CN112946091A - 一种定量检测单细胞内目标蛋白质的系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定量检测单细胞内目标蛋白质的系统,此系统包括:电源模块、微流控芯片模块、单细胞处理及蛋白质分离模块和荧光检测模块。利用微流控芯片将单个细胞引入单细胞处理及蛋白质分离模块,该模块用于实现单细胞在线破膜、目标蛋白质捕集和蛋白质分离;荧光检测模块用于检测目标蛋白的荧光信号,最后,利用数据采集器与数据处理器计算目标蛋白的浓度。本系统采用纳流液相色谱分离目标蛋白,克服了传统毛细管电泳方法柱容量低的缺点;提高了定性和定量的准确性;装置结构简单,易于在实验室推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,更具体地说,涉及一种定量检测单细胞内目标蛋白质的系统。
背景技术
一切生理活动都需要蛋白质的参与,如生长、繁殖、细胞分化、机体防御和生理机能调节等各个方面都离不开蛋白质。若蛋白质的表达水平发生变化,会极大地影响到相关的生理过程,甚至导致疾病。因此,发展测定细胞中蛋白质含量的技术和方法十分必要。
在蛋白质的检测技术中,传统的方法为测定大量细胞(约为106个细胞数量级)的平均值,如酶联免疫法(ELISA)和比色法等技术。在这种情况下,无法得知细胞与细胞之间的差异性,并且由于检测灵敏度受限,也会使检测结果失真。因此,要不断的提高检测灵敏度和发展相关的单细胞蛋白质检测方法。
近年来,一些具有高灵敏度的检测技术已经用于单细胞蛋白质检测,如荧光流式细胞术、质谱流式细胞术、微流控芯片技术和毛细管电泳激光诱导荧光检测(CapillaryElectrophoresis-Laser-Induced Fluorescence)等。然而,荧光流式细胞术因为缺乏定量方法,只能定量检测细胞膜蛋白,而无法对细胞内的蛋白进行定量检测。大多数的微流控芯片技术只能实现单细胞蛋白质的半定量检测,无法实现绝对定量,而且很多芯片技术由于抗体的选择性有限,可能产生假阳性结果。采用毛细管电泳或纳流液相色谱对蛋白质进行分离,可以提高检测的准确性,减小假阳性结果发生的概率,且针对不同的蛋白质和细胞,可以选择不同的分离模式,但毛细管电泳的最佳上样量仅为pL数量级,虽然与哺乳动物细胞的体积(5~500pL)相当,但在单细胞样品前处理过程中的稀释效应会使单细胞样品体积增大,上样时很容易导致样品过载,引起电泳分离效率大大降低。
发明内容
本发明提供了一种定量检测单细胞内目标蛋白质的系统,此系统包括:电源模块、微流控芯片模块、单细胞处理及蛋白质分离模块和荧光检测模块。其中,微流控芯片模块中的微型通道直径与细胞直径相当,使得细胞在进样时,保证每次只有一个细胞进入系统,并且微流控芯片与十通阀相连,可将单细胞引入高压液相系统中;单细胞处理及蛋白质分离模块用于实现单细胞捕获、单细胞破膜、蛋白质捕获和蛋白质分离;荧光检测模块包括荧光检测器、数据采集器和数据处理器,荧光检测器中的光源将目标蛋白激发,产生荧光后被荧光检测器接收;最后,利用数据采集器与数据处理器计算目标蛋白的浓度。
本发明的技术方案是:
一种定量检测单细胞内蛋白质的系统,包括:
(1)电源模块,用于为系统供电;
(2)微流控芯片模块,用于单细胞操控,包括芯片基底、芯片上盖、细胞入口管、细胞出口管和微型通道,将芯片上盖盖在已刻蚀有微型通道的芯片基底上形成微型通道;其中,微型通道的直径与细胞直径相当(相当即微型通道直径与细胞直径相同至小于2倍的细胞直径),使细胞在所述微型通道内分散的流动且细胞之间无连结;采用石英毛细管作为细胞入口管和细胞出口管,细胞入口管的一端与芯片微型通道的入口端相连,另一端插入装有细胞悬浮液的试管中,细胞出口管一端与芯片微型通道的出口端相连,另一端与单细胞处理及蛋白质分离模块中十通阀的10号位相连,石英毛细管内径为10~30μm;
