CN112946292B

CN112946292B - 一种定量检测单细胞内目标蛋白质的方法

Info

Publication number: CN112946292B
Application number: CN201911258225.6A
Authority: CN
Inventors: 石蒙; 关亚风; 段春凤; 李盛红
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2039-12-10
Also published as: CN112946292A

Abstract

本发明提供了一种定量检测单细胞内目标蛋白质的方法，包括：单细胞洗涤、细胞膜表面打孔、封闭、目标蛋白质标记、单细胞捕获、单细胞破膜、目标蛋白质捕集、分离与检测等步骤，本方法采用具有高特异性的抗体对目标蛋白进行标记，并通过微流控芯片和定量环协同作用实现单细胞的在线捕获、破膜、目标蛋白质捕集等步骤，然后在线洗脱给具有高分离效率的纳流液相色谱，将细胞内目标蛋白复合物、非目标蛋白及多余的抗体进行分离，实现单细胞内目标蛋白质的准确定量。

Description

一种定量检测单细胞内目标蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体地说，涉及一种定量检测单细胞内目标蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质是一切生命活动的参与者，其在物质运输、调控、机体防御、酶催化等各项生理过程中发挥着重要作用。细胞内蛋白质的含量变化可以指示或影响细胞的生长和繁殖等生理过程，甚至导致疾病。因此，发展测定细胞中蛋白质含量的技术和方法十分必要。

传统的细胞内蛋白质定量检测方法有酶联免疫、比色法、质谱等技术，但由于灵敏度受限，这些技术的样本均为大量细胞(约为10⁶～10⁷量级)，所测结果为大量细胞的平均值。在这种情况下，细胞与细胞之间的差异性会被掩盖，致使很多重要的分子机制和变化无法被发现；并且在疾病发展早期，往往只是少数细胞开始病变，传统的检测技术无法及时发现病情。因此，在单细胞层面上对蛋白质进行测定能够更加精确的反映生命过程的真实情况。

近年来，已经发展了一些针对单细胞蛋白质定量检测的技术，例如流式细胞术、微流控芯片和毛细管电泳激光诱导荧光检测(Capillary Electrophoresis-Laser-InducedFluorescence)技术等。然而，流式细胞术因为缺乏定量方法，无法对细胞内蛋白质进行定量检测。单细胞蛋白印迹法(Single Cell Western Blot)，将凝胶电泳法与微流控芯片相结合，可在单细胞水平对细胞内多种蛋白进行分离检测，但此种技术仅能实现单细胞内蛋白质的半定量分析，无法实现绝对定量。条码芯片或微室芯片技术可以定量检测细胞内蛋白质，但由于抗体的选择性有限，此种技术可能产生假阳性结果。CE-LIF可以实现单细胞内蛋白质的定量检测，CE具有高分离效率(塔板数为10⁵～10⁶/米)，可将非目标蛋白与目标蛋白分离，提高检测方法的准确性，且LIF具有较高的灵敏度，适合于超痕量检测。但毛细管电泳的最佳上样量低至pL量级，虽然与哺乳动物细胞的体积(5～500pL)相当，但是单细胞样品前处理过程中会产生稀释效应，实际样品体积可能增加至nL量级，在上样时很容易导致样品过载，引起电泳分离效率大大降低。在相同柱内径下，毛细管液相色谱最佳的进样体积是毛细管电泳的上百倍，其中，流速范围在nL级别的纳流液相色谱，由于内径小造成的稀释效应小，因此，适用于单细胞的分离分析。在上世纪80年代，纳流液相色谱就开始被应用于分析单细胞中的蛋白质，但是普遍采用特异性差的小分子荧光分子对蛋白质进行荧光标记，导致细胞内上万种蛋白均被标记，给分离造成极大困扰，无法实现精准定量。同时，采用离线样品前处理的方式对单细胞进行提取、破膜，多步转移导致样品损失，影响定量分析的准确性。

为提高定量分析能力，最好的方式是采用在线样品前处理，同时采用免疫荧光法标记细胞内蛋白，利用抗原-抗体的特异性反应提高方法的选择性，进而实现准确定量。然而，采用这种方法面临以下技术难题：

