CN102813926B - miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。本发明还提供含有miR-7表达抑制剂的系统性红斑狼疮治疗药物。在B细胞中抑制表达miR-7后,PTEN的mRNA水平上调,并且发现B细胞增殖功能减弱,表明miR-7表达抑制剂可通过调控PTEN基因的表达来影响B细胞的增殖功能,从而起到治疗SLE的作用。同时,miR-7也通过抑制其靶基因CD200R1参与SLE发病,因此抑制miR-7的表达可以起到治疗SLE的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是最为经典的自身免疫病,几乎涵盖了整个免疫系统的紊乱,免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成,免疫反应包括固有免疫和适应性免疫,近年研究发现micro RNA(miRNA,微RNA)参与免疫系统的紊乱。
miRNAs是一类20-22个寡核苷酸的非编码RNA,成熟miRNA通过核酸序列互补识别特定靶mRNA的3’UTR区,在转录后水平抑制靶mRNA表达,从而抑制蛋白质的合成,达到调控基因表达的目的。miRNAs广泛存在于从病毒、线虫、植物到动物体内,参与生物体的生长、发育、衰老、凋亡的调控及遗传背景的稳定。2002年,Calin GA等人发现miR-15/miR-16在人慢性淋巴瘤中表达下调,首次将microRNA的研究与人类疾病相联。Satoh M等发现,在冠状动脉心脏病中,let-7i的表达与TLR-4信号相关。在造血干细胞向免疫细胞分化的不同阶段,miRNA表达会发生相应的变化,Monticelli S在对小鼠的造血系统研究中发现,T细胞成熟过程中miR-150表达水平明显升高,但是在进一步向Th1、Th2亚群分化时它的表达水平迅速下降。脾脏来源的成熟B细胞中可以检测到miR-150表达明显上调,而在骨髓来源的pro-B细胞中并无上调。miR-181a在T细胞分化早期双阴性期表达水平较高,而在双阳性期及以后时期其水平又明显下降。miR-223可抑制粒细胞的扩增及活化,miR-223缺陷的粒细胞表现出更强的氧化耐受和杀伤白色念珠菌的能力。有研究发现与正常小鼠相比,bic/miR-155-/-小鼠体内出现胶原沉积、抗体滴度低、T细胞反应水平低等近似人自身免疫病表现。在人树突状细胞,敲除miR-155后IL-1β等前炎分子的表达增加。巨噬细胞中miR-155的生成依赖TLR信号并能抑制DNA损害诱导的凋亡。miR-17-92簇参与胸腺阴性选择过程,并可通过抑制BIM和PTEN表达延长T细胞存活期。miR-326通过作用于其靶基因ETS1促进Th17细胞分化。Dai等通过芯片技术分析了SLE及正常人PBMC中miRNA表达谱差异,发现16个SLE相关miRNA。Tang等应用Taqman PCR方法检测了156个成熟miRNAs在SLE和正常对照组间的表达差异,发现包括miR-146a在内的42个miRNAs在SLE患者中存在表达差异,并发现miR-146a通过作用于Ⅰ型干扰素通路调节SLE的病理过程。
目前关于miR-146a与SLE的发病机制已有相关研究,然而对miR-7的研究主要在肿瘤方面,Lu ZJ发现在神经胶质瘤细胞系中,过表达Mir-7能够抑制肿瘤细胞迁移并抑制肿瘤生成。在神经母细胞瘤分化,皮质发育和胚胎干细胞分化中,miR-7和miR-214特异表达,并控制突起的生长。在胃炎和胃部肿瘤中,miR-7表达量下调,并且与炎症负相关,提示其具有肿瘤抑制作用,在胃癌细胞中转染Mir-7能够抑制细胞增殖和集落形成。在肝细胞癌中,过表达miR-7能够抑制肝癌细胞生长和转移,这一作用是通过Mir-7作用于PI3K/AKT通路实现的。但是,也有研究表示miR-7促进了肿瘤的形成,比如在肺癌中,EGFR能够通过Ras/ERK/Myc通路,促进Mir-7表达。在肺中异常的miR-7表达能促进肿瘤细胞生长,并且使裸鼠的致死率显著提高。另一方面,在内分泌系统中,发现Mir-7在胰岛高表达,在胚胎发育早期,利用反义序列抑制miR-7能够抑制出生后胰岛素的生成量,减少beta细胞的数量和葡萄糖的耐受水平。miR-7还参与了蛋白合成,在工程细胞CHO细胞中过表达Mir-7会抑制细胞生长。Doxakis E发现Alpha-突触核蛋白的表达会受到Mir-7与miR-153的负调控。然而,miR-7在自身免疫病特别是SLE的发病中的作用尚无研究。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。
其中,所述的所述的miR-7表达抑制剂优选为miR-7反义单链寡核苷酸和/或miR-7-sponge。
