WO2024117055A1 - 高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途 - Google Patents

高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途 Download PDF

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WO2024117055A1
WO2024117055A1 PCT/JP2023/042274 JP2023042274W WO2024117055A1 WO 2024117055 A1 WO2024117055 A1 WO 2024117055A1 JP 2023042274 W JP2023042274 W JP 2023042274W WO 2024117055 A1 WO2024117055 A1 WO 2024117055A1
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cells
inhibitor
cell
highly proliferative
ectodermal
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PCT/JP2023/042274
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孝広 落谷
和也 滝澤
達也 篠田
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学校法人東京医科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to highly proliferative cells, a method for producing the same, and uses thereof.
  • the object of the present disclosure is to provide highly proliferative cells, methods for producing highly proliferative cells, and uses thereof.
  • a highly proliferative cell derived from an ectodermal cell which has characteristics of an ectodermal cell and shows the following A1 expression behavior: (A1)
  • the relative value (E1/Ec) determined by the expression level ( E1 ) of at least one marker gene selected from the group consisting of GFAP, S100B, Musashi1 , CSPG4, Nestin, and SLC1A3 and the expression level (Ec ) of a control gene satisfies the reference range shown in Table 1 below.
  • a method for producing highly proliferative cells comprising: (i) obtaining highly proliferative cells having enhanced cell proliferation ability compared to the starting ectodermal cells by culturing the starting ectodermal cells in the presence of a small molecule signal transduction pathway inhibitor; A method for producing highly proliferative cells, wherein in (i), the culture period in the presence of the inhibitor is 28 days or less.
  • a method for producing highly proliferative cells comprising: (i) obtaining highly proliferative cells having enhanced cell proliferation ability compared to the starting ectodermal cells by culturing the starting ectodermal cells in the presence of a small molecule signal transduction pathway inhibitor; A method for producing highly proliferative cells, comprising culturing the cells in the presence of the inhibitor until at least one condition selected from the group consisting of condition a1, condition b1, and condition c1 is satisfied in the step (i).
  • the relative value (E1/Ec) determined by the expression level ( E1 ) of at least one marker gene selected from the group consisting of GFAP, S100B, Musashi1 , CSPG4, Nestin, and SLC1A3 and the expression level ( Ec ) of a control gene satisfies the reference range shown in Table 2 below.
  • the number of cells cultured in the presence of the inhibitor is more than 1.0-fold the number of ectodermal cells cultured under the same culture conditions but for the same culture period in the absence of the inhibitor.
  • the expression level of at least one marker gene selected from GFAP, SOX2, Musashi1, and Nestin is 1.0-fold or more compared to that of ectodermal cells cultured under the same culture conditions for the same culture period except in the absence of the inhibitor.
  • a method for producing a cell secretion product derived from highly proliferative cells comprising: (I) obtaining a culture of highly proliferative cells derived from ectodermal cells described in any one of [1] to [5]; or obtaining a culture of highly proliferative cells by carrying out the production method described in any one of [6] to [11]; and (II) separating the cell secretion product secreted from the highly proliferative cells from the culture.
  • a cell secretion product containing at least one of a protein and miRNA The protein is a combination of glycoprotein M6B (Q13491), HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain (P01903), Tweety homolog 1 (Q9H313), fibrillin-2 (P35556), HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain (P01911), and S100 calcium binding protein A8 (P05109);
  • the miRNA is Cell secretions containing combinations of hsa-miR-206 (MIMAT0000462), hsa-miR-204-5p (MIMAT0000265), hsa-miR-128-3p (MIMAT0000424), hsa-miR-363-3p (MIMAT0000707), and hsa-miR-323a-3p (MIMAT0000755).
  • the present disclosure provides highly proliferative cells, a method for producing the same, and uses thereof.
  • FIG. 1 shows the morphology of ectodermal cells after culture in Example 1, and FIG. 1-1 is a 40-times magnified view.
  • FIG. 1 shows the morphology of ectodermal cells after culture in Example 1, and FIG. 1-2 is a 100-times enlarged view.
  • FIG. 2 shows proteins selected by proteome analysis of NHA-YA-derived exosomes in Example 5.
  • FIG. 3 shows proteins selected by proteome analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 5.
  • FIG. 4 shows proteins selected by proteome analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 5.
  • FIG. 5 shows miRNAs selected as Parkinson's disease markers by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 6.
  • FIG. 6 shows miRNAs selected as Alzheimer's disease markers by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 6.
  • FIG. 7 shows miRNAs selected as Alzheimer's disease markers by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 6.
  • FIG. 8 shows miRNAs selected as Alzheimer's disease markers by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 6.
  • FIG. 9 shows miRNAs selected as Alzheimer's disease markers by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 6.
  • FIG. 10 shows miRNAs selected as depression markers by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 6.
  • FIG. 11 shows the morphology of cells in the NHA-YA group according to Example 8, and FIG.
  • the term "cell” is to be interpreted as including at least one cell, unless otherwise specified. Therefore, unless otherwise specified, the cell referred to by the term “cell” is not limited to a single cell, and may be used synonymously with a cell population.
  • cell population is to be interpreted as including at least one type of cell, unless otherwise specified. Therefore, unless otherwise specified, the cells referred to in the term “cell population” are not limited to one type of cell.
  • the "ectoderm” is one of the three germ layers that arise during the development of metazoans.
  • the ectoderm originates from the outer layer of the embryo and develops into the skin, nervous system, sensory organs, etc.
  • skin includes, for example, the epidermis, hair, nails, and skin glands
  • the nervous system includes, for example, the cranial nerves, spinal cord, and peripheral nerves
  • the sensory organs include, for example, the organs of vision, hearing, balance, taste, olfaction, and touch.
  • progenitor cell refers to a cell at a differentiation stage leading up to a mature cell, which is capable of developing from a stem cell and differentiating into a terminally differentiated cell that constitutes the body.
  • small molecule signaling pathway inhibitor may also be referred to simply as “inhibitor.”
  • the "expression level of a gene” may, for example, directly refer to the expression level of the gene itself, or indirectly refer to the expression level of the protein encoded by the gene. Therefore, in this specification, the expression of a gene can be interpreted as, for example, the expression of the protein encoded by the gene.
  • hyperproliferative cells of the present disclosure include first hyperproliferative cells and second hyperproliferative cells.
  • the first highly proliferative cells of the present disclosure are, as described above, highly proliferative cells derived from ectodermal cells that have characteristics of ectodermal cells and show the following A1 expression behavior.
  • A1 In the highly proliferative cells, the relative value (E1/Ec) determined by the expression level ( E1 ) of at least one marker gene selected from the group consisting of GFAP, S100B, Musashi1 , CSPG4, Nestin, and SLC1A3 and the expression level (Ec ) of a control gene satisfies the reference range shown in Table 1 below.
  • the expression level (E 1 ) of the marker gene may be represented, for example, by the expression level of the protein encoded by the marker gene
  • the expression level (E C ) of the control gene may be represented, for example, by the expression level of the protein encoded by the control gene.
  • the relative value (E 1 /E C ) may be the same or different between the case where a marker gene is used and the case where a protein encoded by a marker gene is used.
  • highly proliferating cells are cells with high proliferation potential.
  • Cells with high proliferation potential refer to cells that have, for example, a higher cell proliferation activity and the property of proliferating in a shorter time, i.e., a shorter cell doubling time, the property of proliferating for a longer period of time, or both, compared to control cells.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure are derived from ectodermal cells and exhibit high cell proliferation ability. Therefore, the highly proliferative cells of the present disclosure can be cultured for a long period of time, and the number of cells can be efficiently increased by culturing. Furthermore, the highly proliferative cells of the present disclosure can produce cell secretions, for example, as described below, and therefore, by obtaining a large number of cells, the amount of the cell secretions recovered can be increased.
  • high proliferation ability means, as described above, that the proliferation ability is higher than that of the control cells.
  • the control cells are, for example, ectodermal cells that are not in contact with the small molecule signaling pathway inhibitor.
  • the small molecule signaling pathway inhibitors mentioned in relation to the highly proliferative cells are those described in relation to the production method described below.
  • ectodermal cells not in contact with a small molecule signaling pathway inhibitor refers to, for example, ectodermal cells that have not been treated with the inhibitor, specifically, ectodermal cells that have not been cultured in the presence of the inhibitor.
  • the proliferation ability of the ectodermal cells is enhanced by culturing them in the presence of the inhibitor, for example, as described later in the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure.
  • ectodermal cells not in contact with the inhibitor i.e., ectodermal cells not treated with the inhibitor
  • the highly proliferative cells of the present disclosure can be obtained, for example, by culturing ectodermal cells as a raw material in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure can be obtained by the first or second manufacturing method of the highly proliferative cells of the present disclosure (hereinafter, collectively referred to as the "manufacturing method of the highly proliferative cells of the present disclosure") described below.
  • the ectodermal cells used as a raw material may be referred to as "raw material cells" in this specification.
  • the raw material cells are, for example, ectodermal cells that are not in contact with the inhibitor, that is, the proliferation-uninduced ectodermal cells.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure can be said to have enhanced proliferation ability compared to the raw material cells (the proliferation-uninduced ectodermal cells).
  • the highly proliferative cells of the present disclosure are not limited to those manufactured by the manufacturing method of the highly proliferative cells of the present disclosure, and may be manufactured by other manufacturing methods, as long as they exhibit the characteristics of the highly proliferative cells of the present disclosure shown below.
  • the description of the first or second method for producing the highly proliferative cells of the present disclosure can be used for the highly proliferative cells of the present disclosure.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure for example, the small molecule signaling pathway inhibitor, the ectodermal cells (raw material cells), etc., can be used for the description of the highly proliferative cells of the present disclosure.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may be, for example, a cell population.
  • the cell population may, for example, contain only HP cells, or may contain other cells in addition to HP cells.
  • the other cells may, for example, be cells with a lower proliferation capacity than HP cells, i.e., non-highly proliferating cells (sometimes referred to as "non-HP cells" in this specification).
  • the cell population may, in addition to HP cells, contain, as the other cells, cells whose proliferation capacity is not enhanced compared to the source cells (the ectodermal cells not induced to proliferate) and whose proliferation capacity is the same as that of the source cells.
  • the proportion of HP cells in the cell population may, for example, be 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more based on the cell number.
  • the characteristics of the highly proliferative cells of the present disclosure can be expressed by the relative value of the expression level (E 1 ) of a marker gene relative to the expression level (E C ) of a control gene.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may be characterized as long as the relative value (E 1 /E C ) of at least one marker gene selected from the group consisting of GFAP, S100B, Musashi1, CSPG4, Nestin, and SLC1A3 satisfies the reference range in Table 1.
  • CSPG4 is also referred to as NG2.
  • the marker genes that satisfy the reference range in Table 1 may be, for example, two or more types, three or more types, four or more types, five or more types, or all of them.
  • the reference range of the relative value ( E1 / Ec ) of each marker gene can be set, for example, based on the following criteria:
  • the number of days of culture (more than 28 days or less than 28 days) in (1) or (2) below means the number of days of culture of the source cells (the ectodermal cells) in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor. (1) excluding the range in which the marker gene is expressed in culture for more than 28 days; and (2) the range in which the marker gene is expressed in culture for 28 days or less. However, it is not necessary that the range in which the marker gene is expressed in culture for more than 28 days be excluded throughout the entire period of culture of 28 days or less.
  • At least the relative value (E 1 /E C ) of the marker gene GFAP preferably falls within the reference range of Table 1.
  • a combination of marker genes that falls within the reference range of Table 1 is, for example, A combination of GFAP and CSPG4, A combination of GFAP, Musashi1, CSPG4, and SLC1A3; A combination of GFAP, Musashi1, Nestin, CSPG4, and SLC1A3; A combination of GFAP, Musashi1 and CSPG4, a combination of GFAP, Nestin, CSPG4 and SLC1A3, or An example is a combination of GFAP, Musashi1, Nestin, S100B, CSPG4, and SLC1A3.
  • the reference range for SLC1A3 is >0.09, and preferably >0.090.
  • the reference range for CSPG4 is ⁇ 0.015, and preferably ⁇ 0.0150.
  • the expression behavior of A1 may further include OLIG2 as the marker gene, and the relative value ( E1 / Ec ) with respect to the control gene may satisfy the reference range of " ⁇ 0.0001", and the reference range is preferably " ⁇ 0.00010".
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may be, for example, such that the relative value ( E1 / Ec ) of at least one of the marker genes satisfies the reference range of A1, and the relative value ( E1 / Ec ) of at least one of the marker genes satisfies the lower and upper limits of the range in Table 3 below.
  • the control gene is preferably a gene that is constitutively expressed regardless of the type of cell, and examples thereof include beta-actin (ACTB) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).
  • ACTB beta-actin
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the control gene in Table 1 is, for example, GAPDH or ACTB, and preferably GAPDH.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure are, for example, cells that exhibit high undifferentiation.
  • a high degree of undifferentiation means, for example, a higher degree of undifferentiation compared to the control cells.
  • the control cells are, for example, ectodermal cells that have not been contacted with the small molecule signaling pathway inhibitor, as described above, that is, the ectodermal cells that have not been induced to proliferate.
  • the term "highly proliferative cells” encompasses the meaning of highly proliferative cells with high undifferentiation.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure can be identified as cells with high undifferentiation, for example, by the expression behavior of markers related to undifferentiation.
  • the markers may be, for example, gene markers or protein markers encoded by the gene markers.
  • undifferentiated means, for example, having the characteristics of a cell at the final stage of differentiation, in other words, an intermediate stage leading up to a stage at which no further differentiation occurs.
  • undifferentiated may mean, for example, that an undifferentiated state is maintained, and may mean exhibiting undifferentiated properties (e.g., exhibiting properties of a stem cell), or exhibiting properties at a differentiation stage closer to undifferentiation (e.g., exhibiting properties closer to a stem cell).
  • the characteristics of the highly proliferative cells of the present disclosure can be specified as the relative value ( E1 / Ec ) of the expression level of the marker gene relative to the control gene, as described above, and can also be specified by, for example, comparing the same items with the control cells.
  • the items (hereinafter also referred to as specific items) are, for example, cell properties, specifically, for example, the above-mentioned proliferation ability, undifferentiation, marker expression behavior, etc.
  • the markers may be, for example, marker genes or proteins (marker proteins) encoded by the marker genes.
  • the marker genes and the marker proteins are not limited to, for example, the above-mentioned genes and proteins, and may also include markers such as those exemplified below.
  • the highly proliferative cells can be compared with the control cells, for example, by using ectodermal cells that have not been contacted with the small molecule signaling pathway inhibitor (the ectodermal cells that have not been induced to proliferate) as the control cells, and evaluating the results as follows.
  • the highly proliferative cells and the control cells are cultured in the absence of the inhibitor, and the same items are compared.
  • the culture conditions other than the absence of the inhibitor are not particularly limited.
  • the other culture conditions include a seeding density of 4 x 103 cells/ cm2 , a culture temperature of 37°C, and a CO2 concentration of 5%.
  • the culture period (hereinafter also referred to as culture period S) is not particularly limited, and is, for example, 5 to 24 days.
  • the culture period may be, for example, the same period or different periods depending on the items, but is preferably the same period.
  • the medium used for the culture is not particularly limited, and can be one exemplified in the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure described below. In the culture of the highly proliferative cells and the control cells (the ectodermal cells not induced to proliferate), for example, the same medium without the inhibitor can be used.
  • the second aspect of the evaluation involves, for example, comparing the highly proliferative cells obtained by culturing the raw material cells (the ectodermal cells whose proliferation has not been induced) in the presence of the inhibitor for a culture period of 28 days or less (hereinafter also referred to as culture period T) with the control cells (the ectodermal cells whose proliferation has not been induced) cultured in the absence of the inhibitor for the culture period T, for the same items.
  • the culture period T can be, for example, an example of the method for producing highly proliferative cells disclosed below.
  • the culture conditions other than the presence or absence of the inhibitor and the culture period T are not particularly limited.
  • the other culture conditions include a seeding density of 4 x 103 cells/ cm2 , a culture temperature of 37°C, and a CO2 concentration of 5%.
  • the medium used for the culture is not particularly limited, and can be one exemplified in the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure described below.
  • the culture of the raw material cells (the proliferation-uninduced ectodermal cells) in the presence of the inhibitor and the culture of the control cells (the proliferation-uninduced ectodermal cells) in the absence of the inhibitor can be performed using the same medium except for the presence or absence of the inhibitor, and can be performed under the same culture conditions as those applied to the production and maintenance of the highly proliferative cells.
  • the proliferation ability of the highly proliferative cells can be evaluated, for example, by comparison with the cell number of the control cells, as follows.
  • the control cells may be the source cells (the ectodermal cells whose proliferation has not been induced).
  • the highly proliferative cells of the present disclosure exhibit, for example, the following proliferation ability of N1 relative to the control cells, and the control cells are ectodermal cells not in contact with the small molecule signaling pathway inhibitor (the ectodermal cells not induced to proliferate).
  • the culture period is not particularly limited, and may be, for example, the number of days exemplified as the culture period S.
  • N1 When the highly proliferative cells and the control cells are cultured for the same culture period and under the same culture conditions in the absence of the inhibitor, the cell number ( N1 ) of the highly proliferative cells obtained and the cell number ( N1 ') of the control cells obtained satisfy ( N1 / N1 ') > 1.0.
  • the ratio ( N1 / N1 ') of the number of cells of the highly proliferative cells ( N1 ) obtained to the number of cells of the control cells ( N1 ') obtained is, for example, more than 1.0 times as described above, and may be 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, or 1.5 times or more.
  • the ratio ( N1 / N1 ') is preferably 1.5 times or more.
  • the first embodiment of the evaluation can be referred to.
  • the highly proliferative cells and the control cells may be cultured in the absence of the inhibitor for the same culture period and under the same culture conditions.
  • the culture conditions that are further made the same include, for example, the composition of the medium that does not contain the inhibitor, the seeding density, the culture temperature, and the CO2 concentration.
  • the culture period is not particularly limited, and may be the number of days exemplified in the culture period S.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure have, for example, the following N2 proliferation ability relative to the control cells, and the control cells are ectodermal cells that have not been contacted with the inhibitor (the ectodermal cells whose proliferation has not been induced).
  • N2 The cell number (N 2 ) of the highly proliferative cells obtained by culturing the raw cells (the ectodermal cells whose proliferation has not been induced) in the presence of the inhibitor for a culture period T of 28 days or less, and the cell number (N 2 ') of the control cells obtained by culturing the raw cells (the ectodermal cells whose proliferation has not been induced) under the same culture conditions for the culture period T except in the absence of the inhibitor, satisfy (N 2 /N 2 ') > 1.0.
  • the ratio ( N2 / N2 ') of the number of cells of the highly proliferative cells ( N2 ) obtained to the number of cells of the control cells ( N2 ') obtained is, for example, as described above, more than 1.0-fold, and may be 1.1-fold or more, 1.2-fold or more, 1.3-fold or more, 1.4-fold or more, or 1.5-fold or more.
  • the ratio ( N2 / N2 ') is preferably 1.5-fold or more.
  • the second embodiment of the evaluation can be referred to.
  • the upper limit of the culture period T is 28 days or less, for example, 20 days, 18 days, or 14 days
  • the lower limit is, for example, 1 day, 4 days, 5 days, or 7 days
  • the range is, for example, 1 to 28 days, 4 to 28 days, 5 to 28 days, 7 to 28 days, 7 to 20 days, 7 to 18 days, or 7 to 14 days.
  • the raw material cells and the control cells may be cultured under the same culture period T and under the same conditions, except that the former is in the presence of the inhibitor and the latter is in the absence of the inhibitor.
  • the items of the culture conditions that are made the same other than the item of the culture period T include, for example, the composition of the medium (excluding the presence or absence of the inhibitor), the seeding density, the culture temperature, and the CO2 concentration.
  • the raw material cells (the ectodermal cells whose proliferation has not been induced) are cultured under the same conditions for the same period (e.g., 5 to 14 days or 5 to 10 days) except for using the inhibitor-containing medium and the inhibitor-free medium, and the number of cells cultured in the inhibitor-containing medium (i.e., highly proliferative cells) is compared with the number of cells cultured in the inhibitor-free medium (i.e., raw material cells).
