生长期的hPDLSCs。

图2为实施例1中hPDLSCs流式细胞术鉴定结果图；

其中，图2A为hPDLSCs表面表达CD34的阳性率为0.027％；

图2B为hPDLSCs表面表达CD45的阳性率为0.044％；

图2C为hPDLSCs表面表达CD90的阳性率为99.2％；

图2D为hPDLSCs表面表达CD105的阳性率为99.9％。

图3为实施例1中hPDLSCs成骨向分化能力鉴定中ALP染色图；

其中，图3A为hPDLSCs正常培养7d后ALP染色大体图；

图3B为hPDLSCs成骨诱导7d后ALP染色大体图；

图3C为hPDLSCs正常培养7d后ALP染色40倍镜下图；

图3D为hPDLSCs成骨诱导7d后ALP染色40倍镜下图。

图4为实施例1中hPDLSCs成骨向分化能力鉴定中茜素红染色图；

其中，图4A为hPDLSCs正常培养21d后茜素红染色大体图；

图4B为hPDLSCs成骨诱导21d后茜素红染色大体图；

图4C为hPDLSCs正常培养14d后茜素红染色40倍镜下图；

图4D为hPDLSCs成骨诱导14d后茜素红染色40倍镜下图。

图5为实施例1中hPDLSCs成脂向分化能力鉴定结果图；

其中，图5A为正常培养hPDLSCs的40倍镜下图；

图5B为成脂诱导6d后100倍镜下图；

图5C为成脂诱导14d后油红O染色400倍镜下图。

图6为实施例1中qRT-PCR验证circRNA差异表达结果图；

其中，图6A为circRNA环状衔接处引物设计；

图6B为引物divergent primer进行qRT-PCR定量分析circRNA的表达水平图。

图7为实施例1中琼脂糖凝胶电泳验证circRNA PRKD3的环状结构图；

图8为实施例1中转染circRNA PRKD3干扰慢病毒后circRNA PRKD3柱形图；

其中，图8A为正常细胞；

图8B为转染阴性对照慢病毒组细胞；

图8C为转染circRNA PRKD3干扰慢病毒1组细胞；

图8D为转染circRNA PRKD3干扰慢病毒2组细胞；

图8E为qRT-PCR检测到转染慢病毒后细胞中circRNA PRKD3含量柱形图；

数据表示为平均值±标准差，control代表非成骨诱导组，sh-NC 代表成骨诱导+阴性对照病毒组，sh-circRNA PRKD3-1#代表成骨诱导 +干扰慢病毒组1#，sh-circRNAPRKD3-2#代表成骨诱导+干扰慢病毒组2#，*表示P＜0.05。

图9为成骨诱导7d后敲基因组hPDLSCs中ALP表达图；

其中，图9A为ALP染色大体图；

图9B为ALP染色40倍镜下图；

Control代表非成骨诱导组，PDLSCs-wt代表正常细胞成骨诱导7d组，sh-NC代表成骨诱导7d+阴性对照病毒组，sh-circRNA PRKD3-1#代表成骨诱导7d+干扰慢病毒组1#。

图10为实施例1中成骨诱导14d后敲基因组hPDLSCs形成的矿化结节茜红素染色图；

图10A为茜素红染色大体图；

图10B为茜素红染色40倍镜下图；

Control代表非成骨诱导组，PDLSCs-wt代表正常细胞成骨诱导 14d组，sh-NC代表成骨诱导14d+阴性对照病毒组，sh-circRNA PRKD3-1#代表成骨诱导21d+干扰慢病毒组1#。

