CN109136333A - 鉴别eb病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法及其应用 - Google Patents

鉴别eb病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法及其应用 Download PDF

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CN109136333A CN201811104244.9A CN201811104244A CN109136333A CN 109136333 A CN109136333 A CN 109136333A CN 201811104244 A CN201811104244 A CN 201811104244A CN 109136333 A CN109136333 A CN 109136333A
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Abstract

本发明提供了一种鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法及其应用，涉及医学检测技术领域，本发明通过将探针与预处理后的外周血提取的单个核细胞混合，杂交后采用流式细胞计量术采集和分析，能够鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例。通过该方法不仅可以准确找出EBV感染的细胞类型，还可以找出EBV感染细胞占该群细胞的比例，有助于临床针对EBV感染的细胞类型和占比制定针对性的治疗方案，对EBV感染造成的疾病进行高效、准确的治疗，对实施正确的治疗，提高患者的预后有重要作用。

Description

鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比 例的方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其是涉及一种鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法及其应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属于4型疱疹病毒，与传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)、EBV相关淋巴组织增殖性疾病(Epstein-Barr virusrelated lymphoproliferative disorders，EBV-LPD)、 Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌等多种疾病密切相关外，还与慢性活动性EBV感染 (chronic active EBV infection syndrome，CAEBV)、EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(Epstein-Barr virus relatedhemophagocytic lymphohistiocytosis，EBV-HLH)和EBV相关T淋巴细胞淋巴瘤 (Epstein-Barr virus genome positive T cell lymphoma)、NK细胞白血病/淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等疾病有关。
而噬血细胞综合征(Hemophagocytic Lymphohistiocytosis，HLH)是一种由各种致病因素引起的一种致死性疾病，主要病理机制是由于巨噬细胞和CTL细胞异常激活而引起的无效免疫反应导致高细胞因子血症，但具体详细的病理基础仍然未知。根据原发病的不同将HLH分为有基因缺陷的原发性噬血细胞综合征和与感染、肿瘤、风湿等引起的继发性噬血细胞综合征。在感染相关噬血细胞综合征中，Epstein–Barr virus(EBV，EB病毒) 相关HLH(EBV-HLH)是最常见的。国外Chellapandian等认为利妥昔单抗对控制EBV感染有帮助，这与国外EBV感染多为B细胞，且与利妥昔单抗作用于CD20+B细胞的机制相对应。
然而在亚洲EBV-HLH患者中，EBV更多地感染非B细胞，有研究认为EBV-HLH中EBV以感染CD8+T细胞为主，而CAEBV中以感染CD4+T 细胞和NK细胞为主，有研究指出CAEBV中，T细胞中EBV阳性的患者预后差，死亡率高，需要尽早进行造血干细胞移植。而目前国内通用的EBV-DNA的检测不能有效区分EBV感染的淋巴细胞类型及其感染细胞所占的比例。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，以缓解现有技术中存在的目前国内通用的EBV-DNA的检测不能有效区分EBV感染的淋巴细胞类型及其感染细胞所占的比例的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供上述方法在确定EBV感染疾病的治疗靶点中的应用。
本发明的第三个目的在于提供上述方法在指导制备治疗EBV感染的药物中应用。
本发明提供了一种鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，所述方法包括：
