CN108611374A - miR-9高表达肿瘤及其治疗与特异标记物的表征 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种构建miR‑9高表达的肿瘤的方法，发现凡德他尼和3‑甲基腺嘌呤能够抑制该方法所构建的肿瘤移植物，但导致了富VEGF外泌体的大量分泌。本发明进一步提供了凡德他尼和3‑甲基腺嘌呤的相应治疗方法和治疗药物或组合物，用于评价相应治疗进程的富VEGF外泌体标记物，以及用于表征该标记物的试剂盒。本发明对肿瘤特别是miR‑9高表达的肿瘤的治疗、预防和治疗效果评价提供了新的策略。

Description

miR-9高表达肿瘤及其治疗与特异标记物的表征
技术领域
本发明涉及药学领域，涉及miR-9高表达肿瘤及其治疗与特异标 记物的表征，特别地涉及响应于抗-血管生成和抗-自噬治疗的富 VEGF外泌体及其相应的表征与应用。
背景技术
旨在通过抑制肿瘤血管形成、破坏已有肿瘤血管，治疗肿瘤的抗 血管生成疗法(AATs)，并没有获得期待的疗效1,2。AATs疗效短暂， 停止治疗后，肿瘤通过不同形式的血管生成，如血管选定、内皮血管 生成和血管生成拟态(VM)等，迅速复发3-7。此外，AATs会破坏肿 瘤血管屏障，促进肿瘤细胞侵袭和转移，使癌细胞如肝细胞癌(HCC) 细胞逃逸AATs、或形成AATs抗性6,7。癌症的转移是全世界癌症相 关死亡的主要原因8。但是，AATs治疗后，肿瘤血管生成的原因及内 在机制仍不清楚9。
研究表明，微小RNAs(miRNAs)调节与肿瘤发生和血管生成相 关的基因表达。致癌的miR-9在HCC组织和肿瘤相关的内皮细胞 (ECs)中显著高表达，其表达水平与HCC患者的不良预后紧密相关。 但是，在AATs中，肿瘤相关EC过表达miR-9的具体作用未知。
此外，自噬在血管生成中发挥重要作用，其作用不依赖于营养或 者低氧应激10。此前，对于miR-9是否促进血管生成，以及抗-自噬 是否破坏miR-9-诱导的血管生成，尚不明确。
最近十年，包括凋亡小体、微泡(MVs)和外泌体(Exosomes) 在内的细胞外囊泡(EVs)备受关注，主要负责人体细胞间信号通讯。 虽然已有证据表明外泌体调节肿瘤发展和转移，但是外泌体在肿瘤血 管生成的作用(特别是AATs之后)并不清楚。
与本发明有关的背景技术如下文献所示：
1Cully,M.Cancer:Tumour vessel normalization takes centre stage.NatRev DrugDiscov16,87(2017).
2Park,J.S.et al.Normalization of Tumor Vessels by Tie2Activation andAng2Inhibition Enhances Drug Delivery and Produces a Favorable TumorMicroenvironment.CancerCell31,157-158(2017).
3Hendrix,M.J.,Seftor,E.A.,Hess,A.R.&Seftor,R.E.Vasculogenic mimicryand tumour-cell plasticity:lessons from melanoma.Nature reviews. Cancer3,411-421(2003).
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发明内容
为了阐明AATs诱发肿瘤血管生成和进展的机制并且回答相关的 问题，我们通过构建过表达miR-9的人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 以模拟肿瘤相关的ECs，研究了miR-9在内皮血管生成中的作用，及 其对内皮自噬的影响。在此基础上，我们还研究了VEGFR2(Flk1)抑制剂凡德他尼和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)的抗血管生成作 用。最终，我们发现，抗血管生成和抗自噬治疗均促进EC释放的富 VEGF的外泌体，从而促进HCC的血管生成和进展。尽管抗血管生 成疗法在抗击多种恶性肿瘤中获得了一定效果，但是最终受限于随后的肿瘤血管生成和进展。抑制自噬可作为改善抗血管生成疗法的辅助 手段。为了研究抗血管生成和抗自噬疗法诱发肿瘤血管生成和进展的 机制，我们通过将miR-9转染入人脐静脉内皮细胞构建了肿瘤相关的 内皮细胞。我们发现，血管生成抑制剂凡德他尼抑制HUVECs中miR-9-诱导的血管生成，但在促进自噬的同时，诱导了富血管内皮生 长因子(VEGF)外泌体的生成和释放。这些富VEGF的外泌体显著地 促进了肝细胞癌中内皮血管的形成和血管生成拟态，以及小鼠肝细胞 癌的体内生长。3-甲基腺嘌呤抗自噬也可促进富VEGF的外泌体的生 成和释放，及相似的促血管生成和肿瘤生长的效果。可见，抗血管生 成和抗自噬治疗之后肿瘤血管生成和进展归因于富VEGF外泌体介 导的内皮与肿瘤细胞之间的交互作用。
更为具体地，本发明第一方面提供了一种肿瘤细胞的构建方法， 包括将miR-9表达载体转染入细胞，
优选，包括将表达miR-9的载体转染入肿瘤相关性内皮细胞。
优选，包括将表达miR-9的慢病毒载体转染入人脐静脉内皮细 胞；
更优选，将表达miR-9的慢病毒载体转染入人脐静脉内皮细胞的 步骤为:
(a)将miR-9的基因片段连接到LV3-pGLV-H1-GFP/puro-慢病 毒表达载体上，形成重组慢病毒载体，
其中所述miR-9的基因片段序列为5′ -TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA-3′，序列如SEQID NO.1所示；
(b)用所述重组慢病毒载体、pGag/Pol、pRev和pVSV-G共转 染293T感受态细胞生产重组慢病毒；
(C)用所述重组慢病毒感染人脐静脉内皮细胞。
本发明第二方面提供了一种肿瘤细胞，所述肿瘤细胞能够高表达 miR-9；
优选，所述肿瘤细胞是通过本发明第一方面所述的方法得到的肿 瘤细胞。
本发明第三方面提供了一种用于抗肿瘤药物测试、肿瘤标志物测 试、抗肿瘤标志物测试或肿瘤药物反应测试的肿瘤动物模型，所述肿 瘤动物模型能够高表达miR-9；
优选，所述肿瘤动物模型是将通过本发明第一方面所述的方法得 到的肿瘤细胞移植到动物体内得到的；
优选，所述肿瘤动物模型是将通过本发明第一方面所述的方法得 到的肿瘤细胞移植到小鼠体内得到的；
优选，所述肿瘤动物模型是将本发明第一方面所述方法得到的肿 瘤细胞皮下注射入Balb/c无胸腺的小鼠得到的。
本发明第四方面提供了抗血管生成药和/或抗自噬药在治疗 miR-9高表达的肿瘤中的用途；
优选，所述抗血管生成药选自凡德他尼；和/或
所述抗自噬药选自3-甲基腺嘌呤；和/或
优选，所述miR-9高表达的肿瘤是通过本发明第一方面所述的方 法得到的肿瘤细胞，或通过本发明第一方面所述的方法得到的肿瘤细 胞移植所产生的肿瘤组织或包含所述肿瘤组织的个体。
本发明第五方面提供了一种用于治疗或预防或减缓miR-9高表 达的肿瘤的药物，所述药物为抗血管生成药和/或抗自噬药；
优选，所述抗血管生成药选自凡德他尼；和/或
所述抗自噬药选自3-甲基腺嘌呤；和/或
优选，所述miR-9高表达的肿瘤是通过本发明第一方面所述的方 法得到的肿瘤细胞，或通过本发明第一方面所述的方法得到的肿瘤细 胞移植所产生的肿瘤组织或包含所述肿瘤组织的个体。
本发明第六方面提供了一种用于表征、检测、监测、跟踪或预后 抗血管生成药和/或抗自噬药治疗miR-9高表达的肿瘤的治疗的标记 物，所述标记物选自富VEGF外泌体和/或自噬小体；
优选，所述抗血管生成药选自凡德他尼；和/或
所述抗自噬药选自3-甲基腺嘌呤；和/或
优选，所述miR-9高表达的肿瘤是通过本发明第一方面所述的方 法得到的肿瘤细胞，或通过本发明第一方面所述的方法得到的肿瘤细 胞移植所产生的肿瘤组织或包含所述肿瘤组织的个体。
本发明第七方面提供了一种用于表征如本发明第六方面所述所 述的标记物的方法，所述方法用于非诊断目的，所述富VEGF外泌体 的表征步骤为：
(1)外泌体分离纯化；
(2)可选地，外泌体的表征；
可选地，所述外泌体分离纯化的步骤为：
(i)获取细胞培养物或待检测体液；
(ii)在第一速度下超速离心预处理；
(iii)在第二速度下超速离心以去除死细胞和细胞碎片；
(iv)在第三速度下超速离心以分离外泌体；
可选地，步骤(ii)为在300g 4℃下20min；
步骤(iii)为在3000g 4℃下离心20min；
