CN113684130B - 一种刺激细胞外泌体分泌的设备、方法及得到的外泌体和其应用 - Google Patents

一种刺激细胞外泌体分泌的设备、方法及得到的外泌体和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种刺激细胞外泌体分泌的设备、方法及得到的外泌体和其应用，其中，该刺激细胞外泌体分泌的设备通过信号发生器输出电信号到叉指换能器产生声表面波信号，声表面波信号对存放器内的细胞进行刺激，利用存放器本身声阻抗大的特性，细胞受到声表面波的机械效应和热效应，造成细胞穿孔，增加细胞外泌体的分泌数量。通过本方案设备刺激细胞外泌体分泌细胞存活率高，分泌速度快，获得的外泌体有效性高、治疗效果好。

Description

一种刺激细胞外泌体分泌的设备、方法及得到的外泌体和其 应用
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，特别涉及一种刺激细胞外泌体分泌的设备、方法及得到的外泌体和其应用。
背景技术
在人体内，细胞外泌体可以通过循环系统实现细胞间的信息传递，外泌体的脂质双层膜结构不仅可以保护内部蛋白质和核酸免于降解，而且还可以保持其亲代细胞固有的靶向能力，这使它们有潜力成为用作将治疗药物运送到受体细胞中的有效载体。外泌体上的CD47蛋白还可以防止其被免疫细胞吞噬，使外泌体比合成的类脂质体更有效。大量研究表明细胞外泌体内的RNA在进行细胞间交流的过程中，能影响吸收它的细胞的功能特性，具有潜在的临床应用价值。
外泌体作为药物载体进行疾病治疗时具有独特的优势，包括以下几点：
(1)使用自源性外泌体进行治疗时不易产生免疫反应。
(2)外泌体作为载体，可以很好的解决RNA在血液中不稳定的问题。
(3)可以通过胞吞等方式被靶细胞吸收，具有很高的转运效率。
(4)由于外泌体膜特异性蛋白的存在，运输时具有靶向性。
(5)外泌体直径在40～150nm之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留效应，有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。
(6)可以跨越特殊的生理屏障：血脑屏障。
外泌体作为药物载体虽然有很多优点，但是技术上由于无法生产足够数量的可以在体内使用的外泌体，外泌体在疾病治疗方面的应用一直受到限制，所以增加细胞外泌体产量的方法就显得尤为重要。
随着疾病治疗研究的不断深入，国内外对外泌体的研究逐渐增多，为了增加外泌体的产量，人们提出了许多提高外泌体产量的方法，例如：
(1)化学方面，细胞间离子霉素和钙离子含量升高可以促进外泌体产生。
(2)改变细胞环境PH值。
(3)机械刺激(如循环拉伸)。
(4)诱导细胞缺氧。
(5)选取特定的能够分泌出足够外泌体的细胞作为外泌体的细胞来源。
(6)暴露于热、氧化、光动力或辐射应力。
(7)还有目前已经开发出来的可以进行高通量生产外泌体的装置，使用电穿孔的方式通过让细胞内钙离子含量增多，且细胞内热休克蛋白含量增加的方式，增加细胞分泌的外泌体数量。
然而上述这些方法中，都存在一些缺点，例如：
(1)离子霉素和磷酸钙的添加虽然能让外泌体含量提升，但是，细胞过度暴露于这些化学物质会导致它们的活力显著下降。
(2)将细胞暴露于电离辐射也会导致细胞凋亡。
(3)另一方面，有报道称氧化应激可在24小时内使外泌体产量增加约20-30倍(约0.8-1.25倍/小时)，但可产生免疫反应性外泌体，这可能削弱其诊断或治疗潜力。
(4)循环拉伸等机械手段会导致破坏细胞膜的完整性，这将影响其治疗活性并带来安全风险。
(5)目前，已知的唯一具有大规模生产外泌体能力的人类细胞类型是间充质干细胞(MSC)，虽然MSCs在体外有巨大的扩展能力，但是需要不断地提取新的MSCs，以补充外泌体的细胞来源，每一次细胞来源都需要重复的提取、测试和验证成本，使得MSC外泌体的生产无法在商业上应用。