图11为实施例1中沉默circRNA PRKD3后hPDLSCs的成骨向分化能力柱形图；

其中，图11A为沉默circRNA PRKD3后成骨诱导的hPDLSCs ALP 活性柱形图；

图11B为CPC检测沉默circRNA PRKD3后成骨诱导的hPDLSCs 中钙离子柱形图；

图11C为qRT-PCR检测沉默circRNA PRKD3后成骨诱导3d、7d、 14d后hPDLSCs中成骨关键基因ALP表达显著降低；

图11D为qRT-PCR检测沉默circRNA PRKD3后成骨诱导3d、7d、 14d后hPDLSCs中成骨关键基因Runx2表达显著降低。

PDLSCs-wt代表正常细胞成骨诱导组，sh-NC代表成骨诱导+阴性对照病毒组，sh-circRNA PRKD3-1#代表成骨诱导+干扰慢病毒组1#。数据表示为平均值±标准差；*,P<0.05；**,P<0.01,NS代表无意义。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对牙周膜干细胞成骨分化调控机制的研究，已公开的研究主要在转录和翻译水平研究牙周膜干细胞成骨分化调控机制，目前已经有许多miRNA被证实能够调控牙周膜干细胞成骨分化，如miRNA-21、miRNA-22、miRNA-214和miRNA-543。为了明确牙周膜干细胞成骨分化的机制，发明人在先研究启示了特异性 lncRNA和circRNA可能作为ceRNA调节牙周膜干细胞成骨分化和影响牙周再生，并且证实了lncRNA TUG1通过与Lin28A相互作用促进牙周膜干细胞的成骨分化。为了进一步确认circRNA与牙周膜干细胞成骨分化的关系，本公开通过生物信息学方法预测了与miRNA-21相关的circRNA，并筛选确认circRNA PRKD3在牙周膜干细胞成骨分化中具有调节作用。

本公开第一方面，提供circRNA PRKD3作为牙周膜干细胞成骨分化诱导剂的应用。

在一些实施例中，所述应用包括circRNA PRKD3作为牙周膜干细胞中ALP或Runx2激动剂的应用。

在一些实施例中，所述应用还包括作为牙周膜干细胞矿化诱导剂的应用。

在一些实施例中，所述circRNA PRKD3为circBase中登记号为 PRKD3_hsa_circ_000302的序列。

本公开第二方面，提供circRNA PRKD3沉默试剂作为牙周膜干细胞成骨分化抑制剂的应用。

在一些实施例中，所述circRNA PRKD3沉默试剂包括沉默转染质粒。

优选的，所述沉默传染质粒为慢病毒转染质粒。

本公开第三方面，提供circRNAPRKD3检测试剂在制备牙周膜干细胞成骨分化水平试剂盒中的应用。

在一些实施例中，所述circRNAPRKD3检测试剂为PCR检测试剂。

优选的，所述PCR检测试剂中包括一组引物序列，所述引物序列包括HumancircRNA PRKD3 divergent primer及Human circRNA PRKD3 convergent primer；

所述Human circRNA PRKD3 divergent primer序列如下：

Forward primer(5′-3′)：CCATTGAAGCCCAGGAAC

Reverse primer(5′-3′)：GCTGATGCTTTCTGACATATAG；

所述Human circRNA PRKD3 convergent primer序列如下：

Forward primer(5′-3′)：AGGACTGAAATGTGAAGGCTGT

Reverse primer(5′-3′)：GGCTGTAGGGGTCTTGGAAC。

进一步优选的，所述引物序列中还包括内参引物，所述内参引物为GAPDH，所述内参引物序列如下：

Forward primer(5′-3′)：TCATGGGTGTGAACCATGAGAA

Reverse primer(5′-3′)：GGCATGGACTGTGGTCATGAG。

本公开第四方面，提供circRNA PRKD3作为牙周膜干细胞成骨分化能力评判标志物的应用。

本公开第五方面，提供一种治疗牙周缺损方法，所述方法通过将circRNA PRKD3转入缺损部位的牙周膜中。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

一、人牙周膜干细胞的体外分离培养及鉴定

1.细胞培养

1.1原代细胞培养

本实施例采用组织块法分离培养人牙周膜干细胞(human periodontal ligamentstem cells,hPDLSCs)，取材人群为12-20岁无系统性疾病及口腔疾病的患者。在获取患者及其家属的知情同意后，将刚拔除的健康完整的正畸牙或第三磨牙置于含5％双抗PBS的离心管中。在超净工作台中用含2％双抗PBS冲净牙根表面的血污，冲洗干净后用一次性无菌刀片刮取牙根表面根中1/3部分的牙周膜至含1％双抗PBS 的8cm²细胞培养皿中，组织块大小约4-9mm2，用含1％双抗的PBS冲洗组织块3-4次，小心吸除组织块表面的液体，后用无菌探针将组织块均匀贴附于25cm²培养瓶底壁，加入4-5ml细胞培养液(含20％FBS 和1％双抗α-MEM)中。将培养瓶底朝上置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3-4h后小心翻转培养瓶至底朝下，使培养基覆盖所有组织块表面。7d后显微镜下观察并记录组织块周围分离出细胞的生长情况，待细胞开始生长后每3d更换一次培养基(含20％FBS的无双抗α-MEM)。原代细胞标记为P0，形态如图1A所示，培养10-14d后，组织块周围聚集大量细胞，且呈放射状生长，细胞形态为均一的长梭形，边缘清晰。