  • highly proliferative cells obtained by culturing the raw material cells in the inhibitor-containing medium for 28 days or less and the raw material cells (the ectodermal cells whose proliferation has not been induced) are each cultured in the inhibitor-free medium for the same period (e.g., 5 to 14 days or 5 to 10 days) under the same conditions, and the number of cells in the former is compared with the number of cells in the latter.
  • the highly proliferative cells can be obtained, for example, by culturing the ectodermal cells in the presence of the inhibitor for a culture period of 28 days or less (referred to as "period T" in this specification).
  • the high proliferation ability of the highly proliferative cells thus obtained can be confirmed, for example, as follows.
  • cell number N of highly proliferative cells when the cell number of the highly proliferative cells obtained by the above-mentioned culture (referred to as “cell number N of highly proliferative cells” in this specification) is more than 1.0 times the cell number of the ectodermal cells cultured under the same culture period and the same culture conditions except in the absence of the inhibitor (referred to as “cell number N' of ectodermal cells” in this specification), the cells are evaluated as having high proliferation ability.
  • the cell number N of the highly proliferative cells is not particularly limited as long as it is more than 1.0 times the cell number N' of the ectodermal cells, and may be, for example, 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, or 1.5 times or more the cell number N' of the ectodermal cells.
  • the cell number N of the highly proliferative cells is 1.5 times or more the cell number N' of the ectodermal cells.
  • the highly proliferative cells may be identified by the expression of a cell-specific marker, i.e., a marker (e.g., a gene or protein) specific to the highly proliferative cells, as described above.
  • a marker e.g., a gene or protein
  • the expression of the marker in the highly proliferative cells may be confirmed based on either the marker gene or the marker protein encoded thereby, as described above.
  • the method for confirming the expression of a gene or protein is not particularly limited, and may be, for example, the presence or absence of expression, a specific expression level or a relative expression level depending on the measurement method, or a comparison with the expression level of the same gene or protein in a specific cell other than the highly proliferative cells.
  • the expression of the marker may be expressed as “positive” or “negative”.
  • “positive” means that the expression of the target gene or protein is observed, while “negative” means that the expression of the target gene or protein is not observed or is below the detection limit.
  • “high expression” or “positive”, or “low expression” or “negative” a specific cell different from the highly proliferative cell can be used as a comparison control.
  • the specific cell to be compared i.e., the "control cell” to be compared, is not particularly limited, and may be a cell in which the expression level of the target gene or protein is extremely low (hereinafter also referred to as a low expression cell) or extremely high (hereinafter also referred to as a high expression cell).
  • the low expression cell may be, for example, a cell in which the expression level of the target marker is below the detection limit and cannot be detected.
  • the control cells to be compared with the highly proliferative cells may be, for example, ectodermal cells that are the raw material in the manufacturing method of the present disclosure, i.e., ectodermal cells that have not come into contact with the inhibitor (the ectodermal cells that have not been induced to proliferate).
  • the control cells may also be, for example, mature cells or their precursor cells.
  • the control cells may be, for example, mature ectodermal cells (hereinafter also referred to as mature cells) or precursor cells (hereinafter also referred to as ectodermal precursor cells).
  • the highly proliferative cells of the present disclosure are "positive” with respect to the expression of the marker, it can mean that the expression level of the marker in the highly proliferative cells is 1.0 times or more the expression level of the marker in ectodermal cells not in contact with the inhibitor (the ectodermal cells not induced to proliferate).
  • the highly proliferative cells are "negative” with respect to the expression of the marker, it can mean that the expression level of the marker in the highly proliferative cells is less than 1.0 times the expression level of the marker in ectodermal cells not in contact with the inhibitor (the ectodermal cells not induced to proliferate).
  • the same or more means that the expression level is 1.0 times or more the expression level in the control cells being compared, unless otherwise specified.
  • the highly proliferative cells are identified by comparing the expression of the marker with ectodermal cells not in contact with the inhibitor (ectodermal cells not induced to proliferate) as the control cells, the comparison can be performed, for example, by the first or second aspect of the evaluation described above.
  • the highly proliferative cells and the control cells may be cultured, for example, in the absence of the inhibitor, under the same conditions for the same culture period S, and the expression of the marker to be evaluated may be compared.
  • Other culture condition items that are made the same besides the inhibitor include, for example, medium composition, seeding density, culture temperature, CO2 concentration, etc.
  • the source cells (the ectodermal cells not induced to proliferate) and the control cells (the ectodermal cells not induced to proliferate) are cultured for the same culture period T under the same conditions, except that the former is cultured in the presence of the inhibitor and the latter is cultured in the absence of the inhibitor, and the expression of the marker to be used as an evaluation item is compared.
  • Items of the culture conditions that are made the same other than the culture period T include, for example, the composition of the medium (excluding the presence or absence of the inhibitor), the seeding density, the culture temperature, and the CO2 concentration.
  • the culture conditions of the highly proliferative cells and ectodermal cells subjected to the method for confirming the expression level can be the same, except for whether they are in contact with the inhibitor or not.
  • the culture conditions can be adjusted, for example, based on the state, proliferation, and cell number of the cells, so that the target cells are in the same or very similar state, such as the culture period, cell passage number, and cell density, and those skilled in the art can select the conditions based on the state of the cells.
  • the expression level of the marker is expressed, for example, as the expression level relative to the control, i.e., the relative value (E 1 /E C ) of the expression level of the marker (E 1 ) to the expression level of the control (E C ).
  • the control is, for example, a gene or a protein, and specifically, when the marker is a marker gene, it is a gene, and when the marker is a marker protein, it is a protein.
  • the control is preferably, for example, a gene or a protein that is constitutively expressed regardless of the type of cell.
  • As the control gene for example, ACTB and GAPDH can be used as described above, and as the control protein, for example, ACTB protein and GAPDH protein can be used.
  • Markers relating to undifferentiation include, for example, SOX2, Nestin, CSPG4, Musashi1 (MSI1), Notch1, PAX6, etc. Based on the expression behavior of these undifferentiation markers, for example, the undifferentiation of cells can be evaluated by whether the expression is positive or not, and whether the expression amount is relatively high or not.
  • the undifferentiation marker being positive means, for example, that the expression amount is 1.0 times or more compared to the expression amount in ectodermal cells that have not been contacted with the inhibitor (the ectodermal cells that have not been induced to proliferate).
  • the highly proliferative cells of the present disclosure are positive for at least one marker gene selected from the group consisting of, for example, SOX2, Nestin, CSPG4, Musashi1 (MSI1), Notch1, and PAX6.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may be positive for two or more of, for example, SOX2, Nestin, CSPG4, Musashi1, Notch1, and PAX6, or may be positive for all of them.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may, for example, comprise at least one cell selected from the group consisting of the following (1) to (6) with respect to the undifferentiated marker.
  • positive means, as described above, for example, that the expression level is the same or higher, specifically, 1.0-fold or higher, as compared to the expression level in ectodermal cells not contacted with the inhibitor (the ectodermal cells not induced to proliferate).
  • SOX2-positive cells preferably SOX2-positive cells which are further positive for at least one selected from the group consisting of Musashi1, Nestin, Notch1, and S100B, and negative for CSPG4.
  • Musashi1-positive cells preferably Musashi1-positive cells which are further positive for at least one selected from the group consisting of SOX2, Nestin, Notch1, and S100B, and negative for CSPG4.
  • Nestin-positive cells preferably Nestin-positive cells which are further positive for at least one selected from the group consisting of SOX2, Musashi1, Notch1, and S100B, and negative for CSPG4.
  • Notch1 positive cells preferably Notch1 positive cells which are further positive for at least one selected from the group consisting of SOX2, Musashi1, Nestin, and S100B, and negative for CSPG4.
  • S100B positive cells preferably S100B positive cells which are further positive for at least one selected from the group consisting of SOX2, Musashi1, Nestin, and Notch1, and negative for CSPG4.
  • CSPG4 negative cells which are positive for at least one selected from the group consisting of SOX2, Musashi1, Nestin, Notch1, and S100B, and negative for CSPG4.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may be any cells that are derived from ectodermal cells and have high proliferation potential, regardless of their differentiation stage.
  • the differentiation stage of the highly proliferative cells of the present disclosure can be identified, for example, by detecting a marker specific to progenitor cells, a marker specific to mature cells, or a marker specific to the differentiation stage from progenitor cells to mature cells.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure are, for example, cells at an immature differentiation stage.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure are highly proliferative and at an immature differentiation stage, they can be referred to as, for example, highly proliferative ectodermal progenitor cells, and hereinafter may be referred to as "highly proliferative ectodermal progenitor cells or highly proliferative progenitor cells.”
  • “highly proliferative cells” includes highly proliferative progenitor cells unless otherwise specified.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure can express, for example, at least one marker characteristic of a mature cell to the same or greater extent than ectodermal cells not in contact with the inhibitor (the ectodermal cells not induced to proliferate), and can express at least one marker characteristic of a progenitor cell to the same or greater extent than ectodermal cells not in contact with the inhibitor (the ectodermal cells not induced to proliferate).
  • Marker genes specific to mature cells include, for example, GFAP, S100B, and SLC1A3. These are genes that are relatively highly expressed in glial cells, which are classified as ectodermal cells, specifically, astrocytes. These genes and the proteins they encode are known as markers that indicate that mature cells, including ectodermal mature cells, are mature cells.
  • Marker genes specific to progenitor cells include, for example, CSPG4, Notch1, Nestin, and SOX2. These are genes that are relatively highly expressed in, for example, oligodendrocyte precursor cells, neuroepithelial cells, and radial glial cells. These genes and the proteins they encode are known as markers that indicate that progenitor cells, including ectodermal precursor cells, are progenitor cells.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may be cells that have high proliferation ability and exhibit the expression behavior of the A1, as described above, and may be cells that exhibit any expression pattern for other markers (genes or proteins), or may be a cell population that includes the highly proliferative cells.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may, for example, exhibit the expression patterns of the markers listed below.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may also be rapidly identified and extracted, for example, according to the expression patterns of the markers listed below.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may include, for example, cells that are positive for GFAP.
  • the highly proliferative cells may, for example, express GFAP to the same extent or greater than the control cells (the ectodermal cells not induced to proliferate).
  • the lower limit of the expression level of GFAP relative to the control cells is, for example, 1.0-fold or more, 4.0-fold or more, and the upper limit is, for example, 200-fold or less.
  • the highly proliferative cells may include, for example, cells that are GFAP positive and CSPG4 negative, or cells that express GFAP at the same or higher levels as the control cells (the ectodermal cells not induced to proliferate) and have a lower CSPG4 expression level (less than 1.0-fold) than the control cells.
  • the highly proliferative cells may include cells that are GFAP and S100B positive and CSPG4 negative, or cells that express GFAP and S100B at the same or higher levels as the control cells and have a lower CSPG4 expression level (less than 1.0-fold) than the control cells.
  • the highly proliferative cells can include cells that express at least one gene specific to the mature ectodermal cells to the same or greater extent than the control cells (ectodermal cells not in contact with the inhibitor) and that express at least one gene specific to the ectodermal progenitor cells to the same or greater extent than the control cells.
  • the highly proliferative cells may include, for example, cells that are negative for CSPG4, or cells that express CSPG4 at a level lower than the level of CSPG4 expression in the control cells (ectodermal cells not in contact with the inhibitor). That is, in this embodiment, the highly proliferative cells may, for example, express CSPG4 at a level lower than the level of CSPG4 expression in the control cells.
  • the hyperproliferative cells can include, for example, cells that are positive for S100B and negative for CSPG4, or can express S100B to the same or greater extent than the control cells (ectodermal cells not contacted with the inhibitor) and express CSPG4 to a lesser extent than the control cells.
  • the highly proliferative cells disclosed herein may be highly proliferative cells having high proliferation potential, particularly highly proliferative ectodermal cells, regardless of their differentiation stage, as described above.
  • the cell population of highly proliferative cells may be, for example, a heterogeneous cell population containing both the highly proliferative mature ectodermal cells and the highly proliferative ectodermal precursor cells, or may be a cell population in which a large majority of multiple types of highly proliferative ectodermal cells at relatively similar differentiation stages are present.
  • the cell population of highly proliferative cells of the present disclosure may be, for example, a population containing the highly proliferative ectodermal progenitor cells as a major component, or may be a population containing both the highly proliferative ectodermal progenitor cells and the highly proliferative ectodermal mature cells.
  • the "major component" in a cell population means, for example, cells that account for at least 50% of the cell population in terms of cell number.
  • the "vast majority” means, for example, that the cell number of a particular cell in a cell population is 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more in terms of cell number.
  • the proportion of the highly proliferative ectodermal mature cells in the cell population of highly proliferative cells may be, for example, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 10%, or less than 5% based on cell number.
  • the cell population of highly proliferative cells may include, for example, cells of an ectodermal cell lineage associated with astrocytes. That is, the highly proliferative cells may be, for example, cells that use astrocytes as the raw ectodermal cells, in other words, cells that are induced from astrocytes, and when produced by the production method disclosed herein, may include cells of an ectodermal cell lineage associated with astrocytes. Examples of cells of the ectodermal cell lineage associated with astrocytes include astrocytes, radial glial cells, oligodendrocyte precursor cells (also called polydendrocytes), oligodendrocytes, and neuroepithelial cells.
  • the cell population containing cells of the ectodermal cell lineage associated with astrocytes may include, for example, cells that have some of the characteristics seen in ectodermal cells and cannot be classified into any of the above-mentioned cells, so long as it is a cell population that exhibits high proliferation ability.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may include, for example, cells that exhibit characteristics of a more immature differentiation stage than astrocytes.
  • ectodermal cells at an immature differentiation stage can also have the following characteristics (a), (b), (c), or (d).
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may include, for example, cells positive for at least one selected from the group consisting of GFAP, S100B, Notch1, Nestin, and SOX2.
  • the highly proliferative cells may include, for example, at least one selected from the group consisting of the following cells (I) to (V).
  • a positive cell may also be interpreted as a cell that expresses a marker gene at the same or higher level (for example, 1.0-fold or higher) than an ectodermal cell not in contact with the inhibitor.
  • the "ectodermal cells not in contact with the inhibitor” may be, for example, the "raw ectodermal cells”.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may include cells that are positive for at least one selected from the group consisting of GFAP and S100B, positive for at least one selected from Musashi1, Notch1, Nestin, and SOX2, and negative for CSPG4. That is, in this embodiment, the cells of (I) to (V) above are, for example, negative for CSPG4.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may be, for example, positive for SLC1A3, a marker for astrocytes. That is, in this embodiment, the cells of (I) to (V) above are, for example, further positive for SLC1A3.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure may be, for example, negative for OLIG2, a marker for oligodendrocytes. That is, in this embodiment, the cells of (I) to (V) above are, for example, further negative for OLIG2.
  • the percentage of GFAP-positive cells is, for example, 10% or more, preferably 40% or more, 80% or more; the percentage of Musashi1-positive cells is, for example, 10% or more, preferably 40% or more, 80% or more; the percentage of SOX2-positive cells is, for example, 10% or more, 10% or more but less than 80%, preferably 40% or more, 40% to less than 80%; and the percentage of Nestin-positive cells is, for example, 10% or more, 10% or more but less than 80%, preferably 40% or more, 40% or more but less than 80%.
  • Musashi1-positive cells may be, for example, SOX2-positive or Nestin-positive
  • SOX2-positive cells may be, for example, Musashi1-positive or Nestin-positive
  • SOX2-positive cells may be, for example, Musashi1-positive or Nestin-positive.
  • the second highly proliferative cell of the present disclosure is a highly proliferative cell that has characteristics of an ectodermal cell, and the number of cells after a culture period of 28 days or less in which the ectodermal cell has been contacted with the small molecule signaling pathway inhibitor is more than 1.0-fold the number of cells of the ectodermal cell cultured under the same culture conditions for the same culture period except for not being contacted with the inhibitor.
  • the second highly proliferative cells of the present disclosure can be obtained, for example, by the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure, similar to the first highly proliferative cells described above. That is, for example, the highly proliferative cells of the present disclosure can be obtained by culturing ectodermal cells (the raw material cells) for 28 days or less in contact with the small molecule signaling pathway inhibitor.
  • the highly proliferative cells obtained by culturing for 28 days or less in the presence of the inhibitor have a proliferation ability of more than 1.0 times the number of cells of ectodermal cells cultured under the same culture conditions for the same culture period except for not coming into contact with the inhibitor.
  • the second highly proliferative cells of the present disclosure include, for example, cells in which the expression level of at least one marker gene selected from GFAP, SOX2, Musashi1, and Nestin is 1.0 times or more that of ectodermal cells cultured under the same culture conditions for the same culture period, except that the cells are not in contact with the inhibitor.
  • the first method for producing highly proliferative cells of the present disclosure is a method for producing highly proliferative cells, comprising: (i) culturing starting ectodermal cells in the presence of a small molecule signaling pathway inhibitor to obtain highly proliferative cells having enhanced cell proliferation ability compared to the starting ectodermal cells; In the above (i), the culture period in the presence of the inhibitor is 28 days or less.
  • highly proliferative cells having enhanced cell proliferation ability compared to the raw material ectodermal cells can be obtained by culturing in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor of (i).
  • the highly proliferative cells of the present disclosure described in ⁇ 1> above can be produced. Note that the description of the manufacturing method of the present disclosure does not limit the method for producing the highly proliferative cells of the present disclosure described in ⁇ 1> above.
  • the method for producing highly proliferative cells disclosed herein can also be interpreted as, for example, a method for producing highly proliferative ectodermal cells, or a method for enriching ectodermal cells with enhanced cell proliferation ability.
  • the manufacturing method disclosed herein by culturing the raw material ectodermal cells in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor for a culture period of 28 days or less, it is possible to obtain highly proliferative cells with enhanced cell proliferation ability, for example, without gene introduction or genetic modification into the ectodermal cells.
  • the highly proliferative cells thus obtained can be cultured for a longer period of time, for example, and a greater number of cells can be obtained, compared to ectodermal cells cultured in the absence of the inhibitor.
  • the production method of the present disclosure by culturing in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor of (i), it is possible to obtain highly proliferative cells that have, for example, enhanced cell proliferation ability and exhibit properties of being more undifferentiated than the raw material ectodermal cells. For this reason, the production method of highly proliferative cells of the present disclosure can also be interpreted as, for example, a method for producing highly proliferative cells that are highly undifferentiated. Furthermore, in the present disclosure, "highly proliferative cells” includes highly undifferentiated highly proliferative cells, unless otherwise specified.
  • highly proliferative cells by culturing in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor of (i), for example, highly proliferative cells can be obtained that have enhanced cell proliferation ability compared to the raw ectodermal cells and exhibit characteristics of an immature differentiation stage.
  • highly proliferative cells that exhibit high proliferation and are at an immature differentiation stage are, for example, the highly proliferative ectodermal progenitor cells (highly proliferative progenitor cells) exemplified in ⁇ 1> above.
  • the production method of highly proliferative cells of the present disclosure can also be interpreted as, for example, a production method of highly proliferative progenitor cells.
  • "highly proliferative cells” includes highly proliferative progenitor cells unless otherwise specified.
  • the ectodermal cells used in the present disclosure may include, for example, cells of the nervous system, and may specifically include, for example, cells of the central nervous system, cells of the peripheral nervous system, or cells of the central nervous system and cells of the peripheral nervous system.
  • the ectodermal cells may include, for example, cells of the central nervous system.
  • the ectodermal cells may include, for example, glial cells, and may specifically include, as described below, astrocytes.
  • the ectodermal cells used in the present disclosure may be provided from any source, for example, from a mammal.
  • mammals include humans and non-human animals.
  • non-human animals include rats, mice, cats, dogs, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, and monkeys.
  • the mammal is preferably a human, rat, mouse, cat, or dog, and more preferably a human, rat, or mouse.
  • the ectodermal cells used in the present disclosure are, for example, cells that constitute ectodermal tissues and ectodermal organs.
