CN111778138A - 一种分选血浆中外泌体的微流控器件及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分选血浆中外泌体的微流控器件，包括上层的微流控芯片与下层的声表面波器件，声表面波器件包括叉指电极和压电材料，微流控芯片内设有第一分离单元和第二分离单元，第一分离单元设有对称蛇形螺旋通道，第二分离单元设有直流通道，叉指电极设在直流通道的附近。本发明通过设计带有螺旋与蛇形对称流道复合结构和直通道结构，对血浆中的大尺寸细胞外囊泡逐级去除，提高了分选的精确性与获得率。本发明还公开了该微流控器件的使用方法，可以在保证芯片尺寸一定时，通过调控流血浆样本与PBS中的聚合物浓度以及声表面波器件参数，可较大限度的提高的分选过程中的通量，高效率的去除血浆中的细胞外囊泡，获取纯度高的外泌体样本。

Description

一种分选血浆中外泌体的微流控器件及其使用方法
技术领域
本发明属于微流控技术和生物颗粒处理技术领域，特别涉及一种分选血浆中外泌体的微流控器件及其使用方法。
背景技术
微流控是在微尺度空间内对流体进行操控的新兴科学技术。微流控芯片作为实现微流控技术的载体，具有连续性、微型化、集成化、低消耗等特征，可实现大型、多功能生化分析实验室的主要功能。近些年来，基于微流控技术发展的细胞分选、细菌分选、肿瘤分选等技术不断涌现，主要采用微流体惯性力、弹性力，外部引入的声力、介电泳力、磁力等生物颗粒操纵方法。
外泌体是细胞分泌的纳米囊泡，广泛存在于各种体液中，其直径约为30～150nm，远小于细胞尺寸。外泌体的功能涉及细胞间通讯、治疗靶标和相互作用调节等，具有丰富的可检测生物学标志物(如蛋白质、DNA、mRNA/miRNA、脂质等)，是液体活检的主要检测物之一。外泌体已被证实可用于肺癌检测，在非侵入性癌症诊断和治疗监测中具有良好的临床应用前景。
传统的外泌体分选方法如超速离心法、微孔膜过滤法、聚合物沉淀法等，普遍存在耗时长、设备昂贵、纯度低、分离物易污染、损失大、操作复杂、效率低以及分选过程不连续的等缺点，且血浆样本中颗粒尺寸覆盖范围较广(0.03-1μm)，一次去除非外泌体尺寸的生物颗粒存在一定困难，限制了外泌体相关研究的推进。因此，开发具有高效率的血浆外泌体微流控分选器件，在外泌体的研究领域具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种分选血浆中外泌体的微流控器件及其制备方法和使用方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种分选血浆中外泌体的微流控器件，包括上层的微流控芯片与下层的声表面波器件，所述声表面波器件包括叉指电极和压电材料，所述微流控芯片内设有第一分离单元和第二分离单元，所述第一分离单元设有对称蛇形螺旋通道，所述第二分离单元设有直流通道，所述叉指电极设在直流通道的附近。
本发明针对现有血浆外泌体分选困难、分选效率低的问题，采用两级分离单元串联的方式，第一分离单元和第二分离单元采用不同的分选原理，将非牛顿流体的粘弹性效应和声表面波原理相结合。具体通过在第一分离单元设计带有螺旋与蛇形对称复合结构的微流道，实现对血浆中尺寸大于外泌体尺寸(0.5μm)的生物颗粒(细胞外囊泡)进行高效去除；并在第二分离单元中将直通道结构与声表面波产生声辐射力结合，进一步分离尺寸大于0.15μm的生物颗粒(细胞外囊泡)，实现对血浆中外泌体的精细提纯，整体实现血浆中外泌体的逐级高效的分选和高效提纯。可同时受非牛顿流体的粘弹性和声表面波参数共同控制，可实现更灵活高效的分选模式，通过控制各级分离单元的调控参数可以实现血浆中外泌体高灵敏度的分选过程，提高了分选过程的通量与分选效率，具有良好的生物医学应用价值。
上述的微流控器件，优选的，所述第一分离单元包括：第一鞘流入口、第一鞘流通道、血浆入口、血浆通道、直行通道、对称蛇形螺旋通道、第一外囊泡通道、第一外囊泡出口和剩余血浆流出通道；所述第一分离单元的第一鞘流入口、血浆入口分别通过第一鞘流通道和血浆通道并在其出口端相连，且依次与直行通道和对称蛇形螺旋通道连接；所述对称蛇形螺旋通道的出口端在鞘流一侧通过第一外囊泡通道与第一外囊泡出口连接，所述对称蛇形螺旋通道的出口端在血浆样本一侧通过剩余血浆流出通道与所述第二分离单元的剩余血浆流入通道连接；
所述第二分离单元包括：第二鞘流入口、第二鞘流通道、剩余血浆流入通道、直流通道、第二外囊泡通道、第二外囊泡出口、分泌体通道和分泌体出口；所述第二分离单元的第二鞘流入口通过第二鞘流通道与所述剩余血浆流入通道在其出口端相连并与直流通道连接，所述直流通道的在血浆样本一侧靠近声表面波器件的叉指电极，所述直流通道的出口端在鞘流一侧通过第二外囊泡通道与第二外囊泡出口连接，所述直流通道的出口端在血浆样本一侧通过分泌体通道与分泌体出口连接。
