JP2008506969A - 光学顕微鏡で試料を分析するための機器および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、生体試料を分析するための機器、システム、および方法に関するものである。特に、本発明は、光学顕微鏡による試料の分析のためのシステムと方法を提供する。本発明は微細な、位置検出および焦点合わせを可能にする。本発明は、少なくとも二つの連携した光線の使用を含む。そのうちの一つはもう一方の位置を決定するために機能する。望ましい実施様態においては、前記システムは全内部反射光学系が据え付けてある顕微鏡である。本発明はまた、全内部反射対物レンズが組み込まれている標準的な顕微鏡からも構成可能である。

Description

関連出願に対する引用
本願は、２００４年７月１９日に出願された、米国仮特許出願第６０／５８９，１７０号に対する優先権を主張し、この出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。本願はまた、本願と同日出願の代理人整理番号ＨＬＩ−００２Ｂによって同定される米国特許出願を本明細書中に参考として援用する。

技術分野
本発明は、一般に、微量流体および関連した生体物質の取り扱いおよび分析のための、機器、方法、およびシステムに関連する。特に本発明は生体試料を分析するための、照明システムのような光学装置に関連する。

背景
一般的に、フローセル中の試料を分析するシステムは、圧力ポンプを用いた圧力駆動流体システムである。前記圧力駆動流体システムはいくつかの不都合な点がある。一つの不都合な点は、前記圧力駆動システムは試料容器がフローセル組立部に密閉されて接合されていなければならないことである。これは、フローセルの取り外しを一層複雑にする。なぜなら、フローセルの取り外しは有害なエアロゾルの発生をもたらすからである。圧力システムはまた、圧力によりシステムにおける漏れが生じることが知られており、圧力システムは頻繁にラインおよびバルブの交換が必要となりがちである。加えて、圧力駆動システムは試料に汚染物質をもたらしてしまう。システムに液体を押し通すことのもう一つの不都合な点は、空気がシステム内に捕捉されるようになること、また、空気泡が試料にもたらされてしまうことである。ポンプ内への空気の混入はキャビテーションをもたらし、システムに衝撃を与える。さらに、圧力駆動システムでは、一つ一つの試料が検査されるごとにラインを適切にパージすることは難しい。これにより、次の検査が行われるときにシステムに残留物が残されているという状況が生じる。また、空気圧によるシステムのパージは、試料に泡や一層細かい泡をもたらし易く、これは分析に不正確さをもたらすことになる。

フローシステム中の試料を分析するために使用されてきた真空駆動の先行技術もまた、不都合な点をもつ。これらの前記先行技術では、真空ポンプがフローセルに直接接続されている。ここでも再び、ポンプの使用が試料に気泡をもたらすことになり、ポンプ内に捕捉された空気はシステムに衝撃をもたらす。加えて、継続的なポンプのオン・オフサイクルは、フローセルを通過する試料の経路が一様でなくなる状況をもたらす。真空システムの先行技術はまた、一般にマルチセル試料をフローセルに通すことに適している。ポンプをフローセルに直接接続することは、ひとつにはシステムに衝撃を与えてしまう理由から、単細胞試料に悪影響をあたえる。

微量流体および関連した生体物質を光源を用いて分析する場合、前記光源は、全内部反射蛍光（「ＴＩＲＦ」）をもたらすように試料を照射することが望ましい。ＴＩＲＦは、ガラスのような密度の高い媒質中を進行している光が、水のようなより密度の低い媒質との境界にぶつかるときに起こる光学的現象である。光が小さな角度で境界にぶつかる場合、光のうちのいくらかは前記境界を通過し（回折され）、いくらかは密度の高い媒質中に反射されて戻ってくる。臨界角とよばれるある角度において、光のすべてが屈折される。しかし、光線のエネルギーのうちのいくらかは低密度媒質のなかを短距離だけ進行し、エバネセント波を生成する。エバネセント波は前記媒質中をわずか約１００ｎｍだけ進入する。このエネルギーが吸収されない場合、このエネルギーは高密度媒質に戻ってくる。しかし、蛍光物質分子がエバネセント波の中にある場合、前記蛍光物質は光子を吸収し、励起される。励起された蛍光物質は、例えば感度を増強したＣＣＤカメラを使って観測できる。ＴＩＲＦを得るために臨界角を正確に調節することは、動的システムでは困難である。

発明の開示
本発明は、光学顕微鏡で試料を分析するシステムと方法を提供する。本発明は微細な、位置検出および焦点合わせを可能にする。本発明は、少なくとも二つの連携した光線の使用を含む。そのうちの一つはもう一方の位置を決定するために機能する。望ましい実施様態においては、前記システムは全内部反射光学系が据え付けてある顕微鏡である。本発明はまた、全内部反射対物レンズが組み込まれている標準的な顕微鏡からも構成可能である。

一態様において、本発明は対象試料を分析するための第一光源および第二光源を有するシステムに関連する。前記第一光源は対象試料と交差する第一光路を画定し、前記第二光源は前記第一光源と共に機能して前記第一光路の位置を決定する。

前記態様の様々な実施形態において、前記第一光源と前記第二光源は同時に機能する。前記第二光源は前記第一光路と少なくとも部分的に同軸であるような第二光路を画定する。一実施形態において、前記第二光源は、前記対象試料に対する前記第一光路の反射角を検出するための位置センサに向けられている。前記第一光路の位置は、前記位置センサからの信号に応じて、前記反射角を変化させるように調整可能である。前記第一光路の位置は、前記対象試料に対する前記第一光源の全内部反射が実質的に得られるように調節可能である。

また、前記第一光源の波長は約３９０ｎｍ〜約１５５０ｎｍまでである。一実施形態において、前記第二光源は赤外光である。前記第一光源および／または前記第二光源は、レーザ、発光ダイオード、もしくはランプである。一実施形態において、前記システムは対象試料を画像化するための撮像装置を備える。さらに、前記システムは、対象試料を分析するための第三光源を備える。前記第三光源は前記第一光路と少なくとも部分的には同軸である第三光路を画定する。前記第一光源と前記第三光源は同時に機能する。前記第二光源は、前記第一光路の位置を継続的に監視するために使用される。一適用例として、前記光源システムは単一分子配列決定システムでの使用に適合され得る。

別の態様において、本発明は対象試料に対する全内部反射を実質的に保つ方法に関する。前記方法は、対象試料と交差するための第一光線を提供するステップと、前記第一光線の位置を決定するための第二光線を提供するステップと、前記第二光線を位置センサに向けるステップと、前記位置センサからの信号に応じて前記第一光線の位置を調整し、対象試料に対する前記第一光線の反射角を変化させ、実質的に全内部反射を保つステップと、を含む。

様々な実施形態において、前記第一光線は前記第二光線と少なくとも部分的には同軸である。前記第一光線は対象試料を分析するためにある。一実施形態において、前記第一光源の波長は約３９０ｎｍ〜約１５５０ｎｍまでである。前記第二光源は赤外光でよい。前記方法はまた、継続的に前記第一光線の位置を監視するステップと、前記対象試料からの反射角を調整して実質的に全内部反射を保つステップと、を含むこともある。

別の態様において、本発明は試料を分析するためのシステムに関する。前記システムは、フローセルと、前記フローセルの中を通してある容積を吸引するパッシブ真空源と、前記フローセル内の前記試料を照射するための照明システムと、前記フローセル内の前記試料を観察するための光学機器とを含む。前記照明システムは、上で記述したタイプのものである。一実施形態において、前記容積は前記試料もしくは前記試料と反応する物質を含むが、この物質は前もってフローセル上もしくはフローセル内に存在する。あるいは、またはこれに加えて、前記試料は容積がフローセル中を通過していく間にフローセルに付着するか、もしくはフローセル内に留まり得る。一実施形態において、前記容積および／または試料は重力によってフローセル内を移動する。例えば、フローセルへの吸気口内での前記容積に対する上部圧力は、前記フローセル内を前記容積が移動するのに十分である。

前記態様の様々な実施形態において、前記システムは前記フローセルを支えるステージを含む。前記ステージは少なくとも一方向に移動可能である。一実施形態において、前記ステージは直交する二方向に移動可能である。前記システムは、前記試料の画像取得のための画像取得装置を備えることもある。前記画像取得装置は、電荷結合素子装置（ＣＣＤ）もしくは相補型金属酸化膜半導体装置（ＣＭＯＳ）もしくは電荷注入装置（ＣＩＤ）もしくはビデオカメラであってもよい。加えて、前記システムは、前記システムによって作り出されたデータの収集および加工のための処理装置、前記データの保存のための記憶装置、および少なくとも前記データもしくは前記試料のどちらかを表示させるための手段、を備えることができる。