步骤(iv)为在10，000g 4℃下离心30-min；
可选地，所述外泌体的表征方法包括：流式细胞分析、体外血管 生成测试、集落形成测试、体内血管生成测试、蛋白标记物的qRT-PCR 测试、核酸标记物的qRT-PCR测试；
优选地，其中，所述流式细胞分析的步骤为：
用抗-VEGF抗体与外泌体孵育，形成第一混合物；
用荧光标记的第二抗体与所述第一混合物温育，形成第二混合 物；
用流式细胞仪分析所述第二混合物；
所述体外血管生成测试的步骤为：
将肿瘤细胞与含有FBS和外泌体的培养基一起孵育；
对孵育结果进行染色；
用显微镜观察与成像；
所述集落形成测试的步骤为：
在细胞培养皿中播种肿瘤细胞，可选地肝癌细胞，并且用外泌体 处理以形成集落；
用结晶紫染色；
用显微镜拍照；
所述体内肿瘤发生分析的步骤为：
将基质胶、肿瘤细胞和外泌体混合形成第一混合物；
将所述第一混合物射入无胸腺的小鼠；
饲养所述小鼠与肿瘤分析；
所述蛋白标记物的qRT-PCR测试，步骤为：
从外泌体中分离RNA；
检测VEGF和/或Flk1的RNA，优选地，以β-肌动蛋白RNA为 对照；
其中：
检测VEGF的正向引物如SEQ ID NO.2所示，具体序列为：
5′-CTGACGGACAGACAGACAGACACC-3′；
检测VEGF的反向引物如SEQ ID NO.3所示，具体序列为：
5′-AGCCCAGAAGTTGGACGAAAA-3′；
检测Flk1的正向引物如SEQ ID NO.4所示，具体序列为：
5′-ACCTGGAGAATCAGACGACAA-3′；
检测Flk1的反向引物如SEQ ID NO.5所示，具体序列为：
5′-GGTTCCCATCCTTCAATACAAT-3′；
检测β-肌动蛋白的正向引物如SEQ ID NO.6所示，具体序列为：
5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′；
检测β-肌动蛋白的反向引物如SEQ ID NO.7所示，具体序列为：
5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。
所述核酸标记物的qRT-PCR测试，步骤为：
从外泌体中分离RNA；
检测成熟miR-9，优选还包括U6snRNA为对照；
检测成熟miR-9的正向引物如SEQ ID NO.8所示，具体序列为：
5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAG-3′；
检测成熟miR-9的反向引物如SEQ ID NO.9所示，具体序列为：
5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCA TACAG-3′；
检测U6snRNA的正向引物如SEQ ID NO.10所示，具体序列为：
5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；
检测U6snRNA的反向引物如SEQ ID NO.11所示，具体序列为：
5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。
本发明第八方面提供了一种用于表征本发明第六方面所述的标 记物的方法，所述方法用于非诊断目的，所述自噬小体的表征方法为：
吖啶橙染色法，步骤为：
用吖啶橙染色待检细胞；
洗涤细胞；
显微镜下观察。
本发明第九方面提供了一种用于表征本发明第六方面所述的标 记物的试剂盒，所述试剂盒包括：
用于流式细胞分析试剂组：抗-VEGF抗体，与抗-VEGF抗体结 合的荧光标记的第二抗体；和/或
用于体外血管生成测试的试剂组包括：FBS、杜尔贝科改良伊格 尔高葡萄糖培养基、Diff-Quick固定剂；和/或
用于集落形成测试的试剂组包括：结晶紫。
本发明第十方面提供了一种用于表征高表达miR-9的肿瘤受试 者中特征性表达标记物的试剂盒，可选地，所述高表达miR-9的肿瘤 患者是本发明第三方面所述的肿瘤动物模型；
所述试剂盒包括从细胞、组织、血液、体液或外泌体中分离RNA 的试剂和检测蛋白标记物的qRT-PCR测试试剂和/或检测核酸标记物 的qRT-PCR测试试剂；
其中所述检测蛋白标记物的qRT-PCR测试试剂包括检测VEGF 和/或Flk1的RNA的试剂，优选地，检测β-肌动蛋白RNA的试剂；
检测VEGF的RNA的试剂包括：
检测VEGF的正向引物如SEQ ID NO.2所示，具体序列为：
5′-CTGACGGACAGACAGACAGACACC-3′；
检测VEGF的反向引物如SEQ ID NO.3所示，具体序列为：
5′-AGCCCAGAAGTTGGACGAAAA-3′；
检测Flk1的RNA的试剂包括：
检测Flk1的正向引物如SEQ ID NO.4所示，具体序列为：
5′-ACCTGGAGAATCAGACGACAA-3′；
检测Flk1的反向引物如SEQ ID NO.5所示，具体序列为：
5′-GGTTCCCATCCTTCAATACAAT-3′；
检测β-肌动蛋白的RNA的试剂包括：
检测β-肌动蛋白的正向引物如SEQ ID NO.6所示，具体序列为：
5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′；
检测β-肌动蛋白的反向引物如SEQ ID NO.7所示，具体序列为：
5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。
所述检测核酸标记物的qRT-PCR测试试剂包括检测成熟miR-9 的试剂，优选还包括检测U6snRNA的试剂；
所述检测成熟miR-9的试剂包括：
检测成熟miR-9的正向引物如SEQ ID NO.8所示，具体序列为：
5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAG-3′；
检测成熟miR-9的反向引物如SEQ ID NO.9所示，具体序列为：
5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCA TACAG-3′；
所述检测成熟U6snRNA的试剂包括：
检测U6snRNA的正向引物如SEQ ID NO.10所示，具体序列为：
5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；
检测U6snRNA的反向引物如SEQ ID NO.11所示，具体序列为：
5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。
附图说明
图1示出了miR-9诱导的血管生成的结果。
(A)与LV3-NC(NC)比较，LV3-miR-9(miR-9)转染之后， HUVECs高表达miR-9。平均值±标准偏差(SD)，n＝4。***P<0.001。 (B)利用共聚焦显微镜观察小鼠腹部皮下基质胶栓冰冻切片中感染 慢病毒的HUVEC(GFP，绿色)；及CD34(红色)，与细胞核(DAPI， 蓝色)。血管(星号)，血管内容物(箭头)。(C和D)免疫组织 化学(IHC)用于CD34(D)以及血管直径的评价(C)。平均值± 标准误差(SEM)，20血管，n＝4。绿线指示区域是血管腔示例。直 径(Φ)＝(管腔面积/π)(1/2)×2。(E–G)IHC末端脱氧核苷酸转移酶dUTP 缺口末端标记法检测细胞凋亡(E)，胶栓中HUVECs的p-Flk1(F)、 及自噬标记物LC3B(G)水平。图片为4次独立试验中的典型示例。 (H–J)实时定量聚合酶链反应(H和I)和免疫印迹法(J)用于检 测过表达miR-9的HUVECs中VEGF和Flk1的表达，及光密度定量 分析。平均值±SEM，n＝4。*P<0.05；**P<0.01。
图2示出了凡德他尼促进miR-9-诱导内皮细胞自噬的结果。
(A-C)过表达miR-9的HUVECs以及用凡德他尼处理以后，透 射电子显微镜观察AVi(箭头)，AVd(星号)和MVB(@)(A)，及 单个细胞中Avis、AVds，和AVs(＝AVis+AVds)的数量(B)。平均 值±SEM，n＝4.*P<0.05vs.NC；#P<0.05。自噬泡(AVs)的平均 面积(C)。平均值±SEM，n＝4。*P<0.05；***P<0.001。(D-F)LC3B 的共聚焦显微视图(D)，相对平均值荧光强度(rMFI)(E)，以及每 细胞LC3斑点的数量(F)。平均值±SEM，n＝4。*P<0.05；**P< 0.01；***P<0.001vs.NC；#P<0.05；##P<0.01:###P<0.001。(G) 过表达miR-9的HUVECs以及用3-MA或/和凡德他尼处理后，自噬 体的吖啶橙(AO)染色。(H和I)过表达miR-9的HUVECs以及 用3-MA或/和凡德他尼处理后，LC3B和beclin-1水平的免疫印迹检 测(H)。光密度定量(I)。平均值±SEM，n＝4。*P<0.05。