提供预处理后的外周血单个核细胞，将探针与所述预处理后的外周血单个核细胞混合，杂交后采用流式细胞计量术采集和分析，鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例；
其中，所述探针具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3 中的一种或多种所示的核苷酸序列。
进一步地，所述探针为混合探针，具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 和SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。
进一步地，所述预处理包括表面染色、固定处理和破膜处理。
进一步地，在所述外周血单个核细胞中加入带有染料标记的抗体进行表面染色。
进一步地，所述抗体包括抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD19抗体和抗CD56抗体。
进一步地，所述固定处理包括一次固定和二次固定；
进一步地，将所述外周血单个核细胞进行一次固定后进行破膜处理，在所述破膜处理后再进行二次固定。
进一步地，在所述杂交后还包括信号放大的步骤。
本发明还提供了上述的方法在确定EBV感染疾病的治疗靶点中的应用。
另外，本发明还提供了上述的方法在指导制备治疗EBV感染的药物中应用。
本发明提供了鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，通过将探针与预处理后的淋巴细胞混合，杂交后采用流式细胞计量术采集和分析，能够鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例。该方法操作简单，普适性强，检测结果准确。通过该方法不仅可以准确找出EBV感染的细胞类型，还可以找出EBV感染细胞占该群细胞的比例，明确是单群细胞感染还是多群细胞感染，有助于临床针对EBV感染的细胞类型和占比制定针对性的治疗方案，对EBV感染造成的疾病进行高效、准确的治疗。此外，应用本发明提供的鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，可以确定EBV 感染的靶细胞，能够指导靶向治疗EBV感染的药物的制备，对实施正确的治疗，提高患者的预后有重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的未加EBER样本的检测结果图；
图2为本发明实施例2提供的加入EBER样本的检测结果图；
图3A为本发明实施例3提供的该患者未加入EBER探针的CD19+B 细胞的空白对照管的检测结果图；
图3B为本发明实施例3提供的该患者加入EBER探针的CD19+B细胞的检测结果图；
图4A为本发明实施例3提供的该患者未加入EBER探针的CD3+T细胞的空白对照管的检测结果图；
图4B为本发明实施例3提供的该患者加入EBER探针的CD3+T细胞的检测结果图；
图5A为本发明实施例3提供的该患者未加入EBER探针的CD8+T细胞的空白对照管的检测结果图；
图5B为本发明实施例3提供的该患者加入EBER探针的CD8+T细胞的空白对照管的检测结果图；
图6A为本发明实施例3提供的该患者未加入EBER探针的CD4+T细胞的空白对照管的检测结果图；
图6B为本发明实施例3提供的该患者加入EBER探针的CD4+T细胞的空白对照管的检测结果图；
图7A为本发明实施例3提供的该患者未加入EBER探针的NK细胞的空白对照管的检测结果图；
图7B为本发明实施例3提供的该患者加入EBER探针的NK细胞的空白对照管的检测结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
本发明提供了一种鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，包括：
提供预处理后的淋巴细胞，将探针与所述预处理后的淋巴细胞混合，杂交后采用流式细胞计量术采集和分析，鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例；
其中，探针具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中的一种或多种所示的核苷酸序列。
本发明提供的鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，操作简单，普适性强，检测结果准确。通过该方法不仅可以准确找出EBV感染的细胞类型，还可以找出EBV感染细胞占该群细胞的比例，明确是单群细胞感染还是多群细胞感染，有助于临床针对EBV 感染的细胞类型和占比制定针对性的治疗方案，对EBV感染造成的疾病进行高效、准确的治疗。此外，应用本发明提供的鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，可以确定EBV感染的靶细胞，能够指导靶向治疗EBV感染的药物的制备，对实施正确的治疗，提高患者的预后有重要作用。
例如，是B细胞阳性，则可以用利妥昔单抗进行治疗，若是非B细胞的EBV感染，则需根据实际情况进行相应的临床治疗。