1.2传代细胞培养

当原代细胞生长至70％-80％融合状态时，在超净工作台中用 37℃、含1％双抗的PBS冲洗3遍后(动作轻柔，勿冲洗掉牙周膜组织块)，加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化，37℃培养箱放置1-2min后(中途可于显微镜下观察消化情况)，显微镜下观察细胞回缩变圆后，立即加入1ml含10％FBS细胞培养液中和，轻柔吹打形成细胞悬液， 1000rpm离心5min，弃去上清液，用含10％FBS细胞培养液重悬细胞。根据细胞量按1:1-2传代培养，每3d换一次液，记为P1。传代细胞生长至80％融合状态时继续按上述方法进行1:3传代培养，依次记为P2、P3、P4，如图1B所示。

2.流式细胞仪测定间充质干细胞表型

选取处于对数生长期的hPDLSCs(P2)，PBS冲洗三遍，去净培养瓶中残留的培养基，按上述方法消化离心后加入PBS再次离心后，用PBS重悬细胞，轻柔吹打混匀，用细胞计数仪计数后离心，后用 PBS调节细胞浓度至5×10⁷/ml,取5个1.5ml EP管，每个管中加入100ul重悬细胞液，即每管含5×10⁶个细胞，然后避光条件下每管分别加入 5μl CD34,CD45,CD90,CD105，对照组加入5ul PBS，混匀后避光孵育 1h，离心，加入1ml PBS洗涤离心一次后，去除上清液并加入500μl PBS形成细胞悬液，放置于流式管中进行上机测量。流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志CD90与CD105的表达及阴性标志CD45与 CD34的表达，CD90阳性率为99.2％(图2C)，CD105的阳性率为 99.9％(图2D)，CD45的阳性率仅为0.044％(图2B),CD34的阳性率仅为0.027％(图2A)。这一结果表明培养的hPDLSCs符合间充质干细胞表面标志的表达，本实施例中成功分离得到了牙周膜干细胞。

3.成骨诱导及ALP染色、茜素红染色

将对数生长期的hPDLSCs(P3)以1×10⁵/孔接种于12孔板中，每孔加入1.5ml含10％FBS的细胞培养液后置于培养箱中培养，每3d 换一次液。当细胞融合至80％时，去除原培养液，PBS冲洗三遍，成骨诱导组每孔加入1.5ml成骨诱导液诱导hPDLSCs成骨向分化，对照组每孔加入1.5ml正常的细胞培养液，每3d换一次液。成骨诱导 7d后，进行ALP染色。弃原培养液，用PBS冲洗3遍，每孔加入 1ml 4％多聚甲醛固定液，固定30min。弃固定液后PBS冲洗3遍，每孔加入1ml ALP染液避光染色15min。弃ALP染液，用PBS冲洗3遍。将12孔板置于显微镜下观察染色效果并拍照。

将对数生长期的hPDLSCs(P3)以2×10⁵/孔接种于6孔板中，每孔加入2ml培养液后置于培养箱中培养，每3d换一次液。当细胞融合至80％时，去除培养基，成骨诱导组每孔加入2ml成骨诱导液诱导细胞成骨向分化，对照组每孔加入2ml正常的细胞培养液，每3d换一次液。成骨诱导14d后，进行茜素红染色。弃培养基，用PBS冲洗3 次，每孔加入1ml 4％多聚甲醛溶液，固定30min后弃多聚甲醛溶液， PBS冲洗3次后，每孔加入1ml 2％茜素红染液，室温染色10min。弃茜素红染液，用三蒸水洗3次。将6孔板置于显微镜下观察染色效果并拍照。

成骨诱导7d后进行ALP染色，肉眼及显微镜下可观察到成骨诱导组约70％hPDLSCs呈红色且着色较深(图3B，D)，对照组 hPDLSCs红色不足10％且着色较浅(图3A，C)。这一结果表明成骨诱导组ALP表达水平比对照组ALP表达水平明显增多增强。ALP 表达水平的升高是hPDLSCs成骨向分化的早期标志。