(3)单细胞处理及蛋白质分离模块,包括十通阀、定量环、捕集柱、纳流液相色谱柱、微流液相色谱泵、纳流液相色谱泵、压力控制装置、显微镜和废液管,用于实现单细胞捕获、单细胞破膜、蛋白质捕集和蛋白质分离;十通阀的2号位和5号位之间连接捕集柱,1号位和8号位之间连接透明的定量环,10号位连接微流控芯片的细胞出口管;9号位连接压力控制装置,压力控制装置为一个注射泵或吸气泵;7号位连接微流液相色谱泵,6号位连接废液管;4号位连接纳流液相色谱泵;3号位连接纳流液相色谱柱,纳流液相色谱柱的出口管路上设有透明光窗;
(4)荧光检测模块,包括荧光检测器、信号采集器和数据处理器,荧光检测器的光源照射至纳流液相色谱柱后所连接管路的透明光窗上,用于激发荧光标记的目标蛋白,荧光信号被检测器接收,然后通过信号采集器传输至数据处理器计算细胞内目标蛋白的浓度。
所述微流控芯片模块中,其中微型通道的材质是聚二甲基硅氧烷,芯片基底材料是石英或有机玻璃,微型通道的截面是圆形。
所述压力控制装置的吸气流速是10~100nL/min。
所述捕集柱是C4或C8的整体柱或填充柱,内径为75~150μm,长度为1~3cm;
定量环为透明的带保护涂层的石英毛细管,长度为8~10cm,内径为10~30μm;
色谱泵流动相的流速为300~1000nL/min;
纳流液相色谱泵流动相的流速为50~500nL/min;
纳流液相色谱柱的固定相为C8或C18,色谱填料的粒径为2~5μm,孔径大于30nm,色谱柱内径为25~50μm,柱子有效长度为10~50cm。
所述显微镜的目镜置于十通阀中定量环的上方,用于观察单细胞捕获过程中,细胞的位置和单细胞的状态;压力控制装置抽取芯片微型通道和定量环内的气体,形成负压,为细胞在微型通道和定量环内流动提供动力,细胞先由细胞入口管进入芯片的微型通道内,再经细胞出口管进入定量环中,完成单细胞的捕获;单细胞被捕获至定量环后,切换十通阀,破膜试剂经7号位、8号位进入定量环将细胞破膜,此时定量环与捕集柱连通,破膜后的细胞内容物将上样至捕集柱柱头,细胞内容物中的蛋白质被捕集柱吸附;待上样完成后,再次切阀,此时捕集柱与纳流液相色谱柱相连,经纳流液相色谱泵驱动的流动相将捕集柱柱头的蛋白质洗脱至纳流液相色谱柱进行分离。
所述数据处理器为电脑;电源模块为直流电源。
与现有技术相比,本发明系统具有如下优点:
1、本系统采用纳流液相色谱分离目标蛋白,与毛细管电泳技术相比,在相同内径下,纳流液相色谱柱的柱容量是毛细管电泳的上百倍,克服了毛细管电泳柱容量低的缺点。
2、本系统中,利用微流控芯片提高了单细胞的捕获能力。
3、本系统采用的色谱填料的孔径大于30nm,能够对抗原抗体复合物进行有效分离,适用于采用免疫荧光法标记目标蛋白的单细胞分析方法。
4、本系统可通过液相色谱将细胞内多种目标蛋白分离,仅采用单一光路就可以实现多种目标蛋白的检测,克服了由于荧光分子种类限制所带来的蛋白质检测能力不足的问题。
5、本系统结构简单,成本低,且易于在其他实验室使用。
6、该系统能够实现单个细胞的在线捕获、在线破膜-目标蛋白捕集、在线洗脱并色谱进样,整个过程减少了人工操作带来的误差,有利于提高定量的准确性。
附图说明
图1示意性展示了本发明系统的一种设计示意图;图中:100-微流控芯片模块,200-单细胞处理及蛋白分离模块,300-纳流液相色谱柱,400-荧光检测器,500-数据采集器,600-数据处理器,700-压力控制装置,800-电源模块。