別の態様において、本発明は生体試料のような微量流体の分析のための機器に関係する。前記機器は前記パッシブ真空源およびフローセルを備え得る。前記微量流体は前記パッシブ真空源によってフローセルから吸引される。一実施形態において、前記パッシブ真空源は、ポンプ、電動モータのようなポンプドライバ、および容器、を備える。前記ポンプは前記容器に接続され、ついで前記容器内を吸引するように動作し得、それにより前記容器内部に真空をもたらす。一実施形態において、真空圧は約１”Ｈｇ〜約２９”Ｈｇである。前記真空圧は、前記フローセル中を微量流体が通過する速度を変化させるために調節される。

前記態様の様々な実施形態において、前記機器／前記システムは、単一分子検出に使用され得る。一実施形態において、前記フローセルはヌクレオチドを受けるための表面を有する。例えば、前記フローセルは、結合されたヌクレオチド、前記ヌクレオチドに結合されたプライマーおよび／または前記フローセルを有し得る。特に、前記フローセルはスライドとカバーガラスを備え得、前記ヌクレオチドおよび／または前記プライマーが、少なくとも前記スライドおよび前記カバーガラスのうちの少なくとも一方に結合される。加えて、前記フローセルは前記微量流体がそこを通過して吸引されるような導管を有する。

前記態様の様々な実施形態において、前記容器の容積と微量流体体積との比は、約１，０００：１〜約２，０００，０００：１もしくは約５０，０００：１〜約１，０００，０００：１、または約２００，０００：１である。さらに、前記機器は前記の各種の構成部品の間に弁体を有し得る。例えば、前記機器は、例えば前記容器のような前記真空源と前記フローセルの間にバルブを備え得る。前記バルブは、前記フローセルと前記真空源をつなぐ開位置と、前記フローセルを前記真空源から分離させる閉位置を備える。前記機器は前記容器につながれた新空圧表示器をも備え得る。さらに、前記機器は、前記微量流体にさらした後の物質の分析を前記フローセル内で行うための光学装置を備え得る。

別の態様において、本発明は単一分子を検出する方法に関する。前記方法は、単一分子を含む試料を、特定の分子を同定するために扱われる前記フローセルの中に置くステップと、前記フローセルを真空にするステップと、前記フローセルによって画定された導管を通して前記試料を吸引するステップと、前記フローセルにさらされた前記分子を同定するために前記試料にさらした後に前記フローセルを観察するプロセスと、を含む。

別の態様において、本発明は単一分子を検出する方法に関する。前記方法は、特定の分子を同定するために扱われる導管を画定するフローセルを提供するステップと、前記導管を通して、単一分子を含む試料を吸引するために前記導管を真空にするステップと、前記単一分子を同定するために前記導管内の試料を観察するステップと、を含む。

前記方法の様々な実施形態は、前記導管から前記試料を吸引した後に前記フローセルから真空を解除するステップを含む。真空に引くステップは、前記フローセルをパッシブ真空源にさらすことを含む。様々な実施形態において、前記試料はヌクレオチドを含む微量流体を含む。加えて、前記フローセルは、特定のヌクレオチドを結合するよう処理された、スライドもしくはカバーガラスのうち少なくとも一つを含み得る。さらに、前記フローセルを観察する前記ステップは、前記したような照明システムによって前記フローセルを照射することを含み得る。前記フローセルを観察する前記ステップは、また、画像化装置の使用を含み得る。一実施形態において、前記方法の動作を制御するために処理装置が使用され得る。前記処理装置は、前記方法が行われている間に作成されたデータの収集および加工のために使用される。前記方法はさらに前記フローセルもしくは前記データのうちの少なくとも一方を表示するステップを含み得る。

別の実施形態において、単一ヌクレオチド検出は、テンプレート依存核酸合成のためのプライマーの存在下でフローセルにテンプレート核酸を加えることで、遂行される。本発明による装置の使用により、テンプレート依存核酸合成のための試薬の導入のため、前記フローセルにわたり真空が生成される。例えば、テンプレート／プライマーのペアが前記フローセルの表面に一旦結合すると、標識付または非標識のヌクレオチド、およびヌクレオチド付加に触媒作用を及ぼすポリメラーゼが導入ポートから加えられる。前記真空化が作動され、前記試薬は前記フローセルにさらされ、その後、前記容器への出口ポートから出ていく。洗浄ステップの後、プライマーに付加された相補的ヌクレオチドが検出される。なるべくなら、試薬ヌクレオチドは例えば蛍光染料によって標識されることが望ましい。このような染料は光学顕微鏡の使用で観測される。例えば、シアニン染料（シアニン−３もしくはシアニン−５）は結合ヌクレオチドの光学的検出に有用である。光学的検出可能な標識の使用により、核酸配列決定は単一分子レベルで行われる。これは、個々のテンプレート核酸それぞれが光学的に分離可能な仕方で前記フローセルに位置づけられることを意味する。前記テンプレートの位置は、例えば個々のテンプレートと混合した、染料標識されたプライマーの使用により決定される。標識付ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドが前記プライマーに付加されるという条件の下で、前記したメカニズムの使用により前記フロー導管にわたり流れていく。一旦混合されると、前記標識は、適当な波長での前記染料の励起および発光スペクトルの検出のための発光フィルタの使用により、検出される。テンプレートを含むことが知られている位置で起こる発光は、その位置において前記標識付塩基の取り込みが行われたことを示す。これらのステップを複数回実行することにより、配列決定は完成する。単一分子配列決定技術は、ＢｒａｓｌａｖｓｋｙらのＰＮＡＳ（ＵＳＡ），１００：３９６０−３９６４（２００３）および同時係属の米国特許出願第０９／７０７，７３７号に記述されており、どちらも参照することにより本明細書に組み込まれる。

別の態様において、本発明はヌクレオチドのような単一分子を分析するフローセルに関する。前記フローセルは、スライド、カバーバラス、および前記スライドと前記カバーガラスの間に配置されるガスケット、を含む。前記スライド、前記カバーガラス、および前記ガスケットは、真空下で単一分子を受け渡すための微量流体導管を画定する。様々な実施形態において、前記フローセルは前記スライドおよび／または前記カバーガラスに結合されたヌクレオチドを含む。加えて、前記フローセルは、前記ヌクレオチド、前記スライド、およびカバーガラスのうちの少なくとも一つに結合されたプライマーを含む。一実施形態において、前記スライドは、前記スライドに結合されている多数のヌクレオチドをもつ。

別の態様において、本発明はフローセルと共に使用されるスライドに関する。前記スライドは、前記スライドの表面に結合されたヌクレオチドを少なくとも一つ含む。前記スライドは前記フローセルの内部に配置される。前記スライドはさらに、前記スライドもしくは前記ヌクレオチドの少なくともどちらか一つに結合されているプライマーを含む。加えて、前記スライドは、前記スライドに結合されている複数のヌクレオチドを含む。

別の態様において、本発明はフローセルと共に使用されるカバーガラスに関する。前記カバーガラスは、前記カバーガラスの表面に結合されたヌクレオチドを少なくとも一つ含む。前記カバーガラスは前記フローセルの内部に配置される。前記カバーガラスはさらに、前記カバーガラスもしくは前記ヌクレオチドの少なくともどちらか一つに結合されているプライマーを含む。一実施形態において、前記カバーガラスは、前記カバーガラスに結合されている複数のヌクレオチドを含む。

本明細書中で開示する本発明の優位性と特徴に加えて、前記した目的および他の目的は、以下の発明の説明、添付図面、および特許請求の範囲の参照を通して明らかになる。さらに、本明細書中で記述する様々な実施形態は互いに排他的ではなく、様々な組み合わせおよび置換で存在可能であることが理解されるべきである。

発明の説明
本発明の実施形態は以下で説明される。しかし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではなく、むしろ、当該技術に精通した者には明らかな変更も含まれることを意図していることが明らかである。例えば、以下の実施形態の多くはフローセルの中を通して微量流体を吸引することに関連して記述されるが、しかし、本発明はまた、例えばフローサイトメトリーやケミカルアナライザーのような他のタイプの分析装置を通した流体吸引に適用することもできる。さらに、機器は、例えば単一ヌクレオチドの光学的検出による単一分子検出のためのシステムの一部として使用されることも可能である。