更优选的，所述对称蛇形螺旋通道由若干蛇形通道单元首尾连接形成螺旋线形状，所述蛇形通道单元的蛇形曲率半径为通道宽度的6-8倍，所述对称蛇形螺旋通道的螺旋线最外圈半径为4.0-4.5mm，螺旋线圈数≤2圈；所述直行通道、对称蛇形螺旋通道和直流通道的截面呈矩形，尺寸为宽50-100μm×高15-50μm；采用低深宽比截面通道，可以抑制分离过程中迪恩流产生的混合效果；所述第一鞘流通道与血浆通道的出口端之间的夹角为30-90°，所述第一外囊泡通道与剩余血浆流出通道的入口端之间的夹角为30-60°，所述第二外囊泡通道与分泌体通道的入口端之间的夹角为30-90°，所述第二鞘流通道与剩余血浆流入通道的出口端之间的夹角为30-60°。
对称蛇形螺旋通道的蛇形曲率半径设置为通道宽度的6-8倍，有助于流体在流动中减少通道阻力，同时诱导流体中产生迪恩拽力，迪恩拽力对颗粒的横向迁移提供有益作用。曲率半径过大会减弱通道的迪恩拽力导致颗粒横向迁移的作用力不足，半径过小增强迪恩拽力在横截面内形成混合效果，对流体分离不利。
通过在各通道交叉聚焦处设置夹角，聚焦鞘流会对主流体形成一定的挤压，使主样本流保持在一侧运动，同时鞘流会沿着通道向分离口运动。通过在各通道分离口处设置夹角，可以使主流道与分离流道中流体流线形成一定的角度，更利于流体分选。
上述的微流控器件，优选的，所述压电材料为128°YX铌酸锂压电材料；所述叉指电极包含铬增粘层和金导电层，通过磁控溅射的方式布置在所述压电材料的抛光面一侧上，所述铬增粘层和金导电层的厚度为分别为5-10nm和50-100nm；所述叉指电极的指条宽度为15-25μm，声孔径为2.5-3mm；所述直流通道的流体方向与叉指电极的指条朝向平行，且所述直流通道与叉指电极的最短距离≤1.5mm。
优选的，所述微流控芯片的厚度为2-10mm；所述微流控芯片的底部设有与所述叉指电极相匹配的空槽结构，所述空槽结构的深度为0.1-0.3mm，确保声表面波传播过程不过多的受PMDS与叉指电极接触影响；所述微流控芯片为聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微流控芯片或环烯烃类共聚物(COC)微流控芯片，也可以选择其他注塑用的热固性聚合物材料，所述微流控芯片采用软光刻技术制作，首先在硅片上利用光刻技术制作母模，再利用PDMS倒模形成微流控芯片。
优选的，所述微流控芯片与声表面波器件通过键合的方式或通过夹具组装。不同材料加工制作微流控芯片的工艺和芯片的键合技术存在差异，可根据具体的应用需求进行选择，针对不同微流控芯片材料与压电材料选择组装方式，除了采用等离子体键合，也可设计专用夹具进对芯片和声表面波器件进行组装。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的微流控器件的使用方法，包括如下步骤：
(1)配制含有粘弹性增强剂的PBS溶液，制备血浆样本；
(2)将所述步骤(1)配制得到的含有粘弹性增强剂的PBS溶液和血浆样本分别注入到所述第一分离单元的第一鞘流入口和血浆入口，使含有粘弹性增强剂的PBS溶液与血浆样本汇入所述对称蛇形螺旋通道，期间控制所述含有粘弹性增强剂的PBS溶液与血浆样本的流速比使血浆样本被压缩在通道的一侧，经过所述对称蛇形螺旋通道的分选后血浆样本中的一部分细胞外囊泡流出微流控器件，剩余的血浆样本流入所述第二分离单元；
(3)将所述步骤(1)配制得到的含有粘弹性增强剂的PBS溶液注入到所述第二分离单元的第二鞘流入口，使所述含有粘弹性增强剂的PBS溶液与所述步骤(2)剩余的血浆样本汇入所述直流通道，期间控制PBS溶液与血浆样本的流速比使血浆样本被压缩在靠近所述叉指电极的一侧，并保证所述叉指电极通电，经过所述直流通道的分选后血浆样本中的剩余细胞外囊泡和外泌体分别从不同通道流出微流控器件，即完成血浆中外泌体的分选。
上述的使用方法，优选的，所述粘弹性增强剂为聚环氧乙烷(PEO)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，也可以是其他具有生物相容性的聚合物粉末，不会对血浆样本的生物颗粒活性产生影响，所述粘弹性增强剂占PBS溶液的质量百分比小于1wt％，以保证整个样本流动在恒粘度区域，即避免发生剪切变稀效应。
优选的，所述血浆样本中含有粘弹性增强剂，也可以不含粘弹性增强剂；所述血浆样本通过以下方法制备得到：利用离心法去除全血中的血细胞，获取血浆，利用直径为1μm的过滤膜过滤掉尺寸大于1μm的细胞颗粒，再利用含有粘弹性增强剂的PBS溶液或不含粘弹性增强剂的PBS溶液对血浆样进行稀释5-20倍，使血浆样本保持牛顿流体的特性，再加入吐温20，即得到血浆样本。
更优选的，所述步骤(2)中，血浆样本的流速为0.5-20μL/min，控制PBS溶液和血浆样本的流速比≥5︰1；所述步骤(3)中，控制PBS溶液和血浆样本的流速比≥3︰1。在该流速和流速比之下，能够高效保证血浆样本被压缩在通道的一侧，可较大限度的提高的分选过程中的通量，高效率的去除血浆中的细胞外囊泡，获取纯度高的外泌体样本。