图3示出了抗自噬可作为抑制Flk1-依赖性血管生成的辅助手段 的结果。
(A)凡德他尼浓度依赖性抑制过表达miR-9的HUVECs的 p-Flk1水平。免疫印迹法检测p-Flk1水平(底部)。光密度定量(顶 部)。平均值±SEM，n＝4。*P<0.05；**P<0.01vs.HUVECs；#P<0.05； ##P<0.01vs.miR-9。(B和C)凡德他尼对过表达miR-9的HUVECs中p-Flk1水平影响的共聚焦显微视图(B)。相对荧光强度(rMFI) (C)。平均值±SEM，n＝4。*P<0.05；**P<0.01vs.NC。(D)凡 德他尼处理后，过表达miR-9的HUVECs的VEGF分泌水平的酶联 免疫吸附检测。平均值±SEM，n＝4。*P<0.05vs.NC。(E–G)凡 德他尼或者3-MA处理后，过表达miR-9的HUVECs的迁移(F) 和侵袭(G)的Transwell检测(E)。平均值±SEM，n＝4。*P <0.05；**P<0.01vs.NC。(H–J)凡德他尼和/或3-MA处理后，过 表达miR-9的HUVECs的成管(H，顶部)、血管网络形成情况(H， 底部)，及管腔长度(I)，和连接点的数量(J)。平均值±SEM，n＝ 4。***P<0.001vs.NC。(K)flk-1抑制剂凡德他尼通过抑制VEGF分 泌与促进自噬，抑制血管生成的示意图(结果显示于图2)；以及抗 自噬可作为抗血管生成的凡德他尼治疗的辅助手段。
图4示出了抑制VEGFR(Flk1)或抗-自噬促进富VEGF的外 泌体从HUVECs释放的结果。
(A)对照HUVEC，和过表达miR-9的HUVEC及经凡德他 尼处理后的细胞透射电子显微镜视图。外泌体(箭头)、MVs(星 号)，和细胞间连接(@)。(B)细胞间隙大小。平均值±SEM，n ＝10个间隙。***P<0.001vs.NC；#P<0.05vs.miR-9。(C)细胞外 囊泡(EVs)的数量的比较。平均值±SEM，n＝4细胞。EVs分 布比较使用卡方检验。*P<0.05，***P<0.001。(D)细胞培养上清 液中分离的外泌体的透射电子显微镜视图。(E-1、E-2、F-H)过表 达miR-9且经凡德他尼或者3-MA处理后的内皮细胞，细胞外泌体释 放情况(E-1、E-2)以及VEGF-阳性外泌体簇(exo1，F；exo2，G； exo1和exo2簇中总事件，H)的纳米流式细胞术分析。平均值±SEM， n＝3。***P<0.001vs.NC。(I)收集过表达miR-9且经凡德他尼或 者3-MA处理后的HUVEC培养物的上清液，分离外泌体，免疫印 迹法检测外泌体中的VEGF水平。CD63为参考指标。光密度定量 (I，柱图)。对照，未处理的HUVECs。平均值±SEM，n＝3。 *P<0.05；**P<0.01vs.对照。(J)外泌体中miR-9水平。平均值±SEM，n＝3。***P<0.001vs.NC。(K)通过flk-1抑制剂和抗-自噬诱导富VEGF外泌体的释放的示意图。
图5示出了富VEGF的外泌体诱导HCC细胞集落形成和VM的 结果。
收集过表达miR-9且经凡德他尼或者3-MA处理后HUVECs上 清液中的外泌体，作用HuH7(A和B)与SMMC-7721细胞(C和 D)，检测集落形成情况和定量分析(检测区域961.6mm2)。平均值 ±SEM，n＝3。**P<0.01；***P<0.001vs.NC；#P<0.05vs. miR-9。(E–H)管形成情况；外泌体处理后，HuH7(E和F)与 SMMC-7721细胞(G和H)形成的管腔的总长度(检测区域1.2mm2)。 平均值±SEM，n＝3。***P<0.001vs.NC；#P<0.05vs.miR-9。
图6示出了富VEGF外泌体诱导肿瘤发生和肿瘤血管生成的结 果。
(A–C)SMMC-7721细胞的在体成瘤试验(1.0x 10-7细胞混合 于500μL基质胶)，接种时添加含/不含从HUVEC培养物上清液收 集的外泌体(12.5μg/μl，总共100μg)的磷酸盐缓冲溶液(A)。红色 箭头指示肿瘤。肿瘤体积(B)与重量(C)。平均值±SEM，n＝ 4。*P<0.05；**P<0.01。(D)用CD34标记内皮血管(箭头)，以 及用PAS标记VM血管(五角星)。图片为每组四只动物，三次独立 试验的示例。(E-F)在0.32mm2区域中内皮血管的数量(E)，和直 径(F)分析结果。(G)VM血管所占面积百分比。平均值±SEM， 分析6个0.076mm2大小的区域，每组4只动物，n＝4。*P<0.05； **P<0.01；***P<0.001；NS:P>0.05。
图7示出了由富VEGF外泌体激活的Flk1和VEGF水平VEGF 外泌体的结果。
IHC用于移植瘤肿瘤的VEGF(A)、p-Flk1(B)，和Flk1(C) 检测。图片为每组四只动物，三次独立试验的示例。(D和E)移植 瘤肿瘤中VEGF、Flk1和p-Flk1水平的免疫印迹检测(D)以及光 密度定量分析(E)。平均值±SEM，n＝4。*P<0.05。(F)富 VEGF外泌体介导的内皮细胞与肿瘤细胞之间的交互作用，以及它们 在抗-血管生成和/或抗-自噬作用之后，促进肿瘤血管生成的示意图。 经凡德他尼处理的HUVECs比用3-MA处理的HUVECs，生成更多 的富VEGF外泌体(图4E-1-4E-2，4F)，可以预见，抗血管生成较 抗-自噬作用具有更强的促血管生成能力。
具体实施方式
将用下面的实施例结合附图来进一步阐述本发明以便提供更好 的理解本发明的基础。
1.方法
在小标题前的序号是为了容易阅读，仅做参考而不决定顺序。
1.1细胞培养
使用HUVEC培养基(HUVEC-004；Allcells)培养HUVECs (Allcells，上海，中国)。我们使用第三代至第六代HUVECs。人类 HCC细胞系SMMC-7721和Huh7购买自美国模式培养物保藏所 (ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚，美国)，在含10％胎牛血清(FBS； Hyclone)的杜尔贝科改良伊格尔培养基高葡萄糖培养基(Hyclone； GE Healthcare，洛根，犹他州，美国)中生长。细胞维持在5％CO2， 37℃。
将MiR-9模拟物(5′-TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA-3′) 插入LV3-pGLV-H1-GFP/puro-慢病毒载体(LV3-miR-9；Cat.No. 150611AZ；GenePhara，上海，中国)。将慢病毒载体(LV3-NC； Cat.No.E23BZ；GenePharma)用作NC。在DNA测序之后，根据 制造商的说明书用293T细胞与慢病毒载体pGag/Pol、pRev和pVSV-G 共转染生产重组慢病毒(miR-9模拟物和NC)并且用于感染 HUVECs。72h后进行基于GFP表达的荧光激活细胞分选，通过实时 逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)证实miR-9过表达。为了探究在肿 瘤-细胞迁移、侵袭、血管生成以及外泌体的释放中Flk1及自噬的作 用，使用Flk1抑制剂凡德他尼(4μM)和自噬抑制剂(3-MA)(5mM) 预处理HUVECs 60min，并将其添加到后续的试验培养基(HUVEC 基础培养基，HUVEC-004B；Allcells)中。
1.2外泌体的分离和纯化
从培养物上清液分离外泌体。经慢病毒感染的HUVECs在 37℃，5％CO2条件下培养48h，形成融合细胞单层。然后，用或不 用凡德他尼(4μM)或者3-MA(5mM)处理细胞60min。在300g (Centrifuge 5804R；Eppendorf，汉堡，德国)4℃下离心20min， 3000g 4℃下离心20min以去除死细胞和细胞碎片，随后10，000g (Centrifuge 5804；Eppendorf)4℃下离心30min沉淀MVs。使用 0.22-μm过滤器(Millipore，比尔里卡，马萨诸塞州，美国)过滤 上清液，随后通过100，000g超速离心(Optima L-80XP，Beckman Coulter，布瑞亚市，加州，美国)2h，收集上清液中的外泌体沉淀。 收集的外泌体重悬于100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并储存于 4℃冰箱。
