CN103948926A - miR-9抑制剂在制备用于抑制肿瘤生长药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR-9抑制剂在制备用于抑制肿瘤生长药物中的用途。本发明利用现代生物学技术，发现了miR-9有调控MDSC细胞的用途，抑制MDSC细胞中miR-9的表达，能够下调MDSC细胞的免疫抑制能力，进而抑制肿瘤的生长。因此，将miR-9作为靶点来治疗肿瘤，对肿瘤的免疫治疗有着潜在的应用价值和实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及miR-9的新用途，miR-9抑制剂在制备用于抑制肿瘤生长药物中的用途属生物技术领域。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一种非编码的、内源性的小分子RNA，长度约20-23个核苷酸。miRNA首先于1993年在线虫体内被发现，经过多年的研究，最新的miRNA数据库显示已发现2万多种不同的miRNA存在于各种生物体内。miRNAs能够特异性地与靶基因mRNAs上3’非编码区(3’UTR)的互补序列结合，从而阻止蛋白的合成。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据报道，大约有30%-92%的人类基因是受到miRNA调控的。miRNAs通过转录后抑制基因的表达，从而在生物体内的各种生理过程中起着重要的调控作用。研究报道显示，miRNAs在体内参与多种细胞的发育、成熟、增殖、分化和凋亡。最近研究指出，miRNAs主要通过以下过程发挥调控作用：首先，编码DNA转录为长链、带有发夹结构的初级miRNAs转录物(pri-miRNAs)，该转录物在细胞核内被剪切成70-90个碱基大小、具发夹结构miRNA前体(pre-miRNAs)，miRNA前体被运送到细胞质中，变为成熟的miRNA。成熟miRNA的一条链整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，miRNA上约2-8个核苷酸长度的“种子区”与靶基因mRNA上3’非编码区上互补序列结合，从而导致靶基因mRNA的降解或者翻译过程受到抑制。miRNA的异常表达会导致机体正常生理功能的紊乱，从而导致多种疾病的发生。大量研究表明，miRNA的表达和功能与人类多种疾病有着密切的联系，包括肿瘤、代谢性疾病、神经性疾病、感染、慢性炎症以及自身免疫病等。由于miRNA能够对各种细胞及机体的生物学过程进行调节，因此，以miRNA为靶向的治疗也成为了一种新兴的临床治疗策略，通过对miRNA表达和功能的调控，从而对相应的靶基因进行调控，进而达到治疗疾病的目的。
MDSCs是一群骨髓来源的未成熟的、异质性的髓系细胞。在肿瘤、炎症和感染的情况下大量增殖。MDSCs构成了免疫系统中调节健康和各种疾病状态下机体免疫应答的主要成分。在健康个体体内，MDSCs从骨髓产生之后能够快速分化为树突状细胞、巨噬细胞和粒细胞。而在病理状况下，MDSCs的分化过程受阻，大量积聚于体内。正常小鼠骨髓中Gr-1+CD11b+细胞占20%-30%、脾脏中占2%-4%，而淋巴结中尚未发现。在荷瘤小鼠的脾脏内，MDSCs的比例超过20%，肿瘤组织也有超过5%的肿瘤浸润淋巴细胞为MDSCs，其数量和比例依据肿瘤的大小和进程及肿瘤组织类型的不同而有所差别。在小鼠中，MDSCs是Gr-1（由Ly6G和Ly6C组成）和CD11b双阳性的细胞。近来，根据细胞形态及Ly6G、Ly6C的表达量的高低，又将MDSCs分为两个亚型：CD11b+Ly6G+Ly6Clow粒细胞样MDSCs(G-MDSCs)和CD11b+Ly6G-Ly6Chi单核细胞样MDSCs(M-MDSCs)。在人类，MDSCs的表型比较复杂，主要为LIN-HLA-DR-CD33+or CD11b+CD14-CD33+。