具体的分选原理如下：
将含有粘弹性增强剂的PBS和血浆样本流体利用微注射泵通过聚乙烯软管注入到第一分离单元的第一鞘流入口和血浆入口，期间控制PBS溶液与血浆样本的流速比大于5︰1，保证血浆样本被压缩在通道的一侧，含有粘弹性增强剂的PBS和血浆样本分别经过第一鞘流通道、血浆通道汇入直行通道和对称蛇形螺旋通道，并在对称蛇形螺旋通道实现第一级分选。由于对称蛇形螺旋通道存在一定的曲率，在垂直于流向的截面上会形成两个反向流动的涡流，称Dean流。Dean流引入会给通道中的颗粒诱导迪恩拽力FD，迪恩拽力一般被认为是斯托克斯拽力，其计算公式为：FD＝3πηdUD，其中UD为迪恩流速，d为颗粒直径，η为流体的粘性系数。由于血浆样本含有粘弹性增强剂，存在粘弹性，会对颗粒产生弹性力FE，FE的计算公式为FE＝Ced3▽N1，弹性力在越靠近通道壁面的时候越显著。经过内弯曲流道时，在FD和FE的作用下，大尺寸外囊泡会远离通道壁面，由于FD和FE分别正比于d和d3，小尺寸颗粒由于产生的横向力不够，因而基本保持原有沿流线运动不变。经过对称蛇形螺旋通道的第一级分选之后，血浆样本中仍含有外囊泡颗粒，尺寸较大的一部分外囊泡通过第一外囊泡通道和第一外囊泡出口流出至第一级外囊泡回收瓶；剩余血浆样本通过剩余血浆流出通道、剩余血浆流入通道进入第二分离单元。
将含有粘弹性增强剂的PBS利用微注射泵通过聚乙烯软管注入到第二分离单元的第二鞘流入口，经过第二鞘流通道与剩余血浆样本在直流通道汇流，对血浆样本形成挤压作用，期间控制PBS溶液与血浆样本的流速比大于3︰1，保证血浆样本被压缩在通道靠近叉指电极的一侧，并保持叉指电极通电，进行第二级分选。由于血浆样本靠近壁面时粘弹性介质诱导的弹性力和声表面波诱导的声辐射力的双重作用，剩余的外囊泡颗粒运动会垂直于流线偏转，外泌体因尺寸过小受到的力不够保持原有运动不变。经过直流通道和声表面波进行第二级分选之后，剩余的外囊泡颗粒通过第二外囊泡通道和第二外囊泡出口流出至第二级外囊泡回收瓶，剩余的只含有外泌体的样本从分泌体通道和分泌体出口流出，经回收瓶进行收集。
整个分选过程中，可以通过调控通道的结构尺寸和粘弹性介质的浓度，在第一分离单元粗分选出大尺寸的细胞外囊泡，通过设置合适的出口，大尺寸的细胞外囊泡从上部出口流出至回收瓶。分离后的样本流入第二分离单元，在第二分离单元中，利用声表面波器件的声表面波在流体中对生物颗粒诱导的声辐射力，实现样本流体中较大尺寸颗粒进行二次去除。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的微流控器件，采用两级分离单元串联的方式，将非牛顿流体的粘弹性效应和声表面波原理相结合，通过设计带有螺旋与蛇形对称流道复合结构和直通道结构，对血浆中的大尺寸细胞外囊泡逐级去除，提高了分选的精确性与获得率。
2、本发明的微流控器件，可同时受非牛顿流体的粘弹性和声表面波参数共同控制，可实现更灵活高效的分选模式，通过控制各级分离单元的调控参数可以实现血浆中外泌体高灵敏度的分选过程，提高了分选过程的通量与分选效率，具有良好的生物医学应用价值。
3、本发明的微流控器件，具有制造工艺简便，成本低廉，采用该方法可以实现连续、快速的处理血浆样本。
4、本发明的微流控器件的使用方法，可以在保证芯片尺寸一定时，通过调控血浆样本与PBS中的聚合物浓度以及声表面波器件参数，可较大限度的提高分选过程中的通量，高效率的去除血浆中的细胞外囊泡，获取纯度高的外泌体样本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的分选血浆中外泌体的微流控器件的结构示意图；
图2是微流控芯片的结构示意图；
图3是声表面波器件的结构示意图；
图4是对称蛇形螺旋通道的立体结构示意图；
图5是对称蛇形螺旋通道的结构说明示意图；
图6是经过第一分离单元的分选效果示意图；
图7是经过第二分离单元的分选效果示意图；
图8是实施例4的第一分离单元的分选原理图(其中血浆样本和PBS中均含粘弹性增强剂)；
图9是实施例5的第一分离单元的分选原理图(其中血浆样本不含粘弹性增强剂，PBS含有粘弹性增强剂)。
图例说明：
1、微流控芯片；2、叉指电极；3、压电材料；11、第一鞘流入口；12、血浆入口；13、第一鞘流通道；14、血浆通道；15、直行通道；16、对称蛇形螺旋通道；17、第一外囊泡通道；18、第一外囊泡出口；19、剩余血浆流出通道；110、剩余血浆流入通道；111、第二鞘流入口；112、第二鞘流通道；113、直流通道；114、第二外囊泡通道；115、第二外囊泡出口；116、分泌体通道；117、分泌体出口；118、空槽结构；119、小尺寸颗粒区域；120、大尺寸颗粒区域；121、分泌体流动区域；122、非牛顿和牛顿流体界面；123、PBS鞘流流动区域；161、蛇形通道单元；162、螺旋线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种分选血浆中外泌体的微流控器件，结构示意图如图1所示，由上层的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片1(如图2)和下层的声表面波器件(如图3)键合而成，声表面波器件包含叉指电极2和128°YX铌酸锂压电材料3，微流控芯片1由第一分离单元和第二分离单元串联形成。其中：