(6)电穿孔会导致外泌体或其包裹的带电荷的药物聚集，从而影响外泌体的治疗功效。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种刺激细胞外泌体分泌的设备，旨在解决现有技术提高外泌体产量的方法存在的弊端。
为实现上述目的，本发明提出一种刺激细胞外泌体分泌的设备，包括：
信号发生器，用于输出电信号；
叉指换能器，用于将所述电信号转换为声表面波信号；
存放器，用于存放待刺激的细胞，具有接收超声热效应和机械效应的特性，所述存放器与所述叉指换能器贴合，所述声表面波信号对所述待刺激的细胞进行超声刺激。
可选地，还包括：
功率放大器，用于对所述电信号进行功率放大，并将放大后的电信号传输到所述叉指换能器；
直流电源，为所述功率放大器供电。
进一步地，还包括：
热成像仪，用于监控所述超声表面波信号对所述待刺激的细胞进行超声刺激后的升温过程。
可选地，所述存放器包括聚二甲基硅氧烷PDMS腔道，所述PDMS腔道具有声阻抗大的特性且能紧密贴合在所述叉指换能器的压电基底上，形成声表面波芯片。
本发明还提出一种刺激细胞外泌体分泌的方法，包括：
制备叉指换能器：通过MEMS制造工艺在压电基底上镀叉指电极得到叉指换能器；
制作聚二甲基硅氧烷PDMS腔道：设计PDMS腔道的结构，使用光刻的方法制作出腔道副本，再通过倒胶、烘干固化、打孔制作出PDMS腔道；
细胞培养：通过用无外泌体血清配制的培养基对细胞进行培养，并种在所述PDMS腔道内进行培养；
声表面波刺激细胞：将种好细胞的PDMS腔道贴合在所述叉指换能器的压电基底上，通过信号发生器向所述叉指换能器输入电信号，叉指换能器将所述电信号转换为超声表面波信号刺激所述PDMS腔道内的细胞；
外泌体收集：声表面波刺激后的细胞培养，从上清液中收集外泌体。
可选地，所述声表面波信号刺激所述PDMS腔道内的液体温度升高至45-50℃。
本发明还提出一种细胞外泌体，通过使用上述任意一项所述的一种刺激细胞外泌体分泌的设备得到，或者通过上述任意一项所述的一种刺激细胞外泌体分泌的方法制备得到。
本发明还提出上述的一种细胞外泌体作为药物载体的应用。
本发明还提出一种药物组合物，包括上述的一种细胞外泌体和包裹在所述细胞外泌体内的药物。
可选地，所述药物包括核酸分子。
本发明技术方案的刺激细胞外泌体分泌的设备通过信号发生器输出电信号到叉指换能器产生声表面波信号，声表面波信号对存放器内的细胞进行刺激，细胞受到声表面波的机械效应和热效应，造成细胞穿孔，增加细胞外泌体的分泌数量。通过本方案设备刺激细胞外泌体分泌细胞存活率高，分泌速度快，获得的外泌体有效性高、治疗效果好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明的刺激细胞外泌体分泌的设备的结构框图；
图2为本发明的刺激细胞外泌体分泌的方法的流程示意图；
图3为不同电压下，声表面波器件工作时间与PDMS腔道内液体温度升高的曲线图；
图4a和图4b分别为超声刺激后的细胞的PI荧光图和细胞穿孔率定量图；
图5a和5b分别为超声刺激后的细胞的Calcein-AM荧光图和细胞存活率定量图；
图6为超声刺激后的细胞分泌的外泌体的数量结果图；
图7为超声刺激后的细胞分泌的外泌体的蛋白浓度结果图；
图8为实施例1的外泌体的粒径分布结果图；
图9为实施例1的外泌体的透射电子显微镜结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种刺激细胞外泌体分泌的设备，请参阅图1，包括：信号发生器10，用于输出电信号；叉指换能器20，用于将所述电信号转换为声表面波信号；存放器30，用于存放待刺激的细胞，具有接收超声热效应和机械效应的特性，所述存放器30与所述叉指换能器20贴合，所述声表面波信号对所述待刺激的细胞进行超声刺激。
其中，信号发生器10用来输出正弦波电信号，信号发生器10的输出频率为22Mhz-24Mhz，信号幅值为0.7Vpp-1.2Vpp。
