CN116773500B - 一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法，涉及细胞外囊泡的分离和鉴定技术领域。该方法依次包括以下步骤：将微流控装置通入电流，电流正极和负极分别对应微流控装置出口和入口；将待分离细胞外囊泡样品从微流控装置入口进入，施加电压，然后收集不同大小的细胞外囊泡；将多聚赖氨酸溶液滴在玻片上，进行包被，风干，然后滴加细胞外囊泡溶液，室温孵育，然后滴加荧光素‑5‑马来酰亚胺溶液，室温避光孵育，再在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。本发明采用的是微流控技术和电泳驱动过滤结合的方式对细胞外囊泡进行分离，采用荧光素‑5‑马来酰亚胺进行标记检测，实现了对囊泡的分类及快检。
Description
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡的分离和鉴定技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到10000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles，MVs)和外泌体(Exosomes，Exos)组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为150nm-10000nm；外泌体由细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为30nm-150nm。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高，它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物，因此，对细胞外囊泡进行准确的分离与鉴定显得尤为重要。
目前，细胞外囊泡(EVs)国内外运用的分离方法主要有差速/密度梯度离心法、沉淀法、粒径分离法、免疫亲和法和微流控技术，上述方法存在价格高昂、纯度低、用时长操作复杂、分离效率低等缺点；鉴定方法主要有透射电子显微镜、流式细胞术、酶联免疫吸附分析、蛋白质印迹、动态光散射技术和纳米颗粒跟踪分析技术，上述方法存在操作复杂、重复性不佳以及不适合检测生物液体中的标志蛋白等缺点。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法，以解决现有分离和鉴定方法操作复杂、重复性不佳的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法，依次包括以下步骤：
(1)将微流控装置通入电流，电流正极和负极分别对应微流控装置出口和入口；
微流控装置包括五个部分，第一部分为28-32nm微孔膜，28-32nm微孔膜下方依次设置有相同孔径大小的微孔和第一收集通道；第二部分为140-160nm微孔膜，140-160nm微孔膜下方依次设置有相同孔径大小的微孔和第二收集通道；第三部分为1.2-1.8μm微孔，1.2-1.8μm微孔下方设置有第三收集通道；第四部分为2-4μm微孔，2-4μm微孔下方设置有第四收集通道；第五部分为5-7μm微孔，5-7μm微孔下方设置有第五收集通道；
将待分离细胞外囊泡样品从微流控装置入口进入，施加电压，然后分别从第一收集通道、第二收集通道、第三收集通道、第四收集通道和第五收集通道收集不同大小的细胞外囊泡；
(2)将多聚赖氨酸溶液滴在玻片上，进行包被30-50min，风干，然后滴加步骤(1)得到的细胞外囊泡溶液，室温孵育25-35min，再滴加荧光素-5-马来酰亚胺溶液，室温避光孵育25-35min，最后在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，微流控装置包括五个部分，第一部分为30nm微孔膜，30nm微孔膜下方依次设置有30nm微孔和第一收集通道；第二部分为150nm微孔膜，150nm微孔膜下方依次设置有150nm微孔和第二收集通道；第三部分为1.5μm微孔，1.5μm微孔下方设置有第三收集通道；第四部分为3μm微孔，3μm微孔下方设置有第四收集通道；第五部分为6μm微孔，6μm微孔下方设置有第五收集通道。
进一步，步骤(2)中，多聚赖氨酸溶液的浓度为90-110μg/mL。
进一步，步骤(2)中，多聚赖氨酸溶液的浓度为100μg/mL。
进一步，步骤(2)中，细胞外囊泡溶液的浓度为0.8-1.2μg/μL。
进一步，步骤(2)中，细胞外囊泡溶液的浓度为1μg/μL。
进一步，步骤(2)中，荧光素-5-马来酰亚胺溶液的浓度为1.8-2.2μmol/L。
进一步，步骤(2)中，荧光素-5-马来酰亚胺溶液的浓度为2μmol/L。
进一步，步骤(2)中，多聚赖氨酸溶液、细胞外囊泡溶液和荧光素-5-马来酰亚胺溶液的体积比为1：1：0.8-1.2。