第一分离单元包括：第一鞘流入口11、第一鞘流通道13、血浆入口12、血浆通道14、直行通道15、对称蛇形螺旋通道16、第一外囊泡通道17、第一外囊泡出口18和剩余血浆流出通道19；第一分离单元的第一鞘流入口11、血浆入口12分别通过第一鞘流通道13和血浆通道14并在其出口端相连，且依次与直行通道15和对称蛇形螺旋通道16连接；对称蛇形螺旋通道16的出口端在鞘流一侧通过第一外囊泡通道17与第一外囊泡出口18连接，对称蛇形螺旋通道16的出口端在血浆样本一侧通过剩余血浆流出通道19与第二分离单元的剩余血浆流入通道110连接；
第二分离单元包括：第二鞘流入口111、第二鞘流通道112、剩余血浆流入通道110、直流通道113、第二外囊泡通道114、第二外囊泡出口115、分泌体通道116和分泌体出口117；第二分离单元的第二鞘流入口111通过第二鞘流通道112与剩余血浆流入通道110在其出口端相连并与直流通道113连接，直流通道113的在血浆样本一侧靠近声表面波器件的叉指电极2，直流通道113的出口端在鞘流一侧通过第二外囊泡通道114与第二外囊泡出口115连接，直流通道113的出口端在血浆样本一侧通过分泌体通道116与分泌体出口117连接。
叉指电极2包含铬增粘层和金导电层，通过磁控溅射的方式布置在压电材料3的抛光面一侧上，铬增粘层和金导电层的厚度为分别为10nm和100nm；叉指电极2的指条宽度为20μm，声孔径为3mm；直流通道113的流体方向与叉指电极2的指条朝向平行，且直流通道113与叉指电极2的最短距离≤1.5mm。
第一分离单元和第二分离单元中，PMDS微流控芯片1的直行通道15、对称蛇形螺旋通道16和直流通道113截面形状为矩形，尺寸为50μm宽，15μm高，采用低深宽比截面通道，可以抑制分离过程中迪恩流产生的混合效果；对称蛇形螺旋通道16的立体示意图见图4，结构说明示意图见图5，对称蛇形螺旋通道16由若干对称的蛇形通道单元161首尾连接形成螺旋线162形状，蛇形通道单元161的蛇形曲率半径为通道宽度的6-8倍，螺旋线的最外圈半径为4.5mm，螺旋线圈数≤2圈；第二外囊泡通道114与分泌体通道116的入口端之间的夹角为60°，第二鞘流通道112与剩余血浆流入通道110的出口端之间的夹角为45°；PMDS微流控芯片1的厚度为3mm，在PMDS微流控芯片1底部设有与叉指电极2相匹配的空槽结构118，空槽结构118的深度为0.1mm，确保声表面波传播过程不过多的受PMDS与叉指电极接触影响。
微流控器件的制备方法：PDMS微流控芯片1采用软光刻技术制作，首先在硅片上利用光刻技术制作母模，再利用PDMS倒模形成微流控芯片；声表面波器件中的压电材料3选择机电耦合系数高的128°YX铌酸锂，在铌酸锂材料的抛光面一侧上，利用剥离工艺制作叉指电极2，电极采用磁控溅射的方式形成，电极包含铬增粘层和金导电层组成，厚度为分别为10nm和100nm；对PMMS微流控芯片和声表面波器件表面进行等离子体处理后进行键合。
具体的分选原理如下：
PDMS微流控芯片1包含两个分离单元，血浆样本流体依次流经第一和第二分离单元，最后得到分离后的外泌体。第一分离单元的对称蛇形螺旋通道16由螺旋与对称蛇形复合而成，包含第一鞘流入口11和血浆入口12，用微注射泵以一定的流速将含PEO的血浆样本从血浆入口12流入血浆通道14，同时用微注射泵将含PEO的磷酸缓冲盐溶液(PBS)鞘流从第一鞘流入口11经注射泵注入流入第一鞘流通道13，鞘流和血浆样本经直行通道15流入对称蛇形螺旋通道16中。
如图6所示，经第一分离单元分离后的血浆样本仍含有尺寸较大的外囊泡颗粒，分离出去的外囊泡从第一外囊泡通道17自第一外囊泡出口18流出至第一级外囊泡回收瓶；剩余血浆样本从剩余血浆流出通道19流入第二分离单元的剩余血浆流入通道110，用微注射泵将含有PEO的PBS鞘流溶液从第二鞘流入口111注入，如图7所示，经第二鞘流通道112与样本流在直流通道113中汇流，对血浆样本形成挤压作用，同时控制鞘流与样本流的流速比≥3︰1，保证样本流被挤压在直流通道113靠近叉指电极2的一侧，在第二分离单元，由于样本流靠近壁面时粘弹性介质诱导的弹性力和声表面波诱导的声辐射力的双重作用，较大尺寸的外囊泡颗粒运动会垂直于流线偏转，外泌体因尺寸过小受到的力不够保持原有运动不变，设置合适的出口，外囊泡从第二外囊泡通道114流出，在第二外囊泡出口115利用第二级外囊泡回收瓶进行收集，剩余的只含有外泌体的样本从分泌体通道116流出，在分泌体出口117经回收瓶进行收集。
