CN112903999A - 一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，属于细胞物质检测技术领域，包括如下步骤：(1)取外泌体样品；(2)对外泌体样品进行冰上解冻处理；(3)对外泌体样品超声处理；(4)向离心管内加入PBS，然后再向该离心管中加入抗体，充分混匀后再加入外泌体样品，再经过孵育、超高速离心机离心处理后得PBS重悬外泌体。本发明公开了一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，本方法操作简单，准确、可靠，灵敏度高，无需经有机溶剂浸提，对目标检测物的选择性高。
Description
技术领域
本发明属于细胞物质检测技术领域，具体涉及一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法及应用。
背景技术
流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。流式细胞术一般包括荧光抗体孵育，离心重悬，上机检测三个主要步骤。外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质，细胞自主分泌的小膜泡(30-150nm)，现其特指直径在40-100nm的盘状囊泡，携带上述信息在细胞通讯中发挥作用。近年来外泌体在肿瘤研究领域显现出重要地位，检测来源于患者血浆的外泌体也是液体活检的手段之一。但外泌体颗粒大小(<100nm)并不是细胞流式仪(500nm)的最佳监测范围，纳米流式仪(Flow NanoAnalyzer)应运而生。纳米流式检测仪覆盖了传统流式细胞仪200nm以下粒径检测的盲区，其可实现单个纳米颗粒(7-1000nm)的粒径及其分布、颗粒浓度、以及生物化学性状的高灵敏、高选择性、高通量检测。由于外泌体提取需要在很高的离心力下提取，细胞流式术的离心和孵育方案不适用于外泌体。
现在还没有出现使用纳米流式仪表征外泌体新生抗原的专利。由于纳米流式仪和超高速离心机是高端实验设备，满足该实验条件的实验室较少，因此开展此类实验较为困难。现有使用普通细胞流式仪器使用纳米流式仪标记外泌体新生抗原的技术难点主要在仅为300nm的外泌体受限于检测仪器精度其尚未出现对外泌体未知蛋白的间接标记技术。但外泌体新生抗原是热门的领域，针对于外泌体新生抗原的检测鉴定一直是一个难题。现基于一些免疫吸附法成本高，推广困难，而间接标记流式技术是基于普通流式技术的提升，其应用的机会更多。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法及应用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：
一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(1)取外泌体样品；
(2)对外泌体样品进行冰上解冻处理；
(3)对外泌体样品超声处理；
(4)向离心管内加入PBS，然后再向该离心管中加入抗体，充分混匀后再加入外泌体样品，再经过孵育、超高速离心机离心处理后得PBS重悬外泌体。
进一步的，步骤(3)中所述的超声处理时控制超声的时长为10min。
进一步的，步骤(4)中所述的离心管的容量为200ul；所述的PBS的加入量为48ul；所述的抗体的加入量为1ul；所述的外泌体样品的加入量为1ul。
进一步的，步骤(4)中所述的孵育的时长控制为30min。
进一步的，步骤(4)中所述的超高速离心机离心处理时的时长为20min，离心力控制为100000g。
一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的应用，具体是在外泌体新生抗原验证上的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明公开了一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，本方法操作简单，准确、可靠，灵敏度高，无需经有机溶剂浸提，对目标检测物的选择性高，极具推广应用价值。
附图说明
图1是本发明方法使用纳米流式仪器检测HSP70蛋白在外泌体上的相对表达量测试图。
图2是外泌体的电镜图。
图3是外泌体的粒镜图。
图4是外泌体标志物TSG101的Western blot结果图。
具体实施方式
实施例1
一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(1)取外泌体样品；
(2)对外泌体样品进行冰上解冻处理；
(3)对外泌体样品超声处理；
(4)向离心管内加入PBS，然后再向该离心管中加入抗体，充分混匀后再加入外泌体样品，再经过孵育、超高速离心机离心处理后得PBS重悬外泌体。
步骤(3)中的超声处理时控制超声的时长为10min。
步骤(4)中的离心管的容量为200ul；PBS的加入量为48ul；抗体的加入量为1ul；外泌体样品的加入量为1ul。
步骤(4)中的孵育的时长控制为30min。
步骤(4)中的超高速离心机离心处理时的时长为20min，离心力控制为100000g。
一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的应用，具体是在外泌体新生抗原验证上的应用。
附图1是采用本发明实施例方法，使用纳米流式仪器检测HSP70蛋白在外泌体上的相对表达量。
附图2是外泌体的电镜图。
附图3是外泌体的粒镜图。
附图4是外泌体标志物TSG101的Western blot结果图。
Claims (6)
1.一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取外泌体样品；
(2)对外泌体样品进行冰上解冻处理；
(3)对外泌体样品超声处理；
(4)向离心管内加入PBS，然后再向该离心管中加入抗体，充分混匀后再加入外泌体样品，再经过孵育、超高速离心机离心处理后得PBS重悬外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的超声处理时控制超声的时长为10min。
3.根据权利要求1所述的一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的离心管的容量为200ul；所述的PBS的加入量为48ul；所述的抗体的加入量为1ul；所述的外泌体样品的加入量为1ul。
4.根据权利要求1所述的一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的孵育的时长控制为30min。
5.根据权利要求1所述的一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的超高速离心机离心处理时的时长为20min，离心力控制为100000g。
6.一种用于纳米流式细胞仪检测的外泌体的应用，其特征在于，具体是在外泌体新生抗原验证上的应用。
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