一実施形態において、機器１０は真空源１２、分離バルブ２０、およびフローセル３０を含む。図１に描写された実施形態において、真空源１２はパッシブであり、真空ポンプ１４、駆動モータ１６、および容器１８を含む。代替的には、真空源１２はノンパッシブであることも可能であるが、このときには真空ポンプ１４はフローセルに直接接続される（例えば図３を参照）。一実施形態において、真空ポンプ１４はコンパクトな回転翼タイプポンプである。しかし、ポンプのサイズおよびタイプは特定の用途に合わせて選択される。例えば、ポンプは、ピンストタイプ、ギアタイプ、もしくはダイアフラムタイプのポンプであることも可能である。さらに、ポンプのサイズは機器１０の動作パラメータに依存する。例えば、ポンプの容量がより大きければ、ポンプ１４は容器１８を一層早く真空化する。一実施形態における駆動モータ１６は１２ボルト直流電流モータである。しかし、モータのサイズおよびタイプは、特定の用途に合わせて選択される。例えば、フローをより大きくするにはより大きなポンプが必要だが、このことは今度はより大きなモータを必要とする。さらに、ポンプ１４は一方向のものでも双方向のものでも可能であり、さらにモータ１４に、直接もしくはフレキシブルカップリングを使って、または当業者には既知の他の手段によって結合される。特定の実施形態において、ポンプ１４およびモータ１６は、例えばウィスコンシン州シェボイガンのＴｈｏｍａｓ Ｐｕｍｐｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｒｅｓｓｏｒｓから入手可能な型式番号５０２００のような組立部品として供給される。

一実施形態における容器１８は、例えばニューヨーク州ロチェスターのＮａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能なＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）型式番号２１２５−４０００のような４リットルのボトルである。容器のサイズは特定の用途に合わせて選択され、また、以下で一層詳細に議論されるが、典型的には真空源１２によって吸引される微量流体の量より実質的に大きい。加えて、容器の材質は金属でもポリマーでも、もしくはそれらの組み合わせでもよい。とくに、容器の材質は微量流体３２と両立するものでなければならない。また容器１８は、容器１８がさらされる圧力に耐えうるものでなければならない。例えば、容器１８は最小の真空漏れで、かつ潰れることなく真空を保つことが出来なければならない。

図１に示される機器１０は、三つのバルブ、２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ（まとめて２０とする）を含む。バルブ２０は、コネチカット州ウェストブルックのＬｅｅ Ｃｏ．から入手可能な型式番号ＬＨＤＡ１２３３１１５Ｈのような、２位置３結合方式ソレノイド弁である。バルブを作動させるソレノイドは１２ボルト直流電圧により電圧を加えられる。しかし、他の電圧も使用可能であり、バルブは油圧または空気圧または手動で作動させることも出来る。加えて、バルブのタイプおよび構造は特定の用途に合わせて選択することが出来る。例えば、バルブは、２位置２結合タイプもしくは２位置４結合タイプであることも可能である。

第一バルブ２０Ａは容器１８とポンプ１４の間に配置される。作動していない状態では、バルブ２０Ａは容器１８をポンプ１４から分離する。ポンプの吸気口４０は大気に繋がれ、一方容器の排気口４２は閉じられる。代替としては、ポンプの吸気口４０は閉じられることもあり得る。第一バルブ２０Ａが、例えばソレノイドに電圧を加えることにより作動すると、バルブ２０Ａは位置を変え、それによりポンプの吸気口４０を容器の排気口４２に接続し、（稼働している）ポンプ１４が容器１８の真空を引くことができるようにする。一実施形態において、真空圧は約１”Ｈｇ〜約２９”Ｈｇであるが、望ましくは約２”Ｈｇ〜１５”Ｈｇまで、さらに望ましくは約５”Ｈｇ〜約６”Ｈｇがよい。しかし、真空圧は特定の用途に応じて変えることが可能である。一般的に、真空圧をよくするほど、フローセルを通して微量流体３２はより速く吸引されることになる。ある場合には、微量流体３２によるフローセル３０内の残留物の量を減少させるために、速いフローが求められる事がある。

第二バルブ２０Ｂは容器１８とフローセル３０の間に配置される。作動していない状態では、バルブ２０Ｂは容器１８をフローセル３０から分離する。容器の吸気口４４は閉じられているが、一方、フローセルの排気口４６は大気に繋がれる。代替として、フローセルの排気口４６は閉じられることもあり得る。第二バルブ２０Ｂが作動すると、バルブ２０Ｂは位置を変え、それによりフローセルの排気口４６を容器の吸気口４４に接続し、結果としてフローセル３０を通して物質３２を吸引することにより、容器１８の内部を真空にする。

任意的なものとして、図１に示された第三バルブ２０Ｃが容器１８に接続され、容器１８をベントすることに使用される。任意のバルブ２０Ｃは、様々な機能を実行するために、機器１０の上の様々な位置に配置されてもよい。代替として、または付加的に、複数のバルブ２０は複数のフローセル３０と併せて使用されることもある。例えば、機器１０は１０個のフローセル３０または他の分析装置を含み、それぞれがバルブ２０および容器１８に直列的に接続される（例えば、図２を参照）。

フローセル３０は、前記の通り真空源１２に接続される。複数のフローセル３０もしくは他の分析装置は、直列的もしくは並列的に真空源１２に接続される（例えば、図２を参照）。一実施形態において、フローセル３０は、ペンシルベニア州バトラーのＢｉｏｐｔｅｃｈｓから入手可能なＦｏｃｈｔ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（型式番号ＦＣＳ２）である。あるいは、特別注文によるフローセルの使用も可能である。図９〜図１１に描かれているフローセル４３０は特別注文によるフローセルであり、図９〜図１１に関して後ほど一層詳細に記述される。

図１には、微量流体３２を機器１０へ導入するためのピペット５０がさらに描かれている。しかし、他のタイプの容器が微量流体３２を機器１０へ導入するために使用できる。例えば、キュベットもしくはビーカーを使うことも可能である。ピペット５０はフローセルの吸気口４８の上部に直接位置される。一実施形態において、微量流体３２はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定に使うための単一分子を含む。一実施形態において、ピペット５０は、約２マイクロリットル（μｌ）〜約２ミリリットル（ｍｌ）の範囲の、望ましくは約１０μｌ〜約１００μｌの範囲の、さらに望ましくは約２０μｌの、個々の微量流体を手動的もしくは自動的に分配する。さらに、ピペット５０は、無人操作で取り扱われ、例えばフローセルの吸気口４８に対してピペット５０を適当な位置に置き、ピペット５０の中で物質を受け取り混ぜ合わせ、および／または、時間および／または量に基づき微量流体３２を正確に分配する。

機器１０はさらに、コネチカット州スタンフォードのＯｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．から入手可能な型式番号ＤＰＧ１０００Ｂ−３０ＩＮＨＧＶＡＣのような圧力表示器６０を備える。表示器６０は、容器１８の内部の真空圧を測定するために使用される。しかし、追加の表示器が機器１０内の別の場所、例えばフローセルの排気口４６、における圧力を測定するために使用されることも可能である。表示器６０は、圧力ゲージ、圧力変換器および／または圧力スイッチでもよく、読み出しを備えていても備えなくてもよい。例えば、圧力変換器は、容器１８の内部の実際の真空圧のデジタル読みだしを備えていることも可能であり、そして／もしくは圧力スイッチは、もし容器１８の内部の圧力が閾値に達したら警報を作動させることも可能である。

図１に描かれている機器１０は、任意のコントローラ７０をも備える。コントローラ７０は、例えばコンピュータ６８および関連するソフトウェアにより、例えば真空源１２およびバルブ２０の動作を電気的に制御することを含む。機器１０は、コンピュータ６８へ直接もしくはコントローラ７０を介して、データの送受信を行うことが出来る。コンピュータ６８は、処理装置、ハードドライブ、ＲＡＭ、ビデオモニター、およびキーボードを備えた、研究室環境に見られるような標準的なコンピュータシステムであり得る。コンピュータ６８は、コントローラ７０とやりとりをし、機器１０を機能させるために必要に応じてデータの保存および加工を行う。代替的もしくは付加的に、コントローラ７０は内部データ処理装置を備えることが出来る。あるいは、機器１０は手動の制御も可能である。示されたコントローラ７０は、マサチューセッツ州ミドルボロのＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な、スイッチおよびセンスタイプである。正確なコントローラの形状は、例えば必要とされる入力および出力の数、および制御される装置のタイプを基にして選択されることになる。一実施形態において、コントローラ７０は、ポンプ１４およびモータ１６のオン・オフを循環させること、およびあらかじめ設定された時間間隔に基づいて、および／またはセンサからの信号に応じてバルブ２０を作動させるロジックを含む。コントローラは、機器１０の様々な構成部品に、必要なパワーを供給する。