1.3外泌体的纳米流式细胞术分析
为了检测特定的表面蛋白，外泌体与抗-VEGF抗体(1:200， ab52917；Abcam，Cambridge，马萨诸塞州，美国)一起在25℃ 孵育30min，然后与AlexaFluor488山羊抗兔IgG二抗(1:2000， H&L；ab150081；Abcam)一起在25℃孵育10min。分别使用兔IgG (1:2000，单克隆；ab172730；Abcam)与未标记的样本用作同型 对照和空白对照。使用ApogeeA60纳米流式细胞仪(Apogee Flow Systems，Northwood，UK)(其为专用于分析纳米粒子而研发的流式细胞仪，http://www.apogeeflow.com/products.php)分析外泌体。
使用折射率为1.59的参考ApogeeMix珠(110-和500-nm绿色 荧光乳胶珠的混合物，Cat#1493；Apogee Flow Systems)和折射率 为1.43的非荧光硅珠(180nm、240nm、300nm、590nm、880nm 和1300nm；http://www.apogeeflow.com/products.php)评价流式细胞 仪的性能和外泌体的粒径分布。将PBS用作背景对照。对参考珠和 外泌体样本进行默认设置。在1.5μL/min的样本流速，总体积为130 μL条件下，利用大角度光散射(LALS)进行粒径分析。将激光 (488-LALS)的样本流速阈值设置为30V和350V，将488-Grn(绿 色荧光)激光的样本流速阈值设置为17V和475V。设定背景门后， 使用Apogee Histogram软件v255.0.0.68(Apogee Flow Systems)计 算感兴趣区域的事件。
1.4体外血管生成分析和集落形成分析
HUVECs在基质胶上可分化形成毛细管状结构，用于评估体外血 管生成能力。用基质胶(300μL/孔，BD生物科学，圣何塞，加利 福尼亚州，美国)包被24-孔板，避免气泡产生。基质胶胶化之后， 每孔接种5×104慢病毒感染的HUVECs，并加入200μL含有10％ FBS的HUVEC基础培养基。为了评估来源于HUVECs的外泌体在 恶性肿瘤VM形成中的作用，将5×104HCC细胞(Huh7或者 SMMC-7721)接种于基质胶包被的孔中，每孔加入10％FBS和5μg 外泌体的200μL杜尔贝科改良伊格尔高葡萄糖培养基。在37℃，5％ CO2/95％空气培养箱中孵育6h检测HUVEC血管生成情况，或者 孵育8h检测HCC细胞VM形成情况。移除培养基后，加入Diff-Quick 固定剂(DadeBehring，Deerfield，IL，美国)孵育30s，然后 使用溶液II染色2min。用显微镜观察成管情况并拍照。使用Image J 软件(版本1.51s，国立卫生研究院，Bethesda，MD，美国)的 血管生成分析插件分析细胞的假性血管组织。
对于集落形成分析，在35-mm细胞培养皿中以2×104细胞/ 孔的密度播种HCC并且用5μg外泌体处理14天以形成菌落。用 结晶紫染色(0.5％，w/v)细胞，用显微镜拍照，使用Image J软件(国 立卫生研究院)定量。
1.5体内血管生成分析
使用鼠基质胶栓评价体内血管生成。依据实验动物指导准则使 用动物，所有动物实验经四川大学动物保护和使用委员会批准。将基 质胶(500μL)单独地或者与1.0×107慢病毒感染的HUVECs一起 皮下注射入三只6-周龄无胸腺的BALB/c Nu/Nu裸鼠(广东省医学实验动物中心，广东，中国)的腹部区域以形成基质胶栓。在注射 7天后处死小鼠，并且取出基质胶栓，用福尔马林固定，并且包埋于 石蜡中。使用苏木精和伊红染色，以及CD34的免疫组织化学(IHC) 染色，确定血管生成的水平。用Image J软件(国立卫生研究院) 分析血管的数量和尺寸。通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末 端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡水平。
1.6体内肿瘤发生分析
基质胶(500μL)与总共1.0×107SMMC-7721细胞和100μg 来源于HUVECs的外泌体(经3-MA处理/未处理的NC或miR-9慢 病毒感染的HUVECs)混合，并且皮下注射入三只6-周龄Balb/c无 胸腺的雌性裸鼠的右腹。设定基质胶与SMMC-7721细胞/PBS混合对 照。每周测量肿瘤尺寸，并绘制生长曲线。三周以后，处死小鼠， 分离肿瘤，并且利用卡尺测量并评价肿瘤体积。通过IHC染色和免 疫印迹法检测CD34-PAS、VEGF、Flk1和p-Flk1，从而评价血管生 成。
1.7细胞迁移与侵袭分析
预处理之后，用0.25％EDTA胰蛋白酶消化慢病毒感染的 HUVECs，并且在有或者没有4μM凡德他尼或者5mM 3-MA的 HUVEC基础培养基中重悬。以1×105细胞每Transwell(BD生物 科学)的密度接种细胞，并且将含有10％FBS的HUVEC基础培养 基添加到下室。48h后，用4％多聚甲醛固定细胞10min，随后用PBS 洗涤两次并用结晶紫(0.5％，w/v)染色。用棉拭子移除非侵袭细 胞，并且定量穿膜迁移的细胞。为了检测侵袭，使用基质胶预包被Transwell膜，在检测迁移时则不进行预包被。
1.8酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF
用凡德他尼(4μM)预处理慢病毒感染的HUVECs 60min，并 且根据制造商的说明书使用ELISA试剂盒(Catalog#PDVE00；R&D 系统，明尼阿波利斯，MN，美国)检测细胞培养物上清液中的 VEGF水平。
1.9qRT-PCR
用Trizol(Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，美国)从细胞、 组织和外泌体中分离核糖核酸(RNA)，使用SYBR Premix Ex Taq试 剂盒(Takara，志贺，日本)执行qRT-PCR分析。引物序列如下: VEGF，5′-CTGACGGACAGACAGACAGACACC-3′(正向)和 5′-AGCCCAGAAGTTGGACGAAAA-3′(反向)；Flk1，5′-ACCTGGAGAATCAGACGACAA-3′(正向)和 5′-GGTTCCCATCCTTCAATACAAT-3′(反向)；以及β-肌动蛋白， 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′(正向)和 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′(反向)。从Takara获取 所有引物和探针。使用2-△△CT方法将目的基因表达标准化为β-肌动 蛋白的表达水平，并且将数据表示为相对于在对照中表达水平的比 值。成熟miR-9与U6小核(sn)RNA的茎环引物和探针如下: hsa-miR-9-5p，5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAG-3′ (正向)和 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATAC AG-3′(反向)；以及U6snRNA 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正 向)和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反向)。将miR-9的 相对表达水平标准化到U6snRNA的表达水平，并且展示为相对于在 对照中表达水平的比值。三次独立重复试验。
1.10免疫印迹
