CN113061579A - 一种外泌体及其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种外泌体的制备方法，涉及生物技术领域，包括以下步骤：将人星型胶质细胞置于培养基中培养；利用超声装置对人星型胶质细胞进行循环刺激；将经超声循环刺激后的人星型胶质细胞继续培养后收集细胞培养上清，对细胞培养上清离心处理得到外泌体。还提供上述制备方法获得的外泌体及应用。上述制备方法操作简单、成本较低且可控性强。

Description

一种外泌体及其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’disease，AD)，又叫老年痴呆症，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，该疾病也是最常见的引起痴呆的原因，约占痴呆总数的60-80％。其主要病理特征包括β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)组成的老年斑和过度磷酸化的微管结合蛋白tau组成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)。到目前为止，目前针对阿尔茨海默症的治疗药物仅仅只能在病情发展的特定阶段缓解部分症状，并不能减缓、治愈阿尔茨海默症。因此，发展针对阿尔茨海默症病因的治疗手段，是急需解决的重要问题。
外泌体(exosomes)是由脂质双分子层包裹形成的类圆形膜性小体，是胞外囊泡的一种类型，内含多种蛋白质、RNA、miRNA、生长因子及其受体等。外泌体可以在中枢神经系统和外围循环之间进行传播1。多种神经退行性疾病都有蛋白的异常积累和聚集2，神经元核内体和溶酶体中富余物质的积累，是阿尔茨海默病中导致神经脆弱的重要因素。细胞外囊泡(EVs)(外泌体和微泡)形成内源性转运系统参与生物分子(蛋白质和RNA)在细胞之间交换。这使得EVs具有巨大的药物输送和再生医学应用的潜力。
目前制备外泌体的方法过程复杂，可控性差且成本较高。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本较低且可控性强的外泌体及其制备方法及应用。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：
将人星型胶质细胞置于培养基中培养；
利用超声装置对人星型胶质细胞进行循环刺激；
将经超声循环刺激后的人星型胶质细胞继续培养后收集细胞培养上清,对细胞培养上清离心处理得到外泌体。
在其中一个实施例中，所述循环刺激条件为:超声装置的探头频率为0.5-5MHz，幅值为50-000mV，脉冲重复频率为50-1000Hz，工作周期为10％-70％，超声装置的功率放大器放大5％-45％，循环20-200k次，脉冲间隔为2μs-2s，超声时间为1分钟-10分钟。
在其中一个实施例中，所述培养基为不含外泌体的高糖DMEM。
在其中一个实施例中，将经超声循环刺激后的人星型胶质细胞继续培养24-72小时后收集细胞培养上清。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是提供上述制备方法获得的外泌体。
在其中一个实施例中，所述外泌体的平均直径约为50nm～150nm。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是将上述制备方法制备得到的外泌体在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是将上述制备方法制备得到的外泌体在用于降解β-淀粉样蛋白中的应用。
本发明的有益效果是：相对于现有技术，本发明利用医学超声技术，通过不同的强度、频率、脉冲重复频率、脉冲宽度、持续时间使刺激部位的中枢神经细胞和胶质细胞等产生不同的生物效应。星形胶质细胞是中枢神经系统稳定、防御和再生的基础。星形胶质细胞的形态和功能可以通过环境刺激或药物来调节。本发明利用超声波刺激人星型胶质细胞，分离得到的外泌体的制备方法过程简单，操作方便，可控性强，成本低。得到的外泌体可以减缓甚至逆转β-淀粉样蛋白(Aβ)对神经细胞的毒性，在小鼠体内减少Aβ斑块在大脑的沉积，可以应用于新型治疗阿尔茨海默症药物中。
附图说明
图1是一实施方式的未经过超声刺激的星型胶质细胞外泌体的透射电镜图；
图2为超声刺激的星型胶质细胞外泌体示意图；
图3为一实施方式的未经过超声刺激的星型胶质细胞外泌体的纳米颗粒追踪分析(NTA)结果示意图；
图4为一实施方式的超声刺激的星型胶质细胞外泌体的纳米颗粒追踪分析(NTA)结果示意图；
图5为一实施方式的未经过超声刺激的星型胶质细胞外泌体和超声刺激的星型胶质细胞外泌体的外泌体的蛋白质组学heatmap图；
图6为一实施方式的超声刺激的星型胶质细胞分泌的外泌体cck-8结果示意图；
图7为一实施方式的超声刺激的星型胶质细胞分泌的外泌体对APP/PSI转基因阿尔茨海默症小鼠的体内治疗作用效果示意图，其中，A图示中采用硫黄素S染色法检测Aβ斑块沉积，绿色为斑块，蓝色为细胞核。B图示中β1-42抗体免疫荧光染色检测Aβ1-42在脑内的分布，绿色为Aβ，蓝色为细胞核；
其他图示解释：HA-EXO表示星型胶质细胞外泌体，US-HA-EXO表示超声刺激的星型胶质细胞外泌体。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：
S110、将人星型胶质细胞置于培养基中培养。