1、纳流液相色谱是高压体系，单细胞样品引入要比毛细管电泳困难；

2、细胞在进入色谱柱之前需将细胞膜在线破碎，并在线进样给色谱柱；

3、传统色谱分离小分子化合物及抗原所用的分离条件并不适用于分离抗原-抗体复合物，需要建立新的分离方案。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提出了一种定量检测单细胞内蛋白质的方法，采用具有高特异性的抗体对目标蛋白进行标记，并通过微流控芯片和定量环协同作用实现单细胞的在线捕获、破膜、目标蛋白质捕集等步骤，并在线洗脱给具有高分离效率的纳流液相色谱，将细胞内目标蛋白复合物、非目标蛋白及多余的抗体进行分离，使单细胞内目标蛋白质的定量分析更准确。

本发明的技术方案是：

一种定量检测单细胞内目标蛋白质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、对培养的细胞进行洗涤，通过离心除去细胞的培养液，洗涤完成后，采用细胞稀释液重悬细胞；

b、采用细胞打孔溶剂对细胞膜进行处理，使细胞膜表面形成孔道，打孔后再次洗涤细胞，洗涤完成后，采用细胞稀释液重悬细胞；

c、采用封闭试剂对细胞内的蛋白进行封闭，封闭完成后，离心除去封闭试剂；

d、采用带有荧光基团的抗体对细胞内目标蛋白进行标记，标记完成后洗涤细胞，然后采用细胞稀释液对细胞进行重悬，形成细胞悬浮液；

e、将步骤d)中获得的细胞悬浮液导入微流控芯片的微型通道内，所述微型通道直径与细胞直径相当(相当即微型通道直径与细胞直径相同至小于2倍的细胞直径)，使细胞在所述微型通道内分散的流动，确保细胞之间无连结；所述微流控芯片的微型通道出口与二位十通阀的3号位连接；所述二位十通阀的2号位和5号位之间连接定量环，1号位和8号位之间连接捕集柱，4号位连接压力调控装置，6号位连接微流液相色谱泵，7号位连接废液瓶，9号位连接纳流液相色谱泵，10号位连接纳流液相色谱柱；通过压力调控装置抽取微型通道和定量环中的空气，形成负压，并控制细胞悬浮液的流动速度，在倒置显微镜观察下，将芯片内的单个细胞经3号位导入二位十通阀上的定量环中，观察到细胞进入定量环后，立即关闭压力调控装置；所述定量环为石英毛细管；细胞进入定量环后，吸附在毛细管内壁；

f、切换十通阀，采用微流液相色谱泵将细胞破膜试剂从6号位泵入定量环内，至定量环被完全充满后停泵，反应一段时间后细胞膜破碎，然后开启泵，通过微流液相色谱泵将破膜后的细胞内容物上样至捕集柱柱头；此时，蛋白质被捕集柱捕获，而小分子化合物随破膜试剂进入废液瓶；

g、切换十通阀，通过纳流液相色谱泵中的流动相将捕集柱柱头的蛋白质洗脱至纳流液相色谱柱中，进行分离分析；

h、目标蛋白经过分离后依次经过检测光窗，经荧光检测器检测荧光信号；所用荧光检测器的波长参数与步骤d中所用荧光基团的激发和发射波长相匹配；

i、依据荧光强度-荧光标记抗体浓度的标准曲线和测定的目标蛋白的荧光强度计算单细胞内目标蛋白质的浓度。

所述荧光强度-荧光标记抗体浓度的标准曲线，通过以下步骤建立：1)将配制的已知浓度的荧光标记抗体标准溶液样品通过十通阀3号口吸入定量环；2)按照权利要求1步骤f～步骤h，获得该浓度荧光标记抗体标准溶液的荧光信号强度；3)配置2个以上其它不同的浓度的荧光标记抗体标准溶液，依次重复步骤1)、2)，获得其他浓度标准溶液的荧光信号强度；4)依据标准溶液的浓度和检测的荧光强度建立标准曲线。

所述步骤a中细胞稀释液是磷酸盐缓冲溶液，细胞洗涤时离心机采用的转速为800～1000rpm/min；所述步骤b中细胞打孔溶剂是TritonX-100，体积分数为3％～5％；所述步骤c中封闭试剂是体积分数为5％～10％的BSA溶液或山羊血清，封闭时间为10～60min。