使用含有蛋白酶-抑制剂cocktail(碧云天，北京，中国)的放 射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液提取细胞、组织和外泌体的蛋白。 使用蛋白测定试剂盒(Cayman ChemicalCompany，安阿伯市，MI， 美国)测定蛋白浓度后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离～50–100μg蛋白样本，电转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore，比尔 里卡，马萨诸塞州，美国)上，用5％脱脂奶粉封闭，并且用VEGF 抗体(TA500289；Origene，罗克维尔，MD，美国)，Flk1抗体 (#9698；Cell信号Technology，丹弗斯，马萨诸塞州，美国)， p-Flk1抗体(Tyr1175；#19A10；Cell signal Technology)，LC3BI/II 抗体(ab192890；Abcam)，和CD63抗体(ab134045；Abcam)在4℃ 下过夜杂交。将抗体1:1000稀释用于检测。将甘油醛-3-磷酸脱氢 酶用作内部对照。蛋白印迹与相应的辣根过氧化物酶(HRP)-结合的 第二抗体(1:5000；碧云天)一起孵育，然后使用Immobilon western 化学发光HRP底物(WBKLS0050；Millipore)执行增强的化学发 光以可视化条带。使用Image J软件(国立卫生研究院)执行光密 度定量。
1.11免疫染色和共聚焦显微镜
对LC3BII和p-Flk1进行免疫荧光染色和定量分析。处理之后， 用2％多聚甲醛/0.1％戊二醛立即固定HUVECs 30min，用0.1％ Triton X-100(T-8787；Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国) 通透5min，用2％山羊血清(Invitrogen)封闭30min，用抗p-Flk1 抗体(1:100；Tyr1175；#19A10；1:100；Cell signal Technology) 和LC3B抗体(1:100；ab192890；1:100；Abcam)在4℃过夜孵 育，然后用AlexaFluor 647山羊抗兔IgG H&L(1:300；ab150076； Abcam)和Alexa Fluor 594驴抗-兔IgG H&L(1:300；ab150079； Abcam)第二抗体在25℃下孵育1h。用蔡司LSM 510激光扫描共 聚焦显微镜(蔡司，上科亨，德国)使用平面高度消色镜63×/1.4 油DIC物镜显像所有样本，使用Image J软件(国立卫生研究院)分析图像堆栈。通过计算LC3斑点的数量定量自噬泡。
为免疫染色分析基质胶栓中的CD34，立刻在OCT化合物中冷 冻样本，切成5-μm冰冻切片，在4℃用冷丙酮固定5min。用0.1％ Triton X-100(T-8787；Sigma-Aldrich)通透10min，并用1％牛血 清白蛋白在25℃封闭1h后，用CD34抗体(1:100；ab81289； Abcam)在4℃孵育过夜。
然后25℃用Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG H&L(1:300； ab150076；Abcam)孵育样本1h，在4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(1 μg/mL；Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国) 下孵育5min，用共聚焦显微镜捕获图像。
1.12免疫组织化学(IHC)染色
基质胶栓和肿瘤移植瘤样本立即在25℃70％乙醇中脱水30min 三次，在25℃90％乙醇中脱水30min两次，在25℃100％乙醇中 脱水30min三次，在25℃二甲苯中脱水20min三次，在甲醛固定液 中固定，在58℃下包埋于石蜡，并且切割成3-μm切片进行免疫染色。 首先，将玻片浸入二甲苯每次15min两次，100％乙醇每次5min 两次，85％乙醇5min，75％乙醇5min，用去离子H2O漂洗，浸 入92-95℃预热的回收液(Catalog#CTS015，R&D系统)8min， 然后在25℃冷却8min。用去离子水漂洗玻片，用3％H2O2在黑暗中 孵育15min，用3％牛血清白蛋白在25℃封闭30min。然后用含 1％牛血清白蛋白、0.3％Triton X-100和0.01％叠氮化钠的PBS稀 释的第一抗体4℃过夜孵育玻片。所用抗体包括CD34抗体(1:100； ab81289；Abcam)、VEGFA抗体(1:100；TA500289；Origene)、 Flk1抗体(1:100；#9698；Cell信号Technology)、p-Flk1抗体 (Tyr1175；1:100；#19A10；Cell Signal Technology)，和LC3B抗体(1:100；ab192890；Abcam)。在PBS中洗涤三次，每次5min； 用HRP-结合的第二抗体(1:5000；碧云天)孵育玻片50min。在 PBS中洗涤三次，每次5min；然后，用干净的DAB显色液孵育玻 片10min，并且用苏木精复染细胞核3min。对于CD34-PAS染色， IHC染色CD3415min后用PAS孵育切片。玻片经75％乙醇中脱水 6min，85％乙醇6min，100％乙醇6min两次，以及二甲苯5min 两次，最终使用PermountTM封片剂(Fischer Scientific，匹兹堡，宾 西法尼亚州，美国)封片，并且使用显微镜在明场照明下可视化。
1.13TUNEL分析
对于TUNEL染色，根据制造商的方案使用辣根过氧化物酶 (POD；Roche，巴塞尔，瑞士)的原位细胞死亡检测试剂盒。脱 蜡和再水化之后，切片与蛋白酶K(40μg/mL)一起在37℃孵育15 min，3.0％过氧化氢孵育5min以去除内源性过氧化物酶。将样本 浸入TUNEL反应混合液在37℃下黑暗中孵育75min，然后与 Converter-POD(Roche)孵育30min。用光学显微镜捕获图像。
1.14吖啶橙(AO)染色自噬体
将AO(Sigma-Aldrich)用于评价自噬期间酸性泡状细胞器的形 成。处理之后，HUVECs在PBS中洗涤一次并且用AO(1μg/mL) 在37℃黑暗中孵育15min。然后在PBS中洗涤细胞并在倒置荧光显 微镜(Olympus IX71；Olympus，东京，日本)下观察细胞。
1.15透射电子显微镜
处理之后，立即用2％电子显微镜级戊二醛(Polysciences，沃 灵顿，宾夕法尼亚州，美国)在0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4) 中固定HUVECs 30min。然后用二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞一次，用 1％四氧化锇(ElectronMicroscopy Sciences，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州，美国)在0.1M二甲胂酸钠缓冲液后固定1h，用1％醋酸 铀(Polysciences)在70％乙醇中整块染色1.5h。经梯度乙醇脱水 (50–100％)之后，样本包埋于环氧树脂812(Epon812)和环氧 树脂M(Araldite M)(Sigma-Aldrich)的环氧树脂混合物。使用透射 电子显微镜(Tecnai G2Spirit；BioTWIN；FEI；Thermo Fisher Scientific)分析超薄切片(40nm)。对于分离的外泌体，将10μL 重悬的外泌体沉淀于25℃吸附在聚醋酸甲基乙烯脂/碳包被的铜网上 5min，用10μL 1％磷钨酸在25℃下负染5min，并使用透射电子显 微镜检查。
1.16统计分析
使用SPSS软件(v24.0；IBM，Armonk，NY，美国)，利 用最小显著差异检验或者Tamhane’s T2检验(取决于Levene’s统计 方差齐性)的单因素方差分析确定统计显著性。利用卡方检验分析 EVs的分布。若P<0.05，则认为有显著统计意义。
2.试验及其结果
除非另外或进一步说明，下文中所采用的试验方案为上文的小标 题方法中所指或确定的并在下文不再描述或详细描述。在附图或照片 中所示的一些试验结果的细节在或仅在小标题附图的简要说明中描 述。对于试验和结果的进一步解释，见下面章节。
2.1MiR-9体内诱导血管生成
为了模拟肿瘤相关ECs中miR-9的上调，我们将表达miR-9的 慢病毒转染入HUVECs以构建细胞模型(图1A)。然后，使用基质 胶栓评价该细胞模型的在体成血管能力。人类祖细胞抗原分化群 (CD)34在HUVECs上表达，是血管生成的内皮标记物。我们发 现，在混合有过表达miR-9的HUVECs的基质胶栓中，无需添加血 管生成因子，有明显的血管生成现象(图1B–D)，其血管直径为15-95 μm，最大45-55μm(图1C)。而在阴性对照(NC)组中，生成的 血管难于辨认。与NC比较，miR-9抑制了细胞凋亡(图1E)，增 强了Flk1的磷酸化(图1F)，并增加了自噬标记物LC3B的水平(图 1G)。