本发明中,miR-7的登录号为MIMAT0000252(http://www.miRbase.org)。miR-7的前体为miR-7-1,登录号为MI0000263(http://www.miRbase.org)。
miR-7反义单链寡核苷酸可人工合成或直接市售获得;miR-7海绵(miR-7-sponge)可根据小RNA sponge技术构建。
进一步的,所述的miR-7反义单链寡核苷酸还可经PNA、LNA或2-Ome修饰。
在本发明优选的实施方案中,所述的miR-7表达抑制剂为Anti-miRTM miR-7Inhibitor,购自Ambion公司。
本发明还提供含有miR-7表达抑制剂的系统性红斑狼疮治疗药物。
其中,所述的miR-7表达抑制剂优选为miR-7反义单链寡核苷酸和/或miR-7-sponge。
进一步的,所述的所述的miR-7反义单链寡核苷酸还可经PNA、LNA或2-Ome修饰。
在本发明优选的实施方案中,所述的miR-7表达抑制剂为Anti-miRTM miR-7Inhibitor,购自Ambion公司。
检测初治SLE患者和正常对照PBMC中miR-7的表达,发现SLE患者miR-7的表达显著高于HC,具有统计学差异(0.86±0.03vs0.10±0.08,p=0.0001)。SLE患者B细胞中miR-7的表达显著高于HC,具有统计学差异(0.59±0.08vs0.31±0.06,p=0.027),然而SLE患者T细胞及单核细胞中miR-7的表达与HC无统计学差异(0.91±0.18vs0.99±0.18,p=0.78,1.30±0.36vs0.98±0.02,p=0.70),所以miR-7表达量的差异主要集中在B细胞。
通过生物信息学方法预测miR-7的靶基因,挑选与SLE发病可能相关的8个(PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB),采用双荧光素酶报告基因系统验证,各组荧光素酶活性均下降(P<005),说明miR-7可以通过与PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB的3′UTR区相互作用发挥功能。
比较初治SLE患者及HC的T、B细胞中PTEN mRNA的表达,发现在SLE患者B细胞中表达较HC下调,具有统计学差异(0.92±0.24vs 2.20±0.49,p=0.041),在T细胞中的表达与HC相比无明显差异(1.23±0.24vs 1.55±0.53,p=0.579)。
通过电转染的方法,分别转染Pre-miRTM miR-7Precursor、Anti-miRTM miR-7 Inhibitor、Pre-miRTM miRNA Precursors-NegativeControl、Anti-miRTM miRNA Inhibitors-Negative Control至外周血B细胞中,结果Pre-miRTM miR-7Precursor能够在B细胞中有效过表达miR-7,Anti-miRTM miR-7Inhibitor能够在B细胞中有效抑制表达miR-7。
在B细胞中过表达或抑制表达miR-7后,PTEN的mRNA水平相应下调或上调,B细胞增殖功能相应增强或减弱,说明在人的B细胞中,miR-7能够直接抑制PTEN的表达水平,并能够促进B细胞增殖,而抑制表达miR-7后能促进PTEN的表达水平,并能够抑制B细胞增殖。
在PBMC中转染Ad-miR-7或Ad-GFP,结果显示转染Ad-GFP 48小时后CD200R1的阳性率为25.13%,平均荧光强度MFI=406.55,转染Ad-miR-748小时后CD200R1的阳性率为7.51%,平均荧光强度MFI=262.86,说明miR-7能够直接下调CD200R1的表达水平。
SLE患者miR-7的表达水平显著高于健康对照,并且SLE患者B细胞中miR-7的表达显著高于健康对照,表明SLE患者高表达miR-7参与SLE的发病。另一方面,SLE患者B细胞中PTEN的表达低于健康对照,表明SLE患者低表达PTEN参与SLE的发病。本发明证明PTEN是miR-7的靶基因,又由于SLE患者高表达miR-7,表明miR-7参与SLE发病。因此,miR-7表达抑制剂能够通过纠正SLE患者PTEN的低表达,并且抑制B细胞的增殖而起到治疗SLE的作用。通过将miR-7表达抑制剂,如miR-7反义单链核苷酸和/或miR-7-sponge直接注射给患者,使miR-7抑制剂与体内miR-7结合,而阻断miR-7对其靶基因的作用,进而起到治疗的目的。
附图说明
图1SLE患者及HC不同细胞亚群中miR-7的相对表达量。
图2所示为靶基因的双荧光素酶报告系统检测结果。
图3所示为SLE患者及HC的T、B细胞中靶基因PTEN mRNA的表达。