図２は、本発明に従う、機器１１０の代替実施形態を、図式化して描いたものである。機器１１０は、図１に関して上記で述べた機器１０と同様である。しかし、図２に示された機器１１０は複数のフローセル１３０、１３０’、１３０”、および並列的に配置された、対応する第二バルブ１２０Ｂ、１２０Ｂ’、１２０Ｂ”を含む。上記の通り、機器１１０はポンプ１１４、モータ１１６、および容器１１８を含むパッシブ真空システム１１２；第一バルブ１２０Ａ；圧力表示器は１６０；ならびにコントローラ１７０を含む。

前記の複数のフローセル１３０、１３０’、１３０”および対応する第二バルブ１２０Ｂ、１２０Ｂ’、１２０Ｂ”は並列的に配置され、同時もしくは連続的な多数の動作の実行を容易にする。例えば、使用者は三つのことなる動作を、動作の間にセットアップを変更することなく実行することができる。容器１１８と微量流体３２、３２’、３２”の容積の差△Ｖが大きいことで、性能の低下を引き起こさずに多数の動作を行うことができる。代替もしくは付加的なこととして、フローセル１３０を連続的に配置することも可能ではある。しかし、連続的に配置されたフローセル１３０は同時に駆動されなければならず、また隣のフローセル１３０に影響を与えるかもしれない。

図３は、本発明に従う、機器２１０の代替実施形態を、図式化して描いたものである。機器２１０は、図１および２に関して上記で述べた機器１０および１１０と同様である。しかし、図３に示された機器２１０は容器を含まない。機器２１０はポンプ２１４およびモータ２１６を有するノンパッシブ真空システム２１２を含む。ポンプ２１４は単一バルブ２２０を介してフローセル２３０に直接接続される。機器２１０はさらに、ポンプ２４０とフローセルの排気口２４６との間に配置される圧力表示器２６０、およびコントローラ２７０を有する。

図４Ａは、図１で図式化して描かれた機器１０の、ひとつの可能な構造の図的記述である。真空システム１２、バルブ２０、および表示器６０は実験用回路板７２上にマウントされ、容器１８は実験用回路板７２の隣で独立して立ち、フローセル３０は実験用回路板７２の隣の顕微鏡タイプステージ５２の上に配置される。実験用回路板７２は、スタンドオフ７４および実験用回路板７２の四隅に配置されたねじ７６を介して、コントローラ７０の上にマウントされる。バルブ２０を動作させるためのプッシュボタン５６、および様々な構成要素のための電気的および流体的接続もまた、実験用回路板７２の上にマウントされる。

図４Ａに示されるように、機器１０は、例えばポンプ１４および容器１８などの様々な構成要素を接続するために配管５４を使用する。一実施形態において、配管５４は、例えばアリゾナ州フェニックスのＰｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣから入手可能な毛細管タイプの配管である。代替もしくは付加的なこととして、例えばペンシルベニア州サウサンプトンのＮｅｗ Ａｇｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＮｙｌｏｔｕｂｅ（登録商標）のような、外径１／８”のナイロン製の標準的ポリマー配管が使用される。配管のサイズ、タイプおよび材質は特定の用途に応じて選択される。例えば、金属製の配管は生体物質には望ましくないかも知れず、さらに、配管５４のサイズは微量流体のフローパラメータに基づいて選択されるべきである。例えば、配管５４の内径は、そこを通過する微量流体の乱流を避けるのに十分な径でなければならない。

さらに、機器１０は様々な光学部品を備える。例えば、顕微鏡対物レンズ、カメラ、微量流体３２の中身を光学的に分析するための複数の光源、および／または機器１０の操作である。加えて、フローセル３０は、使用者が光学的に観察するために、顕微鏡タイプステージ５２の上に配置される。一実施形態において前記ステージ５２は、Ｘ、Ｙ、および／またはＺ方向に移動可能で、光学部品に対するフローセル３０を適当な位置に置くように出来る。代替的実施形態において、フローセル３０は固定された物の内部に固定される。代替的または付加的に、光学部品はＸ、Ｙ、および／またはＺ方向に移動可能である。機器１０はまた、機器１０の様々な動作を監視するための付加的なセンサを有することも可能である。例えば、機器１０は、フローセルの吸気口４８内の微量流体３２の量のレベルを監視するための光学センサを備えることも可能である。

図４Ｂは、図４Ａに示される機器１０の一部分の図的記述である。具体的には、図４Ｂは、フローセル３０の拡大した様子を図４Ａとは反対側から見た図である。フローセル４８がむき出しの遮る物がない状態で示されている。稼働の際は、フローセルの吸気口４８の上部にピペットが置かれる。ピペットは、フローセル３０を通って吸引される微量流体を含んだり分配したりする。フローセルの吸気口４８の上部に示されるのは、フローセルの吸気口４８の画像およびそこを通過する流体フローを使用者に表示するために使用されるカメラ８０、例えば任意のビデオモニターである。代替的または付加的に、画像は、例えば第二バルブ２０Ｂを閉めるための信号をコントローラ７０に送るためのセンサとともに使用され得る。フローセルの排気口４６は、フィッティングおよびそこで稼働している毛細管タイプ配管と共に示される。フィッティング７４は、例えばナットおよびフェルールタイプ部品のような、配管をフローセルの排気口４６に接続するために使用される標準タイプの部品である。配管は第二バルブ２０Ｂに接続される（図４Ａ参照）。フローセル３０の隣に示されるのは、例えばフローセル３０のような様々な構成部品を温めるために使用されるヒータ５８であり、必要に応じて特定の動作を実行する。

機器１０は、図４Ａ、４Ｂ、５および６に関してさらに記述される。ポンプ１４およびモータ１６は、取り付け用金具７４によって実験用回路板７２の上にマウントされる。前記の３つのバルブ２０もまた、実験用回路板７２に固定される。ポンプ１４は二つの連結部を持つ。吸気口４０および排気口４１である。排気口４１は大気に向かって開いているが、排気口フィルタ２４を備えること（図１）も、もしくは離れた場所へ配管されることもある。吸気口４０は、配管５４を介して第一バルブ２０Ａ上の排気口４３へ配管される。第一バルブ２０Ａの吸気口４５は容器１８に配管される。ポンプ１４、バルブ２０、および容器１８の連結部はプッシュタイプのフィッティングであり、配管５４はフィッティングに押し込まれると摩擦および／または返しによって固定される。他のタイプのフィッティングもまた、本発明の範囲内で沈思および熟考される。

第二バルブ２０Ｂ上の排気口４７は、容器１８に配管される。第二バルブ２０Ｂ上の吸気口４９はフローセル３０に配管される。第三バルブ２０Ｃは図式化された構造では任意であるため、従って、配管されて示されてはいない。圧力表示器６０は、容器１８内の真空圧を継続的に監視するため、容器１８に配管された吸気口５１を備える。

バルブ２０のそれぞれ、およびモータ１６は電気連結部５３を備える。電気連結部５３は、必要な電源および制御ロジックへの接続のために前記コントローラ７０に配線される。プッシュボタン５６Ａ、５６Ｂ、５６Ｃ、５６Ｄ（まとめて５６とする）もまた、バルブ２０、モータ１６、およびコントローラ７０と配線される電気連結部を備える。コントローラ７０は、コントローラ７０をコンピュータ６８へ接続するための電気連結部７８を備える（図１を参照）。コントローラ７０は、外部電源に接続するための付加的連結部を備えることもある。一実施形態において、電気連結部７８はＵＳＢコネクションである。代替的または付加的に、コントローラ７０は、Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｉｎｃにより販売されているＦＩＲＥＷＩＲＥ（登録商標）商標のような、ＩＥＥＥ１３９４コネクションを備えることもあり得る。コントローラ７０はさらに、電源スイッチおよび表示器を、単独もしくはユーザインターフェースの一部分として備える。

上記で示された一実施形態において、プッシュボタン５６は、ポンプ１４を駆動するモータ１６を動作させ、また、ソレノイド弁バルブ２１に電圧を加えることでバルブ２０を作動させる。具体的には、第一プッシュボタン５６Ａは、押されると、モータ１６に電圧を加え、それによりポンプ１４が真空を引く。第二ボタン５６Ｂは、押されると、第一電磁バルブ２１Ａに電圧を加え、それによりポンプ１４を容器１８に接続する。５６Ａおよび５６Ｂ両方のプッシュボタンが押されると、ポンプ１４は容器１８から空気を吸引し、それにより容器１８内に真空を作り出す。第三プッシュボタン５６Ｃは、押されると、第二ソレノイド弁２１Ｂに電圧を加え、それにより容器１８をフローセル３０に接続する。第四プッシュボタンは、押されると、第三電磁バルブ２１Ｃに電圧を加え、それにより第三バルブ２０Ｃを作動させる。機器１０は特定の構造による要求次第では、付加的なバルブおよびプッシュボタンを備えることも可能である。加えて、ここに示されたプッシュボタンと対照的に、他のタイプのスイッチも前記の様々な構成部品を作動させるために使用が可能である。例えば、トグルタイプのスイッチが使用可能である。