图2示意性展示了本发明系统中所用十通阀的连接方式的示意图;图中:200-十通阀,201-定量环,202-捕集柱,在十通阀内,2号位和5号位连接捕集柱(trap),1号位和8号位连接定量环,10号位连接微流控芯片的细胞出口管,9号位连接压力控制装置,7号位连接微流液相色谱泵(loading-pump),6号位连接废液管(waste),4号位连接纳流液相色谱泵(nano-pump),3号位连接纳流液相色谱柱(column)。
图3示意性展示了本系统中微流控芯片的示意图。图中:100-微流控芯片,101-微型通道,102-细胞出口管,103-细胞入口管,104-芯片基底105-芯片上盖。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,通过实施例和应用例对本发明进行说明。本发明所列的这些具体实施例和应用例仅限于说明本发明,而非对本发明的限定。
实施例1:
本发明提供了一种定量检测单细胞内蛋白质的系统,此系统包括:
电源模块,用于为整个系统供电;
微流控芯片模块,用于单细胞操控,包括芯片基底、芯片上盖、细胞入口管、细胞出口管和微型通道,芯片上盖盖在已刻蚀有微型通道的芯片基底上形成微型通道;芯片示意图如图3,其中微型通道的直径为30μm,与细胞直径相当,使细胞在所述微型通道内分散的流动且细胞之间无连结;采用石英毛细管作为细胞入口管和细胞出口管,细胞入口管的一端与芯片微型通道的入口端相连,另一端插入装有细胞悬浮液的试管中,细胞出口管一端与芯片的出口相连,另一端与单细胞处理及蛋白质分离模块中十通阀的10号位相连,其中,石英毛细管内径为30μm;芯片上盖的材料是PDMS,芯片基底材料是石英,微型通道的截面是圆形;
单细胞处理及蛋白质分离模块,包括十通阀、定量环、捕集柱、纳流液相色谱柱、微流液相色谱泵、纳流液相色谱泵、压力控制装置、显微镜和废液管,用于实现单细胞捕获、单细胞破膜、蛋白质捕集和蛋白质分离;十通阀的2号位和5号位之间连接捕集柱,捕集柱是C4整体柱,内径为75μm,外径是360μm,长度是2cm;1号位和8号位之间连接定量环,定量环为透明的石英毛细管,长度为8cm,内径为30μm,外径是360μm;10号位连接微流控芯片的细胞出口管;9号位连接注射泵,注射泵的吸气流速是20nL/min;7号位连接微流液相色谱泵,色谱泵流动相的流速为300nL/min;6号位连接废液管;4号位连接纳流液相色谱泵,纳流液相色谱泵流动相的流速为75nL/min;3号位连接纳流液相色谱柱,纳流液相色谱柱的出口管路上设有透明光窗,纳流液相色谱柱的固定相为C18,色谱填料的粒径为3μm,孔径为35nm,色谱柱内径为25μm,外径是360μm,柱子有效长度是30cm;
显微镜的目镜置于十通阀中定量环的上端,用于观察单细胞捕获过程中,细胞的位置和单细胞的状态,放大倍数为400倍;压力控制装置抽取芯片微型通道和定量环内的气体,形成负压,抽速为20nL/min,为细胞在微型通道和定量环内流动提供动力,试管中的细胞先由细胞入口管103进入芯片的微型通道101内,再经细胞出口管102进入定量环201中,完成单细胞的捕获;单细胞被捕获至定量环后,切换十通阀,破膜试剂经7号位、8号位进入定量环将细胞破膜,此时定量环与捕集柱连通,破膜后的细胞内容物将上样至捕集柱柱头,细胞内容物中的蛋白质被捕集柱吸附;待上样完成后,再次切阀,此时捕集柱与纳流液相色谱柱相连,经纳流液相色谱泵驱动的流动相将捕集柱柱头的蛋白质洗脱至纳流液相色谱柱进行分离。