图4所示为转染Pre-miRTM miR-7Precursor、Pre-miRTM miRNAPrecursors-Negative Control、Anti-miRTM miR-7 Inhibitor、Anti-miRTM miRNA Inhibitors-Negative Control后,RT-PCR检测miR-7的表达。
图5所示为在B细胞中过表达或抑制表达miR-7后,PTEN的mRNA水平的变化。
图6所示为转染Pre-miRTM miR-7Precursor、Pre-miRTM miRNAPrecursors-Negative Control、Anti-miRTM miR-7Inhibitor、Anti-miRTMmiRNA Inhibitors-Negative Control后,B细胞的增殖能力。
图7所示为腺病毒转染效率及miR-7对CD200R1表达水平的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
共采集20例SLE患者,为北京协和医院2009~2011年门诊初治患者,均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE诊断标准,排除患有其它全身性疾病者。正常对照20例来自健康志愿者,年龄、性别与病例匹配,同时不得具备SLE诊断标准中的任何一条。
实施例1SLE患者及HC的PBMC、T细胞、B细胞、单核细胞中miR-7的表达
用Trizol法抽提总RNA,反转录后用实时定量PCR法扩增测定miRNA表达。采用TaqMan探针法,试剂为美国应用生物系统公司(ABI)商品化的引物及试剂盒(反转试剂盒:名称FG,Taqman(r)microRNA RT Kit 200rxns,货号4366596;PCR试剂盒:名称TaqMan Gene Expression Master Mix,货号4369016;反转引物及PCR引物:名称MicroRNA Assays 50RT+150PCR,货号货号4427975)。
收集初治SLE患者和HC各4例,检测PBMC中miR-7的表达,发现SLE患者miR-7的表达显著高于HC,具有统计学差异(0.86±0.03vs0.10±0.08,p=0.0001),为进一步明确各细胞亚群上miR-7的表达差异,收集SLE患者12例及HC6例,通过流式细胞仪分选T、B细胞及单核细胞,发现SLE患者B细胞中miR-7的表达显著高于HC,具有统计学差异(0.59±0.08vs0.31±0.06,p=0.027),然而SLE患者T细胞及单核细胞中miR-7的表达与HC无统计学差异(0.91±0.18vs0.99±0.18,p=0.78,1.30±0.36vs0.98±0.02,p=0.70),所以miR-7表达量的差异主要集中在B细(图1)。
实施例2双荧光素酶报告基因系统验证预测的miR-7的靶基因
通过Targetscan、PicTar及miRanda三个软件对miR-7的靶基因进行预测,根据这些靶基因的生物学功能是否与自身免疫病的发病机制相关,选取8个作为miR-7的靶基因进行验证,分别为PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB。
克隆miR-7预测的靶基因3’-UTR序列,并在引物两端加上酶切位点XbaI(5’-TCTAGA-3’)和NotI(5'-GCGGCCGC-3')。引物序列如下:
分别对pmiRGLO载体(购自Promega)和上述扩增到的序列进行XbaI和NotI双酶切。回收目的片段后,将各自的扩增片段连接到载体上,构建成携带有靶基因3′UTR区的双荧光素酶报告基因载体。
将构建好的质粒共转染293T细胞(中国医学科学院细胞中心),方法如下:
1)293T细胞至对数生长期,胰酶消化后计数,按每孔为2×104个细胞将细胞均匀接种在96孔细胞培养板,常规培养过夜,细胞生长状态稳定并达到每孔细胞的贴壁覆盖率为90-95%左右;
2)转染293T细胞,每孔细胞转染报告基因质粒150ng,共转Pre-miRTM miR-7Precursor(miR-7前体,购自美国Ambion公司)或Pre-miRTM miRNA Precursors-Negative Control(针对Pre-miRTM miR-7Precursor的阴性对照,购自美国Ambion公司)3pmol,二者按比例混合后加入到25opti-MEM培养基中;
3)用25μl Opti-MEM培养基稀释1.0μl脂质体(LipofectamineTM2000),轻混匀,室温孵育5min;
4)将稀释的质粒DNA和脂质体混合后混匀,室温孵育20min;
5)吸除培养板中的细胞培养液,每孔加入50μl预热的新鲜无血清DMEM培养基;
6)将50μl脂质体和质粒混合液加入到各培养孔中,轻轻混匀;
7)置于37℃,5%CO2培养箱中孵育6h,更换新鲜的完全细胞培养基,继续培养24h后用双荧光报告基因检测系统检测报告基因的表达水平。