所述步骤e中微型通道的材质是PDMS，基底是石英或有机玻璃，压力调控装置是注射泵。

所述步骤f中细胞悬浮液的流动速度为10～100nL/min；十通阀上的定量环内径为25～50μm，毛细管长度为5～10cm。

所述步骤g中的破膜试剂是Triton X-100，体积分数为5％～10％；捕集柱是C4、C8或PS-DVB聚合物材料制备的填充柱或整体柱，捕集柱长度为1～3cm。

所述步骤h中纳流液相色谱柱的固定相是C4、C8或者C18材料，色谱填料的粒径范围是1～5μm，孔径为30～100nm，毛细管色谱柱的内径为25～50μm，有效长度为10～50cm。

抗体为带有BV605荧光基团的抗MIP-1β、MIP-1α和CCL₄兔抗人IgG抗体中的一种或二种以上，对应的细胞内目标蛋白质MIP-1β、MIP-1α和CCL₄中的一种或二种以上。

本发明方法与条码芯片或微室芯片技术相比，由于有纳流液相色谱柱的分离，能够明显减小由于抗体选择性不足带来的假阳性结果，进而提高检测方法的准确性；与流式细胞技术相比，本方法可以将细胞膜破碎，对细胞内蛋白进行定量分析；与毛细管电泳相比，纳流液相色谱的柱容量大，且两者的分离机理不同，通过毛细管电泳无法分离的蛋白质，通过毛细管液相色谱却可能被分开。

与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：

1、传统的单细胞内多种蛋白质分析方法是采用特异性较低的荧光分子对目标蛋白进行标记，几乎细胞内所有的蛋白质都会被荧光分子所标记，此种方法的选择性差，直接影响定量准确性。而本发明采用带有荧光分子的高特异性的抗体对目标蛋白进行标记，提高了方法的选择性，有利于准确定量。

2、本方法采用纳流液相色谱技术将目标蛋白与非特异性标记的蛋白分离，提高了定性和定量的准确性。

3、本方法中的纳流液相色谱的最佳上样量远大于相同内径的毛细管电泳的最佳上样量，可以满足稍大尺寸的细胞(如神经细胞的直径约为100μm)的完全上样，可实现大尺寸细胞的完整分析。

4、本方法将微流控芯片与纳流液相色谱系统相结合，提高了单细胞样品的可操控性。

5、本发明通过纳流液相色谱将细胞内多种目标蛋白分离，仅采用单一光路就可以同时检测多种目标蛋白。

6、与码芯片或微室芯片等技术相比，本方法通过建立标准曲线，可以定量分析细胞内目标蛋白，而且经纳流液相色谱分离，可以解决由于抗体选择性不足而带来的假阳性的问题。

附图说明

图1示意性展示了实施例1、实施例2和实施例3中的十通阀与微型通道芯片的连接方式的示意图；图中：1号位和8号位连接捕集柱(trap)，2号位和5号位连接定量环，3号位连接微型通道芯片的出口，4号位连接注射泵，6号位连接微流液相色谱泵(loading-pump)，7号位连接废液口(waste)，9号位连接纳流液相色谱泵(nano-pump)，10号位连接纳流液相色谱柱(column)。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，通过实施例和应用例对本发明进行说明。本发明所列的这些具体实施例和应用例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：

定量检测单个巨噬细胞内三种蛋白质的方法，包括以下步骤：

a、将巨噬细胞从细胞培养皿中收集到1mL的试管中，细胞数目约为1×10⁶个，洗涤细胞，细胞洗涤时离心机采用的转速是800rpm/min，除去培养时所用的细胞培养液，采用4℃的PBS缓冲液对巨噬细胞进行重悬，用移液枪反复吹打细胞，最后细胞悬浮液的体积为250μL；

b、在250μL的细胞悬浮液中加入250μL体积分数为4％的Triton X-100，对巨噬细胞的细胞膜进行打孔，使细胞膜表面形成微小孔道，使抗体分子可以进入细胞膜内，打孔后再次洗涤巨噬细胞，采用4℃的PBS缓冲液对巨噬细胞进行重悬，用移液枪反复吹打细胞，最后细胞悬浮液的体积为250μL；

c、在250μL细胞悬浮液中加入250μL体积分数为5％的BSA(牛血清蛋白)溶液作为封闭试剂对细胞内非目标蛋白进行封闭，将细胞悬浮液置于37℃条件下，封闭时间是15min，封闭后离心5min，转速为1000rpm/min，除去上清液，加入100μL的PBS缓冲液使细胞重悬,用移液枪反复吹打细胞，使细胞分散成细胞悬浮液；