  • ectodermal tissues and ectodermal organs include the central nervous system (e.g., the central nervous system of the brain or the central nervous system of the spinal cord), the pituitary gland, peripheral nerves, enteric nerves, adrenal medulla, melanocytes, facial cartilage, dental dentin, epidermis, hair, nails, skin, sebaceous glands, salivary glands, sweat glands, mammary glands, nasal cavity, nasal mucosa, oral epithelium, oral cavity, eyes, bladder, anus, etc.
  • the central nervous system e.g., the central nervous system of the brain or the central nervous system of the spinal cord
  • the pituitary gland e.g., peripheral nerves, enteric nerves, adrenal medulla, melanocytes, facial cartilage, dental dentin, epiderm
  • the brain can be broadly divided into the cerebrum, cerebellum, and brain stem.
  • the cerebrum can be further divided into the telencephalon and diencephalon, and the brain stem can be further divided into the midbrain, pons, and medulla oblongata.
  • the central nervous system is composed of nerve cells (neurons) and glial cells.
  • nerve cells i.e., nerve cells, glial cells, or both, can be selected as raw material cells (also called starting materials for culture).
  • raw material cells also called starting materials for culture
  • the ectodermal cells used in the present disclosure are not particularly limited and may be, for example, glial cells.
  • the glial cells may be, for example, at least one selected from the group consisting of astrocytes, microglia, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursor cells (also called polydendrocytes), ependymal cells, Schwann cells, and satellite cells.
  • the glial cells may be, for example, one type or a mixture of two or more types. These cells may be, for example, primary cells obtained from a living organism, established cell lines, or ectodermal cells induced from pluripotent stem cells such as ES cells or induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • the ectodermal cells used in the present disclosure may be, for example, cells prepared by isolation and purification from a brain sample collected from a mammal.
  • the collection of a brain sample from a mammal may be, for example, removal of the entire brain or removal of a piece of brain tissue, depending on the condition of the mammal.
  • a brain sample extracted from an adult rat aged 10 to 20 weeks it is preferable to use.
  • the brain sample may be collected, for example, by biopsy or surgery.
  • the brain sample can be obtained, for example, by biopsy or surgery.
  • both the nerve cells and the glial cells can be obtained from a brain tissue piece collected by biopsy.
  • a resected brain tissue piece from an adult or a brain extracted from a dead fetus can be used to prepare the ectodermal cells.
  • nerve cells or glial cells can be isolated and purified from these collected brain samples, and then frozen, and the frozen cells can be used as the ectodermal cells.
  • the ectodermal cells used in the present disclosure can be defined as, for example, cells that exhibit characteristics of ectodermal cells.
  • characteristics of ectodermal cells include cell morphology and expression of genes or proteins (sometimes referred to as "marker genes or marker proteins") specific to the cells.
  • the ectodermal cells can be confirmed by the expression of at least one marker gene selected from the group consisting of GFAP, S100B, and CSPG4 at any of the differentiation stages.
  • the expression of the marker gene of the ectodermal cells may be confirmed based on either genes or proteins.
  • the expression of a gene or protein can be confirmed by a method known in the art, for example, the presence or absence of expression, a specific expression level depending on the measurement method, or a comparison with the expression level of the same gene or protein in a specific cell.
  • the expression of the marker can be confirmed using techniques known in the art.
  • the expression level can be measured using, for example, quantitative PCR (sometimes referred to as "qPCR"), and in the case of the marker protein, the expression level can be measured using, for example, immunoassays such as ELISA and flow cytometry.
  • the ectodermal cells (raw material cells) used as the raw material for manufacturing the highly proliferative cells are as described above.
  • the raw material cells are, for example, ectodermal cells that have not been contacted with the small molecule signaling pathway inhibitor before the culture in (i) above, i.e., the ectodermal cells that have not been induced to proliferate.
  • the raw material cells (the ectodermal cells not yet induced to proliferate) prepared as described above are contacted with the small molecule signaling pathway inhibitor.
  • the raw material cells may be contacted with the inhibitor in vitro.
  • the inhibitor include transforming growth factor (TGF) ⁇ receptor inhibitors, ROCK [Rho-associated protein kinase] inhibitors, and glycogen synthase kinase 3 (GSK3) inhibitors.
  • TGF transforming growth factor
  • ROCK Rho-associated protein kinase
  • GSK3 glycogen synthase kinase 3
  • the inhibitor may be, for example, any one of the inhibitors or two or more of the inhibitors may be used in combination, and the combination is not particularly limited.
  • the inhibitor may include, for example, at least one compound selected from the group consisting of a TGF ⁇ receptor inhibitor, a ROCK inhibitor, and a GSK3 inhibitor.
  • the inhibitor may include, for example, at least one compound selected from the group consisting of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor.
  • the TGF ⁇ receptor inhibitor is not particularly limited as long as it has the effect of inhibiting the function of the TGF ⁇ receptor.
  • examples of the TGF ⁇ receptor inhibitor include 2-(5-benzo[1,3]dioxol-4-yl-2-tert-butyl-1H-imidazol-4-yl)-6-methylpyridine, 3-(6-methylpyridin-2-yl)-4-(4-quinolyl)-1-phenylthiocarbamoyl-1H-pyrazole (A-83-01), [2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-4-(4-pyridylamino)]butene, and the like.
  • the TGF ⁇ receptor inhibitor is preferably CultureSure (registered trademark) A-83-01.
  • the TGF ⁇ receptor inhibitor also includes, for example, TGF ⁇ receptor antagonists.
  • the TGF ⁇ receptor inhibitor may be used alone or in combination of two or more types.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it has an effect of inhibiting the function of Rho-binding protein kinase.
  • examples of the ROCK inhibitor include GSK269962A (Axon Medchem), Fasudil hydrochloride (Tocris Bioscience), CultureSure (registered trademark) Y-27632 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), and H-1152 dihydrochloride (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation).
  • the ROCK inhibitor is preferably CultureSure (registered trademark) Y-27632. Only one type of ROCK inhibitor may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the GSK3 inhibitor is not particularly limited as long as it has the effect of inhibiting the function of glycogen synthase kinase (GSK) 3.
  • GSK3 inhibitor examples include SB216763 (Selleck), CHIR 98014 (Axon medchem), CHIR 99021 (Axon medchem), SB415286 (Tocris Bioscience), and Kenpaullone (Cosmo Bio).
  • the GSK3 inhibitor is preferably CHIR 99021. Only one type of GSK3 inhibitor may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the small molecule signaling pathway inhibitor used in the production method of the present disclosure can be, for example, at least one selected from the group consisting of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor. That is, the inhibitor used in the production method of the present disclosure can be, for example, - combination of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor, It may be a TGF ⁇ receptor inhibitor or a ROCK inhibitor. In one embodiment of the present disclosure, the inhibitor used is a combination of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor.
  • the inhibitor includes the following inhibitors: (1) at least one compound selected from the group consisting of 2-(5-benzo[1,3]dioxol-4-yl-2-tert-butyl-1H-imidazol-4-yl)-6-methylpyridine, 3-(6-methylpyridin-2-yl)-4-(4-quinolyl)-1-phenylthiocarbamoyl-1H-pyrazole (A-83-01), [2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-4-(4-pyridylamino)]pteridine (SD-208), 3-(pyridin-2-yl)-4-(4-quinonyl)]-1H-pyrazole, 2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine, SB431542 and CultureSure® A-83-01; (2) at least one compound selected from the group consisting of 2-(5-benzo[1,
  • the raw material cells are cultured in the presence of the inhibitor.
  • a medium containing the inhibitor can be used for the culture, and the raw material cells can be cultured in the medium while being in contact with the inhibitor.
  • the concentration of the inhibitor in the medium is not particularly limited, and examples of the concentration include the following.
  • the lower limit of the concentration of the inhibitor in the medium is, for example, 0.001 ⁇ M or 0.05 ⁇ M
  • the upper limit is, for example, 30 ⁇ M, 50 ⁇ M, 80 ⁇ M, or 100 ⁇ M
  • the range is, for example, 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, 0.01 ⁇ M to 80 ⁇ M, 0.01 ⁇ M to 50 ⁇ M, 0.01 to 30 ⁇ M, or 0.05 ⁇ M to 30 ⁇ M.
  • the concentration of the inhibitor can be adjusted appropriately, for example, depending on the type of inhibitor used. In this specification, the "M" in concentration can be read as "mol/L.”
  • the concentration range of the inhibitor exemplified above can be applied, for example, to the case where one type of inhibitor is used alone or two or more types of inhibitors are used in combination.
  • the inhibitor may be added to the medium as is, or may be dissolved in a solvent and then added to the medium to the final concentration.
  • the solvent include aqueous solvents and organic solvents.
  • the aqueous solvent include water, buffer solutions, and physiological saline.
  • an organic solvent is used.
  • the organic solvent is preferably, for example, low-toxic, and a specific example that can be used is DMSO, and the inhibitor is preferably, for example, soluble in a small amount of the organic solvent.
  • the concentration of the TGF ⁇ receptor inhibitor in the medium is, for example, within the range of 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, 0.01 ⁇ M to 50 ⁇ M, or 0.05 ⁇ M to 30 ⁇ M, and can be adjusted appropriately depending on the type of TGF ⁇ receptor used.
  • the concentration of the TGF ⁇ receptor inhibitor in the medium for example, CultureSure (registered trademark) A-83-01, is 0.1 ⁇ M to 3 ⁇ M.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is, for example, within the range of 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, 0.01 ⁇ M to 80 ⁇ M, or 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and can be adjusted appropriately depending on the type of ROCK inhibitor used.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium for example, CultureSure (registered trademark) Y-27632, is 1 ⁇ M to 30 ⁇ M.
  • the concentration of the GSK3 inhibitor in the medium is, for example, within the range of 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, 0.01 ⁇ M to 80 ⁇ M, or 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and can be adjusted appropriately depending on the type of GSK3 inhibitor used.
  • concentration ranges are applicable, for example, when the TGF ⁇ receptor inhibitor, ROCK inhibitor, and GSK3 inhibitor are used alone, and when these inhibitors are used in combination.
  • the inhibitor when it is water-insoluble or poorly water-soluble, as described above, it can be dissolved in a small amount of a low-toxicity organic solvent (e.g., DMSO, etc.) and then added to the medium to the above-mentioned final concentration.
  • a low-toxicity organic solvent e.g., DMSO, etc.
  • the raw material cells are cultured in the presence of the inhibitor.
  • a medium containing the inhibitor can be used for the culture, and the raw material cells can be cultured in the medium in contact with the inhibitor.
  • the raw material cells may be prepared and cultured as is in the presence of the inhibitor, or may be cultured in the absence of the inhibitor first and then in the presence of the inhibitor.
  • the culture of the raw material cells in the absence of the inhibitor i.e., the culture until contact with the inhibitor
  • preculture the culture of the raw material cells in the absence of the inhibitor
  • main culture the culture in a state where the cells are in contact with the inhibitor
  • the main culture is a culture for a predetermined period of time in the presence of the inhibitor, and since the inhibitor is contained in the medium, contact between the cells and the inhibitor continues during the main culture.
  • the medium used in the pre-culture and main culture is not particularly limited, and a medium widely used for culturing animal cells can be used as the basal medium, and a commercially available basal medium may be used.
  • basal media include, but are not limited to, Astrocyte Growth Medium (AGM), Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium (DMEM), RPMI 1640 medium, 199 medium, Ham's F12 medium, William's E medium, and NS basal medium (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation).
  • the medium may be one of the above, or two or more types may be combined.
  • the same medium or different media may be used for the pre-culture and main culture.
  • the medium may further contain, for example, additives.
  • additives added to the medium include cytokines, growth factors (e.g., epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2)), hormones (e.g., insulin, estradiol, progesterone, testosterone, and thyroxine), steroids (e.g., dexamethasone (Dex)), plasma-derived proteins (e.g., transferrin), various amino acids (e.g., L-glutamine and L-proline), various inorganic salts (e.g., selenite and NaHCO 3 ), various vitamins (e.g., nicotinamide and ascorbic acid derivatives), N2 supplement (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), NS supplement (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), B-27 Plus Supplement (Thermo Fisher Scientific), various antibiotics (e.g., penicillin and streptomycin), antimycotics (e.g.,
  • the medium for the preculture (first culture) and the medium for the main culture (second culture) may be, for example, either a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • exosomes extracellular vesicles
  • FBS from which exosomes have been removed can be used, for example, to facilitate exosome isolation.
  • exosome-removed media include FBS exosome-depleted, OneShot format (Gibco (registered trademark), Thermo Fisher Scientific).
  • the concentration of serum in the medium is, for example, 0.5-25% (v/v), 1-25% (v/v), 1-20% (v/v), 1-15% (v/v), 2-15% (v/v), 2-10% (v/v), 3-10% (v/v), 3-8% (v/v), and 3-5% (v/v).
  • the concentration of serum in the medium is, for example, 3% (v/v).
  • a serum substitute may be added to the medium.
  • serum substitutes include bovine serum albumin (BSA), knockout serum replacement (KSR), and human serum albumin (HSA or human albumin, serum; HAS).
  • human serum albumin examples include human serum albumin isolated from human plasma, and human serum albumin purified from rice expressing the human serum albumin gene (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • factors such as growth factors (e.g., hEGH), cytokines, and hormones are usually added.
  • EGF epidermal growth factor
  • insulin transferrin
  • dexamethasone Dex
  • N2 Supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation
  • NS Supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation
  • B-27 Serum Free Supplement Thermo Fisher Scientific
  • the culture vessel used for the culture is not particularly limited, and for example, a vessel suitable for adhesion culture can be used, such as a dish, a Petri dish, a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a multi-plate, a multi-well plate, a chamber slide, a petri dish, a tube, a tray, and a culture bag.
  • a vessel whose inner surface is coated with a cell support substrate can be used for the purpose of improving adhesion to cells.
  • the cell support substrate include collagen, gelatin, Matrigel, poly-L-lysine, laminin, and fibronectin.
  • a preferred cell support substrate is collagen or Matrigel.
  • a culture vessel whose surface has been treated so that cells cannot adhere can also be used.
  • the seeding conditions of the source cells (the ectodermal cells not yet induced to proliferate), for example, the seeding cell density, is not particularly limited.
  • the source cells can be seeded on a culture vessel at a cell density of, for example, 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , or 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • the culture conditions of the raw material cells can be, for example, the conditions generally applied to the culture of ectodermal cells.
  • a CO2 incubator can be used for the culture.
  • the culture temperature and CO2 concentration are not particularly limited and may be those generally used, for example, 37°C and 5% (v/v).
  • the culture period (culture period T) of the main culture is a period during which the cells are cultured in the presence of the inhibitor, i.e., with the inhibitor.
  • the culture period T may be, for example, a continuous period or a discontinuous period, i.e., a period resulting from the sum of a number of discontinuous periods.
  • the upper limit of the culture period T of the main culture is 28 days, and may be, for example, 20 days, 18 days, or 14 days.
  • the lower limit of the culture period T of the main culture may be, for example, 1 day, 4 days, 5 days, or 7 days.
  • the range of the culture period T of the main culture may be, for example, 1 to 28 days, 4 to 28 days, 5 to 28 days, 7 to 28 days, 7 to 20 days, 7 to 18 days, or 7 to 14 days.
  • the passage of the cells during the culture is not particularly limited, and may be appropriately performed depending on, for example, the cell density in the culture vessel, the state of the medium, or the state of the cells, and the passage interval may be, for example, about 2 to 20 days.
  • the culture period in the absence of the inhibitor is not particularly limited.
  • the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure may further include, for example, the following (ii) after the main culture (i). (ii) isolating the hyperproliferative cells from the culture obtained by culturing in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor of (i).
  • the highly proliferative cells are obtained by the main culture.
  • the culture of the main culture contains a cell population containing the highly proliferative cells. Therefore, in the manufacturing method of the present disclosure, for example, the highly proliferative cells may be further isolated from the culture.
  • the isolation of the highly proliferative cells may be, for example, isolation as a cell population containing the highly proliferative cells, or isolation and purification of the highly proliferative cells.
  • the isolation method can be a fluorescence-activated cell sorting (FACS) method based on the expression of a protein derived from the above-mentioned marker gene specific to the highly proliferative cells, or a magnetic cell isolation method using Dynabeads or the like.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • the highly proliferative cells of the present disclosure can be obtained.
  • the characteristics of the highly proliferative cells obtained by the manufacturing method of the present disclosure can be the characteristics of the highly proliferative cells described in ⁇ 1> above.
  • the characteristics of the highly proliferative cells obtained by the manufacturing method of the present disclosure can be shown, for example, by comparison with the raw ectodermal cells.
  • the "raw ectodermal cells" to be compared with the highly proliferative cells include, for example, the control cells described in ⁇ 1> above, and specifically, ectodermal cells that have not been in contact with the inhibitor, that is, the proliferation-uninduced ectodermal cells.
  • the "raw ectodermal cells" to be compared with the highly proliferative cells include, for example, ectodermal cells that have not been subjected to the main culture in the manufacturing method of the present disclosure, that is, ectodermal cells that have not been cultured in the presence of the inhibitor, and the proliferation-uninduced ectodermal cells correspond to the above.
  • the "raw ectodermal cells" to be compared with the highly proliferative cells are not limited to, for example, ectodermal cells actually used as a raw material in the production of the highly proliferative cells, but may be ectodermal cells that have not come into contact with the inhibitor (the ectodermal cells not induced to proliferate) that can be used as a raw material in the production method of the present disclosure.
  • the "raw ectodermal cells" to be compared with the highly proliferative cells means ectodermal cells that can be used as a raw material (the ectodermal cells not induced to proliferate), without being limited to whether they were actually used as a raw material in the production of the highly proliferative cells, unless otherwise specified.
  • the proliferation ability of the highly proliferative cells obtained by the manufacturing method of the present disclosure can be evaluated by the method described above for the highly proliferative cells of the present disclosure.
  • the control cells are, for example, the ectodermal cells not induced to proliferate
  • the highly proliferative cells obtained by the manufacturing method of the present disclosure may be identified, for example, by a marker specific to the cell, as described above.
  • the type of marker of the highly proliferative cells, the method for confirming the expression of the marker, the expression behavior, etc. may be referenced from the description of the highly proliferative cells of the present disclosure in ⁇ 1> above.
  • the cell population of the highly proliferative cells may include cells of an ectodermal cell lineage associated with astrocytes.
  • the cells of the ectodermal cell lineage associated with astrocytes include astrocytes, radial glial cells, oligodendrocyte precursor cells (also called polydendrocytes), oligodendrocytes, and neuroepithelial cells.
  • the cell population of the ectodermal cell lineage associated with astrocytes may include cells that have some of the characteristics seen in ectodermal cells and cannot be classified into any of the above-mentioned cells, so long as it is a cell population that exhibits enhanced cell proliferation ability.
  • the manufacturing method of the present disclosure uses, for example, human primary mature astrocytes as the raw cells, and uses a combination of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor as the inhibitor.
  • the highly proliferative cells obtained in this embodiment can be cultured for a longer period of time, for example, compared to cells obtained by culturing the raw cells in the absence of the inhibitor (also referred to as an inhibitor non-contact cell group). That is, in the highly proliferative cells obtained in this embodiment (inhibitor contact group), cell proliferation can continue for a longer period of time, for example, compared to the inhibitor non-contact group.
  • the number of cells in the inhibitor contact group is, for example, 2 times or more, 5 times or more, 10 times or more, 50 times or more, 100 times or more, 200 times or more, or 400 times the number of cells in the inhibitor non-contact group.
  • the second method for producing highly proliferative cells of the present disclosure includes: A method for producing hyperproliferative cells, comprising: (i) culturing a starting ectodermal cell in the presence of a small molecule signaling pathway inhibitor to obtain a highly proliferative cell having a higher cell proliferation ability than the starting ectodermal cell; In the step (i), the culture is continued in the presence of the inhibitor until at least one condition selected from the group consisting of condition a1, condition b1, and condition c1 is satisfied.