我们然后分析了miR-9在HUVECs的VEGF和Flk1表达中的作 用。与血管生成的诱导相一致，miR-9增加了HUVECs的VEGF和 Flk1mRNAs和蛋白水平，并促进VEGFA的释放，提示miR-9促进 与VEGF信号相关的自分泌作用以诱发血管生成(图1H–J)。由此可 知，我们成功地构建了高表达miR-9的细胞模型。
2.2MiR-9与抗血管生成的凡德他尼诱发自噬
自噬是涉及细胞质组分清除的溶酶体降解途径。为了研究miR-9 是否诱发自噬，以及用凡德他尼的抗-VEGFR2(Flk1)处理是否诱发 自噬，我们评估了使用或者不使用凡德他尼处理的过表达miR-9的 HUVECs自噬的变化(图2)。我们观察到miR-9转染的HUVECs 中有大量形态完整的早期/初级自噬泡(AVis)和含有降解的细胞质 材料和溶酶体-融合组分的晚期/降解的自噬泡(AVds)(图2A)。凡 德他尼处理进一步增加了ECs中AVis和AVds的数量和尺寸(图2 B和C)，以及具有空泡的多泡体(MVBs)的融合(图2A)。我们 还评估了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对miR-9和凡德他尼 诱发的自噬的逆效果(图2D–I)。施用3-MA通过抑制LC3B和 beclin-1表达显著地消除了miR-9和凡德他尼诱发的自噬(图2D， E，H和I)，并且将LC3BI转化为LC3BII(图2H和I)。3-MA 还减少了LC3B斑点(图2D和F)与自噬泡的数量(图2G)。
2.3凡德他尼和3-MA抑制血管生成
图3A示出了施用凡德他尼60min之后，miR-9-诱导的Flk1磷 酸化以浓度依赖性方式被显著地抑制(在2μM P<0.05，在4和8μM P<0.01)。我们还发现了施用4μM凡德他尼60min几乎完全地抑制 了Flk1磷酸化、及miR-9诱导的FLK1在细胞膜上的再定位(图3B 和C)，并且抑制了miR-9-诱导的VEGFA分泌(图3D)。
我们然后分析了在miR-9-诱导的血管生成中，凡德他尼和3-MA 的作用。凡德他尼或者3-MA处理显著地抑制了由miR-9诱导的细胞 迁移和侵袭(图3E–G)。同时，凡德他尼或者3-MA或者二者处理显 著地降低了由miR-9诱导的管形成、管腔长度和连接点的数量(图3H–J)。这些结果显示miR-9不仅仅通过激活HUVECs中的Flk1信 号，还通过促进细胞自噬促进血管生成。抗-血管生成和/或抗-自噬抑 制miR-9-诱导的血管生成(图3K)。
2.4施用凡德他尼或者3-MA促进HUVECs释放富VEGF外泌体
图4A和B示出了miR-9显著地将细胞间隙从147.0±29.9nm (NC)扩大到716.1±44.8nm，尽管它没有改变包括外泌体和微泡 (MVs)的细胞外囊泡(EVs)的尺寸分布和数量(图4C)。出人意料 地，凡德他尼处理(抗-VEGFR2)，虽然抑制了血管生成(图3)， 但是不仅进一步将细胞间隙扩大到896.2±94.3nm，还增加了EVs 的数量并改变了他们的尺寸分布(图4C)。凡德他尼处理使30-150 nm尺寸的EVs显著增加。外泌体具有脂双层膜，可携带RNA分子 和蛋白质等。我们发现了过表达miR-9的HUVECs具有较NC细胞 (85.9±4.9μm，n＝4，P<0.05)相比更大的细胞面积(112.3±5.8μm， n＝4)，凡德他尼进一步将细胞面积增加到136.9±6.0μm(n＝4， P<0.01)。
我们然后利用超速离心方法从HUVECs的培养基上清液中分离 得到了外泌体。分离的EVs的尺寸在23nm到210nm范围，其中 30nm和150nm之间的EVs占所有EVs的90.3％(图4D)。图4D 的插图中的外泌体具有典型的杯形结构。使用纳米流式细胞术，我们 进一步发现了来自施用凡德他尼或者3-MA之后过表达miR-9的 HUVECs的上清液中有两簇富含VEGF的外泌体(exo1和exo2)(图 4E-1-4E-2、F-H)。这些富VEGF外泌体的尺寸小于110nm(图 4E-1-4E-2)。我们没有检测到大于200nm富VEGF的MVs。凡德他 尼或者3-MA不仅增加了HUVEC外泌体中的VEGF水平，还增加了 过表达miR-9HUVEC的VEGF水平(图4I)，但是它们都没有影响这些外泌体中的miR-9水平(图4J)。
上述结果表明用VEGFR2或者自噬抑制剂处理，促进了来自ECs 的富VEGF外泌体的释放，特别是来自肿瘤相关的ECs(过表达 miR-9)的富VEGF外泌体的释放(图4K)。
2.5富VEGF外泌体体外促进HCC集落形成与血管生成拟态
为了研究富VEGF外泌体对肝细胞癌(HCC)发生和发展的作 用，我们收集了凡德他尼或者3-MA处理后过表达miR-9的HUVECs 分泌的富VEGF外泌体，并用于处理Huh7和SMMC-7721细胞(恶 性的HCC细胞系)。图5A–H显示了，相比来源于未经抑制剂处理 的过表达miR-9的HUVECs的富miR-9-外泌体，这些富VEGF外泌 体显著地增加了Huh7和SMMC-7721细胞的集落和管形成。这些结 果表明富VEGF外泌体促进HCC增殖与癌细胞血管生成拟态 (VM)。VM是肿瘤细胞形成的内皮血管样网络。
2.6富VEGF外泌体促进在体肿瘤血管生成和HCC进展
为了检验富VEGF外泌体在体HCC进展中的作用，我们向无胸 腺的裸鼠的腹部区域中皮下注射了混合有SMMC-7721细胞和来源于 HUVECs的外泌体的基质胶。我们发现了，与接种混有PBS的基质 胶的小鼠相比，接种混有富miR-9的外泌体和NC-外泌体的基质胶的小鼠分别在10天和17天(P<0.05)呈现出显著的肿瘤生成现象 (图6A–C)。然而，在接种了混合了3-MA处理后过表达miR-9的 HUVECs分泌的富VEGF外泌体的基质胶的小鼠中，肿瘤生长更明 显。由于与3-MA相比，由凡德他尼诱导的富VEGF外泌体更多(图 4F和G)，预期使用凡德他尼处理的过表达miR-9的HUVECs释放的 外泌体，将显著促进肿瘤生成和进展。
为了分析源自HUVECs的外泌体在微血管增殖中的作用，我们 通过免疫组织化学(IHC)染色分析了CD34(图6D中箭头，内皮 血管标记)和高碘酸希夫(PAS，图6D中星号，VM标记)染色 在肿瘤切片中定量了EC血管生成和VM情况(图6D-G)。富miR-9 的外泌体比PBS和NC-外泌体，诱发了更多更大的血管内皮血管(对 于血管数量P<0.001以及对于血管直径P<0.01)，但在VM的形成中 没有显著性差异。然而，富VEGF外泌体不但诱发了更多更大的内皮血管的形成(图6D-F)还有更多VM的形成(图6D和G)，表明 富VEGF外泌体特异地促进VM。
随后我们验证了在接种了富miR-9-和富VEGF外泌体的肿瘤组 织中VEGF(图7A)、p-Flk1(图7B)的蛋白水平的增加。通过免 疫印迹法进一步确认了这些增加(图7D，E)。在接种了PBS以及 NC-、富miR-9-和富VEGF外泌体的肿瘤细胞中未观察到明显的细胞 凋亡改变(数据未显示)。
结合图3、4A-J、5、6、7A-E的结果，我们得出结论抗-血管 生成(即，通过凡德他尼)和/或抗自噬(即，通过3-MA)诱发肿 瘤相关的ECs(过表达miR-9)释放富VEGF外泌体，其增加了内 皮血管和VM的形成，尤其是在肿瘤组织中VM的形成，因而促进 肿瘤的生长和进展，如图7F所示。
3.讨论
VEGF与VEGFRs如VEGFR2(Flk1)结合，启动络氨酸激酶信 号级联，以促进血管生成，及肿瘤生长和进展。使用VEGFR抑制剂 (即，凡德他尼)，或者抗血管生成疗法(AATs)可靶向肿瘤血管，然 而，在许多病症患者中均未能取得理想的效果11-13。抗血管生成剂与 常规的放疗或化疗一起施用仅产生了适度生存效益14。尽管人们早已 认识到AATs的益处是短暂的，以及许多肿瘤通过血管选定、内皮血 管生成和血管生成拟态(VM)为它们提供进展所需营养和氧供应3-7,15，但是并不清楚这些途径是如何发展的。我们的研究的研究结果 对此提供了合理的解释和阐明。