将Pre-miRTM miR-7 Precursor或Pre-miRTM miRNAPrecursors-Negative Control与含有靶基因3′UTR区的报告质粒共转染入293T细胞中,以miR-7的非靶基因IL-10作为该系统的阴性对照,设计与miR-7前体序列完全互补的序列作为该系统的阳性对照,测定细胞荧光素酶活性。所有实验均重复两次,每次三复孔。如果miRNA与相应的靶基因的3′UTR相互作用,则表现为细胞荧光素酶活性表达下降。结果显示,转染miR-7前体的细胞中,共转miR-7前体序列完全互补的序列后,荧光素酶活性显著下降,说明过表达的miR-7能够通过与互补序列结合有效抑制荧光素酶活性。共转靶基因PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB的3′UTR序列后,各组荧光素酶活性下降(P<005);共转IL10的3′UTR序列荧光素酶活性几乎与对照相当。说明miR-7可以通过与PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB的3′UTR区相互作用发挥功能(图2)。
实施例3SLE患者及HC的T、B细胞中靶基因PTENmRNA水平的检测
分别提取SLE患者以及HC的T、B细胞的RNA,反转录成cDNA后,用荧光定量PCR测定靶基因PTEN的mRNA表达水平,以GAPDH作为内参基因。
引物设计如下:
PCR反应条件如下:95℃预变性1min,95℃5s,60℃30s,30个循环,95℃1min,55℃1min,然后以每10s上升0.5℃,共需81个循环升至95℃,采集溶解曲线。结果如图3所示。比较初治SLE患者及HC的T、B细胞中靶基因PTEN mRNA的表达,发现在SLE患者B细胞中表达较HC下调,具有统计学差异(0.92±0.24vs 2.20±0.49,p=0.041),在T细胞中的表达与HC相比无明显差异(1.23±0.24vs 1.55±0.53,p=0.579)。
实施例4过表达或者抑制表达miR-7后PTEN的mRNA水平的变化
通过电转染的方法,转染Pre-miRTM miR-7Precursor、Pre-miRTMmiRNA Precursors-Negative Control、Anti-miRTM miR-7 Inhibitor、Anti-miRTM miRNA Inhibitors-Negative Control(购自美国Ambion公司),至外周血B细胞,采用荧光定量PCR法(Taqman探针法)检测转染后的细胞中miR-7的表达以明确转染效果,结果显示,Pre-miRTM miR-7Precursor能在B细胞中有效过表达miR-7,而Anti-miRTM miR-7Inhibitor能够在B细胞中有效抑制表达miR-7(图4)。
选取1例SLE初治患者,通过电转染的方法,在B细胞转染Pre-miRTM miR-7 Precursor、Pre-miRTM miRNA Precursors-NegativeControl、Anti-miRTM miR-7 Inhibitor、Anti-miRTM miRNAInhibitors-Negative Control后,PTEN的mRNA相对表达量分别为0.79、0.87、1.29、0.86,说明与miRNA阴性对照相比,过表达miR-7能够在一定程度抑制PTEN的基因表达,而抑制miR-7能够促进PTEN的基因表达(图5),即在人的B细胞中,Anti-miRTM miR-7Inhibitor能够抑制miR-7对PTEN的下调作用,实现SLE患者PTEN表达的上调,抑制患者体内B细胞过度增殖,控制疾病发展。
实施例5miR-7对B细胞增殖功能的影响
为了解miR-7对于B细胞增殖功能的影响,在B细胞转染Pre-miRTM miR-7Precursor、Pre-miRTM miRNA Precursors-NegativeControl、Anti-miRTM miR-7Inhibitor、Anti-miRTM miRNAInhibitors-Negative Control,使其miR-7的表达上调或者下调,再将细胞进行CFSE染色后进行培养5天,观察B细胞中miR-7的表达水平对B细胞增殖功能的影响,可见转染了Pre-miRTM miR-7Precursor的B细胞增殖能力高于转染Anti-miRTM miR-7Inhibitor的B细胞,说明miR-7表达抑制剂能够抑制B细胞的增殖(图6)。
实施例6miR-7对CD200R1表达水平的影响