成骨诱导14d后进行茜素红染色，肉眼可观察到成骨诱导组 hPDLSCs红染明显，显微镜下可见大量的矿化结节形成(图4B，D)，而对照组未观察到矿化结节(图4A，C)。矿化结节的形成是hPDLSCs 成骨向分化的晚期标志。

ALP染色及茜素红染色结果均表明成骨诱导后，hPDLSCs可成骨向分化。

4.成脂诱导及油红O染色

将对数生长期的hPDLSCs(P3)以2×10⁵/孔接种于6孔板中，每孔加入2ml常规的含10％FBS的细胞培养液后置于培养箱中培养，每 3d换一次液。当细胞融合至80％时，弃培养液后PBS冲洗三遍，每孔加入2ml成脂诱导液诱导细胞成脂向分化，每3d换一次液。成脂诱导14d后，进行油红O染色。弃培养基，用PBS冲洗3次，每孔加入1ml 4％多聚甲醛溶液，固定30min。弃多聚甲醛溶液，PBS冲洗3次后，每孔加入1ml油红O染液，室温染色10min。弃油红O染液，加入1ml 70％乙醇漂洗以去除多余油红O染色液，PBS洗3 次。将6孔板置于显微镜下观察染色效果并拍照。

成脂诱导3d后，显微镜下可见成脂诱导细胞形态发生改变，由之前的长梭形逐渐变为椭圆形或多角形；成脂诱导6d后，镜下可看到成脂诱导细胞中有折光性高的小脂肪滴出现(图5B)；诱导14d后小脂肪滴增多，呈串珠状排列，油红O染色后，可观察到脂滴被染成红色(图5C)。这一结果表明hPDLSCs具有成脂向分化能力。

上述实验结果表明，本实施例中分离得到的hPDLSCs在成骨分化诱导作用下能够表现出成骨特性，可作为良好的实验模型。

二、与牙周膜干细胞成骨分化相关的环状RNA

本实施例中，基于starbase数据库(http://www.starbase.sysu.edu.cn) 预测与miRNA 21相关的circRNA，得到如表1所示的15个 circRNA。

表1.生物信息学预测与miRNA-21相关的circRNA

通过GO分析与及KEGG富集性分析这15个circRNA片段大小及其亲本基因(parentgene)的功能，筛选出7个circRNA(RSF1、 HECA、DDB2、PRKD3、KIAAO146、C3orf23、DNMT3B)，如表2所示。

表2.circRNA引物序列

为了进一步筛选circRNA，本实施例将7个差异表达circRNA进行qRT-PCR检测。根据circRNA环状衔接处的序列设计并合成特异性引物。qRT-PCR结果表明这7个差异表达circRNA的差异性表达 (图6，B)。与对照组相比，诱导组中circRNA PRKD3表达上调，circRNA C3orf23、HECA、KIAA0146、DNMT3B、UGGT1和RSF1 表达下调，且circRNA PRKD3表达差异较明显。

三、circRNA PRKD3对牙周膜干细胞成骨向分化的影响

1.引物扩增产物鉴定确为circRNA PRKD3

1)琼脂糖凝胶电泳验证circRNA PRKD3的环状结构

根据circRNA PRKD3序列设计干扰RNA(shRNA)，设计了两条干扰片段序列分别为1#AAAGGCTAACTATATGTCAGA；2# TATCAAAAGGCTAACTATATG。将构建shRNA载入质粒包装到慢病毒GV248载体中，并构建阴性对照慢病毒载体。慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司进行构建及包装。病毒序列如表3所示。

表3病毒序列

根据circRNA PRKD3的序列信息设计divergent primer和 convergent primer两种引物。按照DNA提取试剂盒说明书，提取正常培养hPDLSCs的gDNA，-20℃保存备用。Trizol法提取正常培养 hPDLSCs的总RNA，逆转录成cDNA，-20℃保存备用。向提取的 gDNA及cDNA中分别加入GAPDH引物及circRNA PRKD3两种引物(表4)、SYBR Green I、RNase Free dH₂O进行PCR扩增，并将 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

表4引物序列

如图7所示，divergent primer用于circRNA PRKD3环状衔接处序列的PCR扩增，convergent primer用于circRNA PRKD3非环状衔接处序列的PCR扩增，同时用GAPDH作为对照。琼脂糖凝胶电泳结果显示两种引物扩增的产物均为单一条带，且条带的大小与引物扩增长度一致。