図７Ａは、本発明に従う機器３１０および補助的な部品を備える本発明、に従う、システム３００の一実施形態を図式的に描いたものである。図７Ｂは、前記システムの様々な構成部品の一つの可能な配置を描いたものである。前記補助的部品は、照明／光学モジュール３２０、顕微鏡モジュール３３０、およびコンピュータモジュール３４０を備える。一般的に、一実施形態において、照明／光学モジュール３２０は、複数の光源、および顕微鏡に光を供給して観察および分析するためのフィルタを備える。光は、例えば顕微鏡モジュール３３０の上に置かれているフローセル３１２上で反射する（図７Ｂ参照）。光は、例えば一つの波長は観察のためで別の波長は分析のためのような、複数の波長を含むものであってよい。特定の照明／光学モジュール６００が図１２Ａおよび１２Ｂに関して記述される。

顕微鏡モジュール３３０は、フローセル３１２を支えるための、および顕微鏡ステージとカメラのような撮像装置を移動させるための、ハードウェアを備える。いくつかの実施形態において、顕微鏡モジュール３３０は機器３１０の一部分である。コンピュータモジュール３４０は、メモリ、様々なモジュールを動作させるために必要な処理装置、およびシステム３００を稼働させるためのユーザインターフェースを有する。前記モジュールは、図７Ａ内の矢印で示させるように、お互いと通信している。例えば、コンピュータモジュール３４０は、ユーザによる入力に基づき照明／光学モジュール３２０に信号を送り、例えばフローセルを照射するために顕微鏡モジュール３３０に赤色光を送る。コンピュータモジュール３４０はまた、顕微鏡モジュール３３０と信号の送受信をして、顕微鏡ステージの位置や他の動作パラメータを変えたり監視したりすることが出来る。加えて、コンピュータモジュール３４０は、バルブの開閉を行うための信号の送受信を顕微鏡モジュール３３０との間で行うことが出来る。

図７Ｂに示されるように、システム３００の様々な構成部品が研究室作業台３０２の上に、互いに接近してマウントされている。しかし、前記の様々な構成部品の配置は、特定の用途および／もしくは環境に応じて変えることが出来る。顕微鏡モジュール３３０は、フローセル３１２もしくは他の分析されるべき品目の位置決めのためのステージ３３２、カメラ３３４、および光学系３３６を備える。一般的に、ニューヨーク州メルビルのＮｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．製の型式番号ＴＥ２０００のような顕微鏡がシステム３００との使用に適している。しかし、使用される顕微鏡のタイプは、特定の用途および分析する試料の性質に基づき選択される。

コンピュータモジュール３４０は、処理装置３４２、ビデオモニター３４６、および、キーボードやマウスなど、システム３００とやりとりをするべくユーザインターフェース３４４を有する。一実施形態において、カメラ３３４は、分析のためのコンピュータモジュール３４０へ画像をおくる、そして／もしくはビデオモニター３４６上に表示する。システム３００の照明／光学モジュール３２０は、光源３４２、３４４、フィルタ３４６、および光源３４２および３４４によって放射された光の調整をするためのモニター３４８、を備える。前記構成部品の配置は、特定の用途および／または環境に応じて変わる。照明／光学モジュール３２０は、顕微鏡内に配置された試料の観察および分析のために、調整された光を顕微鏡モジュール３３０に提供する。

図８は、本発明の一実施形態に従って、機器の基本的な動作を表したものである。一般的に、ユーザは容器の内部の真空状況を監視する（ステップ５１０）。もし、例えば真空レベルが設定した限界値以内でない場合、ユーザは真空ポンプを動作させることで容器内部の真空圧を増加させることができる（ステップ５２０、５３０）。一旦真空圧が設定限界値以内になれば、ユーザは試料（例えば微量流体）をフローセルの吸気口に挿入する（ステップ５４０）。続いて、ユーザはフローセルの、容器への排気口を開け、それによりフローセルを通して試料を吸引する（ステップ５５０）。一旦、ユーザもしくはコントローラがフローセルの吸気口が空であると決定したら（ステップ５６０）、フローセルの排気口と容器の間の連結部は閉じられる（ステップ５７０）。後に続く行程を汚染するのを避けるためにフローセルを通して本質的に試料のすべてを吸引することが望ましい場合には、ユーザおよび／またはコントローラはフローセルの吸気口が空になるまでフローセルの排気口と容器の間の連結をそのままにしておくことになる。もしフローセルを通して吸引されるべきさらなる試料があるならば（ステップ５８０）、試料が無くなるまでこの基本的動作を繰り返し、試料が無くなったら動作を終了する（ステップ５９０）。代替的もしくは付加的なこととして、分析される試料はフローセルの中に含まれるが、その状況では試料はフローセルを通して吸引される物質にさらされることになり、それにより反応を引き起こしたり、もしくはさもなければフローセル内部の試料に影響を与えることになる。

さらに具体的には、稼働中であれば、ユーザは例えばポンプ１４およびモータ１６を動作させて容器１８内に真空を作り、ついで第一バルブ２０Ａを作動させポンプ１４を容器１８から分離する。一旦、例えば約６”Ｈｇのような望ましい真空に到達したら、第一バルブ２０Ａの作動は止められ、ポンプ１４およびモータ１６は停止される。次に、ピペット５０はフローセルの吸気口４８の中に微量流体３２を挿入する、そして、ついで第二バルブ２０Ｂが作動され、それにより真空容器１８をフローセルの排気口４６に接続し、フローセル３０を通して微量流体３２を吸引してそして容器１８に入れ、結果として微量流体およびその内容物を、フローセル内に保持されている例えばヌクレオチドに、一時的にさらすことになる。さらに、試料もしくは微量流体は重力によりフローセルの中を通って動かされることも可能であり、具体的には流体の先端はフローセルの吸気口もしくはピペットの中に保たれている。一旦、微量流体３２がフローセルの吸気口４８から無くなると、第二バルブ２０Ｂは閉じられ、それによりフローセル３０から真空圧が取り除かれる。一般的に、第二バルブ２０Ｂは、微量流体３２がフローセル３０の中を通って通過していくのに十分な長さの時間だけ開いているべきである。もしバルブ２０Ｂが長く開きすぎていると、空気および気泡が前記フローセル３０中に吸引される。もし、必要な時間の分だけ開いていない場合は流体３２の一部がフローセル３０の中に残り、これは後に続く行程を汚染する場合がある。続いて、試料が要望通りに観測および分析される。

稼働中は、微量流体の体積に比較した容器１８の容積がとても大きいことが望まれる。例えば、前記比は約１０００：１〜約２，０００，０００：１、望ましくは約５０，０００：１〜約１，０００，０００：１、さらに望ましくは約２００，０００：１である。一実施形態において、容器１８の容積は約４リットル（ｌ）であり、微量流体体積は約２０μｌであり、それにより結果として比は約２００，０００：１である。正確な比は、例えば容器のリークレート、微量流体のサイズ、および実行される動作の回数に依存する。特別に大きな比は、機器１０の動作が、リークおよび／もしくはフローセル３０の中を通って吸引される微量流体３２のサイズに実質的に影響を受けないという結果をもたらす。なぜなら、真空下での容器の体積は容器によって吸収される量に対してとても大きく、体積変化は無視できるからである。例えば、
Ｐ_１Ｖ_１＝Ｐ_２Ｖ_２
ここで、
Ｐ_１＝微量流体の体積（△Ｖ）を加える前の容器内の真空圧、
Ｖ_１＝△Ｖを加える前の容器内の体積、
Ｐ_２＝△Ｖを加えた後の容器内の真空圧、および
Ｖ_２＝△Ｖを加えた後の容器内の体積、
である。
Ｖ_１は△Ｖに対してとても大きいので、Ｖ_１は実質的にＶ_２に等しい。従って、Ｐ_１は実質的にＰ_２に等しい。