具体的，叉指换能器20(IDT)，就是在压电基底表面上形成形状像两只手的手指交叉状的金属图案，它的作用是实现声电换能，叉指换能器20是构成声表面波器件最基本的单元，声表面波器件包括输入换能器和输出换能器。
声表面波器件的工作原理是，压电基底上的输入换能器通过逆压电效应将输入的电信号转变成声信号，此声信号沿压电基底表面传播形成声表面波，最终由输出换能器将声信号转变成电信号输出。整个声表面波器件的功能是通过对在压电基底上传播的声信号进行各种处理，并利用声一电换能器的待性来完成的。
所述存放器30用于存放可以分泌产生外泌体的细胞，存放器30可以接收超声的机械效应产生振动，还可以接收超声的热效应，使得在超声刺激过程中，存放器内温度升高。所述存放器30与所述叉指换能器20贴合，使得叉指换能器20产生的声表面波信号可以作用于存放器30内的细胞。
所述存放器30可以为聚硅氧烷制作而成，例如可以为聚二甲基硅氧烷，环甲基硅氧烷，氨基硅氧烷，聚甲基苯基硅氧烷，聚醚聚硅氧烷共聚物等。
本发明技术方案的刺激细胞外泌体分泌的设备通过信号发生器10输出电信号到叉指换能器20产生声表面波信号，声表面波信号对存放器30内的细胞进行刺激，细胞受到声表面波的机械效应和热效应，造成细胞穿孔，增加细胞外泌体的分泌数量。通过本方案设备刺激细胞外泌体分泌细胞存活率高，分泌速度快，获得的外泌体有效性高、治疗效果好。
通过声表面波信号刺激细胞，对细胞膜伤害小，不影响细胞完整性和存活率。并且叉指换能器的制备工艺为标准的MEMS工艺，器件性能具有良好的一致性，实验的可重复性高，可以高效率的分泌外泌体。
由于外泌体表面和外泌体内容物中可能会带正负电荷，传统的电穿孔刺激外泌体分泌的过程中使用的不同极性的电极会导致正负电荷不同的外泌体或外泌体内容物向不同的电极聚集，影响外泌体的功能性。本发明技术方案的刺激细胞外泌体分泌的设备通过使用声表面波对细胞进行穿孔，没有带电电极与细胞直接接触，因而不会影响外泌体的功能。
在一实施例中，请参阅图1，所述的一种刺激细胞外泌体分泌的设备还包括：功率放大器40，用于对所述电信号进行功率放大，并将放大后的电信号传输到所述叉指换能器20；直流电源50，为所述功率放大器40供电。
可以理解的是，由于信号发生器10输出的电信号通常电流很小，无法驱动叉指换能器20两端通过压电基底产生声表面波，对细胞进行超声刺激。所以设置功率放大器40，将信号发生器10输出的电信号首先经过功率放大器40放大信号，功率放大器为2W。直流电源50是给功率放大器40供电，让功率放大器40能够正常工作。
进一步地，请继续参阅图1，所述的一种刺激细胞外泌体分泌的设备还包括：热成像仪60，用于监控所述声表面波信号对所述待刺激的细胞进行超声刺激后的升温过程。
所述热成像仪60接收升温过程的红外辐射能量，通过监控PDMS腔道内的液体升温过程，实时控制声表面波对细胞的刺激强度和刺激时间。
在一实施例中，所述存放器30包括聚二甲基硅氧烷PDMS腔道，所述PDMS腔道贴合在所述叉指换能器20的压电基底上，形成声表面波芯片。
聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)是一种高分子有机硅化合物，通常被称为有机硅，具有光学透明性，且在一般情况下，被认为是惰性，无毒，不易燃。聚二甲基硅氧烷是最广泛使用的硅为基础的有机聚合物材料。所述PDMS腔道用于存放、培养细胞。
所述PDMS腔道的形状可以为圆形、正方形或长方形，在此不做限定。优选地，所述PDMS腔道的形状为圆形，圆形PDMS腔道可以直接用打孔器制作出，方便操作。
所述PDMS腔道与所述叉指换能器20贴合的底面厚度为0.4mm-0.8mm，该厚度下所述PDMS腔道较易制作，并且声表面波信号对所述PDMS腔道内的细胞超声刺激效果最好。
本发明还提出一种刺激细胞外泌体分泌的方法，请参阅图2，包括：
S10：制备叉指换能器：通过MEMS制造工艺在压电基底上镀叉指电极得到叉指换能器。