抗-VEGFR2的凡德他尼成功地抑制了肿瘤相关ECs(过表达 miR-9)的血管生成及VEGFA分泌，解释了AATs的短期疗效。然而， 凡德他尼触激发了ECs的富VEGF外泌体的释放。富VEGF外泌体 在体外增加了HCC的集落和血管网络形成，在体内增强了HCC中内 皮血管生成和VM，促进了肿瘤生长和进展，同时还提高了肿瘤组 织中VEGF、p-Flk1和Flk-1的水平。这些发现说明了AATs的晚期 抗性是如何发展的。高水平VEGF还说明肿瘤组织中新形成的内皮血 管具有渗漏壁面，对肿瘤侵袭和转移易感16,17。
已经证实在远端转移位点处的“土壤”应当首先被来自原发肿瘤 的肿瘤-分泌因子所激活以形成合适的微环境，促进循环肿瘤细胞 (CTCs)的生存和生长18。检测血中的富VEGF外泌体将成为AATs 后转移癌症诊断或预测的新方法。靶向肿瘤相关的ECs成为癌症治疗中靶向肿瘤的重要方法。
AATs与其他靶向癌症治疗之间重要的不同为，对未经筛选的病 人使用抗血管生成剂，抑制肿瘤组织中通常存在的血管生成19。致癌 的miR-9在HCC组织和HCC相关的ECs中显著地高表达，我们的 发现表明抗-VEGFR2的凡德他尼显著地提高了过表达miR-9的ECs的富VEGF外泌体的释放水平，因此，在AATs治疗前，有必要对病 人进行筛选以避免产生抗性。
我们模拟了在肿瘤相关ECs中miR-9的上调，并发现了通过激 活VEGF/Flk1信号促进EC血管生成以及富miR-9外泌体的释放， 参与促进裸鼠中HCC移植瘤的内皮血管生成。通过凡德他尼抗 -VEGFR2成功地抑制了miR-9促进的EC血管生成，但诱发ECs 释放富VEGF外泌体。
自噬是亚细胞降解的动态过程，其对于营养不良状况下的细胞存 活是必要的。自噬可促进或抑制肿瘤，这取决于肿瘤类型和处理方法 20。我们的结果显示了miR-9抑制了EC凋亡、促进了血管生成，但 诱发了细胞自噬。通过凡德他尼抗-VEGFR2抑制了miR-9-诱导的血 管生成，但进一步促进了miR-9-诱导的细胞自噬。
肿瘤血管生成包括VM和血管生成5,15。已有研究表明，在一些 肿瘤中，自噬可能与肿瘤血管生成相关21,22,但VM的形成不依赖于 VEGF-驱动的、由自噬和Flk1活化介导的血管生成22,23。我们的研究 结果表明，3-MA和凡德他尼抑制了miR-9-诱导的EC血管生成。因 此，抗-自噬能够成为AATs的辅助策略。尽管抗-VEGFR2促进了自 噬，但抗-VEGFR2和抗-自噬二者联合作用仍抑制了miR-9-诱导的血 管生成。通过3-MA抗-自噬废除了抗-VEGFR2-诱导的自噬，但没有 改变由抗-VEGFR2诱导的抗血管生成的效果。
在另一方面，通过凡德他尼或者3-MA对血管生成的抑制显著地 诱导了来自miR-9过表达ECs的富VEGF外泌体的分泌。外泌体是 多泡体(MVBs)与质膜融合释放的腔内囊泡24。抑制自噬可促进EC 外泌体释放，以通过融合的自噬体–MVB细胞内区室移除细胞废物 25-27。然而，令人惊讶的是抑制血管生成也促进了ECs释放富VEGF 外泌体。
我们的研究结果清楚地显示了外泌体在肿瘤血管生成中的作用。
总之，我们发现，经抗-血管生成或者抗-自噬处理之后肿瘤相关 ECs释放的富VEGF外泌体，负责肿瘤细胞和ECs的交互作用以促 进肿瘤血管生成。该发现为提高AATs的治疗效果提供了一些合理的 策略。
抗-自噬与抗-血管生成一样可抑制血管生成，但是激发更少的富 VEGF外泌体，表明抗-自噬是辅助或更好的AAT策略。我们的发现 还提示了控制外泌体分泌或改变外泌体成分以抑制肿瘤血管生成，可 增强肿瘤的抗血管生成和抗-自噬治疗效果。
4.工业化前景分析
1)富VEGF外泌体可用于评价肿瘤病人的耐药性和预后。
2)注射VEGF中和的内皮细胞外泌体，联合凡德他尼或3-MA等 对肿瘤病人进行治疗。
3)注射含VEGF抑制剂/抗体的内皮细胞外泌体，对肿瘤病人进 行治疗。
4)干预肿瘤相关内皮细胞释放富VEGF，进行治疗。
5)制备检测肿瘤病人内皮细胞过表达miR-9的试剂盒，用于筛 选适合抗血管生成治疗的患者，以期避免产生抗性。
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本 发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发 明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川大学
<120> miR-9高表达肿瘤及其治疗与特异标记物的表征
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 1
tctttggtta tctagctgta tga 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 2
ctgacggaca gacagacaga cacc 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 3
agcccagaag ttggacgaaa a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 4
acctggagaa tcagacgaca a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 5
ggttcccatc cttcaataca at 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 6
atcgtgcgtg acattaagga gaag 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 7
aggaaggaag gctggaagag tg 22
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 8
acactccagc tgggtctttg gttatctag 29
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 9
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtcat acag 44
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 10
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<400> 11
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (10)

1.一种肿瘤细胞的构建方法，包括将miR-9表达载体转染入细胞，
优选，包括将表达miR-9的载体转染入肿瘤相关性内皮细胞。
优选，包括将表达miR-9的慢病毒载体转染入人脐静脉内皮细胞；
更优选，将表达miR-9的慢病毒载体转染入人脐静脉内皮细胞的步骤为:
(a)将miR-9的基因片段连接到LV3-pGLV-H1-GFP/puro-慢病毒表达载体上，形成重组慢病毒载体，
其中所述miR-9的基因片段序列为5′-TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA-3′，序列如SEQ IDNO.1所示；
(b)用所述重组慢病毒载体、pGag/Pol、pRev和pVSV-G共转染293T细胞生产重组慢病毒；
(C)用所述重组慢病毒感染人脐静脉内皮细胞。
2.一种肿瘤细胞，所述肿瘤细胞能够高表达miR-9；
优选，所述肿瘤细胞是通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞。
3.一种用于抗肿瘤药物测试、肿瘤标志物测试、抗肿瘤标志物测试或肿瘤药物反应测试的肿瘤动物模型，所述肿瘤动物模型能够高表达miR-9；
优选，所述肿瘤动物模型是将通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞移植到动物体内得到的；
优选，所述肿瘤动物模型是将通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞移植到小鼠体内得到的；
优选，所述肿瘤动物模型是将要求1所述的方法得到的肿瘤细胞皮下注射入Balb/c无胸腺的小鼠得到的。
4.抗血管生成药和/或抗自噬药在治疗miR-9高表达的肿瘤中的用途；
优选，所述抗血管生成药选自凡德他尼；和/或
所述抗自噬药选自3-甲基腺嘌呤；和/或