バルブ２０、ピペット５０、およびポンプ１４は、手動でも自動でも作動可能である。例えば、第二バルブ２０Ｂは、ピペット５０が流体３２をフローセルの吸気口４８に挿入した後「ｘ」秒間は作動（つまり、開）させ、設定した時間間隔の最後で作動を止める（つまり、閉）ようにプログラムすることが可能である。一実施形態において、前記時間間隔は、異なった容積３２に対応して調節可能である。代替実施形態において、光学センサが第二バルブ２０Ｂを作動および／また作動を止めるために使用される。例えば、第二バルブ２０Ｂは、光学センサが適当な容積３２がフローセルの吸気口４８に注入されたことを検知したら作動し、前記センサが前記フローセルの吸気口４８が空になったことを検知したら作動を止めることが出来る。一実施形態において、センサはコントローラ７０に信号を送り、このことが今度は前記信号に対して適当な反応を出力する、すなわち、第二バルブ２０Ｂの作動をとめる。加えて、圧力センサ６０が第一バルブ２０Ａおよびポンプ１４を制御するために使用される。例えば、もし圧力センサ６０が容器１８内の真空度がある閾値よりも下回ったら、コントローラ７０はポンプ１４およびモータ１６をオンにし、さらに第一バルブ２０Ａを作動させて容器１８内の真空度を増加させる。

図９、１０、および１１は、特別注文によるフローセル４３０を描いたものである。フローセル４３０は、Ｆｏｃｈｔ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｙｓｔｅｍと同様であり、連結リング４３６、上部ガスケット４３８、スライド４４０、下部ガスケット４４２、カバーガラス４４４、およびロッキングベース４２８を備える。同様に示されているのは、任意のヒータ４５８である。連結リング４３８は様々な構成部品の上に載り、そこに置かれベース４２８に固定された時には、構成部品を所定の位置にしっかりとふさぐ。フローセル４３０は、正圧力でボリュームを押すのと反対に、真空下でボリュームを引くことで作動させるのが望ましい。フローセル４３０に正圧力を加えることは、スライド４４０および／もしくはカバーガラス４４４が外向きに曲がるか、汚染物質がガスケット４３８、４４２、スライド４４０、および／またはカバーガラス４４４の間で捕獲されるか、もしくはさもなければ前記フローセルの構造の整合性を危うくするものである。真空を使うことで、ガスケット４３８、４４２、スライド４４０、およびカバーガラス４４４の間の接触領域は保持され、それによりそれらの接触領域での汚染物収集の可能性をなくすことが出来る。

連結リング４３６は、フローセル吸気口４４８およびフローセル排気口４４６を内蔵する。示された実施形態において、吸気口４４８および排気口４４６はリング４３６を通して機械加工される。吸気口４４８は円錐型凹部であり、排気口４４６はフィッティングを受け入れるためにねじ込みタイプ連結部である。円錐型吸気口４４８は、挿入されたあらゆる微量流体のフローの観察が容易になるように出来るだけ大きくなっている。連結リング４３６はまた、スライド４４０およびカバーガラス４４４が見えるようなビューイングエリア４３２を画定する。さらに、連結リング４３６は、寸法が不変であり、そこの中を通過する微量流体と両立できる、および前記微量流体内のいかなる物質もそこに付着しないような材質で作られるべきである。このような材質には、例えば、ＰＥＥＫ（登録商標）という登録商標でＰＬＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから販売されているポリエーテルエーテルケトン、Ｄｅｌｒｉｎ（登録商標）という登録商標でＤｕＰｏｎｔから販売されているポリオキシメチレン、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）という登録商標でＤｕＰｏｎｔから販売されているポリテトラフルオロエチレン、およびＨａｌａｒ（登録商標）という登録商標でＡｌｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから販売されているエチレン−クロロトリフルオロエチレン、が含まれる。

上部ガスケット４３８はスライド４４０と連結リング４３６の間の密閉を提供する。示された実施形態において、上部ガスケット４３８は薄い環状形状をしている。しかし、上部ガスケット４３８のサイズおよび形状は、特定の用途に応じて変わる。下部ガスケット４４２はスライド４４０とカバーガラス４４４の間の密閉を提供する。示された実施形態において、下部ガスケット４４２はカバーガラス４４４の上表面のかなりの部分を覆う。特に、下部ガスケット４４２は、スライド４４０の下表面４４１およびカバーガラス４４４の上表面４４５と共に、微量流体が移動するフロー導管４３４を画定する。フロー導管４３４のサイズおよび形状は、特定の用途に応じて変わる。例えば、下部ガスケット４４２は約１０ミクロン〜約３ミリメートル（ｍｍ）の厚みを持ち、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍの幅の開口部を画定し（フロー導管４３４）、前記開口部の長さは実質的に前記フローセル４３０の全幅と同じ長さに及ぶ。一実施形態において、下部ガスケット４４２は約５０ミクロンの厚みを持ち、フロー導管４３４は約１ｍｍ幅で２５ｍｍ長である。あるいは、微量流体フロー導管４３４はスライド４４０および／またはカバーガラス４４４にエッチングされることも可能である。

稼働中は、微量流体は、連結リング４３６の上のフローセルの吸気口４４８の中に挿入され、真空下でフローセル４３０の中を通って吸引される。微量流体は図１０の矢印で示されたようにフローセル４３０の中を移動する。具体的には、微量流体は下向き方向に、連結リング４３６の中を通り、ついで上部ガスケット４３８内の開口部４３９Ｂ、４４３Ｂ、そしてスライド４４０を通り、その後下部ガスケット４４４の中のフロー導管４３４の中へ移動する。微量流体はその後、カバーガラス４４４で画定されるフロー導管４３４、ついでスライド４４０、そして下部ガスケット４４２の中を移動する。一旦、微量流体が、スライド４４０の中の相対する開口部４４３Ａに到着すると、微量流体は上方向に進み、スライド４４０の中の開口部４４３Ａ、４３９Ａ、そして上部ガスケット４３８、そして例えば容器内の真空圧によって、フローセル排気口４４６の外へ引かれる。様々な実施形態において、スライド４４０および／またはカバーガラス４４４は、フローセル４３０の中を通って吸引される微量流体と反応するものとして扱われる。例えば、複数のＤＮＡ糸が、下部ガスケット４４２の中のフロー連結４３４に対応する領域で、カバーガラスに付着する。このような用途は以下でさらに詳しく記述される。

本発明に従う、機器の一つの用途は、単一分子配列決定の遂行を含む。この用途において、フローセルは、例えばフローセル４３０の中のカバーガラス４４４に結合されている、ＤＮＡもしくはＲＮＡ（テンプレート）の個々のらせん構造を含む（図９および１０を参照）。前記ＤＮＡもしくはＲＮＡは、例えばビオチン−アビジン相互作用もしくは他の適切な付着化学反応を使用してＤＮＡもしくはＲＮＡを表面に吸着させるためのあらゆる既知の手段により、カバーガラスに結合される。フローセルの中に結合されているＤＮＡもしくはＲＮＡの一部とハイブリダイズするプライマーが加えられる。

微量流体のフロー経路にさらされているカバーガラスもしくはフローセルの他の構成部品は、それらに結合される特定のオリゴヌクレオチドと共に製造され販売される。さらに、カバーガラスの材質は、ガラス、水晶、シリコン、もしくは他の一般に入手可能な核酸アレイチップのなかの現存する材質を含む。前記材質は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを表面に結合させやすくするための、エポキシド表面もしくは他の適当な反応性材質を内蔵する。

一実施形態において、配列決定されるＤＮＡもしくはＲＮＡは、ビオチン／ストレプトアビジン結合を使用して、スライドもしくはカバーガラスの上に固定される。あるいは、固定化は前記プライマーを介しても起こる。例えば、ビオチン化プライマーは、表面のビオチンへのストレプトアビジンの結合を介して、カバーガラス上に固定される。続けて、固定プライマーを、相補的ＤＮＡもしくはＲＮＡへさらすことは、配列決定されるＤＮＡもしくはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションにつながる。

次に、ポリメラーゼおよびヌクレオチド溶液を含む微量流体は、フローセルの中を通って吸引され、前記の結合されたテンプレートにさらされる。相補的ヌクレオチドはプライマーの中に含まれることになる。検出可能な標識が検出性能を上げるために使用される。しかし、検出はヌクレオチド結合の兆候、例えば反応もしくは結合がもたらすピロリン酸塩生成により発生する熱を検知することで起こる。時間経過と共にヌクレオチド結合を監視することにより、スライドもしくはカバーガラス上の場所でさらされたヌクレオチドの配列を見つけ出すことが出来る。前記機器は、それぞれはカバーガラス上の別の場所に置かれた、非常に多くの、個々に分離可能な単一分子を平行して監視することができるため、それに対応した大量の配列情報を一時に集めることが出来る。こうして、コンピュータシステムは、前記過程中に観測された標識を監視したり、結果として得られた配列データを処理するために、有用である。配列決定されるＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の性質に応じて、前記機器は、例えば病気に関連した核酸配列変異を同定し、一連の治療の選択もしくはその過程を監視し、もしくは、個人内もしくは人口に占める遺伝子発現を監視するために使用される。