MEMS制造工艺(Microfabrication Process)是下至纳米尺度，上至毫米尺度微结构加工工艺的通称。起源于半导体和微电子工艺，以光刻、外延、薄膜淀积、氧化、扩散、注入、溅射、蒸镀、刻蚀、划片和封装等为基本工艺步骤来制造复杂三维形体的微加工技术。
叉指换能器主要是通过在压电基底上镀上叉指电极制作而成的，压电基底材料例如可以为铌酸锂，为了获得较大的机电耦合系数选用128°YX双面抛光的铌酸锂作为压电基底。在制作叉指换能器的过程中主要包括涂胶、光刻等工艺。
进一步地，叉指换能器制作好之后通过网络分析仪测量其共振频率和能量衰减，以测试叉指换能器的最佳输入频率，即在该输入频率下，能够输入最小的电信号幅值得到最大的超声振动幅值。
S20：制作聚二甲基硅氧烷PDMS腔道：设计PDMS腔道的结构，使用光刻的方法制作出腔道副本，再通过倒胶、烘干固化、打孔等步骤制作出PDMS腔道。利用等离子处理的方法将腔道与已经制作好的PDMS底部进行键合从而制作出实验所用的存放器。
所述PDMS腔道与所述叉指换能器贴合的底面厚度为0.4mm-0.8mm，该厚度下所述PDMS腔道较易制作，并且声表面波信号对所述PDMS腔道内的细胞超声刺激效果最好。
S30：细胞培养：通过用无外泌体血清配制的培养基对细胞进行培养，并种在所述PDMS腔道内进行培养。
所述PDMS腔道内的细胞培养液体积为5ul-15ul，细胞培养液的体积应保证能没过所有培养的细胞，以提供细胞生长环境，使其在超声刺激过程中不易凋亡；细胞培养液体积不能过高，由于液体的比热容大，在超声刺激过程中，过大的液体体积会导致超声刺激过程中超声热效应对腔道内细胞升温不明显。所述PDMS腔道内的细胞密度为1.0至3.0x105个/ml，细胞密度太小会使得分泌外泌体的细胞数量太小，得不到足够的外泌体；细胞密度太大，由于细胞生存空间过小会发生细胞凋亡，降低细胞的存活率。
S40：声表面波刺激细胞：将种好细胞的PDMS腔道贴合在所述叉指换能器的压电基底上，通过信号发生器向所述叉指换能器输入电信号，叉指换能器将所述电信号转换为声表面波信号刺激所述PDMS腔道内的细胞。
进一步地，声表面波信号刺激细胞之后还包括检测细胞的存活情况和穿孔情况，取声表面波信号刺激后的细胞进行钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)染色和碘化丙啶(PI)联合染色，检测细胞存活情况和细胞膜穿孔情况。
CalceinAM本身并无荧光，进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素(Calcein)，从而被滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光。
由于死细胞缺乏酯酶，CalceinAM仅用于对活细胞的活力测试和短期标记，而核酸红色荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)由于不能穿透活细胞的细胞膜而只能染色细胞膜完整性被破坏的细胞，所以CalceinAM与碘化丙啶联合使用，对活细胞且发生了细胞膜穿孔的细胞同时进行双重荧光染色。
S50：外泌体收集：声表面波刺激后的细胞培养，从上清液中收集外泌体。
声表面波刺激后的细胞继续在PDMS腔道培养48至72小时，收集上清液，从上清液中收集外泌体，并进行含量检测。通过化学沉降的方法收集细胞上清液中的外泌体，并经过三次梯度离心后，将收集到的外泌体，通过马尔文Nanosight仪器(纳米粒子追踪技术)分析外泌体的粒子数量。
可选地，所述声表面波信号刺激所述PDMS腔道内的细胞的时长为2～5秒。
声表面波信号刺激时间在2～5s以内，对细胞膜伤害小，不影响细胞膜完整性和存活率。细胞的高存活率可以使得同一细胞源可以通过连续的刺激和刺激后孵育步骤重复循环。
具体的，一方面在细胞经过超声刺激后培养48～72小时收集外泌体结束后，再用这批细胞进行超声刺激再收集外泌体，实现重复循环；另一方面，在细胞进行了2～5s超声刺激后，缓冲6～12s视为一个周期，可以进行多个周期刺激，提高外泌体产量。