实施例2：
一种分选血浆中外泌体的微流控器件，结构示意图如图1所示，由上层的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微流控芯片1(如图2)和下层的声表面波器件(如图3)键合而成，声表面波器件包含叉指电极2和128°YX铌酸锂压电材料3，微流控芯片1由第一分离单元和第二分离单元串联形成。其中：
第一分离单元包括：第一鞘流入口11、第一鞘流通道13、血浆入口12、血浆通道14、直行通道15、对称蛇形螺旋通道16、第一外囊泡通道17、第一外囊泡出口18和剩余血浆流出通道19；第一分离单元的第一鞘流入口11、血浆入口12分别通过第一鞘流通道13和血浆通道14并在其出口端相连，且依次与直行通道15和对称蛇形螺旋通道16连接；对称蛇形螺旋通道16的出口端在鞘流一侧通过第一外囊泡通道17与第一外囊泡出口18连接，对称蛇形螺旋通道16的出口端在血浆样本一侧通过剩余血浆流出通道19与第二分离单元的剩余血浆流入通道110连接；
第二分离单元包括：第二鞘流入口111、第二鞘流通道112、剩余血浆流入通道110、直流通道113、第二外囊泡通道114、第二外囊泡出口115、分泌体通道116和分泌体出口117；第二分离单元的第二鞘流入口111通过第二鞘流通道112与剩余血浆流入通道110在其出口端相连并与直流通道113连接，直流通道113的在血浆样本一侧靠近声表面波器件的叉指电极2，直流通道113的出口端在鞘流一侧通过第二外囊泡通道114与第二外囊泡出口115连接，直流通道113的出口端在血浆样本一侧通过分泌体通道116与分泌体出口117连接。
叉指电极2包含铬增粘层和金导电层，通过磁控溅射的方式布置在压电材料3的抛光面一侧上，铬增粘层和金导电层的厚度为分别为10nm和100nm；叉指电极2的指条宽度为20μm，声孔径为3mm；直流通道113的流体方向与叉指电极2的指条朝向平行，且直流通道113与叉指电极2的最短距离≤1.5mm。
第一分离单元和第二分离单元中，PMMA微流控芯片1的直行通道15、对称蛇形螺旋通道16和直流通道113截面形状为矩形，尺寸为50μm宽，15μm高，采用低深宽比截面通道，可以抑制分离过程中迪恩流产生的混合效果；对称蛇形螺旋通道16的立体示意图见图4，结构说明示意图见图5，对称蛇形螺旋通道16由若干对称的蛇形通道单元161首尾连接形成螺旋线162形状，蛇形通道单元161的蛇形曲率半径为通道宽度的6-8倍，螺旋线的最外圈半径为4.5mm，螺旋线圈数≤2圈；第二外囊泡通道114与分泌体通道116的入口端之间的夹角为60°，第二鞘流通道112与剩余血浆流入通道110的出口端之间的夹角为45°；PMMA微流控芯片1的厚度为3mm，在PMMA微流控芯片1底部设有与叉指电极2相匹配的空槽结构118，空槽结构118的深度为0.1mm，确保声表面波传播过程不过多的受PMMA与叉指电极接触影响。
微流控器件的制备方法：PMMA微流控芯片1采用软光刻技术制作，首先在硅片上利用光刻技术制作母模，再利用PMMA倒模形成微流控芯片；声表面波器件中的压电材料3选择机电耦合系数高的128°YX铌酸锂，在铌酸锂材料的抛光面一侧上，利用剥离工艺制作叉指电极2，电极采用磁控溅射的方式形成，电极包含铬增粘层和金导电层组成，厚度为分别为10nm和100nm；对PMMA微流控芯片和声表面波器件表面进行等离子体处理后进行键合。
实施例3：
一种分选血浆中外泌体的微流控器件，结构示意图如图1所示，由上层的环烯烃类共聚物(COC)微流控芯片1(如图2)和下层的声表面波器件(如图3)键合而成，声表面波器件包含叉指电极2和128°YX铌酸锂压电材料3，微流控芯片1由第一分离单元和第二分离单元串联形成。其中：
第一分离单元包括：第一鞘流入口11、第一鞘流通道13、血浆入口12、血浆通道14、直行通道15、对称蛇形螺旋通道16、第一外囊泡通道17、第一外囊泡出口18和剩余血浆流出通道19；第一分离单元的第一鞘流入口11、血浆入口12分别通过第一鞘流通道13和血浆通道14并在其出口端相连，且依次与直行通道15和对称蛇形螺旋通道16连接；对称蛇形螺旋通道16的出口端在鞘流一侧通过第一外囊泡通道17与第一外囊泡出口18连接，对称蛇形螺旋通道16的出口端在血浆样本一侧通过剩余血浆流出通道19与第二分离单元的剩余血浆流入通道110连接；
第二分离单元包括：第二鞘流入口111、第二鞘流通道112、剩余血浆流入通道110、直流通道113、第二外囊泡通道114、第二外囊泡出口115、分泌体通道116和分泌体出口117；第二分离单元的第二鞘流入口111通过第二鞘流通道112与剩余血浆流入通道110在其出口端相连并与直流通道113连接，直流通道113的在血浆样本一侧靠近声表面波器件的叉指电极2，直流通道113的出口端在鞘流一侧通过第二外囊泡通道114与第二外囊泡出口115连接，直流通道113的出口端在血浆样本一侧通过分泌体通道116与分泌体出口117连接。