d、采用带有BV605荧光基团的三种兔抗人抗IL10、IL2和TNF-α的IgG抗体对巨噬细胞内三种目标蛋白进行标记，三种蛋白分别为IL10、IL2和TNF-α，取三种抗体各5μL加入100μL的单细胞悬浮液中，将细胞悬浮液置于4℃冰箱内，孵育1hour，孵育完成后洗涤细胞三次，采用1mL的PBS缓冲液对细胞进行稀释，用移液枪反复吹打细胞，使细胞分散成细胞悬浮液；

e、将步骤d)中获得的细胞悬浮液导入微流控芯片的微型通道内，所述微型通道直径为30μm，与细胞直径相当，微型通道的材料是PDMS，基底是有机玻璃，使细胞在所述微型通道内分散的流动，确保细胞之间无连结；所述微流控芯片的微型通道出口与十通阀的3号位连接；所述十通阀的2号位和5号位之间连接定量环，定量环由石英毛细管制成，内径是25μm，毛细管长度是8cm；1号位和8号位之间连接捕集柱，4号位连接注射泵，6号位连接微流液相色谱泵，7号位连接废液瓶，9号位连接纳流液相色谱泵，10号位连接纳流液相色谱柱；通过调节注射泵的抽速使巨噬细胞悬浮液在芯片内的流动速度为35nL/min，形成负压，在倒置显微镜观察下，将芯片内的单个巨噬细胞通过3号位导入十通阀上的定量环中，观察到细胞进入定量环后，立即关闭注射泵；细胞进入定量环后，吸附在毛细管内壁；

f、切换十通阀，采用微流液相色谱泵将体积分数为5％的Triton X-100从6号位泵入定量环内，至定量环被完全充满后停泵，反应10min后细胞膜破碎，然后开启泵，通过微流液相色谱泵将破膜后的细胞内容物上样至捕集柱柱头,捕集柱是C4整体柱,柱内径为100μm，柱长为2cm，上样流动相是体积分数为10％的乙腈，上样时间是10min，上样流速是1μL/min；此时，蛋白质被捕集柱捕获，而小分子化合物随破膜试剂进入废液瓶；

g、切换十通阀，通过纳流液相色谱泵中的流动相将捕集柱柱头的蛋白质洗脱至纳流液相色谱柱中，进行分离分析；色谱柱的固定相是C18材料，色谱填料的粒径是3μm，孔径是30nm，色谱柱的内径为25μm，有效长度为15cm，进行分离分析，液相色谱梯度洗脱条件为

0～30min 10％～65％ (v/v) 乙腈

31～32min 65％～10％ (v/v) 乙腈

32～35min 10％ (v/v) 乙腈；

h、三种目标蛋白经过梯度洗脱后依次经过检测光窗，激发光源波长为405nm，检测波长范围是590～720nm，荧光信号被检测器接收，检测器检测到的信号通过Sepu3010传输至电脑；

i、建立荧光强度-荧光标记抗体浓度标准曲线，将配制的七个浓度的含三种IL10、IL2和TNF-α蛋白的标准溶液样品通过3号口吸入定量环，至定量环充满，(浓度分别为5×10^-13M、1×10^-12M、2.5×10^-12M、5×10^-12M、2.5×10^-11M、5×10^-11M和1×10^-10M)然后按照步骤f～步骤h进行分离和检测，获得各个浓度荧光标记抗体标准溶液的荧光信号强度，然后依据标准溶液的浓度和检测的荧光强度建立标准曲线；

j、依据荧光强度-荧光标记抗体浓度的标准曲线和测定的IL10、IL2和TNF-α蛋白的荧光强度计算单个巨噬细胞内IL10、IL2和TNF-α蛋白的分子数目。

实验结果表明，50个巨噬细胞内IL10、IL2和TNF-α蛋白的分子数目范围如下：IL10的数目范围是629到12171，平均分子数目为8435；IL2的数目范围是321到4350，平均分子数目为2037；TNF-α的数目范围是2031到25171，平均分子数目为16330。