据报道，肿瘤细胞通过分泌VEGF、GM-CSF、IL-6、IL-10、TGF-β等多种因子动员骨髓造血前体细胞向MDSCs分化、增殖，并向肿瘤组织迁移，致使大量的MDSCs积聚于肿瘤病人体内，从而有效地抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的抗瘤免疫应答，最终导致肿瘤相关的免疫抑制，成为肿瘤治疗中的一大难题。MDSCs通过多种不同的机制来抑制抗瘤免疫应答。一方面MDSCs通过表达大量的精氨酸酶(arginase1，ARG-1)、诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)，抑制T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫以及NK细胞和巨噬细胞介导的天然抗肿瘤免疫。另一方面，MDSCs通过诱导CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)的产生来下调效应性T细胞的功能。因此，降低这群细胞在体内的数量，下调其免疫抑制能力，可成为有效的抗瘤免疫治疗的方法。因此，寻求和探究调控MDSC细胞功能的分子对于预防和治疗肿瘤有着重要的意义。
miR-9最早是发现于神经组织中表达，调控神经组织的发育。近年来，大量研究表明miR-9有类似于癌基因的作用，与肿瘤的发生发展有着密切的关系。据报道，miR-9高表达于多种肿瘤中，如霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、脑癌、胃癌、子宫颈癌、肠癌等。目前，对于引起miR-9上调的因素尚不十分明确。Wilting等认为，子宫颈癌中miR-9的上调可能是由于染色体的扩增引起的；而在某些乳腺癌中，发现癌基因MYC能够上调miR-9的表达。miR-9能够通过影响肿瘤形成的各个过程来调控肿瘤的发生发展，包括肿瘤细胞的增殖、迁移以及引发的炎症反应。然而，miR-9对于一些非肿瘤细胞，例如对肿瘤相关免疫细胞的调控目前尚未见任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-9的新用途。
为了实现上述目的，分析了miR-9对MDSC细胞免疫抑制功能的调控，抑制MDSC细胞中miR-9的表达，有能够下调MDSC细胞的免疫抑制功能，延缓肿瘤发生发展的用途。
基于上述miR-9的上述功能，本发明提供了一种技术方案：
miR-9抑制剂在制备用于抑制肿瘤生长药物中的用途。
所述的肿瘤为肺癌。
所述的miR-9抑制剂为化学合成的miR-9抑制剂，可通过与成熟miRNA分子特异性结合而抑制miR-9作用，削弱细胞中内源性miR-9导致的基因调控作用。
本发明的有益效果是：
本发明利用现代生物学技术，首次提出了miR-9对MDSC细胞的调控作用，发现抑制miR-9的表达，能够下调MDSC细胞的免疫抑制能力，进而发现miR-9抑制剂具有抑制肿瘤生长的功能。因此，将miR-9作为靶点来治疗肿瘤，对肿瘤的免疫治疗有着潜在的应用价值和实际意义。
附图说明
图1是：miR-9对M-MDSC细胞免疫抑制功能的调控；
图2是：miR-9对G-MDSC细胞免疫抑制功能的调控；
图3是：miR-9对肿瘤发展进程以及小鼠存活率的影响；
图4是：肺癌患者肿瘤组织中miR-9与MDSC细胞及其效应分子的表达情况。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述的技术方案作进一步的详细说明。
本发明所涉及的miR-9的拟似物或抑制剂为商业化商品，可从广州锐博生物科技有限公司、上海吉凯基因化学技术有限公司、QIAGEN、Ambion等公司购买。
实施例1
miR-9对M-MDSC/G-MDSC细胞功能的调控
（1）肿瘤模型的建立
取6～8周龄的C57BL/6小鼠，体重20g左右。在超净实验工作台上，消毒小鼠右腋下皮肤，细胞悬液摇匀后，皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞，每只200μl，共计5.0×106个细胞。接种3周后小鼠皮下出现肿块，质硬，活动度差，即为皮下移植瘤。