2.沉默circRNA PRKD3后hPDLSCs的成骨向分化能力降低

1)转染circRNA PRKD3干扰慢病毒后circRNA PRKD3表达降低

如图8B-D所示，转染circRNA PRKD3阴性对照病毒及干扰慢病毒后，表达GFP荧光的hPDLSCs约占80％左右，这一结果表明慢病毒转染效率高，为后续实验提供了很好的实验基础。qRT-PCR进一步检测circRNA PRKD3的表达量，与正常组及阴性对照组相比，沉默组circRNA PRKD3-1#的表达量下降了86.7％左右,沉默组circRNA PRKD3-2#的表达量下降了56％左右(图8E)。这一结果表明circRNA PRKD3-1#干扰慢病毒有效敲低了circRNA PRKD3的表达。

2)成骨诱导后沉默组hPDLSCs ALP表达降低

成骨诱导7d后进行ALP染色，图9表明肉眼及显微镜下可观察到成骨诱导组比非诱导组红染明显增强，即ALP表达明显升高；成骨诱导的三组中，与正常组及阴性对照组相比，敲减组ALP表达明显降低。

3)成骨诱导后沉默组hPDLSCs形成的矿化结节减少

成骨诱导14d后进行茜素红染色观察矿化结节的形成及CPC定量钙离子的浓度检测钙化水平。图10表明肉眼及显微镜下可观察到成骨诱导组形成的矿化结节明显多于非诱导组形成的矿化结节；成骨诱导的三组中，沉默组形成的矿化结节少于正常组及阴性对照组。CPC定量结果也表明成骨诱导后，与正常组及阴性对照组相比，敲基因组的钙离子浓度明显减少(图11B)，这一结果与茜素红染色结果一致。

4)成骨诱导后沉默组hPDLSCs ALP活性及成骨关键基因的表达降低

成骨诱导7d后进行ALP活性测定，图11A表明成骨诱导组ALP 活性明显比非成骨诱导组强；成骨诱导的三组中，与正常组及阴性对照组相比，沉默组ALP活性明显降低，这一结果与ALP染色结果一致。

成骨诱导0d，3d，7d和14d后qRT-PCR检测成骨关键基因ALP、 Runx2的表达。结果显示成骨诱导3d、7d和14d后ALP、Runx2表达逐渐升高；与正常组及阴性对照组相比，成骨诱导7d、14d后，敲减circRNA PRKD3组ALP、Runx2表达明显降低(图11C-D)。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.circRNA PRKD3作为牙周膜干细胞成骨分化诱导剂的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括circRNA PRKD3作为牙周膜干细胞中ALP或Runx2激动剂的应用，或作为牙周膜干细胞矿化诱导剂的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述circRNA PRKD3为circBase中登记号为PRKD3_hsa_circ_000302的序列。

4.circRNA PRKD3沉默试剂作为牙周膜干细胞成骨分化抑制剂的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述circRNA PRKD3沉默试剂包括沉默转染质粒；优选的，所述沉默传染质粒为慢病毒转染质粒。

6.circRNA PRKD3检测试剂在制备牙周膜干细胞成骨分化水平试剂盒中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述circRNA PRKD3检测试剂为PCR检测试剂；优选的，所述PCR检测试剂中包括一组引物序列，所述引物序列包括Human circRNAPRKD3 divergent primer及Human circRNA PRKD3 convergent primer；

所述Human circRNA PRKD3 divergent primer序列如下：

Forward primer(5′-3′)：CCATTGAAGCCCAGGAAC

Reverse primer(5′-3′)：GCTGATGCTTTCTGACATATAG；

所述Human circRNA PRKD3 convergent primer序列如下：

Forward primer(5′-3′)：AGGACTGAAATGTGAAGGCTGT

Reverse primer(5′-3′)：GGCTGTAGGGGTCTTGGAAC。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述引物序列中还包括内参引物，所述内参引物为GAPDH，所述内参引物序列如下：

Forward primer(5′-3′)：TCATGGGTGTGAACCATGAGAA

Reverse primer(5′-3′)：GGCATGGACTGTGGTCATGAG。

9.circRNA PRKD3作为牙周膜干细胞成骨分化能力评判标志物的应用。

10.一种治疗牙周缺损方法，所述方法通过将circRNA PRKD3转入缺损部位的牙周膜中。