实施例2：

定量检测单个巨噬细胞内MIP-1β、MIP-1α和CCL₄三种蛋白，包括以下步骤：

a、对1×10⁶个巨噬细胞进行洗涤，细胞洗涤时离心机采用的转速是900rpm/min，除去培养时所用的细胞培养液和培养基中的药物，采用4℃的1×PBS缓冲液对巨噬细胞进行重悬，用移液枪反复吹打细胞，最后细胞悬浮液的体积为200μL；

b、在200μL的细胞悬浮液中加入200μL体积分数为3％的Triton X-100对巨噬细胞的细胞膜进行打孔，使细胞膜表面形成微小孔道，使抗体分子可以进入细胞膜内，打孔后再次洗涤巨噬细胞，采用4℃的1×PBS缓冲液对巨噬细胞进行重悬，用移液枪反复吹打细胞，最后细胞悬浮液的体积为200μL；

c、在200μL细胞悬浮液中加入200μL体积分数为5％的山羊血清作为封闭试剂对细胞内非目标蛋白进行封闭，将细胞悬浮液置于37℃，封闭时间是30min，封闭后离心5min，转速为1000rpm/min，除去上清液后加入100μL的PBS缓冲液使细胞重悬,用移液枪反复吹打细胞，使细胞分散成细胞悬浮液；

d、采用带有BV605荧光基团的三种兔抗人IgG抗体对巨噬细胞内三种目标蛋白进行标记，三种蛋白分别为MIP-1β、MIP-1α和CCL₄，取三种抗体各5μL加入100μL的单细胞悬浮液中，将细胞悬浮液置于4℃冰箱内，孵育2hour，孵育完成后洗涤细胞三次，孵育完成后采用3mL的PBS缓冲液对细胞进行稀释，用移液枪反复吹打细胞，使细胞分散成细胞悬浮液；

e、将步骤d)中获得的细胞悬浮液导入微流控芯片的微型通道内，所述微型通道直径为30μm，与细胞直径相当，微型通道的材料是PDMS，基底是有机玻璃，使细胞在所述微型通道内分散的流动，确保细胞之间无连结；所述微流控芯片的微型通道出口与十通阀的3号位连接；所述十通阀的2号位和5号位之间连接定量环，定量环由石英毛细管制成，内径是30μm，毛细管长度是8cm；1号位和8号位之间连接捕集柱，4号位连接注射泵，6号位连接微流液相色谱泵，7号位连接废液瓶，9号位连接纳流液相色谱泵，10号位连接纳流液相色谱柱；通过调节注射泵的抽速使巨噬细胞悬浮液在芯片内的流动速度为40nL/min，形成负压，在倒置显微镜观察下，将芯片内的单个巨噬细胞通过3号位导入十通阀上的定量环中，观察到细胞进入定量环后，立即关闭注射泵；细胞进入定量环后，吸附在毛细管内壁；

f、切换十通阀，采用微流液相色谱泵将体积分数为5％的Triton X-100从6号位泵入定量环内，至定量环被完全充满后停泵，反应10min后细胞膜破碎，然后开启泵，通过微流液相色谱泵将破膜后的细胞内容物上样至捕集柱柱头,捕集柱是C4整体柱,柱内径为75μm，柱长为1.5cm，上样流动相是体积分数为15％的乙腈，上样时间是12min，上样流速是500nL/min；此时，蛋白质被捕集柱捕获，而小分子化合物随破膜试剂进入废液瓶；

g、切换十通阀，通过纳流液相色谱泵中的流动相将捕集柱柱头的蛋白质洗脱至纳流液相色谱柱中，进行分离分析；色谱柱的固定相是C8材料，色谱填料的粒径是2μm，孔径是30nm，色谱柱的内径为25μm，有效长度为30cm，进行分离分析，液相色谱梯度洗脱条件为

0～30min 10％～70％ (v/v) 乙腈

31～32min 70％～10％ (v/v) 乙腈

32～35min 10％ (v/v) 乙腈；

i、建立荧光强度-荧光标记抗体浓度标准曲线，将配制的七个浓度的含三种MIP-1β、MIP-1α和CCL₄蛋白的标准溶液样品通过3号口吸入定量环，至定量环充满(浓度分别为5×10^-13M、1×10^-12M、2.5×10^-12M、5×10^-12M、2.5×10^-11M、5×10^-11M和1×10^-10M)，然后按照步骤f～步骤h进行分离和检测，获得各个浓度荧光标记抗体标准溶液的荧光信号强度，然后依据标准溶液的浓度和检测的荧光强度建立标准曲线；

j、依据荧光强度-荧光标记抗体浓度的标准曲线和测定的MIP-1β、MIP-1α和CCL₄蛋白的荧光强度计算单个巨噬细胞内MIP-1β、MIP-1α和CCL₄蛋白的浓度。