具体地，培养基为不含外泌体的高糖DMEM。在一实施方式中，将人星型胶质细胞(HA)细胞培养在细胞培养瓶中，加入不含外泌体的高糖DMEM培养基，等细胞在37°培养箱中培养，24小时后利用超声装置对细胞培养皿进行刺激。总的时间持续5分钟。刺激结束后，在显微镜下观察细胞形态，细胞形态良好，与未刺激细胞无差异。
S120、利用超声装置对人星型胶质细胞进行循环刺激；
具体地，在一实施方式中，循环刺激条件为:超声装置的探头频率为0.5-5MHz，幅值为50-000mV，脉冲重复频率为50-1000Hz，工作周期为10％-70％，超声装置的功率放大器放大5％-45％，循环20-200k次，脉冲间隔为2μs-2s，超声时间为1分钟-10分钟。循环超声可以自主调节多个超声参数，有助于超声参数的多样化及对细胞的精确刺激。
S130、将经超声循环刺激后的人星型胶质细胞继续培养后收集细胞培养上清，对细胞培养上清离心处理得到外泌体。
上述制备方法制备得到的外泌体。
在其中一个实施例中，所述外泌体的平均直径约为50nm～150nm，且呈现典型的外泌体粒径分布情况。
上述制备方法制备得到的外泌体在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
上述制备方法制备得到的外泌体在用于降解β-淀粉样蛋白中的应用。
实施例
将人星型胶质细胞(HA)细胞培养在细胞培养瓶中，加入不含外泌体的高糖DMEM培养基，等细胞在37°培养箱中培养，24小时后利用超声装置对细胞培养皿进行刺激。总的时间持续5分钟。HA细胞经超声刺激后继续置于37°培养箱继续培养，24小时，48小时，72小时后，收集细胞培养上清。对细胞培养上清进行一系列离心处理，400g，离心15分钟，2000g，离心30分钟，10000g离心60分钟，100000g离心90分钟，获得的沉淀即为外泌体。参阅图1和图2，图1为未经过超声刺激的星型胶质细胞外泌体的透射电镜图；图2为超声刺激的星型胶质细胞外泌体示意图。
结合图3和图4的纳米颗粒追踪分析(NTA)结果如下，结果显示外泌体粒径，US-HA-EXO的平均直径约为133.1±1.2nm，HA-EXO的平均直径约为132.3±1.5nm。
结合图5中外泌体的iTRAQ定量蛋白质组学结果可知，超声刺激后星型胶质细胞分泌的外泌体，与未超声组分泌的外泌体相比较，外泌体中与蛋白酶体功能相关的蛋白含量增加，有助于外泌体降解异常折叠蛋白功能的发挥。
在Aβ1-42(10μmol/L)加入SH-SY5Y细胞48小时后，更换新鲜无血清培养基，加入US-HA-EXO孵育24小时后，CCK-8测定SH-SY5Y细胞的增殖活性。结果如图6所示，显示超声刺激的星型胶质细胞分泌的外泌体可以逆转Aβ1-42对SH-SY5Y细胞的毒性。
为了验证US-HA-EXO对APP/PSI转基因阿尔茨海默症小鼠的体内治疗作用。尾静脉注射US-HA-EXO，1周，2周，3周后，分别取小鼠脑组织，固定，脱水，用硫黄素S染色法检测Aβ斑块沉积，利用Aβ1-42抗体免疫荧光染色检测Aβ1-42在脑内的分布，结果显示均显示US-HA-EXO治疗组，有明显的Aβ斑块减少，以及Aβ1-42分布下降。参见图7，图7中A中采用硫黄素S染色法检测Aβ斑块沉积，绿色为斑块，蓝色为细胞核。B中采用Aβ1-42抗体免疫荧光染色检测Aβ1-42在脑内的分布，绿色为Aβ，蓝色为细胞核。
其相对于现有技术，本发明利用医学超声技术，通过不同的强度、频率、脉冲重复频率、脉冲宽度、持续时间使刺激部位的中枢神经细胞和胶质细胞等产生不同的生物效应。星形胶质细胞是中枢神经系统稳定、防御和再生的基础。星形胶质细胞的形态和功能可以通过环境刺激或药物来调节。本发明利用超声波刺激人星型胶质细胞，分离得到的外泌体的制备方法过程简单，操作方便，可控性强，成本低。得到的外泌体可以减缓甚至逆转β-淀粉样蛋白(Aβ)对神经细胞的毒性，在小鼠体内减少Aβ斑块在大脑的沉积，可以应用于新型治疗阿尔茨海默症药物中。
以上仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将人星型胶质细胞置于培养基中培养；
利用超声装置对人星型胶质细胞进行循环刺激；
将经超声循环刺激后的人星型胶质细胞继续培养后收集细胞培养上清，对细胞培养上清离心处理得到外泌体。
2.根据权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，所述循环刺激条件为:超声装置的探头频率为0.5-5MHz，幅值为50-000mV，脉冲重复频率为50-1000Hz，工作周期为10％-70％，超声装置的功率放大器放大5％-45％，循环20-200k次，脉冲间隔为2μs-2s，超声时间为1分钟-10分钟。
3.根据权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养基为不含外泌体的高糖DMEM。
4.根据权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，将经超声循环刺激后的人星型胶质细胞继续培养24-72小时后收集细胞培养上清。
5.权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到的外泌体。
6.根据权利要求5所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体的平均直径约为50nm～150nm。
7.权利要求1-4任一项所述的制备方法或权利要求5或6所述的外泌体在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述的制备方法或权利要求5或6所述的外泌体在用于降解β-淀粉样蛋白中的应用。
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