別の実施形態において、単一ヌクレオチド検出は、テンプレート核酸を、テンプレート依存核酸合成のためのプライマーの存在下でフローセルに付着させることで遂行される。本発明による装置の使用により、テンプレート依存核酸合成のための試薬の導入のため、真空がフローセルにわたって作り出される。例えば、テンプレート／プライマーのペアがフローセルの表面に一旦結合すると、標識付または非標識のヌクレオチド、およびヌクレオチド付加に触媒作用を及ぼすポリメラーゼが前記フローセルの吸気口を介して加えられる。真空化が作動され、試薬がフローセルにさらされ、その後フローセルの排気口から容器へ向けて出ていく。洗浄ステップの後、プライマーに付加された相補的ヌクレオチドが検出される。可能な場合は、試薬ヌクレオチドは例えば蛍光染料によって標識されることが望ましい。このような染料は光学顕微鏡の使用で観測される。例えば、シアニン染料（シアニン−３もしくはシアニン−５）は結合ヌクレオチドの光学的検出に有用である。光学的検出可能な標識の使用により、核酸配列決定は単一分子レベルで行われる。これは、個々のテンプレート核酸それぞれが光学的に分離可能な仕方で前記フローセルに位置づけられることを意味する。テンプレートの位置は、例えば個々のテンプレートと混合した、染料標識されたプライマーの使用により決定される。標識付ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドが前記プライマーに付加されるという条件の下で、前記したメカニズムの使用によりフロー導管にわたり流れていく。一旦混合されると、前記標識は、適当な波長での染料の励起および発光スペクトルの検出のための発光フィルタの使用により、検出される。テンプレートを含むことが知られている位置で起こる発光は、その位置において標識付塩基の取り込みが行われたことを示す。これらのステップを複数回実行することにより、配列決定は完成する。単一分子配列決定技術は、ＢｒａｓｌａｖｓｋｙらのＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、１００：３９６０−３９６４（２００３）および同時係属の米国特許出願第０９／７０７，７３７号に記述される。

本発明の一実施形態に従う、試料分析のためのシステムは、照明システム６００を含む。図１２Ａおよび１２Ｂに示される照明システム６００は、光源６０２、第一フィルタ６０４、第二フィルタ６０６、シャッター６０８、コリメータレンズ６０９、集光レンズ６１０、および電源６１２、を備える。図１２Ａで示される、照明システム６００の第一部分は、三つの光源６０２Ａ、６０２Ｂ、６０２Ｃ（まとめて６０２とする）を備える。しかし照明システム６００は、二つの光源のみ、もしくは必要に応じて光源を追加することもあり得る。光源６０２は、レーザ、発光ダイオード、もしくはランプのいずれかを備える。一実施形態において、第一光源６０２Ａの波長は、約３９０ｎｍ〜約７８０ｎｍまでである。一実施形態において、第一光源６０２Ａは赤色レーザである。第二光源６０２Ｂの波長は、約９３６ｎｍ〜約１３４０ｎｍまでである。一実施形態において、第二光源６０２Ｂは赤外光レーザである。第三光源６０２Ｃの波長は、約３９０ｎｍ〜約７８０ｎｍである。一実施形態において、第三光源６０２Ｃはグリーンレーザである。

図１２Ａに示された照明システム６００はまた、三つの主要なフィルタ、６０４Ａ、６０４Ｂ、６０４Ｃ（まとめて６０４とする）を備える。前記主要フィルタ６０４はノッチ・フィルタを含むことができる。前記ノッチ・フィルタは、それぞれの光源６０２からの放射された波長のうち、所望の波長は透過させ、不要な波長をブロックするように、選択される。加えて、図１２Ａに示された前記照明システム６００は、三つの補助的フィルタ、６０６Ａ、６０６Ｂ、６０６Ｃ（まとめて６０６とする）を備える。前記補助的フィルタ６０６は干渉フィルタを含む。一実施形態において、前記干渉フィルタは、前記光源６０２に対して４５°の角度をもって位置される。前記光源６０２に対して４５°の角度をもって位置された干渉フィルタにより、前記フィルタによって透過することになっていた光源はそのまま透過するが、前記フィルタによってブロックされることになっていた光源は９０°反射される。前記照明システム６００はまた、前記光源６０２をブロックするためのシャッター６０８を備える。加えて、前記集光レンズ６１０は前記光源６０２から放射された光線を狭くするために使用され、また、コリメータレンズ６０９は前記光源６０２からの光線を再び拡大した後に平行にして所望の径にするために使用される。一実施形態において、前記三つの光源、６０２Ａ、６０２Ｂ、６０２Ｃは実質的に同じ径にコリメートされる。前記光源６０２の光線は、それらが対象試料にあたる際には、前記試料６２０の照射の領域がどの光源６０２であるかにかかわらず同じであるように、実質的に同じ径および同じ強度であることが望まれる。また、前記照明システム６００は前記光源６０２に電力を供給するための電源６１２を備える。前記照明システム６００はまた、必要に応じて前記光源の光路を変更するためのミラーを一つ以上有する。

前記光源６０２は所望の地点に向けられる。図１２Ｂに示したように、前記第一光源６０２Ａは、対象試料６２０と公差するような第一光路６３０を画定する。前記第二光源６０２Ｂは、前記第一光路６３０の位置を決定するために使用される。図１２Ａに関して、前記第一光源６０２Ａは、所望の光路６３０内に、所望の波長を持つ光線を放射する。前記光線は前記光線を狭くする前記集光レンズ６１０を通過し、それから所望の径にするために前記光線を再び拡大した後に平行にする前記コリメータレンズ６０９を通過する。前記第一光源６０２Ａの光線は、要望通りに、シャッター６０８によりブロックされるか、もしくは通過を許される。前記光線は前記ノッチ・フィルタ６０４Ａを通過するが、ここでは所望の波長を持つ光だけが通過を許される。その後、前記第一光源６０２Ａからの光線は、第一干渉フィルタ６０６Ａで入射角に対して９０°の方向に反射される。前記第一光源６０２Ａからの光線は、前記の所望光路６３０において、その後に続く、もしくは下流側の干渉フィルタ、６０６Ｂ、６０６Ｃを通過する。

第二光源６０２Ｂは、所望の波長の光線を放射する。前記光線はその後ノッチ・フィルタ６０４Ｂを通過するが、ここでは所望の波長をもった光だけが通過を許される。前記第二光源６０２Ｂからの光線は、その後、前記第二光源６０２Ｂの光線が少なくとも実質的に前記第一光源６０２Ａの光線の光路６３０と同軸（すなわち、同じ軸に沿って進行する）であるように、干渉フィルタ６０６Ｂで、入射角に対して９０°の方向に反射される。前記第一光源６０２Ａおよび前記第二光源６０２Ｂからの光線は実質的に同じ径をもつ。前記第一光源６０２Ａからの光線と、前記第二光源６０２Ｂからの光線、の両方は、前記第三干渉フィルタ６０６Ｃを通過する。

前記第一光源６０２Ａに付加的に、もしくは代替的に使用される第三光源６０２Ｃは、所望の波長の光線を放射する。前記光線は前記光線を狭くする集光レンズ６１０を通り、それから所望の径にするために前記光線を再び拡大した後に平行にする前記コリメータレンズ６０９を通過する。前記光線はシャッター６０８によりブロックされるか、もしくは通過を許される。前記光はその後、前記第三ノッチ・フィルタ６０４Ｃを通過し、所望の波長を持つ光だけが通過を許される。前記第三光源６０２Ｃからの光線は、その後、前記第三光源６０２Ｃが少なくとも実質的に前記第一光源６０２Ａおよび／もしくは前記第二光源６０２Ｂと同軸であるように、前記第三干渉フィルタ６０６Ｃで、入射角に対して９０°の方向に反射される。前記第三光源６０２Ｃの光線は実質的に前記第一光源６０２Ａおよび前記第二光源６０２Ｂと同じ径をもつ。