荧光检测模块,包括荧光检测器400、数据采集器500和数据处理器600,荧光检测器的光源的波长是405nm,光电放大器的光谱响应范围是320~1100nm;数据采集器是Sepu3010,数据处理器是电脑,荧光检测器的光源照射至透明的毛细管光窗上,光窗直径为25μm,被光源照射的荧光分子发射荧光,被检测器接收,然后通过Sepu3010传输至电脑后,计算细胞内目标蛋白的浓度。模块的工作顺序为:1、电源模块启动,为整个系统供电;2、微流控芯片模块和单细胞处理及蛋白质分离模块协同工作,将单个细胞捕获至十通阀上的定量环中;3、切阀,单细胞处理及蛋白分离模块中的微流液相色谱泵将细胞破膜试剂泵入定量环中,至定量环被充满后停止上样泵,在显微镜观察下,待细胞破膜之后,再次启动微流液相色谱泵,将细胞内蛋白质上样到捕集柱柱头;4、再次切阀,采用纳流液相色谱泵将捕集柱柱头的蛋白质洗脱至纳流液相色谱柱中进行色谱分离;5、荧光检测模块对荧光进行定量检测。
应用例1
采用上述系统对单个巨噬细胞内3种目标蛋白进行定量检测,该实验的流程为:
a、对培养皿中收集的巨噬细胞进行洗涤,通过离心除去细胞的培养液,洗涤完成后,采用细胞稀释液对细胞进行重悬;
b、采用细胞打孔溶剂对巨噬细胞膜进行处理,使巨噬细胞膜表面形成孔道,打孔后再次洗涤细胞,洗涤完成后,采用细胞稀释液对细胞进行重悬;
c、采用封闭试剂对巨噬细胞内的非目标蛋白进行封闭,封闭完成后,离心除去封闭试剂;
d、采用带有BV605荧光基团的三种兔抗人IgG抗体对巨噬细胞内三种目标蛋白进行标记,三种蛋白分别为IL10、IL2和TNF-α,标记完成后洗涤细胞三次,然后采用细胞稀释液对细胞进行重悬,形成细胞悬浮液;
e、电源模块启动,为整个系统供电;
f、首先,微流控芯片模块和单细胞处理及蛋白质分离模块协同工作,将单个细胞捕获至十通阀上的定量环中;如图2,通过注射泵抽取微型通道和定量环中的空气,形成负压,调节注射泵的抽速为20nL/min,将步骤d)中获得的巨噬细胞先由细胞入口管103进入芯片的微型通道101内,再经细胞出口管102进入定量环201中,完成单细胞的捕获;
g、切阀,采用微流液相色谱泵将体积分数为5%的Triton X-100泵入定量环中,至定量环被完全充满后停止泵,反应10min后,在显微镜下可观察到细胞膜破碎,通过微流液相色谱泵中的流动相将破膜后的巨噬细胞内容物上样至捕集柱柱头,上样流动相是体积分数为10%的乙腈,上样时间是10min,上样流速是300nL/min;
h、切阀,通过纳流液相色谱泵中的流动相将捕集柱柱头的细胞内容物洗脱至纳流液相色谱柱当中,进行分离分析,液相色谱梯度洗脱条件为
0~30min 10%~65%(v/v)乙腈
31~32min 65%~10%(v/v)乙腈
32~35min 10%(v/v)乙腈;
i、三种目标蛋白经过梯度洗脱后依次经过检测光窗,激光器电流强度是53mA,荧光信号被检测器接收,检测器检测到的信号通过Sepu3010传输至电脑;
j、建立荧光强度-荧光标记抗体浓度标准曲线,将配制的七个浓度的含三种IL10、IL2和TNF-α蛋白的标准溶液样品通过10号口吸入定量环,至定量环充满,(浓度分别为5×10-13M、1×10-12M、2.5×10-12M、5×10-12M、2.5×10-11M、5×10-11M和1×10-10M)然后按照步骤g~步骤i进行分离和检测,获得各个浓度荧光标记抗体标准溶液的荧光信号强度,然后依据标准溶液的浓度和检测的荧光强度建立标准曲线;
k、依据荧光强度-荧光标记抗体浓度的标准曲线和测定的IL10、IL2和TNF-α蛋白的荧光强度计算单个巨噬细胞内IL10、IL2和TNF-α蛋白的浓度。实验结果表明,50个巨噬细胞内IL10、IL2和TNF-α蛋白的分子数目范围如下:IL10的数目范围是629到12171,平均分子数目为8435;IL2的数目范围是321到4350,平均分子数目为2037;TNF-α的数目范围是2031到25171,平均分子数目为16330。
Claims (6)