（2）MDSCs细胞的分离纯化
无菌取荷瘤小鼠脾脏，采用Miltenyi Biotec公司的“Myeloid-Derived Suppressor CellIsolation Kit”进行分离纯化，通过抗Ly6G抗体阳性选择获得G-MDSC细胞，再将阴性细胞经抗Gr-1抗体阳性选择获得M-MDSC细胞。FCM检测细胞纯度。
（3）细胞转染
将由广州锐博公司提供的miR-9的拟似物或抑制剂100nM与RNA转染试剂（EngreenBiosystem）2.5μl/孔配制成转染复合物，于室温静置30min，继而转染入2.0×106MDSC细胞，24孔板每孔培养体系为500ul。转染所用的培养液均为无血清、无抗生素的培养液。
（4）精氨酸酶（Arginase）的检测
miR-9的拟似物或抑制剂转染入MDSC细胞后，培养24h，用100μl蛋白裂解液裂解细胞，收取裂解上清。采用QuantiChrom Arginase Assay kit(BioAssay system公司)检测精氨酸酶的含量。
（5）一氧化氮合酶（iNOS）的检测
Trizol提取转染后的细胞RNA，经逆转录获得cDNA，实时荧光定量PCR检测iNOS的表达量。
逆转录试剂采用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit(Code No.:FSQ-101)，10μl逆转录体系：
逆转录程序如下：
先将RNA与DEPC水混合，于PCR仪上预变性，65℃5min，冰上静置2min。再将其他试剂加入，于PCR仪上37℃15min，98℃5min。
实时荧光定量PCR检测iNOS：
小鼠iNOS引物序列：
上游引物5’-GAGCCCTCAGCAGCATCCAT-3’,（SEQ ID.1）
下游引物5’-GGTGAGGGCTTGGCTGAGTG-3’;（SEQ ID.2）
小鼠18s引物序列：
上游引物5’-TCCGGAGAGGGAGCCTGAGA-3’,（SEQ ID.3）
下游引物5’-GCACCAGACTTGCCCTCCAA-3’.（SEQ ID.4）
20μl反应体系如下：
实时荧光定量PCR反应程序：
95℃5min，95℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，扩增40个循环。
采用△Ct法计算iNOS的相对表达量。
（6）活性氧（ROS）的检测
收集转染后的G-MDSC细胞，将细胞重悬于1ml PBS中，加入2.5μM DCFDA和30ng/mlPMA，于37℃孵育30min.PBS洗两遍，于流式细胞仪上进行检测。
（7）MDSC细胞免疫抑制功能试验
利用免疫磁珠分离纯化野生型C57BL/6小鼠脾脏中CD4+或CD8+T细胞，加入不同处理组的MDSCs细胞，在抗CD3/CD28抗体刺激的刺激下，37℃5%CO2培养3天，在结束培养前16小时加入[3H]thymidine(1μCi/孔)，β液体闪烁仪测定cpm值。
如图1、2所示，抑制MDSC细胞中miR-9的表达，能够显著降低MDSC相关效应分子的表达，包括精氨酸酶（图1A，图2A）、一氧化氮合酶（图1B）、活性氧（图2B）；另外，下调MDSC细胞中miR-9的表达，能够减弱MDSC对CD4+或CD8+T细胞的抑制能力，从而说明了抑制miR-9的表达能够削弱MDSC细胞的免疫抑制能力。
实施例2
miR-9对肿瘤发生发展的影响
（1）取6～8周龄的C57BL/6小鼠，皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞，每只200μl，共计3.0×106个细胞。于植入肿瘤细胞后10天，将转染了miR-9拟似物或抑制剂的MDSC细胞注射入荷瘤小鼠肿瘤局部，2.0×106个细胞/只。一周后再注射一次细胞，每2天测量一次肿瘤大小，以公式体积=0.5×长×宽2来计算肿瘤的体积。同时，观察不同处理组小鼠的生存率情况。