Li Y,Zhao LD,Tong LS,et al.Aberrant CD200/CD200R1expression and function in systemic lupus erythematosus contributes toabnormal T-cell responsiveness and dendritic cell activity.Arthritis ResTher.2012;14(3):R123的研究结果表明,SLE患者PBMC中CD200R1的mRNA水平及蛋白水平均较HC有明显减少,致SLE患者体内CD200/CD200R1信号通路缺陷,该缺陷使SLE患者炎性Th17细胞分化增加,调节性Treg生成减少,促进抗CD3/抗CD28刺激的CD4+T细胞增殖,DC对凋亡细胞吞噬障碍等,为明确miR-7是否能够调控PBMC中CD200R1的表达,将miR-7前体片段克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV多克隆位点,构建成pAdTrack-CMV-miR-7。构建好的pAdTrack-CMV-miR-7(过表达miR-7前体的带有GFP标签的穿梭载体)与腺病毒载体AdEasy1同源重组成重组腺病毒载体,将重组腺病毒载体转染293A细胞包装成重组腺病毒Ad-miR-7。另外,将pAdTrack-CMV与腺病毒载体AdEasy1按相同方法同源重组并转染细胞包装成重组腺病毒Ad-GFP(仅仅带有GFP标签的重组腺病毒)作为阴性对照。用Ad-miR-7或Ad-GFP感染PBMC,通过流式细胞仪检测GFP阳性率来确定转染效率,并检测GFP阳性细胞中CD200R1的表达,即可比较过表达miR-7的PBMC及阴性对照中CD200R1的表达水平,方法如下:
1、重组腺病毒的构建与包装
1)利用PCR方法从人基因组DNA中扩增得到的miR-7-1前体片段用BglⅡ-NotⅠ双酶切后与同样用BglⅡ-NotⅠ双酶切穿梭载体pAdTrack-CMV定向连接,连接产物转化E.coli DH5α,铺卡那霉素抗性LB平板,挑取克隆,接种于5ml卡那霉素抗性LB液体培养基中,37℃震摇过夜,次晨直接用菌液进行PCR鉴定,或提取质粒进行酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆经测序正确后扩大培养,提取质粒并标记为pAdTrack-CMV-miR-7。
2)将穿梭质粒pAdTrack-CMV-miR-7或pAdTrack-CMV 300ng经PmeI酶切4h或过夜,充分线性化(不完全消化往往产生较高的背景,从而降低重组率,将线性化质粒去磷酸化有助于降低背景信号),凝胶回收纯化酶切后的DNA,溶于6μl去离子水中。
3)pAdTrack-CMV-miR-7或pAdTrack-CMV与AdEasy1同源重组:将回收的线性化载体与1μl(100ng/μl)腺病毒载体(Ad easy-1质粒)共转化E.coli BJ5183感受态细菌(电转条件2500V,200Ohms,25micro-FD)。用500μl LB培养基重悬细菌,37℃孵育10-20min,铺卡那霉素抗性LB平板,置于37℃孵箱内培养16-20h。
4)鉴定阳性克隆:挑取较小的克隆15-20个,分别接种于卡那抗性液体LB培养基5ml中,37℃震摇过夜。次晨收菌,立即提取质粒(避免在任何温度下储存菌液,但可将其制成甘油菌-80℃冻存),凝胶电泳,挑选大质粒,然后用PCR的方法鉴定筛选重组子。带有目的基因者用PacI酶切鉴定可得到30kb带以及较小的4.5kb或3kb条带。
5)质粒大量提取:取鉴定正确的重组质粒转化E.coli DH5α,铺卡那霉素抗性LB平板,置于37℃孵箱内培养过夜。挑取阳性菌落接种于含25μg/ml卡那霉素的液体LB培养基100-200ml中,37℃震摇过夜(20h),按常规方法提取质粒。
6)PacI酶切线性化:取50μg重组质粒用PacI酶切4-6h或过夜。酚、氯仿/氯仿+异戊醇(24:1)各抽提一次,乙醇沉淀后,在无菌条件下溶于MilliQ级别纯水中,-20℃保存备用。
7)将上一步线性化的重组质粒转导293A细胞:转染前一天,293A细胞按70%左右接种于10cm平皿中,取3-4ug线性化的重组质粒,与Lipofectamine2000试剂按比例混合,按Lipofectamine2000说明书转染293A细胞。
8)上述转染的细胞培养约7-10天左右可用荧光显微镜观察,至细胞基本全部呈绿色且30-50%细胞悬浮时,收集细胞及培养液,于-80℃与37℃之间,冻融4次,2000g离心收集上清,用于再次扩增病毒。
9)以上步收集病毒液再次感染293A细胞,2-3天后,细胞约有50%左右悬浮,重复(8)步骤,增加病毒滴度,约3-5次。
10)每种重组病毒感染约15个10cm平皿,收集细胞,PBS洗2次,离心后以PBS重悬(约1-2ml),反复冻融3-4次,融化时使用37度水浴,但是控制融化的温度,不要让病毒温度升得太高,刚刚融化时即放入冰上,然后离心收集上清。
11)上步上清以Amicon Ultra-15(1000,000MW)柱纯化病毒,测定病毒滴度。