其中，可以单独使用具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为探针，也可以单独使用具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列作为探针，还可以单独使用具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列作为探针，或者使用具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列作为探针，或者使用具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列作为探针，或者使用具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列作为探针，另外，还可以使用具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列作为混合探针。
在一些优选的实施方式中，探针为混合探针，具有如SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
使用三种不同氨基酸序列的混合探针，能够更大程度的提高检测结果的准确性及可靠性。
在一些优选的实施方式中，预处理包括表面染色、固定处理和破膜处理。
在一些优选的实施方式中，在所述外周血单个核细胞中加入带有染料标记的抗体进行表面染色。
在一些优选的实施方式中，所述抗体包括抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD19抗体和抗CD56抗体。
在一些优选的实施方式中，固定处理包括一次固定和二次固定，将不同亚群分型的淋巴细胞进行一次固定后进行破膜处理，在破膜处理后再进行二次固定。
固定处理能够使细胞尽量保持细胞的固有形态和结构，减少或终止外源性酶和内源性酶的反应，保持细胞的抗原性，同时增强染色的作用。在破膜处理前后分别进行一次固定和二次固定，能够进一步加强固定的效果，提高检测的准确性。
破膜处理能够进一步提高标记抗体的表达量，同样起到提高检测的准确性的作用。
另外，本发明还提供了上述种鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法在确定EBV感染疾病的治疗靶点中的应用，以及在指导制备治疗EBV感染的药物中应用。
例如：检测治疗前后患者的EBV感染的细胞比例，评价药物治疗是否有效；或者，当检测到患者存在多群细胞感染时，通过检测患者的EBV感染的细胞比例，能够评价所使用的治疗手段是否能清除所有感染的淋巴细胞亚群，或是仅能清除某一群淋巴细胞，并且能够明确清除的效能。需要说明的是，本发明提供的鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，为非疾病的诊断与治疗目的。
为了进一步了解本发明的具体操作过程和有益效果，下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
如无特殊说明，本发明使用的试剂和仪器来源如下：
流式细胞仪(Beckman公司，cytoflex)、离心机(eppendorf，Minispin，德国)、冷冻离心机(eppendorf，5417R，德国)、涡旋振荡器(其林贝尔， VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、-20℃低温冰箱(SIMENS， KG21V41T1，德国)、-80℃低温冰箱(SANYO，MDF-1155，日本)、医用显微镜(OLYMPMS，PM-PB20型，日本)、电热恒温培养箱(SANYO， MCO-20AIC，日本)、15ml离心管(Corning，美国)、1.5ml EP管(AXYGEN，美国)。
ddH2O/RNase-free ddH2O(北京天跟生化科技有限公司)、人外周血淋巴细胞分离液(Sigma公司/美国)、破膜剂(Permeabilization Buffer 10×) (eBioscience)、Fixation/Permeabilization(eBioscience)、红细胞裂解液 (Solarbio,CAT#R1010)(Solarbio)、1×PBS(Solarbio,CAT#P1020)(北京Solarbio)。
Anti-Human CD3Alexa700(eBioscience,clone OKT3,CAT# 56-0037-42),Anti-Human CD8a eFluor 450(clone RPA-T8,CAT#48-0088-42), Anti-HumanCD4eFluor 506(eBioscience,clone RPA-T4,CAT#69-0049-42), Anti-Human CD19FITC(eBioscience,clone HIB19,CAT#11-0199-42), Anti-Human CD56(NCAM)710(eBioscience,clone CMSSB, CAT#46-0567-42)。
其余试剂均来自试剂盒PrimeFlow RNA Assay(REF EB16488)
实施例1淋巴细胞的预处理
一、提取人外周血单个核细胞(HPBMC)
1、空腹静脉血6mL，置于EDTA抗凝的无菌试管中，用PBS稀释1 倍后用淋巴细胞分离液分离PBMC(2000转20分钟)；
2、吸取中间白膜层，加入10mL PBS，1400rpm，10min洗涤并沉淀 PBMC；
3、弃上清，加入2mL红细胞裂解液(索莱宝红细胞裂解液货号： Cat#R1010)裂解，混匀，室温下孵育5分钟；