实施例3：

定量检测单个白血病细胞内四种蛋白质，包括以下步骤：

a、对数目为3×10⁶个白血病细胞进行洗涤，细胞洗涤时离心机采用的转速是1000rpm/min，除去培养时所用的细胞培养液，采用4℃的PBS缓冲液对白血病细胞进行重悬，用移液枪反复吹打细胞，最后细胞悬浮液的体积为200μL；

b、在200μL的细胞悬浮液中加入200μL体积分数为5％的Triton X-100对白血病细胞的细胞膜进行打孔，使细胞膜表面形成微小孔道，使抗体分子可以进入细胞膜内，打孔后再次洗涤白血病细胞，采用4℃的PBS缓冲液对白血病细胞进行重悬，用移液枪反复吹打细胞，最后细胞悬浮液的体积为200μL；

c、在200μL细胞悬浮液中加入200μL体积分数为0.1％的NP-40的PBS缓冲溶液，作为封闭试剂对细胞内非目标蛋白进行封闭，将细胞悬浮液置于37℃条件下，封闭时间范围是15min，封闭后离心5min，转速为1000rpm/min，除去上清液后加入100μL的PBS缓冲液使细胞重悬,用移液枪反复吹打细胞，使细胞分散成细胞悬浮液；

d、采用带有FITC荧光基团的四种鼠抗人IgG抗体对白血病细胞内四种目标蛋白进行标记，四种蛋白分别为caspase 2、caspase3、caspase 6和caspase 10，取三种抗体各5μL加入100μL的白血病单细胞悬浮液中，将细胞悬浮液置于4℃冰箱内，孵育4hour，孵育完成后洗涤细胞三次，采用1mL的PBS缓冲液对细胞进行稀释，用移液枪反复吹打细胞，使细胞分散成细胞悬浮液；

e、将步骤d)中获得的细胞悬浮液导入微流控芯片的微型通道内，所述微型通道直径为15μm，由于白血病细胞的直径为10～15μm，与细胞直径相当，微型通道的材料是PDMS，基底是石英玻璃，使细胞在所述微型通道内分散的流动，确保细胞之间无连结；所述微流控芯片的微型通道出口与十通阀的3号位连接；所述十通阀的2号位和5号位之间连接定量环，定量环由石英毛细管制成，内径是20μm，毛细管长度是6cm；1号位和8号位之间连接捕集柱，4号位连接注射泵，6号位连接微流液相色谱泵，7号位连接废液瓶，9号位连接纳流液相色谱泵，10号位连接纳流液相色谱柱；通过调节注射泵的抽速使白血病细胞悬浮液在芯片内的流动速度为10nL/min，形成负压，在倒置显微镜观察下，将芯片内的单个巨噬细胞通过3号位导入十通阀上的定量环中，观察到细胞进入定量环后，立即关闭注射泵；细胞进入定量环后，吸附在毛细管内壁；

f、切换十通阀，采用微流液相色谱泵将体积分数为1％的NP-40从6号位泵入定量环内，至定量环被完全充满后停泵，反应5min后细胞膜破碎，然后开启泵，通过微流液相色谱泵将破膜后的细胞内容物上样至捕集柱柱头,捕集柱是PS-DVB的整体柱,柱内径为75μm，柱长为1cm，上样流动相是体积分数为10％的乙腈，上样时间是10min，上样流速是500nL/min；此时，蛋白质被捕集柱捕获，而小分子化合物随破膜试剂进入废液瓶；

g、切换十通阀，通过纳流液相色谱泵中的流动相将捕集柱柱头的蛋白质洗脱至纳流液相色谱柱中，进行分离分析；色谱柱的固定相是C8材料，色谱填料的粒径是3.6μm，孔径是30nm，色谱柱的内径为25μm，有效长度为15cm，进行分离分析，液相色谱梯度洗脱条件为