  • the relative value (E1/Ec) determined by the expression level ( E1 ) of at least one marker gene selected from the group consisting of GFAP, S100B, Musashi1 , CSPG4, Nestin, and SLC1A3 and the expression level ( Ec ) of a control gene satisfies the reference range shown in Table 2 below.
  • the number of cells cultured in the presence of the inhibitor is more than 1.0-fold the number of ectodermal cells cultured under the same culture conditions but for the same culture period in the absence of the inhibitor.
  • the expression level of at least one marker gene selected from GFAP, SOX2, Musashi1, and Nestin is 1.0-fold or more compared to that of ectodermal cells cultured under the same culture conditions for the same culture period except in the absence of the inhibitor.
  • the second manufacturing method of the present disclosure by culturing in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor of (i), it is possible to obtain highly proliferative cells (the HP cells) having enhanced cell proliferation ability compared to the raw material ectodermal cells, as in the first manufacturing method of the present disclosure.
  • the manufacturing method of the present disclosure it is possible to produce the highly proliferative cells of the present disclosure described in ⁇ 1> above. Note that the description of the manufacturing method of the present disclosure does not limit the method of producing the highly proliferative cells of the present disclosure described in ⁇ 1> above.
  • the culture of the source cells (ectodermal cells) in the presence of the inhibitor in (i) is carried out until the cells being cultured satisfy condition b1 or condition c1.
  • condition b1 or condition c1 the cell number or the expression level of the marker gene of the source cells (ectodermal cells) cultured in the absence of the inhibitor may be obtained, for example, by culturing the source cells in the absence of the inhibitor in parallel with the culture of the source cells in the presence of the inhibitor in (i).
  • the source cells (ectodermal cells) used in (i) may be separately cultured in the absence of the inhibitor to obtain information on the cell number or the expression level of the marker gene.
  • the second production method of the present disclosure may refer to the description of the highly proliferative cells of the present disclosure in ⁇ 1> above and the second production method of the highly proliferative cells of the present disclosure in ⁇ 2> above.
  • the present disclosure may include, for example, a method for evaluating highly proliferative cells. According to the evaluation method of the present disclosure, for example, it is possible to evaluate whether the cells to be evaluated are highly proliferative cells of the present disclosure. For example, the following steps in the evaluation method of the present disclosure may be referred to in the description of the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure.
  • the method for evaluating highly proliferative cells comprises: Providing a source of ectodermal cells; Culturing the source ectodermal cells in the presence of the small molecule signaling pathway inhibitor; When the cells being cultured satisfy at least one selected from the group consisting of condition a1, condition b1, and condition c1, the cells are evaluated as being highly proliferative cells having enhanced cell proliferation ability compared to the raw material ectodermal cells.
  • the relative value (E1/Ec) determined by the expression level ( E1 ) of at least one marker gene selected from the group consisting of GFAP, S100B, Musashi1 , CSPG4, Nestin, and SLC1A3 and the expression level ( Ec ) of a control gene satisfies the reference range shown in Table 2.
  • the number of cells cultured in the presence of the inhibitor is more than 1.0-fold the number of ectodermal cells cultured under the same culture conditions but for the same culture period in the absence of the inhibitor.
  • the expression level of at least one marker gene selected from GFAP, SOX2, Musashi1, and Nestin is 1.0-fold or more compared to that of ectodermal cells cultured under the same culture conditions for the same culture period except in the absence of the inhibitor.
  • the cells being cultured can be evaluated as being highly proliferative cells when they further satisfy the expression of various markers exemplified for the highly proliferative cells of the present disclosure in ⁇ 1> above.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure include, for example, the highly proliferative ectodermal precursors (the highly proliferative precursor cells).
  • the highly proliferative precursor cells can be used for the following purposes, for example. Note that the present disclosure is not limited to these uses.
  • the ectodermal progenitor cells of the present disclosure can be used, for example, in a method for evaluating a neurological disorder treatment agent.
  • the usefulness of a candidate neurological disorder treatment agent can be evaluated by contacting the candidate neurological disorder treatment agent with the ectodermal progenitor cells.
  • the present disclosure relates to a method for evaluating a candidate neurological disorder treatment agent, which includes contacting the candidate neurological disorder treatment agent with the ectodermal progenitor cells of the present disclosure.
  • the candidate drug can be evaluated as useful.
  • the present disclosure further relates to a method for evaluating a neurological disease model, and includes the use of the highly proliferative ectodermal progenitor cells. For example, when a gene associated with a neurological disease has been identified, a mouse having a mutation in the gene is artificially produced, and the highly proliferative ectodermal progenitor cells are administered to the genetically mutated mouse, and the neurological function corresponding to the neurological disease, mouse behavior, etc. are evaluated.
  • the present disclosure further relates to a method for producing ectodermal mature cells, which includes using the highly proliferative ectodermal progenitor cells and inducing differentiation of the highly proliferative ectodermal progenitor cells to obtain ectodermal mature cells.
  • the conditions for inducing differentiation are not particularly limited, and a general method for inducing differentiation can be adopted, for example, by culturing the highly proliferative ectodermal progenitor cells under maturation conditions that induce differentiation to maturity.
  • “under maturation conditions” refers to culture conditions using known differentiation-inducing factors, without any particular limitations.
  • the differentiation-inducing factors include fibroblast growth factor-2 (FGF-2); IL-6 family cytokines such as leukemia inhibitory factor (LIF) or ciliary neurotrophic factor (CNTF); bone morphogenetic protein (BMP) family cytokines such as BMP2 or BMP4; Notch family proteins; Wnt gene family proteins; Sonic hedgehog proteins; and retinoic acid.
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 neurotrophin-3
  • NT-4/5 neurotrophin-4/5
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the culture conditions using the differentiation-inducing factor can be selected from known differentiation-inducing conditions applied in a differentiation-inducing method using a differentiation-inducing factor, and the differentiation-inducing conditions can be appropriately selected depending on, for example, the type of differentiation-inducing factor used.
  • the small molecule signaling pathway inhibitor used in the production method of the present disclosure can be used to maintain or promote the proliferation ability of ectodermal cells. Therefore, a further aspect of the present disclosure relates to a proliferation regulator for ectodermal cells, comprising the small molecule signaling pathway inhibitor. Specifically, the present disclosure also relates to a proliferation regulator used in the maintenance or promotion of the proliferation ability of the highly proliferative cells or ectodermal cells, comprising the small molecule signaling pathway inhibitor.
  • the inhibitor can be, for example, the inhibitors listed as examples in the first production method of the present disclosure in ⁇ 2> above, and the combination of the inhibitors can also be the combinations listed as examples.
  • the inhibitor includes, for example, at least one inhibitor selected from the group consisting of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor.
  • the term “proliferation regulation” can mean achieving at least one of cell proliferation maintenance and proliferation promotion.
  • the terms “proliferation maintenance” and “proliferation promotion” are not particularly distinguished from each other, for example, as long as the number of cells is maintained or increased over the culture period.
  • the concentration of the proliferation regulator used for regulating cell proliferation is not particularly limited, and for example, the concentration of the small molecule signaling pathway inhibitor described in the first production method of the present disclosure can be applied as is.
  • Cell secretion product and its manufacturing method Yet another aspect of the present disclosure relates to a method for manufacturing a cell secretion product, which includes obtaining a culture of the highly proliferative cells of the present disclosure, or performing the method for manufacturing the highly proliferative cells of the present disclosure to obtain a culture of the highly proliferative cells, and isolating a cell secretion product derived from the highly proliferative cells from the culture.
  • the manufacturing method of the present disclosure may further include any step as necessary.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure are highly proliferative cells with enhanced cell proliferation ability, and therefore, for example, compared to ectodermal cells not in contact with the inhibitor, they proliferate in a shorter time and for a longer period, or they proliferate in a shorter time and for a longer period. Therefore, in the method for manufacturing a cell secretion product of the present disclosure, for example, the cell secretion product secreted by the highly proliferative cells can be obtained in a larger amount in a shorter time than the control cells.
  • the control cells are, for example, the control cells described above, and are ectodermal cells not in contact with the inhibitor.
  • Cell secretions are also generally referred to as "secretomes.”
  • the cell secretions of the present disclosure are not particularly limited as long as they are substances secreted from the highly proliferative cells of the present disclosure, and examples include extracellular vesicles such as exosomes, microvesicles, and apoptotic vesicles; and functional proteins such as cytokines, hormones, and antibodies.
  • the cell secretions may be, for example, extracellular vesicles, and may in particular be exosomes.
  • the culture prepared is a culture of the highly proliferative cells of the present disclosure, and the culture contains a cell secretion product secreted from the highly proliferative cells.
  • the culture containing the cell secretion product may be, for example, produced by carrying out the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure, may be produced by obtaining and culturing the highly proliferative cells of the present disclosure, may be a culture obtained by carrying out the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure, or may be a culture of the highly proliferative cells of the present disclosure obtained separately.
  • the term "culture product" refers to, for example, a combination of cultured cells obtained by culturing cells and a culture supernatant (conditioned medium).
  • the method for producing a cell secretion of the present disclosure includes separating the cell secretion from the culture, as described above.
  • the method for separating the cell secretion from the culture is not particularly limited, and known separation methods such as collection of the supernatant from the culture and centrifugation can be used.
  • the cell secretion separated from the culture may be obtained, for example, in the form of a composition containing the cell secretion.
  • the cell secretion-containing composition may contain, for example, the cell secretion and an aqueous medium.
  • the aqueous medium is not particularly limited, and is, for example, a known aqueous medium selected depending on the type of the cell secretion, and specific examples include the culture supernatant, water, a buffer solution (e.g., phosphate buffer, Good's buffer), physiological saline, and a medium in the culture.
  • a buffer solution e.g., phosphate buffer, Good's buffer
  • physiological saline e.g., physiological saline
  • the method for producing a cell secretion product disclosed herein may further include purifying or isolating the cell secretion product separated from the culture.
  • the method for purifying or isolating the cell secretion product is not particularly limited, and known methods can be applied depending on the type of cell secretion product.
  • Examples of the method for isolating or purifying the cell secretion include filtration and concentration.
  • the cell secretion-containing composition separated from the culture can be used for isolation or purification.
  • a membrane having a size or molecular weight cutoff value depending on the size of the target cell secretion can be used to filter the cell secretion-containing composition to isolate or purify the cell secretion.
  • tangential flow filtration or ultrafiltration can be used to filter or concentrate the cell secretion-containing composition to isolate or purify the cell secretion.
  • the isolated or purified cell secretion is also referred to as, for example, an isolated cell secretion.
  • the cell secretion can be used, for example, in the form of a composition containing the cell secretion, or in the form of the isolated cell secretion obtained after isolation or purification.
  • the cell secretion can be stored, for example, in the form of the composition or the isolated cell secretion.
  • the cell secretion composition or the isolated cell secretion can be dried by known processes such as spray drying and freeze drying, and can be used as the dried product or can be stored as the dried product.
  • the storage method is not particularly limited, and examples include storage at room temperature, refrigeration, and freezing.
  • the cell secretion derived from the highly proliferative cells of the present disclosure is specifically a cell secretion containing at least one of the proteins and miRNAs shown below, or a cell secretion containing both the proteins and miRNAs shown below.
  • the proteins are selected, for example, from those shown in Figures 2 to 4, and the miRNAs are selected, for example, from those shown in Figures 5 to 10 and 12.
  • the symbols are protein abbreviations, the names are protein names, and the accession numbers are accession numbers in UniProtKB/Swiss-Prot (https://www.uniprot.org/).
  • the miRNA column is the miRNA name
  • the accession numbers are accession numbers in miRBase (Release 21) (https://www.mirbase.org/).
  • the cell secretion of the present disclosure may, for example, contain at least one selected from these proteins or at least one selected from these miRNAs, and may also contain at least one selected from these proteins and at least one selected from these miRNAs.
  • the cell secretion product of the present disclosure contains, as a protein: - PA group: may include at least a combination of glycoprotein M6B (Q13491), HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain (P01903), Tweety homolog 1 (Q9H313), fibrillin-2 (P35556), HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain (P01911), and S100 calcium binding protein A8 (P05109);
  • PB group A combination of glycoprotein M6B (Q13491), HLA class II histocompatibility antigen, DR ⁇ chain (P01903), Tweety homolog 1 (Q9H313), fibrillin-2 (P35556), HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 ⁇ chain (P01911), and S100 calcium-binding protein A8 (P05109) with endophilin-A2 (Q99961), NEDD4-like E3 ubiquitin ligase (
  • subunit ⁇ 8 P26012
  • intercellular adhesion molecule 1 P05362
  • ephrin-B2 P52799)
  • DnaJ homolog subfamily A member 2 O60884
  • coiled-coil domain-containing protein 50 Q8IVM0
  • latent transforming growth factor ⁇ binding protein 2 Q14767
  • midkine P21741
  • basal cell adhesion molecule P50895
  • PC group A combination of glycoprotein M6B (Q13491), HLA class II histocompatibility antigen, DR ⁇ chain (P01903), Tweety homolog 1 (Q9H313), fibrillin-2 (P35556), HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 ⁇ chain (P01911), and S100 calcium-binding protein A8 (P05109) with endophilin-A2 (Q99961), NEDD4-like E3 ubiquitin ligase ⁇
  • Ras-associated protein Rab-5A (P20339), galectin-7 (P47929), Toll-interacting protein (Q9H0E2), clusterin (P10909), CD47 (Q08722), cadherin-13 (P55290), ezrin (P15311), and vacuolar protein sorting protein 37C (A5D8V6); or - PD group: may include all proteins listed in Figure 2, Figure 3 or Figure 4.
  • Examples of the miRNA contained in the cell secretions of the present disclosure include the miRNAs listed in FIG. 12.
  • examples of the miRNAs involved in the treatment of Parkinson's disease include the miRNAs listed in FIG. 5
  • examples of the miRNAs involved in the treatment of Alzheimer's disease include the miRNAs listed in FIG. 6 to FIG. 9, and examples of the miRNAs involved in the treatment of depression include the miRNAs listed in FIG. 10.
  • the cell secretion of the present disclosure includes, as miRNA: - RA group: may include at least a combination of hsa-miR-206 (MIMAT0000462), hsa-miR-204-5p (MIMAT0000265), hsa-miR-128-3p (MIMAT0000424), hsa-miR-363-3p (MIMAT0000707), and hsa-miR-323a-3p (MIMAT0000755); RB group: combination of hsa-miR-206 (MIMAT0000462), hsa-miR-204-5p (MIMAT0000265), hsa-miR-128-3p (MIMAT0000424), hsa-miR-363-3p (MIMAT0000707), and hsa-miR-323a-3p (MIMAT0000755) with hsa-miR-29c-3p (MIMAT0000681), hsa-miR
  • the cell secretion of the present disclosure may contain, as proteins, the above-mentioned protein group of the PA group, the PB group, the PC group, or the PD group, and, as miRNAs, the above-mentioned miRNA group of the RA group, the RB group, the RC group, or the RD group.
  • the cell secretion according to one embodiment can be used, for example, as a pharmaceutical composition having known effects caused by these proteins and miRNAs.
  • the cell secretion product of the present disclosure is an extracellular vesicle, specifically a vesicle containing a lipid bilayer.
  • the diameter of the extracellular vesicle is, for example, 50 nm to 5 ⁇ m, or 50 nm to 1000 nm.
  • the diameter of exosomes, which are one type of extracellular vesicle, is, for example, 50 nm to 200 nm. Exosomes contain various physiologically active substances, such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, and lipids, and are therefore expected to be used in disease treatment and diagnosis methods, pharmaceuticals, cosmetics, and the like.
  • exosomes are secreted from the adherent cells into the culture medium, particularly into the culture supernatant.
  • the cells of origin are non-adherent cells and the non-adherent cells are present in a cell suspension, exosomes are secreted from the non-adherent cells into the culture supernatant or cell suspension.
  • the highly proliferative cells of the present disclosure can be prepared as adherent cells (also referred to as highly proliferative ectodermal adherent cells) or non-adherent cells (also referred to as highly proliferative ectodermal non-adherent cells), and the extracellular vesicles can be obtained from the adherent cells or the non-adherent cells.
  • adherent cells also referred to as highly proliferative ectodermal adherent cells
  • non-adherent cells also referred to as highly proliferative ectodermal non-adherent cells
  • the extracellular vesicles can be obtained from the adherent cells or the non-adherent cells.
  • the exosomes include exosomes described in Journal of Controlled Release, Vol. 323, pp. 225-239 (2020).
  • Exosomes can be isolated, for example, based on molecular weight, size, shape, composition, or biological activity. Specifically, exosomes can be isolated by, for example, separating sediments by ultracentrifugation, separating fractions by density gradient ultracentrifugation, separating using size exclusion chromatography, separating using ion exchange chromatography (e.g., CIMmultus TM EV (manufactured by BIA separations), separating by capture using a protein (e.g., MagCapture TM Exosome Isolation Kit PS (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), separating by capture using an antibody, separating precipitates using a polymer such as polyethylene glycol, and the like. These methods can be carried out, for example, by combining one or more of them.
  • ion exchange chromatography e.g., CIMmultus TM EV (manufactured by BIA separations)
  • the properties of the exosomes can be used to track the activity of the exosomes.
  • the activity of the exosomes can be confirmed, for example, using static light scattering, dynamic light scattering, an ultraviolet-visible detector, a fluorescence detector, or a differential refractive index detector.
  • the cell secretion product may be separated from the culture after the main culture in the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure, or the highly proliferative cells obtained may be further cultured and the cell secretion product may be separated from the culture.
  • the culture medium for the culture e.g., the medium in the main culture
  • the recovery medium is specifically a medium for recovering a culture supernatant.
  • the additional culture means for example, culture with the recovery medium performed after culture with the culture medium.
  • the period of the additional culture is not particularly limited and is a culture for a shorter period than the main culture, and can be, for example, 6 hours or more, 12 hours or more, 18 hours or more, 24 hours or more, 36 hours or more, 48 hours or more, or 60 hours or more, and can be, for example, 96 hours or less, or 72 hours or less.
  • the recovery medium may be, for example, a serum-free medium or an exosome-depleted medium.
  • a commercially available exosome-depleted medium may be, for example, FBS exosome-depleted, OneShot format (Gibco (registered trademark), Thermo Fisher Scientific). It is preferable that the recovery medium does not contain, for example, the small molecule signaling pathway inhibitor.
  • the serum-free medium is preferably a medium that does not contain, for example, serum from a non-human mammal, specifically, bovine serum such as fetal bovine serum.
  • bovine serum such as fetal bovine serum
  • bovine fetal serum or the like that contains factors for promoting cell proliferation is added to the medium used for cell culture, and bovine exosomes may be contaminated in the medium.
  • bovine exosomes may be contaminated in the medium.
  • the additional culture culture is centrifuged to separate the culture supernatant as an exosome-containing composition, and, if necessary, the separated culture supernatant can be subjected to the above-mentioned exosome isolation or purification method to obtain exosomes.
  • the cell secretions derived from the highly proliferative cells of the present disclosure described above are expected to have various effects on various cell types, such as neuroprotective effects, neurite outgrowth inhibitory effects, neurite outgrowth effects, neurite network formation effects, neuronal cell death prevention effects, and neuronal cell proliferation promotion effects. Based on these functions, the cell secretions derived from the highly proliferative cells are expected to be useful, for example, as pharmaceutical compositions for preventing or treating disorders related to peripheral nerve cells or central nerve cells.
  • the cell secretions derived from the highly proliferative cells are not particularly limited, and include those listed in ⁇ 6> above, with exosomes being preferred.
  • the neuroprotective effect is, for example, an effect of making nerve cells less susceptible to damage or slowing the progression of nerve damage.
  • some hormones such as corticosterone
  • corticosterone can cause central diseases such as depression due to nerve damage and functional disorders caused by excessive stimulation of hormone receptors when they become locally excessive in the central nervous system.
  • the cell secretion of the present disclosure has the effect of suppressing nerve cell death, it is expected to protect nerves by making nerve cells less susceptible to damage or slowing the progression of nerve damage.