4、充分混匀后，吸取20μL细胞用2％的冰醋酸按1：3稀释后，用细胞计数仪进行第一次读数，并记录读数；
5、加满PBS，1400rpm离心10min后弃上清，即得到人外周血单个核细胞。
二、人外周血单个核细胞的表面染色
1、吸取5×106个细胞放入流式管中，分别加入Anti-Human CD3-AF-700 5μL,Anti-Human CD4 eFluor450 5μL，Anti-Human CD8 eFluor506 5μL, Anti-Human CD19FITC 5μL,Anti-Human CD56-PE 5μL，FVD APC-eFluor780 1μL；
2、室温避光孵育20分钟，加入2mL PBS洗涤，1400转5分钟，洗涤两次。
三、细胞固定与破膜
1、准备Fix Buffer 1，需要将FixBuffer1A(颠倒混匀)和Fix Buffer 1B (颠倒混匀)等体积混合组成FixBuffer1(颠倒混匀)。每管样本加入1mL 的Fix Buffer 1，颠倒混匀，4℃避光孵育30min；
2、800×g离心5min，弃上清，使用残留液重悬细胞；
3、准备1×Permeabilization Buffer，每个样本共需要2mL；使用无RNA 酶的水将10×Permeabilization Buffer稀释到1×，再加入RNAase inhibitor s (100倍稀释)，颠倒混匀，置于冰上备用；
4、向每个样本中加入1mL 1×Permeabilization Buffer，颠倒混匀，800 ×g离心5min，弃上清，使用残留液重悬细胞；
5、向每个样本中加入1mL 1×Permeabilization Buffer，颠倒混匀，800 ×g离心5min，弃上清，使用残留液重悬细胞。
四、再次固定
1、准备RNAFixation Buffer 2，使用Wash Buffer，将8×的Fixation Buffer 2稀释至1×，颠倒混匀，每个样本需要1mL，避免剧烈混合试剂。
2、室温避光孵育60min；
3、800×g离心5min，弃上清至残留100μL，使用残留液重悬细胞；
4、向每个样本中加入1mL的Wash Buffer，颠倒混匀，吸出上清使残留液约为100μL，使用残留液重悬细胞；
5、重复上述步骤4，残留100μL对下面的探针杂交非常重要；
6、此外，还可以使用Wash Buffer 1000倍稀释RNase Inhibitors(100 ×)，每个样本需要1mL的稀释液，将样本2-8℃避光过夜保存。
实施例2探针杂交及上机检测
一、目标特异性探针杂交
1、准备探针稀释液(混合探针，具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列)。将Target Probe Diluent提前预热到 40℃，并将20×探针稀释到1×。每个样本需要100μL探针稀释液。取5μL EBER探针加到95μL的Target Probe Diluent中，上下吹打混合均匀；
2、将100μL稀释好的探针直接加入到细胞悬液中，注意不要将探针打到管壁上。涡旋均匀，40℃孵育2h，杂交1h后颠倒混匀样本后继续完成最后1h的杂交；
3、每个样本中加入1mL的Wash Buffer，颠倒混匀，800×g离心5min，弃上清至残留100μL，使用残留液重悬细胞；
4、准备加有RNase Inhibitor(100×)的Wash Buffer，即使用Wash Buffer 将100×的RNase Inhibitor s稀释至1×，每个样本需要1mL稀释液；
5、每个样本加入1mL加有RNase Inhibitors的Wash Buffer，800×g 离心5min，弃上清至残留100μL，使用残留液重悬细胞；
6、将样本2-8℃避光过夜保存。
二、信号放大
1、将样本和Wash Buffer平衡到室温，将PreAmp Mix，Amp Mix以及 Label ProbeDiluent预热到40℃备用，Label Probe(100×)避光置于冰上解冻；
2、向每个样本中加入100μL PreAmp Mix，混匀，40℃孵育1.5h；
3、向每个样本中加入1mL的Wash Buffer，颠倒混匀，800×g离心5 min，弃上清至残留100μL，使用残留液重悬细胞，共洗涤3次；
4、向每个样本中加入100μL Amp Mix，混匀，40℃孵育1.5h；
5、向每个样本中加入1mL的Wash Buffer，颠倒混匀，800×g离心5 min，弃上清至残留100μL，使用残留液重悬细胞，共洗涤2次；
6、准备Label Probe稀释液，使用Label Probe Diluent将100×Label Probe稀释至1×，每个样本需要100μL的1×Label Probe；
7、向每个样本中加入100μL 1×Label Probe，混匀，40℃孵育1h；
8、向每个样本中加入1mL的Wash Buffer，颠倒混匀，800×g离心5 min，弃上清至残留100μL，使用残留液重悬细胞，共洗2次；
9、每个样本中加入1mL的storage Buffer或者Staining Buffer，颠倒混匀，800×g离心5min，弃上清至残留100μL，加入100μL PBS，混匀上机检测。
实验结果如图1和图2所示，从图中可以看出EBER为EBV编码的小 RNA，普遍存在EBV感染的淋巴细胞中，检测到EBER阳性就可以说明该细胞内存在EBV感染，本实验中采用的是含EBV的Raji细胞系进行的实验，图1为未加入EBER探针的阴性对照管，图2为加入EBER探针的对照管，加入EBER探针后，97.72％的Raji细胞显示EBER阳性，说明该探针及方法能够检测出EBV阳性的细胞。
