CN110564865A - 一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA及其应用，该circRNA的circbase ID为hsa_circ_0006618。经分析该环状RNA hsa‑circ‑0006618的表达水平与成骨分化的相关性，结果显示环状RNA hsa‑circ‑0006618在成骨分化样本中上调。通过对circRNA进行靶基因预测，表明其参与成骨分化通路，因此针对此circRNA的检测制剂用于预测人脂肪干细胞向成骨细胞分化，同时环状RNA hsa‑circ‑0006618诱导人脂肪干细胞向成骨细胞分化可用于骨创伤的修复，有助于临床治疗。

Description

一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA及其应用

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞成骨分化circRNA差异性表达谱及其筛选应用。

背景技术：

脂肪干细胞(adipose Derived Stem Cells，ADSCs)最近几年引起了广泛的关注。与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)相比，脂肪干细胞来源广泛、含量较多、获取方式简单、患者承受的痛苦也较少。脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞一样，具有多项分化的能力，能表达相同的表面标志物，具有相似的基因结构以及相同的分化潜能。所以，在适当的环境下，脂肪干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞以及肌细胞等。ADSCs具有多向分化能力和较明确的成骨潜能，因此成为骨组织工程中重要的种子细胞。自发现ADSCs以来，人们对ADSCs做了大量研究，尤其在它的来源(去分化)和多向分化效率上，这些研究都旨在明确ADSCs能否结合细胞组织工程从而解决人类疾病问题。而在ADSCs的多向分化潜能上，它的多向分化机制不详决定了它的分化效率低下从而直接限制它的应用。

环状RNA是一类特殊的非编码RNA，具有环状结构的，在诸多生命活动中发挥着重要的调控作用。它最早于1976年被发现存在于类病毒RNA中，并于1979年被发现存在于在真核细胞的细胞质中。随着研究的深入，发现环状RNA广泛的、稳定的、保守的、多样的存在于真核生物体中，使RNA家族的内容大大丰富，已成为非编码RNA研究领域的热点新星。今年来有研究着重研究环状RNA在干细胞的成骨分化过程中的重要作用。

发明内容：

本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA及其应用。为了研究环状RNA在脂肪干细胞成骨分化过程的差异表达谱，从而找出一条对于人脂肪干细胞成骨分化至关重要的环状RNA，探讨其在再生医学领域的应用，涉及干细胞与再生医学、分子生物学和转录组学，重点涉及应用微阵列芯片分析脂肪干细胞成骨分化过程中circRNA的差异表达，筛选出一条在成骨分化中高表达的环状RNA为hsa_circ_0006618，并提供其用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA，其circbase ID为hsa_circ_0006618。

一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，是由如该序列所示的序列首尾连接成的环状结构。

所述的环状RNA hsa-circ-0006618在制备人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂中的应用。

所述的诊断试剂中包括检测环状RNA hsa-circ-0006618表达量的实时荧光定量PCR检测试剂。

所述实时荧光定量PCR检测试剂包括实时荧光定量PCR的特异性引物：

环状RNA hsa-circ-0006618特异性正向引物：

5’CCAGAATGACAAGCATACTGGC 3’

环状RNA hsa-circ-0006618特异性反向引物：

5’TTCCTTTAACTTCATCCTGCTGG 3’

所述的环状circRNA-0006618基因在制备人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂中的应用，该环状RNA基因作为人脂肪干细胞向成骨细胞分化的标记物。

所述的环状circRNA-0006618基因在制备治疗骨创伤修复药物中的应用。

利用所述的环状RNA hsa-circ-0006618制备的人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂盒，所述的环状RNA hsa-circ-0006618用于诱导人脂肪干细胞向成骨细胞分化。

所述的试剂盒包括：

内参GAPDH的特异性正向引物：

5’GGGAAACTGTGGCGTGAT3’

内参GAPDH的特异性反向引物：

5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3’。

本发明的有益效果：

本发明检测了环状RNA hsa-circ-0006618在分化前和分化样本中的表达，并分析了环状RNA hsa-circ-0006618的表达水平与成骨分化的相关性。其具体手段为：分化前和分化样本中提取RNA，然后逆转录成cDNA，进行实时定量PCR，检测环状RNA hsa-circ-0006618的表达。结果显示环状RNA hsa-circ-0006618在成骨分化样本中上调。通过对circRNA进行靶基因预测，表明其参与成骨分化通路，因此针对此circRNA的检测制剂可用于预测人脂肪干细胞向成骨细胞分化，同时环状RNA hsa-circ-0006618诱导人脂肪干细胞向成骨细胞分化可用于骨创伤的修复，有助于临床治疗。