  • the neurite outgrowth inhibitory effect is, for example, an effect of inhibiting the differentiation of less differentiated cells into peripheral nerve cells, particularly sympathetic nerve cells, in relation to the differentiation of peripheral nerve cells.
  • the cell secretion product of the present disclosure for example, on peripheral nerve cells, it is expected that the peripheral nervous system, particularly the sympathetic nervous system, will be inhibited.
  • the cell secretion product of the present disclosure for example, on central nerve cells, it is expected that the central nervous system will be activated based on its neurite outgrowth effect, neurite network formation effect, neuronal cell death prevention effect, and neuronal proliferation promotion effect, etc.
  • the present disclosure relates to pharmaceutical compositions, including a therapeutically or prophylactically effective amount of a cellular secretion of the present disclosure and a pharma- ceutically acceptable carrier, and the present disclosure relates to methods of treatment or prevention, including administering to a subject the pharmaceutical composition of the present disclosure.
  • treatment includes not only curing a disorder, but also ameliorating symptoms of the disorder, such as alleviation and remission.
  • disorders to be treated or prevented are not particularly limited and include disorders related to peripheral nerve cells or central nerve cells, such as disorders selected from the group consisting of cancer, pain, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, schizophrenia, and dementia.
  • disorders related to peripheral nerve cells particularly disorders related to sympathetic nerve cells, include, for example, cancer and pain related to sympathetic nerve cells.
  • disorders related to central nerve cells are, for example, selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, schizophrenia, and dementia.
  • the pharma- ceutically acceptable carrier is not particularly limited, and may be one known in the art, such as physiological saline. Furthermore, in relation to the above-mentioned action, the present disclosure relates to a method for inhibiting sympathetic nerves or a method for inhibiting neurite outgrowth, which includes contacting a cell secretion (specifically, an exosome) derived from the highly proliferative cell with a nerve cell (e.g., a sympathetic nerve cell).
  • a cell secretion specifically, an exosome
  • a nerve cell e.g., a sympathetic nerve cell
  • the subject of administration is a human or a non-human animal, and the above-mentioned examples can be used as the non-human animal.
  • the administration form is not particularly limited, and may be, for example, oral administration or parenteral administration. Examples of the parenteral administration include injection into the affected area, intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, drip injection, transdermal administration, etc.
  • a numerical range indicated using “ ⁇ ” indicates a range that includes the numerical values before and after " ⁇ " as the minimum and maximum values, respectively.
  • the upper or lower limit of a numerical range in one stage can be arbitrarily combined with the upper or lower limit of a numerical range in another stage.
  • Example 1 Culture of human astrocytes in inhibitor-supplemented medium Human astrocytes were cultured using the following materials, reagents, and culture products. Unless otherwise specified, the same materials, reagents, culture products, devices, etc. were used in Example 1 and subsequent Examples.
  • ⁇ Culture procedure> The culture was carried out according to the following procedure. A frozen tube of human astrocyte cells (NHA) was thawed in a water bath at 37°C. The lysed cells were then transferred to a culture medium to make a total of 10 mL, and centrifuged at 180 x g for 5 minutes at room temperature, after which the medium was removed. The cells were again suspended in a new culture medium and seeded on a 150 mm cell culture dish at a seeding density of 5.8 x 103 cells/ cm2 . On the 10th day of culture, the cells were detached from the dish using a cell detacher and suspended in a new culture medium.
  • NHA human astrocyte cells
  • This cell suspension was seeded on a 60 mm cell culture dish at a seeding density of 4.8 x 103 to 1.4 x 104 cells/ cm2 for gene expression and protein expression analysis, and the cell suspension was seeded on a 100 mm cell culture dish at a seeding density of 5.5 x 103 cells / cm2 for subculture.
  • the dishes for analysis and the dishes for passage were divided into a normal group (also called the NHA group), a YA group (also called the NHA-YA group), a Y group (also called the NHA-Y group), and a group A (also called the NHA-A group), and the main culture medium was replaced with the main culture medium corresponding to each group (culture day 0), and main culture was performed.
  • the normal group was used as the main culture medium containing no inhibitor
  • the YA group was used as the main culture medium containing the inhibitor Y and the inhibitor A
  • the Y group was used as the main culture medium containing the inhibitor Y
  • the A group was used as the main culture medium containing the inhibitor A.
  • the concentration of the inhibitor in the main culture medium was as described above.
  • the term "inhibitor YA" means the addition of both the inhibitor Y and the inhibitor A.
  • the medium was replaced every 2 or 3 days.
  • the main culture medium was replaced with fresh medium (containing or not containing an inhibitor), and the cells were observed and photographed under a microscope (KEYENCE, BZ-X810, or Tommy Seiko, MX-307).
  • the cells for subculture were detached from the dish every 7 days using a cell detacher and suspended in the main culture medium (containing or not containing inhibitors).
  • the cell suspension was then seeded on a 60 mm cell culture dish at a seeding density of 4.8 x 103 to 1.4 x 104 cells/ cm2 for new gene expression and protein expression analysis, and then seeded on a 100 mm cell culture dish at a seeding density of 5.5 x 103 cells / cm2 for new subculture, thereby subculturing the cells.
  • the above steps were repeated, and main culture was performed for up to 28 days in the presence or absence of the inhibitors.
  • Cells for gene expression and protein expression analysis were cultured in the 60 mm cell culture dish for a maximum of 14 days, after which, as described above, new cells for subculturing were seeded and cultured. Then, in the main culture using the main culture medium (with or without inhibitors), the cells were detached from the analysis dish on days 1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 21, and 28, and cell counts, RNA recovery, and protein immunostaining were performed. A portion of the sampled cells were frozen and stored for later analysis.
  • the relationship between the number of days of main culture and the total cell number for each group is shown in Table 4.
  • the total cell number is shown as a cumulative total assuming that all cells were passaged at the time of passage (same below).
  • the proliferation rate began to increase after 5 days of main culture in the presence of the inhibitor, and the cell proliferation rate remained high for up to 28 days of main culture. Furthermore, the cell number in the YA group was 1.2 times that of the normal group on the 7th day of main culture, 24 times on the 14th day, 92 times on the 21st day, and 326 times on the 28th day. From these results, it was found that the cell population obtained by main culture in the presence of the inhibitor contained highly proliferative cells with improved proliferation. Furthermore, improved proliferation was confirmed by main culture in groups Y and A as well.
  • Figure 1 shows micrographs of cells on a given number of days (3rd, 7th, 14th, and 28th days) from the start of main culture.
  • each photograph is a 40x magnification, and the bars in the photograph are 200 ⁇ m
  • each photograph is a 100x magnification, and the bars in the photograph are 100 ⁇ m.
  • AGM is a photograph of the Normal group
  • YA is a photograph of the YA group
  • Y is a photograph of the Y group. From Figure 1, the following characteristics were confirmed for the YA group, Y group, and A group cultured in the presence of the inhibitor, compared to the Normal group cultured in the absence of the inhibitor.
  • Example 2 Confirmation of ectodermal cell markers by quantitative PCR
  • the expression levels of ectodermal cell marker genes were examined for a cell population containing highly proliferative cells obtained by main culture in the presence of the inhibitor (YA group) and a cell population cultured in the absence of the inhibitor (Normal group).
  • RNA Mini Kit (registered trademark, product number: 12183018A, TermoFisher), PureLink DNase Set (registered trademark, product number: 12185010, TermoFisher)
  • Equipment Refrigerated centrifuge MX-307, Bio-Rad, spectrophotometer NanodoropTM, ThermoFisher
  • ⁇ Quantitative PCR> Using the cDNA synthesized from the total RNA as a template, the expression of ectodermal cell marker genes was confirmed by quantitative PCR using the following primers and probe. The preparation of the total RNA and the setting of reaction conditions were performed according to the protocol attached to the product.
  • the cutoff value can be a condition for distinguishing cells obtained by culturing in the presence of the inhibitor for 28 days or less from cells obtained by culturing in the presence of the inhibitor for more than 28 days. Therefore, the cutoff value can be used as a reference range for the expression behavior of a marker gene for identifying the highly proliferative cells of the present disclosure.
  • Table 7 shows the expression levels of each marker gene on days 5, 7, 9, 14, and 28 of the main culture.
  • the expression levels of the marker genes were measured and corrected with the measured expression level of the control gene (GAPDH).
  • the corrected expression level (E N ) of the marker gene in the Normal group on the same culture day was set to "1," and the relative value (E YA /E N ) of the corrected expression level (E YA ) of the same marker gene in the YA group was shown.
  • Example 3 Confirmation of ectodermal cell markers by immunostaining Using a method similar to that used in Example 1, a cell population (YA group) containing highly proliferative cells obtained by main culture in the presence of the inhibitor and a cell population (Normal group) cultured in the absence of the inhibitor were prepared, and the expression of ectodermal cell marker proteins was confirmed for each cell population using immunostaining.
  • reagent Cell fixative and cell membrane treatment solution: eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (trademark, product number: 00-5523-00, Invitrogen), 4% paraformaldehyde phosphate buffer (PFA) (product number: 161-20141, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries), Triton X-100 (product number: 93443, Sigma Aldrich), Otsuka distilled water (product number: 05206903, Otsuka Pharmaceutical) Cell washing solution: Phosphate buffered saline (PBS(-): calcium and magnesium free, same below) (product number: 166-23555, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries), Phosphate Buffered Saline with Tween 20 (PBS-T) (product number: T9183, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) Primary antibody: Rabbit monoclonal Anti-Human GFAP (product number: ab68428,
  • Human astrocyte cells were cultured for 7 days in the presence and absence of the inhibitor YA in the same manner as in Example 1 (preparation of normal and YA groups). The cells cultured for 7 days were then detached from the dish using a cell detacher, and some of the cells were collected in a 15 mL centrifuge tube and suspended in 13 mL of growth medium (the culture medium in Example 1 not containing the inhibitor), followed by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes at 4° C. to wash the cells. The cells in the centrifuge tube were suspended in the FACS solution, and the cell concentration was adjusted to 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL.
  • the cells were fixed by incubation at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged at 1,200 rpm for 3 minutes at 4° C. After centrifugation, the supernatant was removed, and 1 mL of PBS(-) was added to the tube to wash the cells. The cells in the tube were slowly suspended in 1 mL of 0.2% Triton-X solution, and the cell membrane was permeabilized at room temperature for 15 minutes. After the treatment, 1 mL of FACS solution was added to the tube, and the cells were washed by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes at 4°C.
  • the protocol attached to the product was followed.
  • the cells in the tube were suspended in 100 ⁇ L of FACS solution, and the secondary antibody was added at 1/50 to 1/175 of the volume, and reacted for 30 minutes to 1 hour at 4° C.
  • the primary antibody was directly labeled with a fluorescent dye, the reaction was performed in the dark.
  • 1 mL of PBS(-) was added to the tube, and the tube was centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes at 4°C to wash the cells twice.
  • the cells in the tube were suspended in 500 ⁇ L of FACS solution.
  • Table 8 shows the percentage of cells positive for marker protein expression (cell positivity rate) and the ratio to the cell positivity rate of the normal group (ratio to normal) for each of the cell populations of the normal group and the YA group on the 7th day of main culture.
  • the astrocyte marker GFAP As shown in Table 8, in the YA group, the astrocyte marker GFAP, the radial glial cell marker and neuroepithelial cell marker Nestin, the neuroepithelial cell marker Notch1 and SOX2, and the neural stem cell marker Musashi1 all showed a higher positive cell rate than the Normal group. In contrast, the positive cell rate of NG2, a marker for oligodendrocyte precursor cells, was lower than that of the Normal group. From these results, it was confirmed that the ratio of the expression levels of various ectodermal cell marker proteins in the YA group to the Normal group on the 7th day of culture was consistent with the relative value (E YA /E N ) of the expression levels of the marker genes on the 7th day of culture in Example 2 (2-2) above.
  • the frozen tube of NHA was thawed in a water bath at 37°C, as in Example 1.
  • the thawed cells were suspended in 30mL of culture medium, seeded in a T-75 cell culture flask at a seeding density of 1.3 x 104 cells/ cm2 , and cultured.
  • the medium was replaced with the main culture medium (containing or not containing the inhibitor YA) at a volume of 15mL/flask, and the culture was continued while performing the same medium replacement every 2-3 days.
  • the cells were detached using a cell detacher, suspended in the main culture medium, and passaged in a 150mm cell culture dish at a seeding density of 6.6 x 103 cells/ cm2 and a volume of 20mL/dish (second passage).
  • Five dishes were used for each of the conditions containing the inhibitor YA and not containing the inhibitor, so the total number of cells seeded was 5 x 106 cells for each condition.
  • the cell group cultured in the main culture medium containing the inhibitor YA is called YA group
  • the cell group cultured in the main culture medium not containing the inhibitor YA is called Normal group.
  • recovery medium an inhibitor-free medium for recovering the culture supernatant
  • the culture supernatant was collected from the dish and filtered with a 0.22 ⁇ m filter system (Stericup, Merck Millipore), and the filtrate was stored at 4° C. Furthermore, fresh recovery medium was added to the dish after the culture supernatant was collected at a volume of 20 mL/dish, and the additional culture was continued.
  • the culture supernatant was collected three times for a total of six days, and a total of 300 mL of culture supernatant P2 (exosome-containing solution) was obtained under each condition.
  • P2 means that subculture was performed twice.
  • PN where N represents a positive integer
  • the "culture supernatant P2" here means the culture supernatant obtained by performing subculture twice.
  • Example 5 Proteome analysis of NHA-YA-derived exosomes Proteome analysis of proteins contained in exosomes was carried out using the cell supernatant P2 (exosome-containing solution) of Example 4.
  • Exosomes were purified from each culture supernatant P2 (exosome-containing solution) of the YA group and the Normal group obtained in Example 4 using a commercially available kit (MagCapture Exosome Isolation Kit PS: trademark, 293-7760, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries).
  • the particle size and particle concentration of the purified exosome specimens were measured using Nanosight NS300 (Malvern Panalytical).
  • the particle concentration of each culture supernatant P2 was determined by subtracting the particle concentration of the inhibitor-free medium for recovering the culture supernatant.
  • Table 9 shows the measurement results of particle size and particle concentration in the exosome specimens of each group.
  • a BCA-Assay was performed using a portion of the exosome specimen to check the quality of the proteins contained in the exosomes.
  • both the exosome samples from the YA group and the normal group contained particles with a mean and mode particle size of 100 nm to 200 nm, confirming the presence of exosomes. Furthermore, the exosome samples from the YA group showed approximately 2.2 times the content of particles with the above particle size compared to the exosome samples from the normal group. This demonstrates that exosomes can be efficiently prepared from the cell population of the YA group obtained by culturing in the presence of the inhibitor YA.
  • Example 4 The culture supernatant P2 (exosome-containing solution) obtained in Example 4 was added with a reduction treatment solution, and reduction treatment was performed at 57 ° C. for 30 minutes.
  • the reduction treatment solution was prepared by dissolving 1.5 mg of DTT in 1 mL of 100 mM ammonium bicarbonate.
  • the alkylation treatment solution was added to the reduced sample, and the reaction was performed at 25 ° C. for 30 minutes.
  • the alkylation treatment solution was prepared by dissolving 10 mg of iodoacetamide in 1 mL of 100 mM ammonium bicarbonate.
  • NanoLC-MS/MS analysis was performed using an UltiMate® 3000 liquid chromatograph (LC) and a Q-Exactive Plus mass spectrometer (MS), with LC and MS controlled by Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). NanoLC-MS/MS analysis conditions and database search using Proteome Discoverer Ver2.5 (Thermo Fisher Scientific) were performed. The search results were then exported and quantitative comparative analysis was performed using Scaffold Ver5.2.0 (Proteome Science).
  • the quantitative method of analysis used the iBAQ (Intensity-Based Absolute Quantification) value, and as a search result, all protein fragments were identified in the exosome fraction derived from the normal group, the exosome fraction derived from the NHA-YA group, and the medium components. From all proteins detected in the database, those detected more frequently in the exosome fraction derived from the YA group than in the normal group were selected, and those with a quantitative value (number of detected spectra, corrected) of 5.0 or more were selected in descending order. Furthermore, from the selected proteins, human-derived proteins were further selected, and if the target was a bovine-derived protein, the probability of identification with human-derived proteins was examined, and those with a high probability of identification were selected. The steps of selecting characteristic proteins that were performed after that are described below.
  • Characteristic proteins were selected in a selection step b, which is different from the above selection step a.
  • Step (b1) of selecting characteristic proteins expected to have pharmacological effects on central nervous system diseases As a result of the search combining SwissProt_Homo sapiens and UniProtKB_Bos taurus, a total of 1642 types of protein fragments were detected by combining the exosome fraction derived from the Normal group and the exosome fraction derived from the YA group with the medium components. From the total of 1642 detected sequences, those that were detected more in the exosome fraction derived from the YA group than in the Normal group and had a Quantitative Value (number of detected spectra. Corrected) of 5.0 or more were selected, and 35 proteins were extracted.
  • Example 6 miRNA Analysis of NHA-YA-Derived Exosomes Using the culture supernatant P2 (exosome-containing solution P2) from Example 4, analysis of small RNAs (including miRNA, piRNA, tRNA, and other RNAs) contained in exosomes was performed.
  • RNA analysis> The obtained total RNA was quality checked by Agilent 2100 Bioanalyzer using Agilent RNA 6000 pico kit (Agilent Technologies) and Agilent small RNA kit (Agilent Technologies). After the quality check, an RNA library was prepared from the total RNA using a directional RNA library preparation kit, NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina. The prepared RNA library was used to perform mRNA-Seq analysis.
  • a miRNA library was prepared from the total RNA using the miRNA library preparation kits QIAseq miRNA Library Kit (Qiagen) and QIAseq miRNA NSG 96 Index IL (Qiagen). The prepared miRNA library was used to perform miRNA-Seq analysis.
  • the quality of the sequence library was checked using the High Sensitivity DNA kit (Agilent Technologies) and an Agilent 2100 Bioanalyzer.
  • NGS was performed using NextSeq500 and Illumina (single-end, 75 bp, average number of reads approximately 10 million).
  • the number of genes detected from the exosome-containing solution P2 was 1,350 in the normal group and 1,346 in the YA group.
  • 377 genes with a fold change of 1.1 or more were detected.
  • 121 genes with increased expression at a fold change of 2 or more were detected in the YA group.
  • miRNA as a marker for Parkinson's disease With reference to the following literature, 39 miRNAs whose expression is decreased in human brain tissues with Parkinson's disease were selected. By administering exosomes containing the miRNAs to cells of a patient with Parkinson's disease, the function of the miRNAs is exogenously complemented in the patient with Parkinson's disease, and a therapeutic effect for Parkinson's disease is expected.
  • miRNAs as a marker for Alzheimer's disease Using IMOTA (https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/), miRNAs associated with the following proteins known to be associated with the pathology of Alzheimer's disease, particularly multiple proteins that contribute to the pharmacological action of drugs treating Alzheimer's disease, were selected.
  • miRNA as a marker for Alzheimer's disease
  • IMOTA amyloid precursor protein
  • miRNA as a marker for Alzheimer's disease
  • BACE1 ⁇ -site APP cleaving enzyme
  • miRNA as a marker for Alzheimer's disease (3) Using IMOTA (https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/), 66 miRNAs associated with NMDA receptors (N-methyl-D-aspartate receptors) in the cerebral cortex were selected. When Alzheimer's disease develops, abnormal proteins accumulate in the brain, causing excessive release of substances that excite the nerves. These excitatory substances overactivate the NMDA receptors, impairing neurotransmission and memory.
  • IMOTA https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/
  • GSK-3 ⁇ glycogen synthase kinase-3 ⁇
  • miRNA as a marker for depression With reference to the following literature, 24 miRNAs whose expression is decreased in the plasma of individuals with depression were selected. By administering exosomes containing the miRNAs to cells of a patient with depression, the function of the miRNAs is exogenously complemented in the patient with depression, and a therapeutic effect for depression is expected.