叉指电极2包含铬增粘层和金导电层，通过磁控溅射的方式布置在压电材料3的抛光面一侧上，铬增粘层和金导电层的厚度为分别为10nm和100nm；叉指电极2的指条宽度为20μm，声孔径为3mm；直流通道113的流体方向与叉指电极2的指条朝向平行，且直流通道113与叉指电极2的最短距离≤1.5mm。
第一分离单元和第二分离单元中，COC微流控芯片1的直行通道15、对称蛇形螺旋通道16和直流通道113截面形状为矩形，尺寸为50μm宽，15μm高，采用低深宽比截面通道，可以抑制分离过程中迪恩流产生的混合效果；对称蛇形螺旋通道16的立体示意图见图4，结构说明示意图见图5，对称蛇形螺旋通道16由若干对称的蛇形通道单元161首尾连接形成螺旋线162形状，蛇形通道单元161的蛇形曲率半径为通道宽度的6-8倍，螺旋线的最外圈半径为4.5mm，螺旋线圈数≤2圈；第二外囊泡通道114与分泌体通道116的入口端之间的夹角为60°，第二鞘流通道112与剩余血浆流入通道110的出口端之间的夹角为45°；COC微流控芯片1的厚度为3mm，在COC微流控芯片1底部设有与叉指电极2相匹配的空槽结构118，空槽结构118的深度为厚度0.1mm，确保声表面波传播过程不过多的受COC与叉指电极接触影响。
微流控器件的制备方法：COC微流控芯片1采用软光刻技术制作，首先在硅片上利用光刻技术制作母模，再利用COC倒模形成微流控芯片；声表面波器件中的压电材料3选择机电耦合系数高的128°YX铌酸锂，在铌酸锂材料的抛光面一侧上，利用剥离工艺制作叉指电极2，电极采用磁控溅射的方式形成，电极包含铬增粘层和金导电层组成，厚度为分别为10nm和100nm；对COC微流控芯片和声表面波器件表面进行等离子体处理后进行键合。
实施例4：
一种分选血浆中外泌体的微流控器件的使用方法，包括如下步骤：
(1)配制含有粘弹性增强剂(PEO)的PBS溶液：在PBS溶液中加入分子质量为600KDa的PEO粉末，利用搅拌器以≤40rpm的速度搅拌1h，使PEO粉末加速溶解于PBS溶液中，再以≤10rpm的速度摇动混合物24h左右，保证PEO粉末完全溶解于PBS溶液中，制备的含PEO的PBS溶液中PEO的浓度为0.12wt％；
(2)配制含有粘弹性增强剂(PEO)的血浆样本：利用离心法去除全血中的血细胞，获取血浆样本，利用直径为1μm的过滤膜过滤掉尺寸大于1μm的细胞颗粒，保证血浆样本中的颗粒尺寸分布在0.03-1μm之间，利用步骤(1)制备的含PEO的PBS溶液，对血浆样本进行稀释20倍，使样本中生物颗粒浓度约为5×109个/mL，使血浆样本保持牛顿流体的特性，加入吐温20防止血浆样本中的颗粒粘附聚集，吐温20最终浓度为0.01v/v％，得到含PEO的血浆样本；
(3)将上述配制得到的含PEO的PBS溶液和含PEO的血浆样本分别注入到第一分离单元的第一鞘流入口11和血浆入口12，含PEO的PBS溶液和血浆样本分别经过第一鞘流通道13和血浆通道14汇入直行通道15，然后流入对称蛇形螺旋通道16，期间控制含PEO的血浆样本的流速为0.5-2μL/min，控制含PEO的PBS溶液与含PEO的血浆样本的流速比为5︰1，保证血浆样本被压缩在通道的一侧，经过对称蛇形螺旋通道16的分选后血浆样本中的一部分细胞外囊泡经过第一外囊泡通道17和第一外囊泡出口18流出至第一级外囊泡回收瓶，剩余的血浆样本通过剩余血浆流出通道19流入第二分离单元的剩余血浆流入通道110；
(4)将上述配制得到的含PEO的PBS溶液注入到第二分离单元的第二鞘流入口111，使含PEO的PBS溶液经过第二鞘流通道112与步骤(3)剩余的血浆样本汇入直流通道113，期间控制含PEO的PBS溶液与含PEO的血浆样本的流速比为3︰1，保证血浆样本被压缩在靠近叉指电极2的一侧，并保证叉指电极2通电，经过直流通道113的分选后，血浆样本中的剩余细胞外囊泡经过第二外囊泡通道114和第二外囊泡出口115流出至第二级外囊泡回收瓶，血浆样本中分选出来的外泌体通过分泌体通道116和分泌体出口117流出至回收瓶收集，即完成血浆中外泌体的分选。
大尺寸颗粒在对称蛇形螺旋通道16中的分离原理如图8所示，由于对称蛇形螺旋通道存在一定的曲率，在垂直于流向的截面上会形成两个反向流动的涡流，称Dean流。Dean流引入会给通道中的颗粒诱导迪恩拽力FD，迪恩拽力一般被认为是斯托克斯拽力，其计算公式为：FD＝3πηdUD，其中UD为迪恩流速，d为颗粒直径，η为流体的粘性系数。由于血浆样本含有粘弹性增强剂，存在粘弹性，会对颗粒产生弹性力FE，FE的计算公式为FE＝Ced3▽N1，弹性力在越靠近通道壁面的时候越显著。经过内弯曲流道时，在FD和FE的作用下，大尺寸外囊泡会远离通道壁面，由于FD和FE分别正比于d和d3，小尺寸颗粒由于产生的横向力不够，因而基本保持原有沿流线运动不变。第一分离单元阶段控制鞘流的流速与血浆样本的流速比大于5︰1，保证血浆样本被限制在通道一侧的小尺寸颗粒区域119，分选出的大尺寸外囊泡分布在大尺寸颗粒区域120。