进一步，步骤(2)中，多聚赖氨酸溶液、细胞外囊泡溶液和荧光素-5-马来酰亚胺溶液的体积比为1：1：1。
本发明还提供上述方法在细胞外囊泡的分离和鉴定方面的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明采用的是微流控技术和电泳驱动过滤结合的方式，EVs的磷脂膜带有负电荷，而蛋白质或其他分子由于氨基酸的侧链而具有不同的电荷，通过给微流控装置通入电流，带有负电荷的EVs会向正极也就是过滤孔方向移动，然后根据孔的大小将EVs与其他物质分离。
样品进入通道后会水平流动，但是在施加的电压下EVs和带有负电荷的蛋白质会垂直迁移，向阳极移动，带中性电荷或正电荷的颗粒(例如，组氨酸、赖氨酸、非极性脂质)通过阴极的吸引力随样品流移动或远离样品流。当样品流到达30nm微孔膜时，在电流的作用下只有小于30nm的颗粒才能穿过膜以及微孔，之后颗粒会进入收集通道；大于30nm的颗粒会随着液体的流动来到150nm的微孔膜处，然后在电流的作用下只有小于150nm的颗粒才能穿过膜以及微孔进入收集通道，大于150nm的颗粒在液体的流动下继续前进到达1.5μm的微孔，在电场的作用下，小于1.5μm的颗粒被留下并收集，其余的继续流动到达3μm的微孔，在电场的作用下，小于3μm的颗粒被留下并收集，其余的继续流动到达6μm的微孔，小于6μm的颗粒被留下并收集，其余的被排出(当孔径大小为其他大小时，原理相同)。
微流控技术的工作原理是基于微通道中的微流体力学原理。不同于传统流体力学，在微米级别下，流体的表面张力和黏度等物理特性会发生显著变化，微通道中的流体流动也会受到微观效应的影响，如毛细效应、惯性效应、电动效应等。胞外囊泡本身带有一定的电荷，在压力作用下矩形微流道中形成二维电场，而外电场则对矩形微流道中的流场产生进一步的影响，从而趋动微流道中胞外囊泡的分离。
2、囊泡被分离出来以后，可以粘附在PLL上，与F5M结合进行荧光观察，也可以收集进行蛋白质组学寻找特异性蛋白等。通过该装置可以收集30-150nm的外泌体，150nm-1.5μm的小微囊泡，1.5-3μm的大囊泡，3-6μm的特大囊泡，由于一个微流控装置可以设计多个过滤收集装置，所以可以同时处理多个样品。
3、利用电场和滤过系统对胞外囊泡进行分类，同时已实现胞外囊泡的粘附、荧光标记，发展了胞外囊泡标志物的特异性标记技术，利用共聚焦显微镜可以精确观察胞外囊泡及其标记物，可以在3h以内完成检测，实现了对囊泡的分类及快检。
附图说明
图1为实施例1微流控装置和电场结合图；
图2为细胞外囊泡与F5M和CD63共同标记的操作流程图；
图3为细胞外囊泡傅里叶红外光谱；
图4为胞外囊泡与CD63结合荧光图；
图5为胞外囊泡与F5M结合荧光图；
图6为胞外囊泡F5M和CD63结合荧光图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法，依次包括以下步骤：
(1)将微流控装置通入电流，电流正极和负极分别对应微流控装置出口和入口；
微流控装置包括五个部分，第一部分为30nm微孔膜，30nm微孔膜下方依次设置有30nm微孔和第一收集通道；第二部分为150nm微孔膜，150nm微孔膜下方依次设置有150nm微孔和第二收集通道；第三部分为1.5μm微孔，1.5μm微孔下方设置有第三收集通道；第四部分为3μm微孔，3μm微孔下方设置有第四收集通道；第五部分为6μm微孔，6μm微孔下方设置有第五收集通道；
将待分离细胞外囊泡样品从微流控装置入口进入，施加电压，然后分别从第一收集通道、第二收集通道、第三收集通道、第四收集通道和第五收集通道收集不同大小的细胞外囊泡；(见图1)
(2)将100μL浓度为100μg/mL多聚赖氨酸(PLL)溶液滴在玻片上，进行包被40min，风干，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡，然后滴加100μL步骤(1)得到的细胞外囊泡溶液(浓度为1μg/μL)，室温孵育30min，使胞外囊泡与PLL交联，然后滴加100μL荧光素-5-马来酰亚胺溶液(浓度为2μmol/L)，室温避光孵育30min，使F5M与胞外囊泡结合，再在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。(见图2中前3步)
实施例2：
一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法，依次包括以下步骤：
(1)将微流控装置通入电流，电流正极和负极分别对应微流控装置出口和入口；
微流控装置包括五个部分，第一部分为28nm微孔膜，28nm微孔膜下方依次设置有28nm微孔和第一收集通道；第二部分为140nm微孔膜，140nm微孔膜下方依次设置有140nm微孔和第二收集通道；第三部分为1.2μm微孔，1.2μm微孔下方设置有第三收集通道；第四部分为2μm微孔，2μm微孔下方设置有第四收集通道；第五部分为5μm微孔，5μm微孔下方设置有第五收集通道；