可选地，所述声表面波信号刺激所述PDMS腔道内的液体温度升高至45-50℃。该温度范围内，可以保证细胞在声表面波信号刺激后具有良好的活性，并且穿孔效果好。
本发明还提出一种细胞外泌体，通过使用上述任意一项所述的一种刺激细胞外泌体分泌的设备得到，或者通过上述任意一项所述的一种刺激细胞外泌体分泌的方法制备得到。
本发明还提出上述的一种细胞外泌体作为药物载体的应用。
本发明还提出一种药物组合物，包括上述的一种细胞外泌体和包裹在所述细胞外泌体内的药物。
可选地，所述药物包括核酸分子。所述药物还可以为蛋白分子。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1.1制备叉指换能器
为了获得较大的机电耦合系数，选用128°YX双面抛光的铌酸锂作为压电基底，在铌酸锂压电基底上镀上叉指电极制作得到叉指换能器，具体的制作步骤如下。
涂胶：在完全清洗干净的铌酸锂压电基底的表面，将正光刻胶AZ5214以3000rpm旋涂30s，然后将压电基底放置在65℃加热板上烘烤3min。利用台阶仪对光刻胶的厚度进行测量，光刻胶的厚度大概为1.5μm。
曝光和显影：然后将制作好的菲林覆盖在上面涂胶后的压电基底上面进行曝光，有图案部分不透光，无图案部分透光，有光透过的部分会固化，在采用mif300进行显影的时候固化部分被溶解，非固化部分不会被溶解，从而菲林图形生成在压电基底上。
磁控溅射：对已完成图形制作的压电基底进行磁控溅射，使其生长厚度约为200nm的金属层。
去胶：将生长金属层的压电基底放在丙酮溶液中，利用超声清洗机的超声波震动进行剥离操作，去掉光刻胶，同时光刻胶上的金属层一同剥离，剩下压电基底上的金属层，完成叉指换能器的制作。
1.2制作PDMS腔道
为了吸收声表面波的机械效应和热效应，需要制作超声刺激过程中细胞的存放器。
(1)PDMS的A胶与B胶的质量比为10：1，倒置于烧杯中，进行搅拌，将混合液体倒入A玻璃皿中。A胶的成分是poly(dimethyl-methylvinylsiloxane)预聚物，还有微量铂催化剂，B胶的成分是带乙烯基侧链的预聚物及交联剂poly(dimethyl-methylhydrogenosiloxane)。通过混合两者，乙烯基可与硅氢键发生氢化硅烷化反应，从而形成三维网络结构。
(2)从A玻璃皿中倒出12g混合液体在B玻璃皿上，做PDMS腔道的上半部分原料。
(3)从A玻璃皿中倒出5g混合液体在C玻璃皿上，做PDMS腔道的下半部分原料。
(4)将B和C玻璃皿放入真空机，用真空机抽30分钟，去掉混合液体内的气泡。
(5)从真空机中取出后，用除尘罐将混合液体表面未被去除的气泡吹破去除。
(6)将B和C玻璃皿放在平衡台上静置半个小时，使混合液体在玻璃皿内分布均匀，保持同一高度。
(7)再用水平电磁台80摄氏度加热十分钟，用玻璃棒确认凝固后，再放到烘箱里80摄氏度加热45分钟，使B和C玻璃皿的PDMS彻底凝固成型，其中，C玻璃皿的PDMS固体厚度为0.5mm。
(8)用手术刀将制成的PDMS固体从B玻璃皿剥离，然后用直径4mm的打孔器打孔，制作得到PDMS腔道的上半部分，形成开放腔道；用手术刀将制成的PDMS固体从C玻璃皿剥离，得到PDMS腔道的下半部分。
(9)将制作好的PDMS腔道的上半部分和下半部分同时放入等离子清洗仪，进行等离子处理，等离子处理的功率为150W，持续时间70s，然后将PDMS腔道的上半部分和下半部分贴合在一起。
(10)将烘烤后贴合在一起的PDMS固体依据开放腔道的位置切成0.5cm x0.5cm的方形，从而得到腔道为圆形、外形为方形的PDMS腔道。
(11)将PDMS腔道放入装满75％的酒精的培养皿浸泡30分钟。
(12)将浸泡后的腔道用烘箱烘烤去除残余酒精。
(13)将烘烤后的腔道放入无菌台中照射紫外杀菌30分钟。
1.3细胞培养