附图说明：

图1为流式分析法检测脂肪干细胞的表面标记物；

图2为脂肪干细胞成骨诱导7天进行茜素红染色结果；

图3为微阵列芯片分析差异表达circRNA的热图；

图4为上调差异表达circRNA靶基因的GO富集结果图；

图5为上调差异表达circRNA靶基因的KEGG富集结果图；

图6为利用实时荧光定量PCR的方法检测成骨分化样本中hsa-circ-0006618的表达水平。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种脂肪干细胞成骨分化相关环状RNA，其circbase ID为hsa_circ_0006618。

一种脂肪干细胞成骨分化相关环状RNA，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，是由如该序列所示的序列首尾连接成的环状结构。

所述的环状RNA hsa-circ-0006618在制备人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂中的应用。

所述的诊断试剂中包括检测环状RNA hsa-circ-0006618表达量的实时荧光定量PCR检测试剂。

所述实时荧光定量PCR检测试剂包括实时荧光定量PCR的特异性引物：

环状RNA hsa-circ-0006618特异性正向引物：

5’CCAGAATGACAAGCATACTGGC 3’

环状RNA hsa-circ-0006618特异性反向引物：

5’TTCCTTTAACTTCATCCTGCTGG 3’

所述的环状circRNA-0006618基因在制备人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂中的应用，该环状RNA基因作为人脂肪干细胞向成骨细胞分化的标记物。

所述的环状circRNA-0006618基因在制备治疗骨创伤修复药物中的应用。

利用所述的环状RNA hsa-circ-0006618制备的人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂盒，所述的环状RNA hsa-circ-0006618用于诱导人脂肪干细胞向成骨细胞分化。

所述的试剂盒包括：

内参GAPDH的特异性正向引物：

5’GGGAAACTGTGGCGTGAT3’

内参GAPDH的特异性反向引物：

5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3’。

实施例1

1.人脂肪干细胞成骨分化的关键circRNA筛选方法：

(1)取三个不同健康成年女性经腹部抽脂获得的脂肪，三个不同来源的人脂肪干细胞是用以下方法制备得到的：

取腹部脂肪组织储存于20mL无菌注射器中备用，并冰袋保存。脂肪组织以1000rpm/5min在50mL离心管中离心，去除下层液体。脂肪组织以1：1的比例与0.2％的I型胶原酶在37℃环境下摇床消化40分钟，静置后可见其分成三层。移出上层油脂层，进行充分震荡和过滤(200目滤网)。随后1000rmp/5min三次进行离心移出上层液体，可见其中的细胞沉淀。用细胞培养液将细胞吹打均匀。随后将细胞接种于培养皿中，密度为5×105/mL。随后将细胞放入37℃、5％CO2、95％湿度的培养箱中。传代培养至第三代，获得第三代脂肪干细胞。

(2)对三个不同来源人脂肪干细胞进行流式细胞检测：

流式细胞仪对第3代脂肪干细胞表面相对特异性抗原进行检测。流式分析法检测脂肪干细胞的表面标记物如图1所示；将hADSCs在PBS中洗涤三次，细胞悬浮液与FITC-CD73，CD44，CD105，CD34，CD45，CD31的荧光抗体在黑暗中在37℃下孵育30分钟，然后洗涤并重悬。上机测定抗原的阳性率。根据中国医药生物技术协会关于《脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识》，本实验细胞符合间充质干细胞的表面标记特点。

(3)对三个不同来源人脂肪干细胞进行成骨分化诱导：

对步骤(1)的三个不同来源的人脂肪干细胞，获得三组成骨分化前样本，分别相应进行成骨诱导操作，获得三组成骨分化样本，成骨分化结果如图2所示，可见细胞中的矿化结节被茜素红染成红色；