实施例5：
一种分选血浆中外泌体的微流控器件的使用方法，采用不含粘弹性增强剂的血浆样本，包括如下步骤：
(1)配制含有粘弹性增强剂(PEO)的PBS溶液：在PBS溶液中加入分子质量为600KDa的PEO粉末，利用搅拌器以≤40rpm的速度搅拌1h，使PEO粉末加速溶解于PBS溶液中，再以≤10rpm的速度摇动混合物24h左右，保证PEO粉末完全溶解于PBS溶液中，制备的含PEO的PBS溶液中PEO的浓度为0.12wt％；
(2)配制不含有粘弹性增强剂(PEO)的血浆样本：利用离心法去除全血中的血细胞，获取血浆样本，利用直径为1μm的过滤膜过滤掉尺寸大于1μm的细胞颗粒，保证血浆样本中的颗粒尺寸分布在0.03-1μm之间，利用不含PEO的PBS溶液，对血浆样本进行稀释20倍，使样本中生物颗粒浓度约为5×109个/mL，使血浆样本保持牛顿流体的特性，加入吐温20防止血浆样本中的颗粒粘附聚集，吐温20最终浓度为0.01v/v％，得到不含PEO的血浆样本；
(3)将含PEO的PBS溶液和不含PEO的血浆样本分别注入到第一分离单元的第一鞘流入口11和血浆入口12，PBS溶液和血浆样本分别经过第一鞘流通道13和血浆通道14汇入直行通道15，然后流入对称蛇形螺旋通道16，期间控制血浆样本的流速为0.5-2μL/min，控制PBS溶液与血浆样本的流速比为5：1，保证血浆样本被压缩在通道的一侧，经过对称蛇形螺旋通道16的分选后血浆样本中的一部分细胞外囊泡经过第一外囊泡通道17和第一外囊泡出口18流出至第一级外囊泡回收瓶，剩余的血浆样本通过剩余血浆流出通道19流入第二分离单元的剩余血浆流入通道110；
(4)将含PEO的PBS溶液注入到第二分离单元的第二鞘流入口111，使PBS溶液经过第二鞘流通道112与步骤(3)剩余的血浆样本汇入直流通道113，期间控制PBS溶液与含PEO的血浆样本的流速比为3︰1，保证血浆样本被压缩在靠近叉指电极2的一侧，并保证叉指电极2通电，经过直流通道113的分选后，血浆样本中的剩余细胞外囊泡经过第二外囊泡通道114和第二外囊泡出口115流出至第二级外囊泡回收瓶，血浆样本中分选出来的外泌体通过分泌体通道116和分泌体出口117流出至回收瓶收集，即完成血浆中外泌体的分选。
如图9所示，在对称蛇形螺旋通道16的内弯通道中，血浆样本被挤压至分泌体流动区域121，形成非牛顿和牛顿流体界面122。在净惯性升力FL和迪恩拽力FD的影响下，大尺寸的外囊泡颗粒会发生横向移动，在界面处克服界面施加的反向弹性力，最终运动至PBS鞘流流动区域123。小尺寸外囊泡和外泌体颗粒由于受力不够，或因净惯性升力和迪恩拽力产生横向位移，但无法克服界面处施加的反向弹性力而继续在分泌体流动区域121流动。在第二分离单元中，声表面波产生的声辐射力，使大于外泌体尺寸的外囊泡颗粒发生偏转，而外泌体保持原有运动不变，实现外泌体与外囊泡的分离，外泌体最终在分泌体出口117处得到并收集。

Claims (10)

1.一种分选血浆中外泌体的微流控器件，包括上层的微流控芯片(1)与下层的声表面波器件，所述声表面波器件包括叉指电极(2)和压电材料(3)，其特征在于，所述微流控芯片(1)内设有第一分离单元和第二分离单元，所述第一分离单元设有对称蛇形螺旋通道(16)，所述第二分离单元设有直流通道(113)，所述叉指电极(2)设在直流通道(113)的附近。
2.根据权利要求1所述的微流控器件，其特征在于，所述第一分离单元包括：第一鞘流入口(11)、第一鞘流通道(13)、血浆入口(12)、血浆通道(14)、直行通道(15)、对称蛇形螺旋通道(16)、第一外囊泡通道(17)、第一外囊泡出口(18)和剩余血浆流出通道(19)；所述第一分离单元的第一鞘流入口(11)、血浆入口(12)分别通过第一鞘流通道(13)和血浆通道(14)并在其出口端相连，且依次与直行通道(15)和对称蛇形螺旋通道(16)连接；所述对称蛇形螺旋通道(16)的出口端在鞘流一侧通过第一外囊泡通道(17)与第一外囊泡出口(18)连接，所述对称蛇形螺旋通道(16)的出口端在血浆样本一侧通过剩余血浆流出通道(19)与所述第二分离单元的剩余血浆流入通道(110)连接；