实施例3
本实施例应用本发明提供的鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，检测了一例EBV阳性患者的外周血淋巴细胞的EBV感染情况。其中，应用实施例1提供的方法进行淋巴细胞的预处理，应用实施例2提供的方法进行探针杂交及上机检测。上机检测的对象为CD3+T，CD4+T，CD8+T，CD19+B，CD56+NK的EBV感染情况。
检测结果如图所示。
其中，图3A为该患者未加入EBER探针的CD19+B细胞的空白对照管的检测结果图，图3B为该患者加入EBER探针的CD19+B细胞的检测结果图；从图3A和图3B中可以看出，结果显示该患者有11.85％的CD19+B 细胞感染了EBV。图4A为该患者未加入EBER探针的CD3+T细胞的空白对照管的检测结果图，图4B为该患者加入EBER探针的CD3+T细胞的检测结果图；从图4A和图4B中可以看出，有1.32％CD3+T的细胞EBER阳性，意味着该患者CD3+T细胞中有1.32％的CD3+T细胞存在EBV感染。
鉴于上述分析的患者T细胞上存在EBV感染，进一步画门看患者 CD8+T还是CD4+T细胞存在EBV感染。其中，图5A为该患者未加入EBER 探针的CD8+T细胞的空白对照管的检测结果图，图5B为该患者加入EBER 探针的CD8+T细胞的空白对照管的检测结果图，从图5A和图5B可以看出，该患者CD8+T细胞不存在EBV感染。图6A为该患者未加入EBER探针的CD4+T细胞的空白对照管的检测结果图，图6B为该患者加入EBER 探针的CD4+T细胞的空白对照管的检测结果图；从图6A和图6B可以看出，CD4+T细胞存在EBV感染，约有1.14％的CD4+T细胞感染了EBV。图7A为该患者未加入EBER探针的NK细胞的空白对照管的检测结果图，图7B为该患者加入EBER探针的NK细胞的空白对照管的检测结果图；从图7A和图7B可以看出，该患者NK细胞不存在EBV感染。
综上所述，根据本发明提供的鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，能够有效鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京倍科为生物技术有限公司
<120> 鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法及其应
用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaacatgcgg accaccagct ggtac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagacggcag aaagcagagt ctggg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaacctctag ggcagcgtag gtcct 25

Claims (10)

1.一种鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例的方法，其特征在于，所述方法包括：
提供预处理后的外周血单个核细胞，将探针与所述预处理后的外周血单个核细胞混合，杂交后采用流式细胞计量术采集和分析，鉴别EB病毒感染淋巴细胞亚群及被感染细胞占该亚群细胞比例；
其中，所述探针具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中的一种或多种所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针为混合探针，具有如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括表面染色、固定处理和破膜处理。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述外周血单个核细胞中加入带有染料标记的抗体进行表面染色。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体包括抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD19抗体和抗CD56抗体。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固定处理包括一次固定和二次固定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述外周血单个核细胞进行一次固定后进行破膜处理，在所述破膜处理后再进行二次固定。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述杂交后还包括信号放大的步骤。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法在确定EBV感染疾病的治疗靶点中的应用。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法在指导制备治疗EBV感染的药物中应用。
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