(4)总RNA提取：

将步骤(3)收集的三组成骨分化前和分化样本，分别相应进行各自总RNA提取操作；获得六组总RNA；

(5)微阵列芯片检测：

采用上海康成生物工程有限公司代理的ArrayStar公司的circRNA芯片产品(Arraystar Human circRNA Array V2)对六组总RNA进行检测，筛选出14条在成骨分化样本中差异性表达的环状RNA，通过微阵列芯片分析该差异表达circRNA的热图如图3所示。

(6)三样本circRNA比对进行表达差异分析：

根据(5)统计得到的脂肪干细胞成骨分化中circRNA的表达结果比对，进行差异分析，差异标准为fold change＞2；P＜0.05，筛选出显著差异表达的circRNA，并记录差异表达结果。对差异表达的circRNA靶基因进行功能富集和信号通路分析，进一步筛查出与成骨分化相关的circRNA。

2.结果

成骨分化前和分化样本相比，差异表达且可能参与成骨分化的circRNA共14个，如表1所示，并预测了与其结合发挥作用的microRNA，呈上调趋势的circRNA为7个，呈下调趋势的circRNA为7个，上调差异表达circRNA靶基因的GO富集结果图如图4所示，上调差异表达circRNA靶基因的KEGG富集结果图如图5所示。

实施例2

实时荧光定量法检测证实hsa-circ-0006618在成骨分化样本中表达上调。

1.材料与方法:

Trizol(Invitrogen)

RNA酶抑制剂(Epicentre)

SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(Invitrogen)

5×RT缓冲液(Invitrogen)

2.5mM dNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTest Ltd)

Primer(英骏生物技术有限公司)

2X PCR master mix(Arraystar)

环状RNA hsa-circ-0006618特异性正向引物：

5’CCAGAATGACAAGCATACTGGC 3’

环状RNA hsa-circ-0006618特异性反向引物：

5’TTCCTTTAACTTCATCCTGCTGG 3’

内参GAPDH的特异性正向引物：

5’GGGAAACTGTGGCGTGAT3’

内参GAPDH的特异性反向引物：

5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3’

将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：

实时荧光定量PCR反应步骤如下：

95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。

反应结束后，确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用T检验计算P值。

2.结果

利用实时荧光定量PCR的方法检测成骨分化样本中hsa-circ-0006618的表达水平，其结果见图6，从图6中，Non-induced为成骨分化前样本，Induced为成骨分化样本，从结果可以得出，与成骨分化前样本相比，hsa-circ-0006618在成骨分化样本中的表达上调，表达量是成骨分化前的2.7倍(p<0.05有统计学意义)，即环状RNA hsa-circ-0006618在成骨分化样本中表达高，而在正常组织中表达低。

采用相同方法对其余13条差异表达circRNA进行实时荧光定量检测，结果和微阵列芯片检测结果不相符，(p>0.05)因此予以排除。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明任何形式上的和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含的本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国医科大学附属第一医院

<120> 一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4297

<212> DNA

<213> hsa-circ-0006618基因的cDNA序列(Unknown)

