CN115326907A - 一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法 - Google Patents

一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法，属于细胞外囊泡检测技术领域。该方法包括以下步骤：将间充质干细胞外囊泡样本加入微流控芯片电泳通道中，进行检测，分别得到间充质干细胞外囊泡样本的亚群外泌体和微囊泡的信号峰，根据信号峰对间充质干细胞外囊泡亚群进行定性分析；检测过程中使用的电泳缓冲液包括质量比为1:1的2‑(N‑吗啉)‑乙磺酸和L‑组氨酸。本发明实现了间充质干细胞外囊泡快速高效的检测，可以在短时间内分离并检测出外泌体和微囊泡两个亚群的峰信号，并且操作简单、无需衍生化处理、样品消耗量少，大大降低了成本。

Description

一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡检测技术领域，特别是涉及一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法。
背景技术
间充质干细胞具有增殖能力强、免疫原性低、多向分化潜能等特点，被广泛地应用于再生医学和各种疾病的组织修复与治疗中。间充质干细胞通过旁分泌机制分泌细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，内含蛋白质、mRNAs、miRNAs和DNA等多种物质，在细胞通讯中发挥作用。研究表明细胞外囊泡与母体细胞具有相似的作用，其免疫原性更低，并且具有无肿瘤形成的优点，因此引起了研究人员的广泛关注。根据颗粒尺寸大小可将EVs分为两个不同的亚群：外泌体，直径在30-150nm内；微囊泡，直径在200-1000nm内。它们在细胞间通讯和许多生理、病理过程的调控中各自发挥着重要的作用，但由于大小、密度和生物组成的重叠特性，使得它们难以完全区分，因此在研究EVs时单一亚群的个体特征信息可能会被掩盖或丢失，为了更多地了解外泌体和微囊泡的共有和特有的物理化学性质，发展新的检测方法是必不可少的。
目前常用于检测细胞外囊泡的方法有透射电镜，纳米粒径跟踪分析,蛋白免疫印迹，酶联免疫吸附试验和流式细胞术等。然而这些方法面临着步骤复杂、分析时间长等问题，难以应用于临床。毛细管电泳分离方法是一类新型的液相分离技术，使分析生物分子得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。有研究使用毛细管电泳结合紫外光检测器或激光诱导荧光检测器实现了外泌体的检测分析，初步显示了基于电泳分离分析的优势，但是这些方法都需要繁杂的衍生化反应，存在低信噪比和光漂白等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法能够在1min内实现间充质干细胞外囊泡两个亚群的分离与检测，弥补了传统的细胞外囊泡分析方法无法对亚群进行分离分析的不足。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法，包括以下步骤：
将间充质干细胞外囊泡样本加入微流控芯片电泳通道中，进行检测，分别得到间充质干细胞外囊泡样本的亚群外泌体和微囊泡的信号峰，根据信号峰对间充质干细胞外囊泡亚群进行定性分析；
检测过程中使用的电泳缓冲液包括质量比为1:1的2-(N-吗啉)-乙磺酸和L-组氨酸。
进一步地，所述电泳缓冲液的浓度为40mM，pH值为6.0。
进一步地，所述检测的过程为：
进样阶段，样品由负极到正极，进样电压为500v，进样时间为40s；分离阶段，样品由负极到正极，分离电压为1000v，运行温度25℃，并将分离阶段的样品电导信号转为电压信号，至出现两个明显的信号峰，结束检测。
进一步地，先出现的信号峰为间充质干细胞外囊泡亚群外泌体，后出现的信号峰为间充质干细胞外囊泡亚群微囊泡。
进一步地，所述间充质干细胞外囊泡样本是将间充质干细胞外囊泡与所述电泳缓冲液按体积比1:1混匀后得到的。
进一步地，所述间充质干细胞外囊泡样本的浓度为109-1011颗粒/mL。
进一步地，进行检测前，分别用0.1M氢氧化钠、去离子水和所述电泳缓冲液清洗电泳通道20min。
进一步地，所述电泳缓冲液进行过滤后再使用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明实现了间充质干细胞外囊泡快速高效的检测，可以在短时间内分离并检测出外泌体和微囊泡两个亚群的峰信号，并且操作简单、无需衍生化处理、样品消耗量少，大大降低了成本。本发明为含有细胞外囊泡样品的质量控制提供了一个有用且易于使用的方案，可高效便捷地获取间充质干细胞外囊泡不同亚群的定性信息。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为间充质干细胞外囊泡的检测方案示意图；