前記第一光源６０２Ａおよび前記第三光源６０２Ｃは独立してブロックされるので、どの光線を所望の位置に向けるかというバリエーションが可能である。例えば、前記第一光源６０２Ａおよび前記第二光源６０２Ｂのみを所望の場所に向けるために、前記第三光源６０２Ｃをブロックすることが可能である。代替案として、三つのすべての光源、６０２Ａ、６０２Ｂ、６０２Ｃを同時に所望の位置に向けることが可能である。いくつかの実施形態において、前記照明システムはまた、前記試料６２０にあてることを許される光の密度を調節するために使用される減光フィルタ６２４を備える。例えば、前記試料６２０が光で飽和してしまうと、前記試料６２０に向けられる光の強さを減らすように前記減光フィルタ６２４を調節する。前記減光フィルタ６２４は前記光路６３０に沿って配置される。

図１２Ｂに示すように、前記光源６０２の同軸光線の前記光路６３０は、ミラー６１４（もしくは代替的には干渉フィルタ）に向けられる。前記光路は、フィルタ６１６に向けて、入射角に対して９０°に反射される。前記第一光源６０２Ａおよび／または前記第三光源６０２Ｃからの光線は、フィルタ６１６で、対象試料６２０へ向けて、入射角に対して９０°の方向に反射される。前記第二光源６０２Ｂの光線は、前記対象試料６２０に対しての前記光路６３０の反射角を検知するための位置センサ６２２に向けて、前記フィルタ６１６によって回折される。

前記位置センサ６２２により提供された情報は、前記光源６０２Ａの前記光路６３０が前記試料６２０と交差する角度θを調節するために使用可能である。例えば、前記試料が存在する前記ステージは前記光路６３０に関して再配置することが可能であり、また／もしくは、前記ミラー６１４の方向が調節されることが可能である。代替案として、前記照明システム６００は、前記ミラー６１４に向けた、前記光源６０２Ａの前記光路６３０の角度を変更することができる平行移動装置６１８を備えることも可能ではある。前記平行移動装置６１８は、前記光路６３０の所望の角度θを設定するために使用されるマイクロメータを有する。

前記の所望光路６３０は、結果として、対象試料６２０に対する前記光源６０２Ａの光線の全内部反射をもたらす。前記角度θは臨界角であり、その値は媒質の屈折率に依存する（θ＝ｓｉｎ^−１（高密度媒質の屈折率／低密度媒質の屈折率）。そのようなことから、前記角度θはガラス（つまり「高密度媒質」）の密度、前記ガラスの表面の質、および試料（つまり「低密度媒質」）の密度、に依存する。

前記位置センサ６２２はコンピュータと通信可能であり、前記コンピュータは、前記位置センサ６２２からの信号に応じて前記光路６３０の方向を自動的に調節するための信号を送る。代替案として、前記位置センサ６２２は、使用者に前記光路６３０の反射角θを知らせ、ついでこの光路を手動で調節するような、読み出しを備えていてもよい。前記光路６３０の前記反射角θは前記システムが稼働している間は継続的に監視され、前記臨界角θを保持するために必要に応じて調節される。

前記光源６０２が前記試料６２０を所望の角度θで照射した場合、前記光のすべてが反射される（すなわち、全内部反射が起こっている）。しかし、光線の持つエネルギーのうちのいくらかは、わずかな距離だけではあるが、そのまま低密度媒質に進入し、エバネセント波を生み出す。前記対象試料６２０に付けてある蛍光分子が前記エバネセント波の光子を吸収し、励起される。励起された蛍光物質は、例えば感度を増強したＣＣＤカメラの使用により観測することが可能である。

図１２Ａおよび１２Ｂで説明され、また上記で記述した、前記照明システムは、本発明に従う照明システムの構成部品の、一つの可能な配置である。フィルタやミラーなどの構成部品の異なる量およびタイプを含む、異なった構成部品の配置による、別の実施形態は、本発明の範囲内で沈思および熟考される。例えば、多様な構成部品が光源の調整や光路の調節のために使用でき、もしくは付加的光源を使用することも可能である。また、多様なセンサが前記光路６３０の反射角θを決定するために使用可能である。

本発明のある実施形態を記述してきたが、ここで開示した概念を含む別の実施形態が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく使用可能であることは、当業者には明らかである。ここに記述された実施形態はあらゆる点において実例にすぎず、それに限定されるものではないことが考慮されるべきである。

図面においては、一般的に、同様の参照文字は異なる図においても同じ部分を指すものとする。また、前記図面は必ずしも原寸に比例しているとは限らず、代わって、一般に本発明の原理を説明することに強調がなされる。以下の説明において、本発明の様々な実施形態は以下の図面を参照して記述される。すなわち、
図１は、本発明に従い微量流体を取り扱うための機器の一実施形態の略図である。 図２は、本発明に従い微量流体を取り扱うための機器の代替実施形態の略図である。 図３は、本発明に従い微量流体を取り扱うための機器の別の代替実施形態の略図である。 図４Ａは、図１の機器の一つの可能な形状を描画した図である。 図４Ｂは、図４Ａの機器の一部分を描画した図である。 図５は、図４Ａの機器の一部分の平面図である。 図６は、図４Ａの機器の一部分の側面図である。 図７Ａは、本発明の一実施形態に従うシステムのブロック図である。 図７Ｂは、図７Ａのシステムを描画した図である。 図８は、本発明に従い微量流体を取り扱う方法の一実施例を描写したフローチャートである。 図９は、本発明の一実施形態に従うフローセルの平面図である。 図１０は、図９の前記フローセルの、直線１０−１０での断面図である。 図１１は、図９の前記フローセルの分解立体図である。 図１２Ａと１２Ｂは、本発明の一実施形態に従う照明システムの略図である。

Claims (23)

1. 対象試料を分析するための第一光源であって、前記対象試料に入射する第一光路を画定する第一光源と、
   前記第一光源と共に機能し前記第一光路の位置を決定するための第二光源と、
   を備える照明システム。
2. 前記第一光路の入射角は、前記第一光源による光線の全内部反射を引き起こす、請求項１記載のシステム。
3. 全内部反射対物レンズを有する顕微鏡をさらに備える、請求項２記載のシステム。
4. 前記第一光源は蛍光光源である、請求項１記載のシステム。
5. 前記第一光源と前記第二光源は同時に機能する、請求項１記載のシステム。
6. 前記第二光源は、前記第一光路と少なくとも部分的には同軸であるような第二光路を画定する、請求項１記載のシステム。
7. 前記第二光源が、前記対象試料に対する前記第一光路の反射角を検出するための位置センサに向けられている、請求項１記載のシステム。
8. 前記位置センサからの信号に応じ、前記反射角を変化させるように前記第一光路の位置が調整される、請求項７記載のシステム。
9. 前記対象試料に対する前記第一光源の全内部反射が実質的に得られるように前記第一光路の位置が調整される、請求項８記載のシステム。
10. 前記第一光源は約３９０ｎｍ〜約１５５０ｎｍまでの波長を含む、請求項１記載のシステム。
11. 前記第二光源は赤外光を含む、請求項１記載のシステム。
12. 前記第一光源と前記第二光源のうち少なくとも一方は、レーザ、発光ダイオード、ランプからなる群の中から選択される、請求項１記載のシステム。
13. 前記対象試料を画像化するための撮像装置をさらに備える、請求項１記載のシステム。
14. 前記対象試料を分析するための第三光源をさらに備え、前記第三光源は、前記第一光路と少なくとも部分的に同軸であるような第三光路を画定する、請求項１記載のシステム。
15. 前記第一光源と前記第三光源は同時に機能する、請求項１４記載のシステム。
16. 前記第二光源は前記第一光源の位置を継続的に監視する、請求項１記載のシステム。
17. 単一分子蛍光現象の検出のための使用に適合された、請求項１記載のシステム。
18. 光に基づく顕微鏡において全内部反射を実質的に保つための方法であって、
    対象試料と交差させるための第一光線を供給するためのステップと、
    前記第一光線の位置を決定するための第二光源を供給するステップと、
    前記第二光線を位置センサに向けるステップと、
    前記位置センサからの信号に応じて前記第一光線の位置を調整し、前記対象試料に対する前記第一光線の反射角を変化させ、実質的に全内部反射を保つようにするステップと、
    を含む方法。
19. 前記第一光線は少なくとも部分的には前記第二光線と同軸である、請求項１８記載の方法。
20. さらに構成要素として、前記第一光線の位置を継続的に監視し、それに応じて、実質的に全内部反射を保つために前記反射角を調整するステップを含む、請求項１８記載の方法。
21. 前記第一光線は対象分子の位置を検出する、請求項１８記載の方法。
22. 前記第一光源は約３９０ｎｍ〜約１５５０ｎｍまでの波長を含む、請求項１８記載の方法。
23. 前記第二光源は赤外光を含む、請求項１８記載の方法。

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