<400> 1

gaatgctggg agagtccgac gagcgctgca ctaacgcagg atccggctgc cgaaggtccc 60

gccagcagga tgaagttaaa ggaagtagat cgtacagcca tgcaggcatg gagccctgcc 120

cagaatcacc ccatttacct agcaacagga acatctgctc agcaattgga tgcaacattt 180

agtacgaatg cttcccttga gatatttgaa ttagacctct ctgatccatc cttggatatg 240

aaatcttgtg ccacattctc ctcttctcac aggtaccaca agttgatttg ggggccttat 300

aaaatggatt ccaaaggaga tgtctctgga gttctgattg caggtggtga aaatggaaat 360

attattctct atgatccttc taaaattata gctggagaca aggaagttgt gattgcccag 420

aatgacaagc atactggccc agtgagagcc ttggatgtga acattttcca gactaatctg 480

gtagcttctg gtgctaatga atctgaaatc tacatatggg atctaaataa ttttgcaacc 540

ccaatgacac caggagccaa aacacagccg ccagaagata tcagctgcat tgcatggaac 600

agacaagttc agcatatttt agcatcagcc agtcccagtg gccgggccac tgtatgggat 660

cttagaaaaa atgagccaat catcaaagtc agtgaccata gtaacagaat gcattgttct 720

gggttggcat ggcatcctga tgttgctact cagatggtcc ttgcctccga ggatgaccgg 780

ttaccagtga tccagatgtg ggatcttcga tttgcttcct ctccacttcg tgtcctggaa 840

aaccatgcca gggggatttt ggcaattgct tggagcatgg cagatcctga attgttactg 900

agctgtggaa aagatgctaa gattctctgc tccaatccaa acacaggaga ggtgttatat 960

gaacttccca ccaacacaca gtggtgcttc gatattcagt ggtgtccccg aaatcctgct 1020

gtcttatcag ctgcttcgtt tgatgggcgt atcagtgttt attctatcat gggaggtagc 1080

acagatggtt taagacagaa acaagttgac aagctttcat catcttttgg gaatcttgat 1140

ccctttggca caggacagcc ccttcctccg ttacaaattc cacagcagac tgctcagcat 1200

agtatagtgc tgcctctgaa gaagccgccc aagtggattc gaaggcctgt tggtgcttct 1260

ttttcatttg gaggcaaact ggttacgttt gagaatgtca gaatgccttc tcatcaggga 1320

gctgagcagc agcagcagca gcaccatgtg ttcattagtc aggttgtaac agaaaaggag 1380

ttcctcagcc gatcagacca acttcagcag gctgtgcagt cacaaggatt tatcaattat 1440

tgccaaaaaa aaattgatgc ttctcagact gaatttgaga aaaatgtgtg gtcctttttg 1500

aaggtaaact ttgaggatga ttctcgtgga aaataccttg aacttctagg atacagaaaa 1560

gaagatctag gaaagaagat tgctttggcc ttgaacaaag tggatggagc caatgtggct 1620

cttaaagact ctgaccaagt agcacagagt gatggggagg agagccctgc tgctgaagag 1680

cagctcttgg gagagcacat taaagaggaa aaagaagaat ctgaatttct accctcatct 1740

ggaggaacat ttaatatctc tgtcagtggg gacattgatg gtttaattac tcaggctttg 1800

ctgacgggca attttgagag tgctgttgac ctttgtttac atgataaccg catggccgat 1860

gccattatat tggccatagc aggtggacaa gaactcttgg ctcgaaccca gaaaaaatac 1920

ttcgcaaaat cccaaagcaa aattaccagg ctcatcactg cagtggtgat gaagaactgg 1980

aaagagattg ttgagtcttg tgatcttaaa aattggagag aggctttagc tgcagtattg 2040

acttatgcaa agccggatga attttcagcc ctttgtgatc ttttgggaac caggcttgaa 2100

aatgaaggag atagcctcct gcagactcaa gcatgtctct gctatatttg tgcagggaat 2160

gtagagaaat tagttgcatg ttggactaaa gctcaagatg gaagccaccc tttgtcactt 2220

caggatctga ttgagaaagt tgtcatcctg cgaaaagctg tgcaactcac tcaagccatg 2280

gacactagta ctgtaggagt tctcttggct gcgaagatga gtcagtatgc caatttgttg 2340

gcagctcagg gcagtattgc tgcagccttg gcttttcttc ctgacaacac caaccagcca 2400

aatatcatgc agcttcgtga cagactttgt agagcacaag gagagcctgt agcaggacat 2460

gaatcaccta aaattccgta cgagaaacag cagctcccca agggcaggcc tggaccagtt 2520

gctggccacc accagatgcc aagagttcaa actcaacaat attatcccca tggagaaaat 2580

cctccacctc cgggtttcat aatgcatgga aatgttaatc caaatgctgc tggtcagctt 2640

cccacatctc caggtcatat gcacacccag gtaccacctt atccacagcc acagccttat 2700

caaccagccc agccgtatcc cttcggaaca ggggggtcag caatgtatcg acctcagcag 2760

cctgttgctc ctcctacttc aaacgcttac cctaacaccc cttacatatc ttctgcttct 2820

tcctatactg ggcagtctca gctgtacgca gcacagcacc aggcctcttc acctacctcc 2880