  • Literature MicroRNAs expressed in depression and their associated pathways: A systematic review and a bioinformatics analysis (Journal of Chemical Neuroanatomy 100 (2019) 101650)
  • Example 7 Verification of neuroprotective effect of NHA-YA-derived exosomes against corticosterone damage
  • PC-12 cells RB0009, RIKEN Cell Bank
  • Corticosterone is an adrenal cortical hormone (glucocorticoid) synthesized in the adrenal cortex, and when a specified amount is added to the medium, it shows toxicity to PC-12 cells and induces apoptosis of the cells.
  • the induction of apoptosis was quantified by measuring the activity of caspase-3 and caspase-7.
  • composition of medium for culturing and growing PC-12 cells basal medium, 10% (v/v) FBS, 10% (v/v) HS, antibiotics
  • Basal medium DMEM, high glucose, pyruvate (11995-073; Gibco)
  • FBS Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil (10270-106; Gibco)
  • HS Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin (26050-088; Gibco)
  • Antibiotic Antibiotic-Antimycotic (100X) (15240-062; Gibco)
  • Cell detachment agent 1 Accutase (AT104, ICT)
  • Cell detachment agent 2 TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red-free (12604-013, Gibco)
  • Cell buffer Phosphate buffered saline (PBS(-), Dulbecco; calcium and magnesium free) (BNDSBN200, KAC)
  • ⁇ Cell freezing medium CELLBANKER 1 (CB011 Takara Bio (Nihon
  • Culture medium AGM Astrocyte Growth Medium Bullet Kit (CC-3186, Lonza) (AGM composition: basal medium, FBS (3% (v/v)), L-glutamine, ascorbic acid, hEGF, insulin, antibiotics) (same as used in Example 1)
  • Inhibitor Y CultureSure (registered trademark) Y-27632 (034-24024, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), final concentration: 10 ⁇ M (the same as that used in Example 1)
  • Inhibitor A CultureSure (registered trademark) A-83-01 (035-24113, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), final concentration: 0.5 ⁇ M (the same as that used in Example 1)
  • ⁇ Exosome-depleted fetal bovine serum Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum Qualified One shot (A2720803, Gibco) ⁇ 0.2
  • the frozen tube in which the cell culture solution containing NHA was stored was thawed in a water bath at 37°C.
  • the thawed cells were suspended again in 30mL of culture medium, seeded in a T-75 cell culture flask at a seeding density of 1.4 x 104 cells/ cm2 , and cultured.
  • the medium was replaced with the main culture medium containing the inhibitor YA and the main culture medium not containing the inhibitor (hereinafter referred to as the main culture medium) at a volume of 15mL/flask, and the main culture was continued while replacing the medium every 2 or 3 days.
  • the cells were detached using a cell detachment agent, suspended in fresh main culture medium, and subcultured in 150 mm cell culture dishes at a seeding density of 3.3 x 103 cells/ cm2 and a volume of 20 mL/dish (second passage). Five dishes were used for each of the conditions containing the inhibitor YA and not containing the inhibitor, so the total number of cells seeded was 5 x 106 cells for each condition.
  • the cell group cultured in the YA-containing main culture medium is called the YA group
  • the cell group cultured in the YA-free main culture medium is called the Normal group.
  • recovery medium a recovery medium not containing an inhibitor for recovering the culture supernatant at a volume of 20 mL/dish, and additional culture for exosome recovery was started.
  • the recovery medium used was the same as that used in Example 1.
  • the culture supernatant was collected from the dish and filtered with a 0.22 ⁇ m filter system (Stericup, Merck Millipore), and the filtrate was stored at 4° C. Furthermore, fresh recovery medium was added to the dish after the culture supernatant was collected at a volume of 20 mL/dish, and the additional culture was continued. By this method, the culture supernatant was collected three times for a total of six days, and a total of 305 mL of culture supernatant P2 (exosome-containing solution) was obtained under each condition.
  • the cells remaining on the dish after three culture supernatants were collected were detached using a cell detachment agent and the number of cells was counted.
  • the total number of cells obtained in the Normal group was 6.4 x 106 cells, and the survival rate relative to the total number of seeded cells was 73.6%, while the total number of cells obtained in the YA group was 7.1 x 107 cells, and the survival rate relative to the total number of seeded cells was 96.7%, which was higher than the Normal group.
  • the washed precipitate was resuspended in PBS(-) to a volume of approximately 1/1000 of the volume of the culture supernatant P2.
  • the resuspended product was used as an evaluation sample.
  • PBS(-) was used as a control for the evaluation sample.
  • ⁇ Evaluation experiment protocol> The frozen tube of PC-12 cells was thawed in a water bath at 37°C. The lysed cells were transferred to the growth medium so that the total volume was 10 mL, and centrifuged at 180 x g for 5 minutes at room temperature, after which the medium was removed. The cells were suspended again in fresh growth medium and seeded on a 100 mm cell culture dish at a seeding density of approximately 5,300 cells/ cm2 . The cells were cultured at 37°C while changing the medium every 2 or 3 days, and the cells were grown with intermittent subculture. The obtained PC-12 cells were detached using the cell detachment agent 2, washed with the assay medium, and then resuspended in fresh assay medium.
  • the suspended cells were seeded in a 96-well plate (collagen I-coated 96-well plate) at a seeding density of 2.0 x 104 cells/100 ⁇ L medium per well, i.e., 61,000 cells/ cm2 , and incubated for about 24 hours to allow the cells to adhere, after which the medium in the well was replaced with 50 ⁇ L of assay medium (protein amount: 10 ⁇ g/mL) containing 100 ⁇ M corticosterone and each of the evaluation samples. Thereafter, the cells were cultured at 37°C for 2 days in the assay medium containing the evaluation samples, and the cell damage state in the resulting culture was evaluated by measuring caspase 3/7 activity.
  • assay medium protein amount: 10 ⁇ g/mL
  • Caspase 3/7 activity was measured using a commercially available apoptosis measurement reagent according to the protocol attached to the measurement reagent.
  • the measurement reagent used was a luminescent homogeneous assay reagent for measuring caspase 3/7 activity.
  • Activation of caspase 3/7 activity is an index of apoptosis induction, so the measurement results of caspase 3/7 activity (amount of luminescence) are shown in Table 10 as an indirect result of the degree of apoptosis.
  • YA is the result of using an evaluation sample derived from the YA group
  • Normal is the result of using an evaluation sample derived from the Normal group
  • PBS is the result of using the control (PBS (-)).
  • the amount of luminescence is shown as a relative value with the average amount of luminescence of the control taken as 1.
  • the relative luminescence intensity of the exosome samples for evaluation derived from the Normal group and the YA group was significantly reduced by 25% in the Normal group and 27% in the NHA-YA group compared to the control (PBS(-)). Furthermore, a further decrease in the luminescence intensity was confirmed for the exosome samples for evaluation derived from the YA group compared to the exosomes for evaluation derived from the Normal group.
  • ⁇ Sample> ⁇ Normal A cell population (Normal group) obtained by main culture in the absence of the inhibitor in Example 1. Cells stored in freezing tubes on day 9 (second passage, N-D9) and day 28 (fourth passage, N-D28) after the start of main culture were used. Hereinafter, the former is referred to as N-D9 (P2) and the latter is referred to as N-D28 (P4).
  • N-D9 N2
  • N-D28 N-D28
  • Culture medium AGM Astrocyte Growth Medium Bullet Kit (CC-3186, Lonza) (AGM composition: basal medium, FBS (3% (v/v)), L-glutamine, ascorbic acid, hEGF, insulin, antibiotics)
  • Cell detachment agent Accutase (AT104, ICT)
  • Cell buffer Phosphate buffered saline (PBS(-), Dulbecco; calcium and magnesium free) (14190250, Thermo Fisher Scientific)
  • Cell freezing medium CELLBANKER 1 (CB011 TaKaRa (Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.)) ⁇ Cell culture dish 100 mm (150466, Thermo Fisher Scientific) Centrifuge: Optima XE-90, Beckman Coulter ⁇ Culture device> ⁇ CO2 incubator: MCO-170AICUVD-PJ, PHC Corporation ⁇ Culture conditions> Temperature: 37°C,
  • ⁇ Culture procedure> The culture procedure was performed following Example 1 unless otherwise specified.
  • the frozen tubes of N-D9 (P2), N-D28 (P2), YA-D9 (P4), and YA-D28 (P4) were thawed in a water bath at 37°C.
  • the lysed cells were then transferred to a culture medium so that the total volume was 10 mL, and centrifuged at 180 x g for 5 minutes at room temperature, after which the medium was removed.
  • the cells were again suspended in fresh culture medium and seeded on a 100 mm cell culture dish.
  • YA-D9 and YA-D28 the same cells were divided into two, and each was seeded on a 100 mm cell culture dish.
  • the medium in the dish was replaced with a culture medium not containing the inhibitor (day 0 of culture start), and the culture was continued.
  • N-D9, N-D28, YA-D9, and YA-D28 were cultured in a culture medium not containing the inhibitor.
  • the medium was replaced with a culture medium not containing the inhibitor every 2 or 3 days, and after culturing for 5 to 7 days, the cells were subcultured for 24 days for 4 passages.
  • the medium was replaced and the cells were observed and photographed under a microscope (Tomy Seiko, MX-307).
  • N-D9 and YA-D9 which are second passages
  • the proliferation rate was calculated for each passage (P3, P4, P5, P6) during the culture period in which the cells were further cultured for four passages in the absence of the inhibitor
  • N-D28 and YA-D28 which are fourth passages
  • the proliferation rate was calculated for each passage (P5, P6, P7, P8) during the culture period in which the cells were further cultured for four passages in the absence of the inhibitor.
  • the proliferation rate of each passage of YA-D9 and YA-D28 in the absence of inhibitors was calculated as a relative value, with the proliferation rate of the same passage in the Normal group set at 1.
  • the YA group (YA-D9 and YA-D28) obtained by culturing in the presence of the inhibitor in Example 1 was able to maintain a higher proliferation rate than the Normal group (N-D9 and N-D28) even when cultured in the absence of the inhibitor YA.
  • Figure 11 shows the cell morphology of N-D9 and YA-D9 at the third passage (P3) and N-D28 and YA-D28 at the fifth passage (P5) in Figure 11-1, and that of N-D9 and YA-D9 at the sixth passage (P6) and N-D28 and YA-D28 at the eighth passage (P8) in Figure 11-2.
  • YA-D9 and YA-D28 in addition to small, dense cell masses, images of cells with process-like morphology proliferating three-dimensionally were observed in both passages.
  • N-D9 (P4) and N-D28 (P6) the cells became larger and the number of cells with process-like morphology decreased in both passages.
  • RNA samples were extracted from the cells of N-D9 at the fourth passage (P4) and YA-D9 at the fourth passage (P4) cultured in the absence of the inhibitor, and from the cells of N-D28 at the sixth passage (P6) and YA-D28 at the sixth passage (P6) cultured in the absence of the inhibitor, and the expression levels of the following ectodermal cell marker genes were examined.
  • RNA samples The preparation of the RNA samples and the setting of reaction conditions for quantitative PCR were performed in accordance with Example 2.
  • the expression levels of neural stem cell markers Musashi1 and Notch1, neuroepithelial cell markers Notch1, Nestin, and SOX2, radial glial cell marker Nestin, astrocyte markers GFAP, S100B, and SLC1A3, and oligodendrocyte precursor cell marker NG2 were measured for the RNA samples, and corrected with the expression level of the internal standard gene GAPDH (E 1 /E C ).
  • RNA samples were similarly prepared from cells on day 0 of culture that had been replaced with the inhibitor-free culture medium, and the expression levels of the marker genes were measured and corrected (E 1 /E C ).
  • the increase or decrease was calculated from the corrected relative value in the cells on day 0 of culture and the corrected relative value in the cells of N-D9 (P4), YA-D9 (P4), N-D28 (P6) and YA-D28 (P6) after passage.

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Abstract

細胞増殖能が高められた高増殖性細胞およびその製造方法を提供すること。　外胚葉性細胞の特徴を備え、以下のＡ１の発現挙動を示す、外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞。 （Ａ１）前記高増殖性細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）が、コントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）に対して、以下の相対値（Ｅ１／ＥＣ）を示す。ＧＦＡＰ　（Ｅ１／ＥＣ）＞０．２；Ｓ１００Ｂ　（Ｅ１／ＥＣ）＞０．０１７；Ｍｕｓａｓｈｉ１　（Ｅ１／ＥＣ）＞０．１５；ＣＳＰＧ４　（Ｅ１／ＥＣ）＜０．０１５；Ｎｅｓｔｉｎ　（Ｅ１／ＥＣ）＞０．６；ＳＬＣ１Ａ３　（Ｅ１／ＥＣ）＞０．０９。 外胚葉性細胞の特徴を備え、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日以下の培養期間後の細胞数が、前記阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞。

Description

高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途
　本発明は、高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途に関する。
　再生医療の分野において、生体内の種々の細胞、種々の分化段階の細胞、または特定方向へ分化誘導された細胞等が利用されている。生体での使用を考慮すれば、これらの細胞については、遺伝子改変を伴わないことが望ましい。これまで、内胚葉性の成熟細胞に特定の低分子化合物を接触させることにより、遺伝子改変を伴うことなく、前記成熟細胞を、幹細胞または前駆細胞にリプログラミングできることが報告されている（特許文献１および特許文献２）。
国際公開第２０１７／１１９５１２号 国際公開第２０２０／０８０５５０号
　一方、遺伝子改変を行わずに得られる細胞、なかでも比較的、成熟細胞に近い細胞の多くは、増殖能に制限があって、長期にわたって生体内外で維持できない傾向がある。このため、細胞の機能の長期利用、または、細胞が生成する有用物質の大量生産等に有効な高増殖性の細胞に対する要請が、依然として残されている。特に、神経系の細胞を含む外胚葉性細胞については、内胚葉性細胞と異なり十分に利用できていない。
　本開示の目的は、高増殖性細胞、高増殖性細胞を製造する方法、およびその用途を提供することである。