图2为不同种类电泳缓冲液对间充质干细胞外囊泡分离检测的影响；
图3为不同浓度的MES/His电泳缓冲液对间充质干细胞外囊泡分离检测的影响；
图4为不同pH值的MES/His电泳缓冲液对间充质干细胞外囊泡分离检测的影响；
图5为间充质干细胞外囊泡样本1的电泳结果图谱；
图6为间充质干细胞外囊泡样本2的电泳结果图谱；
图7为不同浓度间充质干细胞外囊泡与信号峰总面积的线性拟合图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所使用的材料、仪器及试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。
1材料和方法
1.1实验方法
选择微芯片电泳无机离子便捷式检测仪(设备型号：MEP-2021A，出厂编号：20210001，由中国科学院合肥物质科学研究院提供，常规微芯片电泳仪也适用)进行间充质干细胞外囊泡样本的分离检测，过程如下：
检测前，分别使用0.1M氢氧化钠溶液、去离子水和电泳缓冲液(BEG)清洗微芯片通道各20分钟，通过使用电动交叉注射的方法完成进样，进样阶段，对样品池(SR)施加500V的电压40s。随后，切换电压对BGE池(BR)施加1000V的电压100s完成分离过程，并依次通过检测区，由非接触电导检测器检测到溶液电导率的变化并将电导信号转化为电压信号输出，得到间充质干细胞外囊泡亚群外泌体、微囊泡的信号峰。间充质干细胞外囊泡的检测方案示意图见图1。
1.2分离条件优化
1.2.1电泳缓冲液种类的选择
电泳缓冲液是决定样品信号能否被稳定高效检测出来的一个重要基础。为了得到最佳的检测效果，本发明测试不同缓冲能力的BEG(浓度均为20mM)：磷酸盐(Phosphate)、硼酸盐(Borate)、硼砂(Borax)、2-(N-吗啉)-乙磺酸/L-组氨酸(MES/His)。检测结果如图2所示，Borax和MES/His作为背景缓冲液时可以检测到峰信号，其中在MES/His条件下获得了高分辨率，分离度更好，出峰时间更早的电泳图谱。MES/His作为一种两性电解质，具有高浓度下低电导率的特点，且其氧化反应缓慢，预计不会对生物系统产生重大的影响。为了能快速高效地进行信号检测，选择其作为电泳缓冲液进行后续的实验，并对其进行了进一步优化。
1.2.2电泳缓冲液浓度的优化
电泳缓冲液浓度对检测效果有显著影响。增加BGE浓度可能会导致电渗流力(Electroosmotic Force,EOF)速度降低、电流和焦耳热增加，从而导致检测稳定性和分辨率的降低。使用不同浓度的MES/His(10、20、40、80mM)进行平行实验。结果如图3所示，随着浓度的升高，EVs电泳迁移速度加快，检测时间减小，但基线噪声增大。同时考虑到过高浓度不利于施加高电压，因此避免使用80mM的浓度。为了实现快速分离、平坦的基线以及高效率和分辨率，选择40mM为最佳电泳缓冲液浓度。
1.2.3电泳缓冲液pH值的影响
电泳缓冲液pH是决定检测物质迁移速度和稳定性的重要因素之一，因为它影响着微通道中EOF的大小。为了获得最佳检测条件，探究了BEG在不同pH范围(pH 3.0、6.0、9.0、12.0)内检测效果。结果如图4所示，随着pH的增大，EOF(方向与电泳力相反)增大，溶液中粒子所受合力减小，从而迁移速度变慢，到达检测器的时间延长。酸性条件下，虽然出峰时间较快，但是两个亚群分离度不高。强碱性条件下，对EVs的稳定性具有一定的破坏力，导致检测不到完整的两个峰信号。pH为6.0时具有更快的检测速率，因此选择pH 6.0为最佳pH值。
1.3按照优化的分离条件进行检测
1.3.1采用根据文献改进的超高速离心法(参考文献：https://doi.org/10.12307/2022.383)：预处理人脐带间充质干细胞培养基上清液于4℃下依次以3,000g、10,000g离心力离心10min和20min，以去除细胞碎片。然后于4℃，120,000g离心力下离心90min。弃上清，用PBS重悬管壁沉淀，再以120,000g离心90min，再重悬得到人脐带间充质干细胞外囊泡样本(样本1)，选择样品1进行以下步骤的检测：
(1)选择缓冲体系：电泳缓冲液为40mM 2-(N-吗啉)-乙磺酸和L-组氨酸(质量比为1:1)，pH 6.0，使用前用0.22μm的一次性尼龙过滤器过滤；
(2)样本预处理：将待测样本1取100μl于-80℃转移至4℃冰箱解冻，待完全融化，加入100μl电泳缓冲液，振荡2分钟混匀，于4℃保存，作为电泳待测样本；
(3)电泳：将上述电泳待测样本加入非接触电导微流控芯片中进行处理；进样阶段，样品由负极到正极，进样电压为500v，进样时间为40s；分离阶段，样品由负极到正极，分离电压为1000v，运行温度25℃；间充质干细胞外囊泡的两个亚群在移动过程中分离，并依次通过检测区，由非接触电导检测器检测到溶液电导率的变化并将电导信号转化为电压信号输出，得到间充质干细胞外囊泡亚群外泌体、微囊泡的信号峰。