1.一种定量检测单细胞内目标蛋白质的系统,其特征在于:包括:
(1)电源模块,用于为系统供电;
(2)微流控芯片模块,用于单细胞操控,包括芯片基底、芯片上盖、细胞入口管、细胞出口管和微型通道,将芯片上盖盖在已刻蚀有微型通道的芯片基底上形成微型通道;其中,微型通道的直径与细胞直径相当(相当即微型通道直径与细胞直径相同至小于2倍的细胞直径),使细胞在所述微型通道内分散的流动且细胞之间无连结;采用石英毛细管作为细胞入口管和细胞出口管,细胞入口管的一端与芯片微型通道的入口端相连,另一端插入装有细胞悬浮液的试管中,细胞出口管一端与芯片微型通道的出口端相连,另一端与单细胞处理及蛋白质分离模块中十通阀的10号位相连,石英毛细管内径为10~30μm;
(3)单细胞处理及蛋白质分离模块,包括十通阀、定量环、捕集柱、纳流液相色谱柱、微流液相色谱泵、纳流液相色谱泵、压力控制装置、显微镜和废液管,用于实现单细胞捕获、单细胞破膜、蛋白质捕集和蛋白质分离;十通阀的2号位和5号位之间连接捕集柱,1号位和8号位之间连接透明的定量环,10号位连接微流控芯片的细胞出口管;9号位连接压力控制装置,压力控制装置为一个注射泵或吸气泵;7号位连接微流液相色谱泵,6号位连接废液管;4号位连接纳流液相色谱泵;3号位连接纳流液相色谱柱,纳流液相色谱柱的出口管路上设有透明光窗;
(4)荧光检测模块,包括荧光检测器、信号采集器和数据处理器,荧光检测器的光源照射至纳流液相色谱柱后所连接管路的透明光窗上,用于激发荧光标记的目标蛋白,荧光信号被检测器接收,然后通过信号采集器传输至数据处理器计算细胞内目标蛋白的浓度。
2.根据权利要求1所述的定量检测单细胞内目标蛋白质的系统,其特征在于:所述微流控芯片模块中,其中微型通道的材质是聚二甲基硅氧烷(PDMS),芯片基底材料是石英或有机玻璃,微型通道的截面是圆形。
3.根据权利要求1所述的定量检测单细胞内目标蛋白质的系统,其特征在于:所述压力控制装置的吸气流速是10~100nL/min。
4.根据权利要求1所述的定量检测单细胞内目标蛋白质的系统,其特征在于:
捕集柱是C4或C8的整体柱或填充柱,内径为75~150μm,长度为1~3cm;
定量环为透明的带保护涂层的石英毛细管,长度为8~10cm,内径为10~30μm;
色谱泵流动相的流速为300~1000nL/min;
纳流液相色谱泵流动相的流速为50~500nL/min;
纳流液相色谱柱的固定相为C8或C18,色谱填料的粒径为2~5μm,孔径大于30nm,色谱柱内径为25~50μm,柱子有效长度为10~50cm。
5.根据权利要求1所述的定量检测单细胞内目标蛋白质的系统,其特征在于:
显微镜的目镜置于十通阀中定量环的上方,用于观察单细胞捕获过程中,细胞的位置和单细胞的状态;压力控制装置抽取芯片微型通道和定量环内的气体,形成负压,为细胞在微型通道和定量环内流动提供动力,细胞先由细胞入口管进入芯片的微型通道内,再经细胞出口管进入定量环中,完成单细胞的捕获;单细胞被捕获至定量环后,切换十通阀,破膜试剂经7号位、8号位进入定量环将细胞破膜,此时定量环与捕集柱连通,破膜后的细胞内容物将上样至捕集柱柱头,细胞内容物中的蛋白质被捕集柱吸附;待上样完成后,再次切阀,此时捕集柱与纳流液相色谱柱相连,经纳流液相色谱泵驱动的流动相将捕集柱柱头的蛋白质洗脱至纳流液相色谱柱进行分离。
6.根据权利要求1所述的定量检测单细胞内目标蛋白质的系统,其特征在于:数据处理器为电脑;电源模块为直流电源。
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2019
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