选用人类癌细胞系MCF-7细胞作为培养细胞，采用含有百分之十胎牛血清的无外泌体培养基培养，用胰酶将细胞从培养皿上消化下来，通过细胞计数器将细胞密度控制在2.0x105个/ml，并吸取7ul细胞液体加入步骤1.2制作得到的PDMS腔道内，将加入细胞的PDMS腔道放入37℃培养箱培养12h，使得细胞完全贴壁于PDMS腔道底部。
1.4声热刺激
(1)通过网络分析仪测量步骤1.1制作得到的叉指换能器的共振频率和能量衰减。
(2)选择最小衰减的频率作为信号发生器的输入频率，由于信号发生器的幅值与声表面波的热效应具有正相关的关系，通过实验测定选择0.9V，1.0V，1.2V的电压作为信号发生器的输入电压
(3)将步骤1.1制作得到的叉指换能器通过紫外固化胶固定在PCB(印制电路板)上，使其与信号发生器和功率放大器电路连接。
(4)用两个2w的功率放大器，其中输入端接信号发生器和直流电源，输出端接PCB板上的转换头，信号发生器输入信号频率为22.15Mhz，信号幅值为1.0Vpp。
(5)将步骤1.3的种好细胞的PDMS腔道紧密贴合在叉指换能器上，声表面波信号刺激4s之后缓冲10s为一个周期，一共进行了五个周期的刺激，PDMS腔道内液体温度上升到47℃。
(6)超声刺激前，PDMS腔道中加入含钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)染料的液体，超声刺激过程中实时观察荧光变化情况，检测细胞存活情况和穿孔情况。
1.5外泌体的收集
将声表面信号刺激后的细胞培养48h，收集细胞培养上清，通过连续离心和超高速离心方法收集外泌体，。具体步骤为：细胞培养上清液400g离心30分钟，2000g离心10分钟，以清除细胞碎片。随后，10000g离心30min以去除凋亡小体。最后，通过转速为100000g超高速离心法离心2h，得到实施例1的外泌体。并最终用Nanosight(纳米粒子追踪技术)测试外泌体粒子数目和粒径分布，以及通过透射电子显微镜观察外泌体的完整性，还通过Bradford法，测定外泌体蛋白浓度。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于信号发生器输入信号的信号幅值为0.9Vpp，声表面波信号刺激PDMS腔道内液体温度升高至42℃，其他实验过程与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于信号发生器输入信号的信号幅值为1.2Vpp，声表面波信号刺激PDMS腔道内液体温度升高到52℃，其他实验过程与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例1、对比例1和对比例2的信号发生器输入不同的信号幅值，PDMS腔道内液体温度升高情况随超声刺激时间变化曲线如图3所示，根据图3可知，在输入频率一定时，信号发生器输入的信号幅值越大，温度变化越快。
对比例3
对比例3的外泌体制备过程没有使用声表面波信号刺激，作为对照组。
实验结果及分析
1、细胞存活率和穿孔率
实施例1至对比例2的声表面波信号刺激后的细胞以及对比例3的细胞的穿孔情况结果如图4a和图4b所示，其中，图4a为实施例1和各对比例的细胞的PI染色荧光结果图，图4b为量化的细胞穿孔率结果图，其中对照组为对比例3，0.9V组为对比例1，1.0V组为实施例1，1.2V组为对比例2，根据图4a和图4b可知，不进行声表面波信号刺激，细胞几乎不会发生穿孔现象，使用0.9V刺激，温度只达到42℃时，细胞的穿孔率较低，使用1.0V刺激，温度达到47℃时，以及使用1.2V刺激，温度达到52℃时，细胞的穿孔率大大提高。
实施例1至对比例2的声表面波信号刺激后的细胞以及对比例3的细胞的存活情况结果如图5a和图5b所示，其中，图5a为实施例1和各对比例的细胞的Calcein-AM染色荧光结果图，图5b为量化的细胞存活率结果图，其中对照组为对比例3，0.9V组为对比例1，1.0V组为实施例1，1.2V组为对比例2，根据图5a和图5b可知，不进行声表面波信号刺激以及使用0.9V刺激，温度只达到42℃时，细胞的存活率很高，使用1.0V刺激，温度达到47℃时，细胞的存活率也能达到较高的水平，但是使用1.2V刺激，温度达到52℃时，细胞的存活率大大降低。