电泳处理前，分别用0.1M氢氧化钠、去离子水清洗通道各20分钟；在进行样品电泳检测前，先利用电泳缓冲液进行预电泳。
图谱和数据采用Microsoft excel和Origin 2020软件包处理。图5是样本1的电泳结果图谱，如图所示，检测到两个峰信号，分别为间充质干细胞外囊泡两个亚群外泌体(信号峰1)和微囊泡(信号峰2)。
1.3.2按照细胞上清外泌体提取试剂盒(货号：UR52121，购自上海宇玫博生物科技有限公司)的说明书使用方法制备得到的人脐带间充质干细胞外囊泡样本(样本2)，选择样本2按1.3.1步骤进行检测。
检测结果如图6所示，与图5结果相比，两者均检测到两个信号峰，并且具有相似的峰迁移时间，但信号峰总面积大小不同，这是由于两个样本浓度差异导致的。根据图5-图6可以看出，采用超高速离心法制备得到间充质干细胞样本信号峰总面积更大，证明样本1相比与样本2具有更高的浓度，损失更小。
1.4样本浓度与信号的面积的线性相关性
将间充质干细胞外囊泡样本1稀释成不同浓度梯度(1.31×109、2.63×109、5.25×109、1.05×1010、2.10×1010颗粒/mL)，每个浓度下取3个样本按上述步骤进行微流控芯片电泳检测，图谱和数据采用Microsoft excel和Origin 2020软件包处理。图7显示了不同浓度间充质干细胞外囊泡与信号峰总面积的线性拟合结果。如图7所示，随着浓度的增加，检测得到的信号峰面积也逐渐增大，这是因为增多的间充质干细胞外囊泡会使溶液的电导率增加，进而使得其与缓冲液电导率差值增加。在109-1011颗粒/mL浓度范围内，间充质干细胞外囊泡浓度与信号峰面积之间具有良好的线性关系。
综合上述，本发明研究了一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法，其具有区分细胞外囊泡的不同亚群(外泌体和微囊泡)的潜力。本发明证实电泳迁移率与颗粒的粒径之间具有线性关系，尺寸较小具有更高的荷质比，使得它们迁移的速度更快，出峰时间更早。因此根据粒径大小的不同，可以分离出细胞外囊泡的两个亚群：外泌体(信号峰1)和微囊泡(信号峰2)。并根据图5-图6结果可知，本检测方法能够在1min内实现间充质干细胞外囊泡两个亚群的分离与检测，弥补了传统的细胞外囊泡分析方法无法对亚群进行分离分析的不足。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种间充质干细胞外囊泡的微流控芯片电泳检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将间充质干细胞外囊泡样本加入微流控芯片电泳通道中，进行检测，分别得到间充质干细胞外囊泡样本的亚群外泌体和微囊泡的信号峰，根据信号峰对间充质干细胞外囊泡亚群进行定性分析；
检测过程中使用的电泳缓冲液包括质量比为1:1的2-(N-吗啉)-乙磺酸和L-组氨酸。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片电泳检测方法，其特征在于，所述电泳缓冲液的浓度为40mM，pH值为6.0。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片电泳检测方法，其特征在于，所述检测的过程为：
进样阶段，样品由负极到正极，进样电压为500v，进样时间为40s；分离阶段，样品由负极到正极，分离电压为1000v，运行温度25℃，并将分离阶段的样品电导信号转为电压信号，至出现两个明显的信号峰，结束检测。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片电泳检测方法，其特征在于，先出现的信号峰为间充质干细胞外囊泡亚群外泌体，后出现的信号峰为间充质干细胞外囊泡亚群微囊泡。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片电泳检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞外囊泡样本是将间充质干细胞外囊泡与所述电泳缓冲液按体积比1:1混匀后得到的。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片电泳检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞外囊泡样本的浓度为109-1011颗粒/mL。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片电泳检测方法，其特征在于，进行检测前，分别用0.1M氢氧化钠、去离子水和所述电泳缓冲液清洗电泳通道20min。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片电泳检测方法，其特征在于，所述电泳缓冲液进行过滤后再使用。
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