　本発明者らは、鋭意研究を行った結果、特定の性質を有する外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞を得た。
　すなわち、本開示は以下の形態を含む。
［１］外胚葉性細胞の特徴を備え、以下のＡ１の発現挙動を示す、外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞。
（Ａ１）前記高増殖性細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）およびコントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）によって決定される相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、下記表１で表される基準範囲を充たす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 ［２］外胚葉性細胞の特徴を備え、外胚葉性細胞を低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日以下の培養期間後の細胞数が、前記阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞。
［３］前記高増殖性細胞が、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である細胞を含む、［１］または［２］に記載の高増殖性細胞。
［４］前記高増殖性細胞が、外胚葉性前駆細胞を含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞。
［５］前記外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、［１］～［４］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞。
［６］高増殖性細胞の製造方法であって、
（ｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
を含み、
前記（ｉ）において、前記阻害剤の存在下での培養期間が、２８日以下である、高増殖性細胞の製造方法。
［７］高増殖性細胞の製造方法であって、
（ｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
を含み、
前記（ｉ）において、条件ａ１、条件ｂ１および条件ｃ１からなる群より選択される少なくとも１つを充たすまで、前記阻害剤の存在下での培養を行う、高増殖性細胞の製造方法。
（ａ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）およびコントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）によって決定される相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、下記表２で表される基準範囲を充たす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 （ｂ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞の細胞数が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える。
（ｃ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である。
［８］前記原料となる外胚葉性細胞が、中枢神経系の細胞を含む、［６］または［７］に記載の高増殖性細胞の製造方法。
［９］前記原料となる外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、［６］～［８］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
［１０］前記阻害剤が、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む、［６］～［９］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
［１１］前記（ｉ）において、前記阻害剤の存在下での培養が、前記阻害剤を含む培地を用いた培養であり、前記培地における前記阻害剤の濃度が、０．００１μＭ～１００μＭの範囲内である、［６］～［１０］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
［１２］（Ｉ）［１］～［５］のいずれか１項に記載の外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞の培養物を得ること、または、［６］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法を実施して高増殖性細胞の培養物を得ること、および
（ＩＩ）前記培養物から、前記高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を分離すること
を含む、高増殖性細胞由来の細胞分泌物の製造方法。
［１３］前記細胞分泌物が、エクソソームを含む、請求項１２に記載の細胞分泌物の製造方法。
［１４］タンパク質およびｍｉＲＮＡの少なくとも一方を含む細胞分泌物であって、
前記タンパク質は、
糖タンパク質Ｍ６Ｂ（Ｑ１３４９１）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲα鎖（Ｐ０１９０３）、トゥイーティーホモログ１（Ｑ９Ｈ３１３）、フィブリリン－２（Ｐ３５５５６）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲＢ１β鎖（Ｐ０１９１１）、およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｐ０５１０９）の組み合わせを含み、
前記ｍｉＲＮＡは、
ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６（ＭＩＭＡＴ００００４６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２６５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７０７）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５５）の組み合わせを含む、細胞分泌物。
　本開示によれば、高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途を提供することができる。
図１は、実施例１に係る培養後の外胚葉性細胞の形態を示し、図１－１は、４０倍の拡大図である。 図１は、実施例１に係る培養後の外胚葉性細胞の形態を示し、図１－２は、１００倍の拡大図である。 図２は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのプロテオーム解析により選出されたタンパク質を示す。 図３は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのプロテオーム解析により選出されたタンパク質を示す。 図４は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのプロテオーム解析により選出されたタンパク質を示す。 図５は、実施例６に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたパーキンソン病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図６は、実施例６に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたアルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図７は、実施例６に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたアルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図８は、実施例６に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたアルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図９は、実施例６に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたアルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図１０は、実施例６に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたうつ病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図１１は、実施例８に係るＮＨＡ－ＹＡ群の細胞の形態を示し、図１１－１は、Ｎ－Ｄ９（Ｐ３）、ＹＡ－Ｄ９（Ｐ３）、Ｎ－Ｄ２８（Ｐ５）およびＹＡ－Ｄ２８（Ｐ５）の細胞の形態を示す。 図１１は、実施例８に係るＮＨＡ－ＹＡ群の細胞の形態を示し、図１１-２は、Ｎ－Ｄ９（Ｐ６）、ＹＡ－Ｄ９（Ｐ６）、Ｎ－Ｄ２８（Ｐ８）およびＹＡ－Ｄ２８（Ｐ８）の形態を示す。 図１２は、本開示の細胞分泌物に含まれるｍｉＲＮＡの例を示す。
　以下に、本発明について例を挙げて説明する。なお、各発明に関する記載は、特に述べない限り、それぞれの記載を援用できる。
　本明細書において、用語「細胞」は、特に断らない限り、少なくとも１つの細胞が含まれる用語として解釈される。このため、特に断らない限り、用語「細胞」が意味する細胞は、一細胞であることに限定されず、細胞集団と同義として使用され得る。
　本明細書において、用語「細胞集団」は、特に断らない限り、少なくとも１種類の細胞が含まれる用語として解釈される。このため、特に断らない限り、用語「細胞集団」が意味する細胞は、１種類の細胞であることに限定されない。
　「外胚葉」は、後生動物の発生途中に生ずる三胚葉の１つである。外胚葉は、胚の外側の層に由来し、皮膚、神経系、感覚器等に発達する。本明細書において、皮膚としては、例えば、表皮、髪、爪および皮膚腺が挙げられ、神経系としては、例えば、脳神経、脊髄および末梢神経が挙げられ、感覚器としては、例えば、視覚器、聴覚器、平衡覚器、味覚器、嗅覚器および触覚器が挙げられる。
　本明細書において、用語「前駆細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）」は、特に断らない限り、成熟細胞に至るまでの分化段階の細胞であって、幹細胞から発生して体を構成する最終分化細胞へと分化することができる細胞を意味する。
　本明細書において、用語「低分子シグナル伝達経路阻害剤」は、単に「阻害剤」と称することもある。
　本明細書において、「遺伝子の発現量」は、例えば、直接的に、遺伝子そのものの発現量でもよいし、間接的に、その遺伝子がコードするタンパク質の発現量でもよい。このため、本明細書において、遺伝子の発現は、例えば、遺伝子がコードするタンパク質の発現に読み替え可能である。
＜１＞高増殖性細胞
　本開示の高増殖性細胞としては、第１の高増殖性細胞または第２の高増殖性細胞が挙げられる。
（第１の高増殖性細胞）
　まず、本開示の第１の高増殖性細胞は、前述のように、外胚葉性細胞の特徴を備え、以下のＡ１の発現挙動を示す、外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞である。
（Ａ１）前記高増殖性細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）およびコントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）によって決定される相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、下記表１で表される基準範囲を充たす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本開示において、前記マーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）は、例えば、前記マーカー遺伝子がコードするタンパク質の発現量により表されてもよいし、前記コントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）は、例えば、前記コントロール遺伝子がコードするタンパク質の発現量により表されてもよい。なお、相対値（Ｅ１／ＥＣ）は、例えば、マーカー遺伝子を用いる場合と、マーカー遺伝子がコードするタンパク質を用いる場合とで、同じ値であっても異なる値であってもよい。
　本開示において、高増殖性細胞（ｈｉｇｈｌｙ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）（本明細書では、「ＨＰ細胞」と称することがある）とは、増殖能が高い細胞である。増殖能が高い細胞とは、例えば、対照細胞と比較して、細胞増殖活性がより高く、より短時間で増殖する性質、すなわち細胞倍加時間がより短いという性質、より長期間に亘って増殖する性質、またはこれら双方を充たす性質を備える細胞であることを意味する。
　本開示の高増殖性細胞は、外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞であり、高い細胞増殖能を示す。このため、本開示の高増殖性細胞は、例えば、長期間にわたる培養が可能であり、また、培養によって効率よく細胞数を増やすことができる。また、本開示の高増殖性細胞は、例えば、後述するような細胞分泌物を生成可能であるため、例えば、多数の細胞が得られることにより、前記細胞分泌物の回収量を増加させることができる。
　本開示の高増殖性細胞において、「増殖能が高い」とは、前述のように、前記対照細胞と比較して、より増殖能が高いことを意味する。前記対照細胞は、例えば、低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触の外胚葉性細胞である。ここで、高増殖性細胞に関連して言及される低分子シグナル伝達経路阻害剤については、後述する製造方法に関して記述されているものが該当する。
　本明細書において、「低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触の外胚葉性細胞」とは、例えば、前記阻害剤で処理されていない外胚葉性細胞、具体的には、前記阻害剤の存在下で培養されていない外胚葉性細胞である。前記外胚葉性細胞は、例えば、本開示の高増殖性細胞の製造方法において後述するように、前記阻害剤の存在下での培養によって、その増殖能が高められる。このため、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞、すなわち、前記阻害剤で処理されていない外胚葉性細胞は、増殖能の向上が誘導されていない細胞ということができ、本明細書では、「増殖未誘導の外胚葉性細胞」と称することがある。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、外胚葉性細胞を原料として、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤存在下での培養によって得ることができ、具体例としては、後述する、本開示の高増殖性細胞の第１の製造方法または第２の製造方法（以下、あわせて「本開示の高増殖性細胞の製造方法」ともいう）により得ることができる。本開示の高増殖性細胞の製造方法において、原料として使用する外胚葉性細胞は、本明細書では、「原料細胞」と称することがある。前記原料細胞は、例えば、前記阻害剤と非接触である外胚葉性細胞、すなわち前記増殖未誘導の外胚葉性細胞である。本開示の高増殖性細胞が、例えば、前記本開示の高増殖性細胞の製造方法により得られた場合、本開示の高増殖性細胞は、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）と比較して、増殖能が高められた細胞ということができる。なお、本開示の高増殖性細胞は、例えば、以下に示す本開示の高増殖性細胞の特徴を示す限り、本開示の高増殖性細胞の製造方法に製造されるものには限定されず、その他の製造方法により製造されてもよい。
　本開示の高増殖性細胞については、特に示さない限り、後述する本開示の高増殖性細胞の第１の製造方法または第２の製造方法の記載を援用できる。具体的に、本開示の高増殖性細胞の説明において、例えば、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤、前記外胚葉性細胞（原料細胞）等は、前記本開示の高増殖性細胞の製造方法における記載を援用できる。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、細胞集団でもよい。前記細胞集団は、例えば、ＨＰ細胞のみを含んでもよいし、ＨＰ細胞に加えて、それ以外の細胞を含んでもよい。前記それ以外の細胞とは、例えば、ＨＰ細胞よりも増殖能が低い細胞、すなわち、非高増殖性細胞（ｎｏｎ－ｈｉｇｈｌｙ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）（本明細書では、「ｎｏｎ－ＨＰ細胞」と称することがある）でもよい。本開示の高増殖性細胞が、例えば、本開示の高増殖性細胞の製造方法で得られた場合、前記細胞集団は、ＨＰ細胞に加えて、前記それ以外の細胞として、例えば、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）と比較して増殖能が高められておらず、前記原料細胞の増殖能と変わらない細胞を含んでもよい。前記細胞集団におけるＨＰ細胞の割合は、例えば、細胞数基準で、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上でもよい。
　本開示の高増殖性細胞において、その特徴は、コントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）に対するマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）の相対値で表すことができる。具体的に、本開示の高増殖性細胞は、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、前記表１の基準範囲を充たせばよい。なお、ＣＳＰＧ４は、ＮＧ２と称されることもある。前記表１の基準範囲を充たすマーカー遺伝子は、例えば、２種類以上、３種類以上、４種類以上、５種類以上、または全てでもよい。
　各マーカー遺伝子の相対値（Ｅ１／ＥＣ）の基準範囲は、例えば、以下の基準を基に設定することができる。下記（１）または（２）における培養日数（２８日超え、または２８日以下）は、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下における前記原料細胞（前記外胚葉性細胞）の培養日数を意味する。
（１）２８日超での培養で、前記マーカー遺伝子が発現している範囲を除く；および
（２）２８日以下の培養で、前記マーカー遺伝子が発現している範囲である。
但し、２８日以下の培養の全ての期間で、２８日超での培養で前記マーカー遺伝子が発現している範囲が除かれている必要はない。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、少なくともマーカー遺伝子ＧＦＡＰの相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、前記表１の基準範囲を充たすことが好ましい。また、本開示の高増殖性細胞において、前記表１の基準範囲を充たすマーカー遺伝子の組み合わせは、例えば、
ＧＦＡＰとＣＳＰＧ４との組み合わせ、
ＧＦＡＰとＭｕｓａｓｈｉ１とＣＳＰＧ４とＳＬＣ１Ａ３との組み合わせ、
ＧＦＡＰとＭｕｓａｓｈｉ１とＮｅｓｔｉｎとＣＳＰＧ４とＳＬＣ１Ａ３との組み合わせ、
ＧＦＡＰとＭｕｓａｓｈｉ１とＣＳＰＧ４との組み合わせ、
ＧＦＡＰとＮｅｓｔｉｎとＣＳＰＧ４とＳＬＣ１Ａ３との組み合わせ、または、
ＧＦＡＰとＭｕｓａｓｈｉ１とＮｅｓｔｉｎとＳ１００ＢとＣＳＰＧ４とＳＬＣ１Ａ３との組み合わせ等が例示できる。
　前記表１において、ＳＬＣ１Ａ３の基準範囲は、「＞０．０９」であり、好ましくは、「＞０．０９０」である。また、前記表１において、ＣＳＰＧ４の基準範囲は、「＜０．０１５」であり、好ましくは、「＜０．０１５０」である。
　本開示の高増殖性細胞において、前記Ａ１の発現挙動は、例えば、さらに前記マーカー遺伝子としてＯＬＩＧ２を含み、前記コントロール遺伝子との相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、基準範囲「＜０．０００１」を充たしてもよく、前記基準範囲は、好ましくは「＜０．０００１０」である。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、前記マーカー遺伝子の少なくとも１つの相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、前記Ａ１の基準範囲を充たし、且つ、前記マーカー遺伝子の少なくとも１つの相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、下記表３の下限と上限の範囲を充たしてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　前記コントロール遺伝子は、例えば、細胞の種類に関わらず、恒常的に発現する遺伝子が好ましく、例えば、ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ（ＡＣＴＢ）およびＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）が例示できる。前記表１におけるコントロール遺伝子は、例えば、ＧＡＰＤＨまたはＡＣＴＢであり、好ましくはＧＡＰＤＨである。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、高い未分化性を示す細胞である。本開示の高増殖細胞について、未分化性が高いとは、例えば、前記対照細胞と比較して、未分化性がより高いことを意味する。前記対照細胞は、例えば、前述と同様に、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触の外胚葉性細胞、すなわち、前記増殖未誘導の外胚葉性細胞である。本開示の高増殖性細胞が、例えば、本開示の高増殖性細胞の製造方法により得られた場合、本開示の高増殖性細胞は、例えば、前記原料細胞と比較して、未分化性が高められた細胞ということができる。また、本開示において「高増殖性細胞」は、特に示さない限り、未分化性が高い高増殖性細胞の意味を包含する。本開示の高増殖性細胞が、未分化性が高い細胞であることは、例えば、未分化に関係するマーカーの発現挙動によって特定できる。前記マーカーは、例えば、遺伝子マーカーでもよいし、前記遺伝子マーカーでコードされるタンパク質マーカーでもよい。
　本明細書において、未分化性とは、例えば、分化の最終段階、換言すれば、それ以上分化しない段階に至る途中段階の細胞の特徴を有することを意味する。あるいは、未分化性とは、例えば、分化していない状態が維持されていることを意味し、未分化の性質を示す（例えば、幹細胞の性質を示す）、または、より未分化に近い分化段階の性質を示す（例えば、より幹細胞に近い性質を示す）ことを意味してもよい。
　本開示の高増殖性細胞の特徴は、前述のように、前記コントロール遺伝子に対する前記マーカー遺伝子の発現量の相対値（Ｅ１／ＥＣ）として特定でき、それ以外にも、例えば、同じ項目について、前記対照細胞との比較を行うことにより特定することもできる。前記項目（以下、特定項目ともいう）は、例えば、細胞の性質であり、具体的には、例えば、前述の増殖能、未分化性、マーカーの発現挙動等である。前記マーカーは、例えば、マーカー遺伝子でもよいし、前記マーカー遺伝子がコードするタンパク質（マーカータンパク質）でもよい。前記マーカー遺伝子および前記マーカータンパク質は、例えば、前述した遺伝子およびタンパク質には制限されず、その他に、以下に例示するようなマーカーを含んでもよい。
　前記高増殖性細胞と前記対照細胞との比較は、例えば、前記対照細胞として、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）を使用し、以下のように評価することができる。
　前記評価の第１態様は、例えば、前記高増殖性細胞と前記対照細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）とを、それぞれ、前記阻害剤の非存在下で培養し、同じ項目について比較を行う。
　前記第１態様において、前記阻害剤を非存在下とする以外の他の培養条件は、特に制限されない。前記他の培養条件は、例えば、４×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度、３７℃の培養温度、５％ＣＯ２濃度等が挙げられる。また、培養期間（以下、培養期間Ｓともいう）は、特に制限されず、例えば、５～２４日間である。前記培養期間は、例えば、前記項目に応じて、同一期間でもよいし、異なる期間でもよいが、同一期間が好ましい。また、培養に使用する培地は、特に制限されず、後述する本開示の高増殖性細胞の製造方法において例示するものが使用できる。前記高増殖性細胞および前記対照細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）の各細胞の培養においては、例えば、前記阻害剤未添加の同一の培地を使用できる。
　つぎに、前記評価の第２態様は、例えば、前記阻害剤の存在下、２８日以下の培養期間（以下、培養期間Ｔともいう）で前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）を培養することによって得られた前記高増殖性細胞と、前記阻害剤の非存在下、前記培養期間Ｔで培養した前記対照細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）とについて、同じ項目について比較を行う。前記培養期間Ｔは、例えば、後述する本開示の高増殖性細胞の製造方法における例示を援用できる。
　前記第２の態様において、前記阻害剤の有無および前記培養期間Ｔ以外の培養条件は、特に制限されない。前記他の培養条件は、例えば、４×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度、３７℃の培養温度、５％ＣＯ２濃度等が挙げられる。培養に使用する培地は、特に制限されず、後述する本開示の高増殖性細胞の製造方法において例示するものが使用できる。前記阻害剤存在下の前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）の培養と、前記阻害剤非存在下の前記対照細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）の培養は、例えば、前記阻害剤の有無以外は、同一の培地を使用でき、また、前記高増殖性細胞の製造および維持に適用される培養条件と同一の培養条件にて、実施できる。
　具体例として、前記高増殖性細胞の増殖能は、例えば、前記対照細胞の細胞数との比較により、以下のように評価できる。前記増殖能の評価には、前記対照細胞として、前述したように、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触の外胚葉性細胞、すなわち、前記増殖未誘導の外胚葉性細胞が使用できる。また、本開示の高増殖性細胞を、本開示の高増殖性細胞の製造方法によって製造した場合、前記対照細胞は、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）でもよい。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、前記対照細胞に対して、以下のＮ１の増殖能を示し、前記対照細胞が、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）である。Ｎ１において、培養期間は、特に制限されず、例えば、前記培養期間Ｓで例示した日数が挙げられる。
（Ｎ１）前記高増殖性細胞と前記対照細胞とを、それぞれ、前記阻害剤の非存在下、同一の培養期間、同一の培養条件で培養した場合、得られた前記高増殖性細胞の細胞数（Ｎ１）と得られた前記対照細胞の細胞数（Ｎ１’）とが、（Ｎ１／Ｎ１’）＞１．０を充たす。
　本態様において、得られた前記高増殖性細胞の細胞数（Ｎ１）と得られた前記対照細胞の細胞数（Ｎ１’）との比率（Ｎ１／Ｎ１’）は、例えば、前述のように、１．０倍超であり、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、または１．５倍以上でもよい。前記比率（Ｎ１／Ｎ１’）は、好ましくは、１．５倍以上である。
　本態様は、前記評価の第１態様が参照できる。この場合、前記高増殖性細胞および前記対照細胞を、それぞれ、前記阻害剤の非存在下、同一の培養期間、同一の培養条件により培養すればよい。前記阻害剤の有無および前記培養期間の項目以外で、さらに同一にする培養条件の項目は、例えば、前記阻害剤を含有しない培地の組成、播種密度、培養温度、ＣＯ２濃度等である。前記培養期間は、特に制限されず、前記培養期間Ｓで例示した日数が挙げられる。
　また、本開示の高増殖性細胞は、例えば、前記対照細胞に対して、以下のＮ２の増殖能を有し、前記対照細胞が、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）である。
（Ｎ２）前記阻害剤の存在下、２８日以下の培養期間Ｔ、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）を培養して得られた前記高増殖性細胞の細胞数（Ｎ２）と、前記阻害剤の非存在下である以外は、前記培養期間Ｔ、同一の培養条件で培養して得られた前記対照細胞の細胞数（Ｎ２’）とが、（Ｎ２／Ｎ２’）＞１．０を充たす。
　本態様において、得られた前記高増殖性細胞の細胞数（Ｎ２）と得られた前記対照細胞の細胞数（Ｎ２’）との比率（Ｎ２／Ｎ２’）は、例えば、前述のように、１．０倍超であり、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、または１．５倍以上でもよい。前記比率（Ｎ２／Ｎ２’）は、好ましくは、１．５倍以上である。