根据上述结果可知，对比例1的细胞在使用0.9V刺激温度只达到42℃后，细胞活性良好，但是细胞膜不穿孔；对比例2的细胞在使用1.2V刺激温度达到52℃后，细胞存活率几乎为零。；只有实施例1的细胞在使用1.0V刺激温度达到47℃之后存活率好，且细胞穿孔效果好。
2、外泌体性质
图6为实施例1至对比例2的声表面波信号刺激后的细胞以及对比例3的细胞分泌得到的外泌体数量结果图，根据图6可知，相对于对照组，只有实施例1的细胞在使用1.0V刺激温度达到47℃之后分泌得到的外泌体数量显著升高。
图7为实施例1和对比例1的声表面波信号刺激后的细胞以及对比例3的细胞分泌得到的外泌体的蛋白浓度倍数结果图，根据图7可知，实施例1的细胞在使用1.0V刺激，温度达到47℃之后分泌得到的外泌体蛋白浓度相对于对照组大大升高。
外泌体的蛋白浓度倍数测量方法为：通过标准蛋白样品，制备横坐标为蛋白浓度，纵坐标为样品紫外吸光度值线性关系的标准曲线。把收集的外泌体蛋白样品进行稀释，用紫外分光光度计测试样品紫外吸光度值，进而根据标准曲线方程计算得出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为外泌体最终蛋白浓度，蛋白浓度越高可以证明外泌体的量越多。
实施例1得到的外泌体使用纳米粒子追踪技术测得的粒子数目和粒径分布如图8所示，结果与外泌体的粒径范围大致相同，证明实施例1获取的上清液中存在大量的外泌体。
实施例1得到的外泌体的透射电子显微镜的结果如图9所示，从图9可知，本发明技术方案声表面波刺激细胞后得到的外泌体结构完整，可以作为药物载体发挥治疗功能。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种刺激细胞外泌体分泌的设备，其特征在于，包括：
信号发生器，用于输出电信号；
叉指换能器，用于将所述电信号转换为声表面波信号；
存放器，用于存放待刺激的细胞，具有接收超声热效应和机械效应的特性，所述存放器与所述叉指换能器贴合，所述声表面波信号对所述待刺激的细胞进行超声刺激，所述存放器包括聚二甲基硅氧烷PDMS腔道，所述PDMS腔道具有声阻抗大的特性且能紧密贴合在所述叉指换能器的压电基底上，形成声表面波芯片，所述PDMS腔道与所述叉指换能器贴合的底面厚度为0.4mm-0.8mm；
热成像仪，用于监控所述声表面波信号对所述待刺激的细胞进行超声刺激后的升温过程;
功率放大器，用于对所述电信号进行功率放大，并将放大后的电信号传输到所述叉指换能器。
2.如权利要求1所述的一种刺激细胞外泌体分泌的设备，其特征在于，还包括：直流电源，为所述功率放大器供电。
3.一种基于权利要求1所述的刺激细胞外泌体分泌的设备刺激细胞外泌体分泌的方法，其特征在于，包括：
制备叉指换能器：通过MEMS制造工艺在压电基底上镀叉指电极得到叉指换能器；
制作聚二甲基硅氧烷PDMS腔道：设计PDMS腔道的结构，使用光刻的方法方法制作出腔道副本，再通过倒胶、烘干固化、打孔步骤制作出PDMS腔道；
细胞培养：通过用无外泌体血清配制的培养基对细胞进行培养，并种在所述PDMS腔道内进行培养，所述PDMS腔道内的细胞培养液体积为5-15μL，所述PDMS腔道内的细胞密度为1.0-3.0×105个/mL；
声表面波刺激细胞：将种好细胞的PDMS腔道贴合在所述叉指换能器的压电基底上，通过信号发生器向所述叉指换能器输入电信号，叉指换能器将所述电信号转换为声表面波信号刺激所述PDMS腔道内的细胞，在细胞进行2-5s超声刺激后，缓冲6-12s视为一个周期，通过热成像仪监控所述声表面波信号刺激所述PDMS腔道内的液体温度升高至45-50℃；
外泌体收集：声表面波刺激后的细胞培养，从上清液中收集外泌体。
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