2、腺病毒感染方法
1)取适量病毒纯化液(Ad-miR-7和Ad-GFP)加入到细胞培养基中(培养基体积不宜太多,以106细胞/ml以上密度为宜),混匀后再加入polylysine至终浓度0.5μg/ml,室温放置100min。
2)细胞以PBS洗2次后,将上述病毒培养基混合液加到细胞上面,放置于培养箱内孵育100min。
3)以1:1体积比加入含10%FBS的完全培养基,培养24h。
4)荧光显微镜观察感染效率,并以PBS洗细胞2次,更换新鲜培养基并进行后续实验。
3、流式标本的荧光染色
1)PBMC经病毒转染48小时后,收集细胞检测CD200R1的表达,取100μl(5×105cell)/每管加入已做好相应标记的流式检测管。
2)检测管中加入PE-CD200R1流式抗体10μl,对照管中加入与抗体相对应的同型对照。轻柔震荡混匀,4℃避光孵育30分钟。
3)孵育结束,每管加入2ml FACS缓冲液,1500rpm,离心6分钟,弃上清。重复洗涤2遍。
4)加入PBS 200μl重悬细胞,立即上机检测或4%多聚甲醛溶液固定,48小时内上机检测。
结果显示,Ad-GFP的转染效率为42.7%,Ad-miR-7的转染效率为57.4%,转染Ad-GFP 48小时后CD200R1的阳性率为25.13%,平均荧光强度MFI=406.55,转染Ad-miR-748小时后CD200R1的阳性率为7.51%,平均荧光强度MFI=262.86,说明miR-7能够直接下调CD200R1的表达水平(图7)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国医学科学院北京协和医院
<120>miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用
<130>
<160>22
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tctagaacac gtacttgtgc ga 22
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gcggccgctc ttgtaatgta aac 23
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tctagacaga gcactgggtt g 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gcggccgcga tttattagtt c 21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tctagaccca cccatgagaa g 21
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gcggccgcca gcttgtttat tc 22
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tctagaggat tctcattcat accc 24
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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gcggccgcca tatttaatct gg 22
<210>9
<211>22
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<400>9
tctagatggc tacgattctc tc 22
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<213>人工序列
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tctagagaca gtcctttgca c 21
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gccatgggtg gaatcatatt gg 22
Claims (2)
1.miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用,其特征在于,所述的miR-7表达抑制剂为miR-7反义单链寡核苷酸和/或miR-7海绵。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的miR-7反义单链寡核苷酸经PNA、LNA或2-Ome修饰。
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