将待分离细胞外囊泡样品从微流控装置入口进入，施加电压，然后分别从第一收集通道、第二收集通道、第三收集通道、第四收集通道和第五收集通道收集不同大小的细胞外囊泡；
(2)将100μL浓度为90μg/mL多聚赖氨酸(PLL)溶液滴在玻片上，进行包被30min，风干，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡，然后滴加100μL步骤(1)得到的细胞外囊泡溶液(浓度为0.8μg/μL)，室温孵育25min，使胞外囊泡与PLL交联，然后滴加80μL荧光素-5-马来酰亚胺溶液(浓度为1.8μmol/L)，室温避光孵育25min，使F5M与胞外囊泡结合，再在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。
实施例3：
一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法，依次包括以下步骤：
(1)将微流控装置通入电流，电流正极和负极分别对应微流控装置出口和入口；
微流控装置包括五个部分，第一部分为32nm微孔膜，32nm微孔膜下方依次设置有32nm微孔和第一收集通道；第二部分为160nm微孔膜，160nm微孔膜下方依次设置有160nm微孔和第二收集通道；第三部分为1.8μm微孔，1.8μm微孔下方设置有第三收集通道；第四部分为4μm微孔，4μm微孔下方设置有第四收集通道；第五部分为7μm微孔，7μm微孔下方设置有第五收集通道；
将待分离细胞外囊泡样品从微流控装置入口进入，施加电压，然后分别从第一收集通道、第二收集通道、第三收集通道、第四收集通道和第五收集通道收集不同大小的细胞外囊泡；
(2)将100μL浓度为110μg/mL多聚赖氨酸(PLL)溶液滴在玻片上，进行包被50min，风干，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡，然后滴加100μL步骤(1)得到的细胞外囊泡溶液(浓度为1.2μg/μL)，室温孵育35min，使胞外囊泡与PLL交联，然后滴加120μL荧光素-5-马来酰亚胺溶液(浓度为2.2μmol/L)，室温避光孵育35min，使F5M与胞外囊泡结合，再在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。
试验例
一、囊泡标记-红外检测
(1)进行连接反应，各组试剂加量如下：总体积90μL
胞外囊泡浓度为3mg/mL，F5M储存液浓度为3μmol/L，终浓度为2μmol/L。
(2)按上表进行反应，反应时将悬液涡旋震荡均匀。将悬液在室温下避光摇动孵育30min。
(3)取90uL样品直接与0.2g KBr粉末进行混合，烘箱60℃烘干，压片模具压片，傅里叶变换红外光谱仪进行检测。FTIR光谱波数范围是4000-650cm-1，16次扫描平均分辨率为4cm-1。
(4)数据使用GraphPad软件进行处理和分析，结果见图3(在横坐标为3000-4000处，纵坐标从下往上浓度依次减小)。
由图3可知，FTIR光谱分析证实了胞外囊泡与马来酰亚胺的连接，并且不同浓度的胞外囊泡与马来酰亚胺连接存在差异。实验表明，马来酰亚胺与疏基结合的硫醚键在光谱上显示，说明F5M成功与胞外囊泡结合，且囊泡浓度越高，结合效率越高，但在0.4μg/μL达到饱和。
二、抗体标记-荧光检测(以生物标记物CD63为例)
1、CD63标记胞外囊泡
(1)100μg/mL PLL(多聚赖氨酸)溶液室温包被玻片40min，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡；
(2)胞外囊泡1μg/μL滴加100μL在包被的玻片上，室温孵育30min，使胞外囊泡与PLL交联；
(3)将CD63(Anti-CD63抗体[EPR5702]，一抗，abcam(ab134045))按1:500稀释后滴加100μL在玻片上，室温避光孵育30min，使CD63与EVs结合；
(4)加入50μL带有荧光标记的二抗(Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG(H+L)，碧云天(A0453))，按1：1000稀释，室温避光孵育30min；
(5)共聚焦显微镜63×物镜下选择555nm激发光观察外泌体的荧光情况。结果见图4。
2、F5M标记胞外囊泡
(1)100μg/mL PLL(多聚赖氨酸)溶液室温包被玻片40min，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡；
(2)胞外囊泡1μg/μL滴加100μL在包被的玻片上，室温孵育30min，使胞外囊泡与PLL交联；
(3)荧光素-5-马来酰亚胺(F5M)2μM滴加100μL，室温避光孵育30min，使F5M与胞外囊泡结合；