优选，所述miR-9高表达的肿瘤是通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞，或通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞移植所产生的肿瘤组织或包含所述肿瘤组织的个体。
5.一种用于治疗或预防或减缓miR-9高表达的肿瘤的药物，所述药物为抗血管生成药和/或抗自噬药；
优选，所述抗血管生成药选自凡德他尼；和/或
所述抗自噬药选自3-甲基腺嘌呤；和/或
优选，所述miR-9高表达的肿瘤是通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞，或通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞移植所产生的肿瘤组织或包含所述肿瘤组织的个体。
6.一种用于表征、检测、监测、跟踪或预后抗血管生成药和/或抗自噬药治疗miR-9高表达的肿瘤的治疗的标记物，所述标记物选自富VEGF外泌体和/或自噬小体；
优选，所述抗血管生成药选自凡德他尼；和/或
所述抗自噬药选自3-甲基腺嘌呤；和/或
优选，所述miR-9高表达的肿瘤是通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞，或通过权利要求1所述的方法得到的肿瘤细胞移植所产生的肿瘤组织或包含所述肿瘤组织的个体。
7.一种用于表征如权利要求6所述的标记物的方法，所述方法用于非诊断目的，所述富VEGF外泌体的表征步骤为：
(1)外泌体分离纯化；
(2)可选地，外泌体的表征；
可选地，所述外泌体分离纯化的步骤为：
(i)获取细胞培养物或待检测体液；
(ii)在第一速度下超速离心预处理；
(iii)在第二速度下超速离心以去除死细胞和细胞碎片；
(iv)在第三速度下超速离心以分离外泌体；
可选地，步骤(ii)为在300g 4℃下20min；
步骤(iii)为在3000g 4℃下离心20min；
步骤(iv)为在10，000g 4℃下离心30-min；
可选地，所述外泌体的表征方法包括：流式细胞分析、体外血管生成测试、集落形成测试、体内血管生成测试、蛋白标记物的qRT-PCR测试、核酸标记物的qRT-PCR测试；
优选地，其中，所述流式细胞分析的步骤为：
用抗-VEGF抗体与外泌体孵育，形成第一混合物；
用荧光标记的第二抗体与所述第一混合物温育，形成第二混合物；
用流式细胞仪分析所述第二混合物；
所述体外血管生成测试的步骤为：
将肿瘤细胞与含有FBS和外泌体的培养基一起孵育；
对孵育结果进行染色；
用显微镜观察与成像；
所述集落形成测试的步骤为：
在细胞培养皿中播种肿瘤细胞，可选地肝癌细胞，并且用外泌体处理以形成集落；
用结晶紫染色；
用显微镜拍照；
所述体内肿瘤发生分析的步骤为：
将基质胶、肿瘤细胞和外泌体混合形成第一混合物；
将所述第一混合物射入无胸腺的小鼠；
饲养所述小鼠与肿瘤分析；
所述蛋白标记物的qRT-PCR测试，步骤为：
从外泌体中分离RNA；
检测VEGF和/或Flk1的RNA，优选地，以β-肌动蛋白RNA为对照；
其中：
检测VEGF的正向引物如SEQ ID NO.2所示，具体序列为：
5′-CTGACGGACAGACAGACAGACACC-3′；
检测VEGF的反向引物如SEQ ID NO.3所示，具体序列为：
5′-AGCCCAGAAGTTGGACGAAAA-3′；
检测Flk1的正向引物如SEQ ID NO.4所示，具体序列为：
5′-ACCTGGAGAATCAGACGACAA-3′；
检测Flk1的反向引物如SEQ ID NO.5所示，具体序列为：
5′-GGTTCCCATCCTTCAATACAAT-3′；
检测β-肌动蛋白的正向引物如SEQ ID NO.6所示，具体序列为：
5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′；
检测β-肌动蛋白的反向引物如SEQ ID NO.7所示，具体序列为：
5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。
所述核酸标记物的qRT-PCR测试，步骤为：
从外泌体中分离RNA；
检测成熟miR-9，优选还包括U6snRNA为对照；
检测成熟miR-9的正向引物如SEQ ID NO.8所示，具体序列为：
5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAG-3′；
检测成熟miR-9的反向引物如SEQ ID NO.9所示，具体序列为：
5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATACAG-3′；
检测U6snRNA的正向引物如SEQ ID NO.10所示，具体序列为：
5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；
检测U6snRNA的反向引物如SEQ ID NO.11所示，具体序列为：
5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。
8.一种用于表征如权利要求6所述的标记物的方法，所述方法用于非诊断目的，所述自噬小体的表征方法为：
吖啶橙染色法，步骤为：
用吖啶橙染色待检细胞；
洗涤细胞；
显微镜下观察。
9.一种用于表征如权利要求6所述的标记物的试剂盒，所述试剂盒包括：
用于流式细胞分析试剂组：抗-VEGF抗体，与抗-VEGF抗体结合的荧光标记的第二抗体；和/或
用于体外血管生成测试的试剂组包括：FBS、杜尔贝科改良伊格尔高葡萄糖培养基、Diff-Quick固定剂；和/或
用于集落形成测试的试剂组包括：结晶紫。
10.一种用于表征高表达miR-9的肿瘤受试者中特征性表达标记物的试剂盒，可选地，所述高表达miR-9的肿瘤患者是如权利要求3所述的肿瘤动物模型；
所述试剂盒包括从细胞、组织、血液、体液或外泌体中分离RNA的试剂和检测蛋白标记物的qRT-PCR测试试剂和/或检测核酸标记物的qRT-PCR测试试剂；
其中所述检测蛋白标记物的qRT-PCR测试试剂包括检测VEGF和/或Flk1的RNA的试剂，优选地，检测β-肌动蛋白RNA的试剂；
检测VEGF的RNA的试剂包括：
检测VEGF的正向引物如SEQ ID NO.2所示，具体序列为：
5′-CTGACGGACAGACAGACAGACACC-3′；
检测VEGF的反向引物如SEQ ID NO.3所示，具体序列为：
5′-AGCCCAGAAGTTGGACGAAAA-3′；
检测Flk1的RNA的试剂包括：
检测Flk1的正向引物如SEQ ID NO.4所示，具体序列为：
5′-ACCTGGAGAATCAGACGACAA-3′；
检测Flk1的反向引物如SEQ ID NO.5所示，具体序列为：
5′-GGTTCCCATCCTTCAATACAAT-3′；
检测β-肌动蛋白的RNA的试剂包括：
检测β-肌动蛋白的正向引物如SEQ ID NO.6所示，具体序列为：
5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′；
检测β-肌动蛋白的反向引物如SEQ ID NO.7所示，具体序列为：
5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。
所述检测核酸标记物的qRT-PCR测试试剂包括检测成熟miR-9的试剂，优选还包括检测U6snRNA的试剂；
所述检测成熟miR-9的试剂包括：
检测成熟miR-9的正向引物如SEQ ID NO.8所示，具体序列为：
5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAG-3′；
检测成熟miR-9的反向引物如SEQ ID NO.9所示，具体序列为：
5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATACAG-3′；
所述检测成熟U6snRNA的试剂包括：
检测U6snRNA的正向引物如SEQ ID NO.10所示，具体序列为：
5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；
检测U6snRNA的反向引物如SEQ ID NO.11所示，具体序列为：
5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。
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