agccctgcta cttctttccc tcctccccct tcctctggag catccttcca gcatggcgga 2940

ccaggagctc caccatcatc ttcagcttat gcactgcctc ctggaacaac aggtacactg 3000

cctgctgcca gtgagctgcc tgcgtcccaa agaacaggtc ctcagaatgg ttggaatgac 3060

cctccagctt tgaacagagt acccaaaaag aagaagatgc ctgaaaactt catgcctcct 3120

gttcccatca catcaccaat catgaacccg ttgggtgacc cccagtcaca aatgctgcag 3180

caacagcctt cagctccagt accactgtca agccagtctt cattcccaca gccacatctt 3240

ccaggtggcc agcccttcca tggcgtacag caacctcttg gtcaaacagg catgccacca 3300

tctttttcaa agcccaatat tgaaggtgcc ccaggggctc ctattggaaa taccttccag 3360

catgtgcagt ctttgccaac aaaaaaaatt accaagaaac ctattccaga tgagcacctc 3420

attctaaaga ccacatttga ggatcttatt cagcgctgcc tttcttcagc aacagaccct 3480

caaaccaaga ggaagctaga tgatgccagc aaacgtttgg agtttctgta tgataaactt 3540

agggaacaga cactttcacc aacaatcacc agtggtttac acaacattgc aaggagcatt 3600

gaaactcgaa actactcaga aggattgacc atgcataccc acatagttag caccagcaac 3660

ttcagtgaga cctctgcttt catgccagtt ctcaaagttg ttctcaccca ggccaataag 3720

ctgggtgtct aaaaggacag cttctcttcc actcaatatt gccatttttc caaagaaaca 3780

tgttaaaaaa aaaaattata agacatggac tagtcctcat tagcatgttt gcatagcaac 3840

cagtcaagag catttacact atttctgctg atatactcac cttagaactg ctcagaaccc 3900

tggtgcttta tttttgtttt aatcttttgt tgccagtgat gattttccta ttctgcaaat 3960

agtgtatttc ctggattaca catagtatgg tttcctgaag tattctgata aatgtgtttt 4020

ttaaaacctc aatatacttt ttagaaaagg agcatctggt tatgcataaa gcagagctaa 4080

aactaaattt ctttcatgtc ctccctactt cctcagtgtc aatcagatta aagtgtgtaa 4140

tcctatttta tgtgtgtata gtcttttttg aaacagctgc ttaaaattta gtttattttt 4200

tgtgtcttag gattcctgag taaataacta catctacaaa ctgctacatg ggttttagca 4260

gatattaata aaaatgggat cactggcttt aactata 4297

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> hsa-circ-0006618的特异性正向引物(Unknown)

<400> 2

ccagaatgac aagcatactg gc 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> hsa-circ-0006618的特异性反向引物(Unknown)

<400> 3

ttcctttaac ttcatcctgc tgg 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 内参GAPDH的特异性正向引物(Unknown)

<400> 4

gggaaactgt ggcgtgat 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 内参GAPDH的特异性反向引物(Unknown)

<400> 5

gagtgggtgt cgctgttga 19

Claims (9)

1.一种脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA，其特征在于，其circbase ID为hsa_circ_0006618。

2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞成骨分化相关的circRNA，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，是由如该序列所示的序列首尾连接成的环状结构。

3.权利要求1所述的circRNA hsa-circ-0006618在制备人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的circRNA hsa-circ-0006618在制备人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂中包括检测circRNA hsa-circ-0006618表达量的实时荧光定量PCR检测试剂。

5.根据权利要求4所述的circRNA hsa-circ-0006618在制备人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测试剂包括实时荧光定量PCR的特异性引物：

circRNA hsa-circ-0006618特异性正向引物：

5’CCAGAATGACAAGCATACTGGC 3’

circRNA hsa-circ-0006618特异性反向引物：

5’TTCCTTTAACTTCATCCTGCTGG 3’。

6.权利要求1所述的circRNA hsa-circ-0006618基因在制备人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂中的应用，其特征在于，该circRNA基因作为人脂肪干细胞向成骨细胞分化的标记物。

7.权利要求1所述的circRNA hsa-circ-0006618基因在制备治疗骨创伤修复药物中的应用。

8.利用权利要求1所述的circRNA hsa-circ-0006618制备的人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂盒，其特征在于，所述的circRNA hsa-circ-0006618用于诱导人脂肪干细胞向成骨细胞分化。

9.根据权利要求8所述的利用circRNA hsa-circ-0006618制备的人脂肪干细胞向成骨细胞分化的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

内参GAPDH的特异性正向引物：

5’GGGAAACTGTGGCGTGAT3’

内参GAPDH的特异性反向引物：

5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3’。