(4)共聚焦显微镜63×物镜下选择494nm激发光观察外泌体的荧光情况。结果见图5。
3、F5M与CD63共同标记(操作流程见图2)
(1)100μg/mL PLL(多聚赖氨酸)溶液室温包被玻片40min，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡。
(2)胞外囊泡1μg/μL滴加100μL在包被的玻片上，室温孵育30min，使胞外囊泡与PLL交联。
(3)荧光素-5-马来酰亚胺(F5M)2μM滴加100μL，室温避光孵育30min，使F5M与胞外囊泡结合。
(4)将胞外囊泡特异性标志物与F5M—EVs(荧光素-5-马来酰亚胺—胞外囊泡)结合，实验选用的是CD63，将CD63按1:500稀释后滴加100μL在玻片上，室温避光孵育30min，使CD63与F5M—EVs结合。
(5)加入50μL带有荧光标记的二抗Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)，按1：1000稀释，室温避光孵育30min，使二抗与F5M—EVs—CD63中的CD63特异性结合。
(6)F5M的激发波长为494nm，二抗的激发波长为555nm，在共聚焦显微镜63×物镜下选择不同的激发光观察外泌体的荧光情况。
结果见图6(标尺为10μm，CD63为红色荧光，F5M为绿色荧光)。
由图4-6可知，CD63与F5M能够分别于胞外囊泡结合，并且数量较多。当胞外囊泡先与F5M结合，再与CD63结合后，荧光结果显示，两种标记物均与胞外囊泡结合，并且能够共同标记胞外囊泡。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种细胞外囊泡的分离和鉴定方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
（1）将微流控装置通入电流，电流正极和负极分别对应微流控装置出口和入口；
所述微流控装置包括五个部分，第一部分为28-32nm微孔膜，所述28-32nm微孔膜下方依次设置有相同孔径大小的微孔和第一收集通道；第二部分为140-160nm微孔膜，所述140-160nm微孔膜下方依次设置有相同孔径大小的微孔和第二收集通道；第三部分为1.2-1.8μm微孔，所述1.2-1.8μm微孔下方设置有第三收集通道；第四部分为2-4μm微孔，所述2-4μm微孔下方设置有第四收集通道；第五部分为5-7μm微孔，所述5-7μm微孔下方设置有第五收集通道；
将待分离细胞外囊泡样品从微流控装置入口进入，施加电压，然后分别从第一收集通道、第二收集通道、第三收集通道、第四收集通道和第五收集通道收集不同大小的细胞外囊泡；
（2）将多聚赖氨酸溶液滴在玻片上，进行包被30-50min，风干，然后滴加步骤（1）得到的细胞外囊泡溶液，室温孵育25-35min，再滴加荧光素-5-马来酰亚胺溶液，室温避光孵育25-35min，最后在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定；
步骤（2）中，多聚赖氨酸溶液的浓度为90-110μg/mL；
步骤（2）中，细胞外囊泡溶液的浓度为0.8-1.2μg/μL；
步骤（2）中，荧光素-5-马来酰亚胺溶液的浓度为1.8-2.2μmol/L；
步骤（2）中，多聚赖氨酸溶液、细胞外囊泡溶液和荧光素-5-马来酰亚胺溶液的体积比为1：1：0.8-1.2。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的分离和鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，多聚赖氨酸溶液的浓度为100μg/mL。
3.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的分离和鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，细胞外囊泡溶液的浓度为1μg/μL。
4.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的分离和鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，荧光素-5-马来酰亚胺溶液的浓度为2μmol/L。
5.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的分离和鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，多聚赖氨酸溶液、细胞外囊泡溶液和荧光素-5-马来酰亚胺溶液的体积比为1：1：1。
6.权利要求1-5任一项所述的细胞外囊泡的分离和鉴定方法在细胞外囊泡的分离和鉴定方面的应用。
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