（2）取6～8周龄的C57BL/6小鼠，皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞，每只200μl，共计3.0×106个细胞。于植入肿瘤细胞后10天，将miR-9拟似物或抑制剂直接注射入荷瘤小鼠肿瘤局部，观察肿瘤大小以及小鼠生存率。
如图3所示，抑制MDSC细胞中miR-9的表达，能够显著延缓肿瘤的发展进程，延长小鼠的存活时间（图3A，B）。另外，抑制肿瘤微环境中miR-9的表达，也能够抑制肿瘤的生长，提高荷瘤小鼠的存活率（图3C，D）。
实施例3
肺癌患者体内miR-9与MDSC相关因子的表达
（1）留取黄豆大小的肺癌组织以及癌旁正常肺组织，浸泡于10%甲醛中进行固定，石蜡包埋后切片，用FITC标记的抗CD11b抗体和APC标记的抗CD33抗体进行免疫荧光染色，检测CD11b+CD33+MDSC细胞的数量。
（2）将肿瘤组织以及癌旁正常肺组织进行碾磨，加入Trizol提取组织RNA，采用特异性的hsa-miR-9逆转录引物进行逆转录获得cDNA，再通过实时荧光定量PCR检测组织中miR-9的表达。
hsa-miR-9特异性逆转录引物，序列如下：
5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCATACA-3'（SEQ ID.5）
10μl逆转录体系如下：
miRNA逆转录程序如下：
先将RNA与DEPC水混合，于PCR仪上预变性，70℃10min，冰上静置2min。再将其他试剂加入，于PCR仪上42℃60min，70℃10min。
miR-9特异性荧光定量PCR
hsa-miR-9荧光定量PCR引物，序列如下：
正向引物：5'-GGGTCTTTGGTTATCTAGC-3'（SEQ ID.6）
反向引物：5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'（SEQ ID.7）
20μl反应体系如下：
miR-9实时荧光定量PCR反应程序：
95℃10min，95℃15sec，60℃15sec，72℃15sec，扩增40个循环。
（3）将肿瘤组织以及癌旁正常肺组织进行碾磨，加入Trizol提取组织RNA，逆转录为cDNA后，进行实时荧光定量PCR。
人精氨酸酶的引物序列如下：
上游引物：5'-CCTTTGCTGACATCCCTAAT-3'（SEQ ID.8）
下游引物：5'-GATTCTTCCGTTCTTCTTGACT-3'（SEQ ID.9）
人18s的引物序列如下：
上游引物：5'-CGGACAGGATTGACAGATTG-3'（SEQ ID.10）
下游引物：5'-GCCAGAGTCTCGTTCGTTATC-3'（SEQ ID.11）
实时荧光定量PCR反应程序：
95℃5min，95℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，扩增40个循环。
如图4所示，肺癌患者局部肿瘤组织中浸润大量的CD11b+CD33+MDSC细胞(图4A)，miR-9的表达量显著高于对照组织（图4B)，精氨酸酶的含量也处于较高的水平（图4C)，且miR-9的表达与精氨酸酶之间存在着较好的相关性（图4D)。这就说明了在临床肺癌患者体内miR-9与MDSC及其效应分子之间存在着密切的相关性。
综上所述，MDSC大量积聚于肿瘤患者体内，抑制肿瘤患者的抗瘤免疫应答，造成患者长期处于一种免疫抑制状态，为抗瘤免疫治疗带来了很大的困难。若能够减少这群细胞在体内的浸润，削弱其免疫抑制能力，将是有效的抗瘤免疫辅助疗法。
本发明通过上述实施例的研究表明，miR-9能够调控MDSC细胞的免疫抑制功能，抑制MDSC细胞中miR-9的表达，能够明显下调MDSC细胞的免疫抑制功能，延缓肿瘤的发生发展。因此，将miR-9作为靶点来治疗肿瘤，对肿瘤的免疫治疗有着潜在的应用价值和实际意义。
Claims (2)
1.miR-9抑制剂在制备用于抑制肿瘤生长药物中的用途。
2.miR-9抑制剂在制备用于抑制肺癌生长药物中的用途。
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