所述第二分离单元包括：第二鞘流入口(111)、第二鞘流通道(112)、剩余血浆流入通道(110)、直流通道(113)、第二外囊泡通道(114)、第二外囊泡出口(115)、分泌体通道(116)和分泌体出口(117)；所述第二分离单元的第二鞘流入口(111)通过第二鞘流通道(112)与所述剩余血浆流入通道(110)在其出口端相连并与直流通道(113)连接，所述直流通道(113)的在血浆样本一侧靠近声表面波器件的叉指电极(2)，所述直流通道(113)的出口端在鞘流一侧通过第二外囊泡通道(114)与第二外囊泡出口(115)连接，所述直流通道(113)的出口端在血浆样本一侧通过分泌体通道(116)与分泌体出口(117)连接。
3.根据权利要求2所述的微流控器件，其特征在于，所述对称蛇形螺旋通道(16)由若干蛇形通道单元(161)首尾连接形成螺旋线(162)形状，所述蛇形通道单元(161)的蛇形曲率半径为通道宽度的6-8倍，所述对称蛇形螺旋通道(16)的螺旋线最外圈半径为4.0-4.5mm，螺旋线圈数≤2圈；所述直行通道(15)、对称蛇形螺旋通道(16)和直流通道(113)的截面呈矩形，尺寸为宽50-100μm×高15-50μm；所述第一鞘流通道(13)与血浆通道(14)的出口端之间的夹角为30-90°，所述第一外囊泡通道(17)与剩余血浆流出通道(19)的入口端之间的夹角为30-60°，所述第二外囊泡通道(114)与分泌体通道(116)的入口端之间的夹角为30-90°，所述第二鞘流通道(112)与剩余血浆流入通道(110)的出口端之间的夹角为30-60°。
4.根据权利要求1所述的微流控器件，其特征在于，所述压电材料(3)为128°YX铌酸锂压电材料；所述叉指电极(2)包含铬增粘层和金导电层，通过磁控溅射的方式布置在所述压电材料(3)的抛光面一侧上，所述铬增粘层和金导电层的厚度为分别为5-10nm和50-100nm；所述叉指电极(2)的指条宽度为15-25μm，声孔径为2.5-3mm；所述直流通道(113)的流体方向与叉指电极(2)的指条朝向平行，且所述直流通道(113)与叉指电极(2)的最短距离≤1.5mm。
5.根据权利要求1所述的微流控器件，其特征在于，所述微流控芯片(1)的厚度为2-10mm；所述微流控芯片(1)的底部设有与所述叉指电极(2)相匹配的空槽结构(118)，所述空槽结构(118)的深度为0.1-0.3mm；所述微流控芯片(1)为聚二甲基硅氧烷微流控芯片、聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片或环烯烃类共聚物微流控芯片。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的微流控器件，其特征在于，所述微流控芯片(1)与声表面波器件通过键合的方式或通过夹具组装。
7.一种如权利要求1-5中任一项所述的微流控器件的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制含有粘弹性增强剂的PBS溶液，制备血浆样本；
(2)将所述步骤(1)配制得到的含有粘弹性增强剂的PBS溶液和血浆样本分别注入到所述第一分离单元的第一鞘流入口(11)和血浆入口(12)，使含有粘弹性增强剂的PBS溶液与血浆样本汇入所述对称蛇形螺旋通道(16)，期间控制所述含有粘弹性增强剂的PBS溶液与血浆样本的流速比使血浆样本被压缩在通道的一侧，经过所述对称蛇形螺旋通道(16)的分选后血浆样本中的一部分细胞外囊泡流出微流控器件，剩余的血浆样本流入所述第二分离单元；
(3)将所述步骤(1)配制得到的含有粘弹性增强剂的PBS溶液注入到所述第二分离单元的第二鞘流入口(111)，使含有粘弹性增强剂的PBS溶液与所述步骤(2)剩余的血浆样本汇入所述直流通道(113)，期间控制所述含有粘弹性增强剂的PBS溶液与血浆样本的流速比使血浆样本被压缩在靠近所述叉指电极(2)的一侧，并保证所述叉指电极(2)通电，经过所述直流通道(113)的分选后血浆样本中的剩余细胞外囊泡和外泌体分别从不同通道流出微流控器件，即完成血浆中外泌体的分选。
8.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于，所述粘弹性增强剂为聚环氧乙烷和/或聚乙烯吡咯烷酮，所述粘弹性增强剂占PBS溶液的质量百分比小于1wt％。
9.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于，所述血浆样本通过以下方法制备得到：利用离心法去除全血中的血细胞，获取血浆，利用直径为1μm的过滤膜过滤掉尺寸大于1μm的细胞颗粒，再利用含有粘弹性增强剂的PBS溶液或不含粘弹性增强剂的PBS溶液对血浆进行稀释5-20倍，再加入吐温20，即得到血浆样本。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中，血浆样本的流速为0.5-20μL/min，控制PBS溶液和血浆样本的流速比≥5︰1；所述步骤(3)中，控制PBS溶液和血浆样本的流速比≥3︰1。
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