0～30min 10％～45％ (v/v) 乙腈

31～32min 45％～10％ (v/v) 乙腈

32～35min 10％ (v/v) 乙腈；

h、四种目标蛋白经过梯度洗脱后依次经过检测光窗，激发光源波长为450nm，检测波长范围是480～650nm，荧光信号被检测器接收，检测器检测到的信号通过Sepu3010传输至电脑；

i、建立荧光强度-荧光标记抗体浓度标准曲线，将配制的七个浓度的含四种caspase 2、caspase3、caspase 6和caspase 10蛋白的标准溶液样品通过3号口吸入定量环，至定量环充满(浓度分别为5×10^-13M、1×10^-12M、2.5×10^-12M、5×10^-12M、2.5×10^-11M、5×10^-11M和1×10^-10M)，然后按照步骤f～步骤h进行分离和检测，获得各个浓度荧光标记抗体标准溶液的荧光信号强度，然后依据标准溶液的浓度和检测的荧光强度建立标准曲线；

j、依据荧光强度-荧光标记抗体浓度的标准曲线和测定的caspase 2、caspase3、caspase 6和caspase 10蛋白的荧光强度计算单个巨噬细胞内caspase 2、caspase3、caspase 6和caspase 10蛋白的浓度。

Claims

1.一种定量检测单细胞内目标蛋白质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

e、将步骤d）中获得的细胞悬浮液导入微流控芯片的微型通道内，所述的微型通道直径是细胞直径的1-2倍，使细胞在所述微型通道内分散的流动，确保细胞之间无连结；所述微流控芯片的微型通道出口与二位十通阀的3号位连接；所述二位十通阀的2号位和5号位之间连接定量环，1号位和8号位之间连接捕集柱，4号位连接压力调控装置，6号位连接微流液相色谱泵，7号位连接废液瓶，9号位连接纳流液相色谱泵，10号位连接纳流液相色谱柱；通过压力调控装置抽取微型通道和定量环中的空气，形成负压，并控制细胞悬浮液的流动速度，在倒置显微镜观察下，将芯片内的单个细胞经3号位导入二位十通阀上的定量环中，观察到细胞进入定量环后，立即关闭压力调控装置；所述定量环为石英毛细管；细胞进入定量环后，吸附在毛细管内壁；

i、依据荧光强度-荧光标记抗体浓度的标准曲线和测定的目标蛋白的荧光强度计算单的细胞内目标蛋白质浓度；

所述荧光强度-荧光标记抗体浓度的标准曲线，通过以下步骤建立：1）将采用细胞稀释液配制的已知浓度的荧光标记抗体标准溶液样品通过十通阀3号口吸入定量环；2）按照步骤f~步骤h，获得该浓度荧光标记抗体标准溶液的荧光信号强度；3）配置2个以上其它不同的浓度的荧光标记抗体标准溶液，依次重复步骤1）、2），获得其它浓度标准溶液的荧光信号强度；4）依据标准溶液的浓度和检测的荧光强度建立标准曲线。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a中细胞稀释液是磷酸盐缓冲溶液，细胞洗涤时离心机采用的转速为800~1000 rpm/min；所述步骤b中细胞打孔溶剂是TritonX-100，体积分数为3%~5%；所述步骤c中封闭试剂是体积分数为5%~10%的BSA溶液或山羊血清，封闭时间为10~60 min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤e中微型通道的材质是PDMS，基底是石英或有机玻璃，压力调控装置是注射泵。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤f中细胞悬浮液的流动速度为10~100 nL/min；十通阀上的定量环内径为25~50 μm，毛细管长度为5~10 cm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤g中的破膜试剂是Triton X-100，体积分数为5%~10%；捕集柱是C4、C8或PS-DVB聚合物材料制备的填充柱或整体柱，捕集柱长度为1~3 cm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤h中纳流液相色谱柱的固定相是C4、C8或者C18材料，色谱填料的粒径为1~5 μm，孔径为30~100 nm，毛细管色谱柱的内径为25~50 μm，有效长度为10~50 cm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

抗体为带有BV605荧光基团的兔抗人MIP-1β、MIP-1α和CCL₄ IgG抗体中的一种或二种以上，对应的细胞内目标蛋白质MIP-1β、MIP-1α和CCL₄中的一种或二种以上。