　本態様においては、前記評価の第２態様が参照できる。この場合、前記培養期間Ｔは、前述のように、その上限が、２８日以下であり、例えば、２０日、１８日、１４日、その下限が、例えば、１日、４日、５日、７日、その範囲が、例えば、１～２８日、４～２８日、５～２８日、７～２８日、７～２０日、７～１８日、７～１４日である。本態様は、前記原料細胞と前記対照細胞とを、前者は前記阻害剤の存在下とし、後者は前記阻害剤の非存在下とする以外は、同一の培養期間Ｔ、同一条件により培養すればよい。また、前記培養期間Ｔの項目以外で、同一にする培養条件の項目は、例えば、培地の組成（前記阻害剤の有無は除く）、播種密度、培養温度、ＣＯ２濃度等である。
　評価方法としては、例えば、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）を、前記阻害剤含有培地および前記阻害剤未含有培地を使用した以外は、同一期間（例えば、５～１４日間、または５～１０日間）、同一条件で培養し、前記阻害剤含有培地で培養された細胞（すなわち、高増殖性細胞）の細胞数と、前記阻害剤未含有培地で培養された細胞（すなわち、原料細胞）の細胞数とを比較する方法が挙げられる。この他にも、例えば、前記原料細胞を前記阻害剤含有培地で２８日以下の培養を行うことで得られた高増殖性細胞と、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）とを、それぞれ、前記阻害剤未含有培地で、同一期間（例えば、５～１４日間、または５～１０日）、同一条件で培養し、前者の細胞数と後者の細胞数とを比較する方法でもよい。
　また、前記高増殖性細胞は、前述のとおり、例えば、前記阻害剤の存在下、２８日以下の培養期間（本明細書では、「期間Ｔ」とする。）で前記外胚葉性細胞を培養して得ることができる。こうして得られた前記高増殖性細胞の高増殖性は、例えば、次のように確認できる。すなわち、前述の培養で得られた前記高増殖性細胞の細胞数（本明細書では、「高増殖性細胞の細胞数Ｎ」とする。）が、前記阻害剤の非存在下である以外は、同一の培養期間、同一の培養条件で培養された前記外胚葉性細胞の細胞数（本明細書では、「外胚葉性細胞の細胞数Ｎ’」とする。）に対して、１．０倍を超える場合、高増殖能と評価する。
　一態様において、高増殖性細胞の細胞数Ｎは、外胚葉性細胞の細胞数Ｎ’の１．０倍超であれば、特に制限はなく、例えば、細胞数Ｎ’の１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上または１．５倍以上であってもよい。好ましくは、高増殖性細胞の細胞数Ｎが、外胚葉性細胞の細胞数Ｎ’の１．５倍以上である。
　前記高増殖性細胞は、前述のように、細胞に特有のマーカー、すなわち前記高増殖性細胞に特有のマーカー（例えば、遺伝子またはタンパク質）の発現によって特定してもよい。前記高増殖性細胞のマーカーの発現は、前述したように、前記マーカー遺伝子およびそれがコードする前記マーカータンパク質のいずれに基づいて確認してもよい。遺伝子またはタンパク質の発現の確認方法は、特に制限されず、例えば、発現の有無、測定方法に依存した具体的な発現量もしくは相対的な発現量、前記高増殖性細胞とは別の特定の細胞における同一遺伝子またはタンパク質の発現量との比較等よって行うことができる。
　本明細書では、前記マーカー（前記マーカー遺伝子または前記マーカータンパク質）の発現に関して、「陽性」または「陰性」と表現することがある。遺伝子またはタンパク質の発現に関して、一般的に、「陽性」とは、対象となる遺伝子またはタンパク質の発現が認められる場合を意味し、一方、「陰性」とは、対象となる遺伝子またはタンパク質の発現が認められない場合、または検出限界以下である場合を意味する。遺伝子またはタンパク質の発現に関して、「発現が高い」もしくは「陽性」、または「発現が低い」もしくは「陰性」と表現する場合、前記高増殖性細胞とは異なる特定の細胞を比較対照とすることができる。比較対照となる特定の細胞、すなわち、比較する「対照細胞」は、特に制限されず、対象となる遺伝子またはタンパク質の発現量が、極めて低い細胞（以下、低発現細胞ともいう）でもよく、極めて高い細胞（以下、高発現細胞ともいう）でもよい。前記低発現細胞は、例えば、対象となるマーカーの発現量が、検出限界以下であり検出できない細胞でもよい。
　前記高増殖性細胞と比較する前記対照細胞は、例えば、本開示の製造方法において原料となる外胚葉性細胞、すなわち前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）でもよい。また、前記対照細胞は、例えば、成熟細胞もしくはその前駆細胞であってもよい。前記対照細胞は、例えば、外胚葉性成熟細胞（以下、成熟細胞ともいう）でもよく、前駆細胞（以下、外胚葉性前駆細胞ともいう）でもよい。
　また、本開示の高増殖性細胞が、前記マーカーの発現に関し「陽性」であるとは、前記高増殖性細胞での前記マーカーの発現量が、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）での前記マーカーの発現量の１．０倍以上であることを意味することができる。これに対し、前記高増殖性細胞が、前記マーカーの発現に関し「陰性」であるとは、前記高増殖性細胞での前記マーカーの発現量が、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）での前記マーカーの発現量の１．０倍未満であることを意味することができる。
　本明細書において、前記マーカーの発現について、「同じかそれ以上」という場合は、特に示さない限り、比較する対照細胞における発現量に対して、１．０倍以上の発現量であることを意味する。
　前記高増殖性細胞の特定を、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）を前記対照細胞として、前記マーカーの発現の比較により行う場合、前記比較は、例えば、前述した、前記評価の第１態様、または前記評価の第２態様により行うことができる。
　すなわち、前記評価の第１態様の場合、前記高増殖性細胞および前記対照細胞は、例えば、前記阻害剤の非存在下、同一の培養期間Ｓ、同一条件により培養し、評価項目となる前記マーカーの発現を比較すればよい。前記阻害剤の項目以外で、さらに同一にする培養条件の項目は、例えば、培地の組成、播種密度、培養温度、ＣＯ２濃度等である。
　また、前記評価の第２態様の場合、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）と前記対照細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）とを、前者は前記阻害剤の存在下、後者は前記阻害剤の非存在下とする以外は、同一の培養期間Ｔ、同一条件により培養し、評価項目となる前記マーカーの発現を比較すればよい。前記培養期間Ｔの項目以外で、さらに同一にする培養条件の項目は、例えば、培地の組成（前記阻害剤の有無は除く）、播種密度、培養温度、ＣＯ２濃度等である。
　なお、前記評価の第２態様において、前記マーカーの発現の比較を行う場合、発現量の確認方法に供与する高増殖性細胞および外胚葉性細胞の培養条件は、阻害剤と接触または非接触であること以外は、同一とすることができる。前記培養条件は、例えば、細胞の状態、増殖性および細胞数等に基づいて、対象となる細胞が同一または極めて同一の状態となるように等、培養期間、細胞継代数および細胞密度等を調整でき、当業者は、細胞の状態に基づいて、条件を選択可能である。
　前記マーカーの発現量は、例えば、コントロールに対する発現量、すなわち、コントロールの発現量（ＥＣ）に対するマーカーの発現量（Ｅ１）の相対値（Ｅ１／ＥＣ）として表される。前記コントロールは、例えば、遺伝子またはタンパク質であり、具体例として、前記マーカーがマーカー遺伝子の場合は、遺伝子であり、前記マーカーがマーカータンパク質の場合は、タンパク質である。前記コントロールは、例えば、細胞の種類に関わらず、恒常的に発現する遺伝子またはタンパク質が好ましい。前記コントロール遺伝子としては、例えば、前述のように、ＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨが使用可能であり、前記コントロールタンパク質としては、例えば、ＡＣＴＢタンパク質、ＧＡＰＤＨタンパク質が使用可能である。
　未分化性に関するマーカー（未分化性マーカー）としては、例えば、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＳＰＧ４、Ｍｕｓａｓｈｉ１（ＭＳＩ１）、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＡＸ６等が挙げられる。これらの未分化性マーカーの発現挙動に基づいて、例えば、発現が陽性か否か、発現量が相対的に多いか否かによって、細胞の未分化性を評価できる。ここで、前記未分化性マーカーが陽性であるとは、例えば、前記阻害剤と未接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）での発現量と比較して、１．０倍以上であることを意味する。本開示の高増殖性細胞は、例えば、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＳＰＧ４、Ｍｕｓａｓｈｉ１（ＭＳＩ１）、Ｎｏｔｃｈ１、およびＰＡＸ６からなる群より選択される少なくとも１つマーカー遺伝子が陽性である。本開示の高増殖性細胞は、例えば、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＳＰＧ４、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、およびＰＡＸ６のうち、２種類以上が陽性でもよいし、全てが陽性でもよい。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、前記未分化性マーカーに関し、以下の（１）～（６）からなる群から選択された少なくとも１つの細胞を含むことができる。以下の例示において、陽性とは、前述のように、例えば、前記阻害剤と未接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）での発現量と比較して、同じがそれ以上、具体例として、１．０倍以上であることを意味する。
　（１）ＳＯＸ２陽性細胞、好ましくは、さらに、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳ１００Ｂからなる群から選択された少なくとも１つが陽性であり、ＣＳＰＧ４が陰性であるＳＯＸ２陽性細胞
　（２）Ｍｕｓａｓｈｉ１陽性細胞、好ましくは、さらに、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳ１００Ｂからなる群から選択された少なくとも１つが陽性であり、ＣＳＰＧ４が陰性であるＭｕｓａｓｈｉ１陽性細胞
　（３）Ｎｅｓｔｉｎ陽性細胞、好ましくは、さらに、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳ１００Ｂからなる群から選択された少なくとも１つが陽性であり、ＣＳＰＧ４が陰性であるＮｅｓｔｉｎ陽性細胞
　（４）Ｎｏｔｃｈ１陽性細胞、好ましくは、さらに、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳ１００Ｂからなる群から選択された少なくとも１つが陽性であり、ＣＳＰＧ４が陰性であるＮｏｔｃｈ１陽性細胞
　（５）Ｓ１００Ｂ陽性細胞、好ましくは、さらに、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＮｏｔｃｈ１からなる群から選択された少なくとも１つが陽性であり、ＣＳＰＧ４が陰性であるＳ１００Ｂ陽性細胞
　（６）ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳ１００Ｂからなる群から選択された少なくとも１つが陽性であり、ＣＳＰＧ４が陰性であるＣＳＰＧ４陰性細胞
　本開示の高増殖性細胞は、前述のように、外胚葉性細胞を由来とする高い増殖能を有する細胞であればよく、その分化段階は問わない。本開示の高増殖性細胞の分化段階は、例えば、前駆細胞に特有のマーカー、成熟細胞に特有のマーカー、または、前駆細胞から成熟細胞に至る分化段階に特有のマーカーを検出することによって、特定できる。
　一態様において、本開示の高増殖性細胞は、例えば、未成熟な分化段階の細胞である。本開示の高増殖性細胞が、高増殖性を示し且つ未成熟な分化段階である場合、例えば、高増殖性を示す外胚葉性前駆細胞と呼ぶことができ、以下、「高増殖性外胚葉性前駆細胞または高増殖性前駆細胞」と称することもある。また、本開示において「高増殖性細胞」は、特に示さない限り、高増殖性前駆細胞を包含する。
　一態様において、本開示の高増殖性細胞は、例えば、成熟細胞に特有の少なくとも１つのマーカーを、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）と同じかそれ以上に発現し、かつ、前駆細胞に特有の少なくとも１つのマーカーを、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）と同じかそれ以上に発現することができる。
　成熟細胞に特有のマーカー遺伝子は、例えば、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、およびＳＬＣ１Ａ３を挙げることができる。これらは、例えば、外胚葉性細胞に分類されるグリア細胞、具体例として、アストロサイト等で、比較的高く発現している遺伝子である。これらの遺伝子およびこれらがコードするタンパク質は、外胚葉性成熟細胞をはじめとする成熟細胞について、成熟細胞であることを示すマーカーとして知られている。
　前駆細胞に特有のマーカー遺伝子は、例えば、ＣＳＰＧ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２等を挙げることができる。これらは、例えば、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経上皮細胞および放射状グリア細胞等で比較的高く発現している遺伝子である。これらの遺伝子およびこれらがコードするタンパク質は、外胚葉性前駆細胞をはじめとする前駆細胞について、前駆細胞であることを示すマーカーとして知られている。
　本開示の高増殖性細胞は、前述のように、高い増殖能を有し、前記Ａ１の発現挙動を示す細胞であればよく、その他のマーカー（遺伝子またはタンパク質）に関しては、如何なる発現パターンを示す細胞でもよく、また、前記高増殖性細胞を含む細胞集団でもよい。本開示の高増殖性細胞は、例えば、次に挙げるようなマーカーの発現パターンを示すものでもよい。前記Ａ１の発現挙動に加えて、以下に例示するマーカーの発現パターンにしたがって、本開示の高増殖性細胞を、例えば、迅速に特定し、抽出することもできる。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、ＧＦＡＰが陽性の細胞を含むことができる。この場合、前記高増殖性細胞は、例えば、ＧＦＡＰを、前記対照細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）と同じかそれ以上に発現できる。具体例として、前記対照細胞に対するＧＦＡＰの発現量は、下限が、例えば、１．０倍以上、４．０倍以上であり、上限が、例えば、２００倍以下である。
　他の一態様では、前記高増殖性細胞は、例えば、ＧＦＡＰが陽性、かつ、ＣＳＰＧ４が陰性の細胞を含むことができ、または、ＧＦＡＰを前記対照細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＣＳＰＧ４の発現量が前記対照細胞の発現量未満（１．０倍未満）とする細胞を含むことができる。他の一態様では、前記高増殖性細胞は、ＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂが陽性、かつ、ＣＳＰＧ４が陰性の細胞を含むことができ、または、ＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂを、前記対照細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＣＳＰＧ４の発現量を前記対照細胞の発現量未満（１．０倍未満）とする細胞を含むことができる。
　別の一態様において、前記高増殖性細胞は、例えば、前記外胚葉性成熟細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を、前記対照細胞（前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞）と同じかそれ以上に発現し、かつ、前記外胚葉性前駆細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を、前記対照細胞と同じかそれ以上に発現する細胞を含むことができる。
　一態様において、前記高増殖性細胞は、例えば、ＣＳＰＧ４が陰性の細胞を含むことができ、または、ＣＳＰＧ４を前記対照細胞（前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞）におけるＣＳＰＧ４の発現量よりも少なく発現する細胞を含むことができる。すなわち、この態様において、前記高増殖性細胞は、例えば、ＣＳＰＧ４の発現量が、前記対照細胞におけるＣＳＰＧ４の発現量よりも低いものでもよい。
　一態様において、前記高増殖性細胞は、例えば、Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、ＣＳＰＧ４が陰性の細胞を含むことができ、または、Ｓ１００Ｂを前記対照細胞（前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞）と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＣＳＰＧ４を前記対照細胞よりも少なく発現することができる。
　本開示の高増殖性細胞は、高い増殖能を有する高増殖性細胞、特に高増殖性外胚葉性細胞であればよく、前述のように、その分化段階は問わない。前記高増殖性細胞の細胞集団は、例えば、前記高増殖性外胚葉性成熟細胞および前記高増殖性外胚葉性前駆細胞の両方が含まれたヘテロな細胞集団でもよく、あるいは比較的分化段階の近い複数種の高増殖性外胚葉性細胞が極めて大多数を占める細胞集団でもよい。
　一態様では、本開示の高増殖性細胞の細胞集団は、例えば、前記高増殖性外胚葉性前駆細胞を主要な構成成分として含む集団でもよく、または、前記高増殖性外胚葉性前駆細胞および前記高増殖性外胚葉性成熟細胞の双方を含む集団でもよい。ここで、細胞集団における「主要な構成成分」とは、例えば、細胞集団において細胞数基準で少なくとも５０％を占める細胞を意味する。本明細書において、「極めて大多数」とは、例えば、細胞集団において、特定の細胞の細胞数が、細胞数基準で９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上であることを意味する。
　前記高増殖性細胞の細胞集団における前記高増殖性外胚葉性成熟細胞の割合は、例えば、細胞数基準で、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満でもよい。
　前記高増殖性細胞の細胞集団には、例えば、アストロサイトに関連する外胚葉性細胞系統の細胞が含まれてもよい。すなわち、前記高増殖性細胞が、例えば、原料となる外胚葉性細胞としてアストロサイトが使用されたもの、換言すれば、アストロサイトから誘導されるものであってもよく、本開示の製造方法により製造された場合、アストロサイトに関連する外胚葉性細胞系統の細胞が含まれてもよい。アストロサイトに関連する前記外胚葉性細胞系統の細胞としては、例えば、アストロサイト、放射状グリア細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ポリデンドロサイトとも言われる）、オリゴデンドロサイトおよび神経上皮細胞が挙げられる。また、アストロサイトに関連する前記外胚葉性細胞系統の細胞を含む前記細胞集団は、高い増殖能を示す細胞集団である限り、例えば、外胚葉性細胞に見られる特徴の一部を備え、かつ、上述した細胞のいずれにも分類できない細胞が含まれてもよい。
　また、本開示の製造方法において、原料となる外胚葉性細胞が、最終分化段階に到達したアストロサイト（成熟アストロサイト）を含む場合、例えば、本開示の高増殖性細胞は、アストロサイトよりも未成熟な分化段階の特徴を示す細胞が含まれてもよい。このような未成熟な分化段階の外胚葉性細胞は、アストロサイトよりも高められた増殖能を有することに加え、さらに、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の特性を有することができる。
　（ａ）アストロサイトと比較して、
ＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂの組み合わせ、ＧＦＡＰおよびＮｏｔｃｈ１の組み合わせ、ＧＦＡＰおよびＮｅｓｔｉｎの組み合わせ、ＧＦＡＰおよびＳＯＸ２の組み合わせ、
Ｓ１００ＢおよびＮｏｔｃｈ１の組み合わせ、Ｓ１００ＢおよびＮｅｓｔｉｎの組み合わせ、Ｓ１００ＢおよびＳＯＸ２の組み合わせ、
Ｎｏｔｃｈ１およびＮｅｓｔｉｎの組み合わせ、Ｎｏｔｃｈ１およびＳＯＸ２の組み合わせ、または
ＮｅｓｔｉｎおよびＳＯＸ２の組み合わせ
の発現量が増加している。
　（ｂ）アストロサイトと比較して、
ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、およびＮｏｔｃｈ１の組み合わせ；ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、およびＮｅｓｔｉｎの組み合わせ；ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、およびＳＯＸ２の組み合わせ；
ＧＦＡＰ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＮｅｓｔｉｎの組み合わせ；ＧＦＡＰ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳＯＸ２の組み合わせ；
ＧＦＡＰ、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２の組み合わせ；
Ｓ１００Ｂ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＮｅｓｔｉｎの組み合わせ；Ｓ１００Ｂ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳＯＸ２の組み合わせ；
またはＮｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２の組み合わせの発現量が増加している。
　（ｃ）アストロサイトと比較して、
ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＮｅｓｔｉｎの組み合わせ；ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｎｏｔｃｈ１、およびＳＯＸ２の組み合わせ；ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２の組み合わせ；ＧＦＡＰ、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２の組み合わせ；
またはＳ１００Ｂ、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２の組み合わせ
の発現量が増加している。
　（ｄ）アストロサイトと比較して、
ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２の組み合わせの発現量が増加している。
　本開示の高増殖性細胞は、上述したように、例えば、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つが陽性である細胞を含むことができる。前記高増殖性細胞は、例えば、以下の細胞（Ｉ）～（Ｖ）からなる群より選択される少なくとも１つを含むことができる。なお、以下の例示において、陽性の細胞とは、マーカー遺伝子を、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞と同じかそれ以上（例えば、１．０倍以上）に発現する細胞とも読み替え可能である。本開示の高増殖性細胞を、後述する本開示の高増殖性細胞の製造方法により得た場合、「前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞」は、例えば、「原料となる外胚葉性細胞」でもよい。
　（Ｉ－１）ＧＦＡＰ陽性細胞；
　（Ｉ－２）Ｓ１００Ｂ陽性細胞；
　（Ｉ－３）Ｎｏｔｃｈ１陽性細胞；
　（Ｉ－４）Ｎｅｓｔｉｎ陽性細胞；
　（Ｉ－５）ＳＯＸ２陽性細胞；
　（ＩＩ－１）ＧＦＡＰが陽性、かつ、Ｓ１００Ｂが陽性の細胞；
　（ＩＩ－２）ＧＦＡＰが陽性、かつ、Ｎｏｔｃｈ１が陽性の細胞；
　（ＩＩ－３）ＧＦＡＰが陽性、かつ、Ｎｅｓｔｉｎが陽性の細胞；
　（ＩＩ－４）ＧＦＡＰが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＩ－５）Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、Ｎｏｔｃｈ１が陽性；
　（ＩＩ－６）Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、Ｎｅｓｔｉｎが陽性；
　（ＩＩ－７）Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性；
　（ＩＩ－８）Ｎｏｔｃｈ１が陽性、かつ、Ｎｅｓｔｉｎが陽性；
　（ＩＩ－９）Ｎｏｔｃｈ１が陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性；
　（ＩＩ－１０）Ｎｅｓｔｉｎが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性；
　（ＩＩＩ－１）ＧＦＡＰが陽性、Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、Ｎｏｔｃｈ１が陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－２）ＧＦＡＰが陽性、Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、Ｎｅｓｔｉｎが陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－３）ＧＦＡＰが陽性、Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－４）ＧＦＡＰが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、かつ、Ｎｅｓｔｉｎが陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－５）ＧＦＡＰが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－６）ＧＦＡＰが陽性、Ｎｅｓｔｉｎが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－７）Ｓ１００Ｂが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、かつ、Ｎｅｓｔｉｎが陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－８）Ｓ１００Ｂが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－９）Ｓ１００Ｂが陽性、Ｎｅｓｔｉｎが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＩＩ－１０）Ｎｏｔｃｈ１が陽性、Ｎｅｓｔｉｎが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＶ－１）ＧＦＡＰが陽性、Ｓ１００Ｂが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、かつ、Ｎｅｓｔｉｎが陽性の細胞；
　（ＩＶ－２）ＧＦＡＰが陽性、Ｓ１００Ｂが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＶ－３）ＧＦＡＰが陽性、Ｓ１００Ｂが陽性、Ｎｅｓｔｉｎが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＶ－４）ＧＦＡＰが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、Ｎｅｓｔｉｎが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（ＩＶ－５）Ｓ１００Ｂが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、Ｎｅｓｔｉｎが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞；
　（Ｖ－１）ＧＦＡＰが陽性、Ｓ１００Ｂが陽性、Ｎｏｔｃｈ１が陽性、Ｎｅｓｔｉｎが陽性、かつ、ＳＯＸ２が陽性の細胞。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、ＧＦＡＰ、およびＳ１００Ｂからなる群より選択される少なくとも１つが陽性であり、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２から選択される少なくとも１つが陽性であり、かつ、ＣＳＰＧ４が陰性である細胞を含むことができる。すなわち、この態様において、上記（Ｉ）～（Ｖ）の細胞は、例えば、ＣＳＰＧ４が陰性である。
　本開示の高増殖性細胞は、例えば、アストロサイトのマーカーであるＳＬＣ１Ａ３が陽性でもよい。すなわち、この態様において、上記（Ｉ）～（Ｖ）の細胞は、例えば、さらに、ＳＬＣ１Ａ３が陽性である。本開示の高増殖性細胞は、例えば、オリゴデンドロサイトのマーカーであるＯＬＩＧ２が陰性でもよい。すなわち、この態様において、上記（Ｉ）～（Ｖ）の細胞は、例えば、さらに、ＯＬＩＧ２が陰性である。
　本開示の高増殖性細胞の細胞集団において、ＧＦＡＰ陽性細胞の割合は、例えば、１０％以上、好ましくは４０％以上、８０％以上であり、Ｍｕｓａｓｈｉ１陽性細胞の割合は、例えば、１０％以上、好ましくは４０％以上、８０％以上であり、ＳＯＸ２陽性細胞の割合は、例えば、１０％以上、１０％以上８０％未満、好ましくは４０％以上、４０％～８０％未満であり、Ｎｅｓｔｉｎ陽性細胞の割合は、例えば、１０％以上、１０％以上８０％未満、好ましくは４０％以上、４０％以上８０％未満である。なお、Ｍｕｓａｓｈｉ１陽性細胞は、例えば、ＳＯＸ２陽性でもよいし、Ｎｅｓｔｉｎ陽性でもよく、また、ＳＯＸ２陽性細胞は、例えば、Ｍｕｓａｓｈｉ１陽性でもよいし、Ｎｅｓｔｉｎ陽性でもよく、ＳＯＸ２陽性細胞は、例えば、Ｍｕｓａｓｈｉ１陽性でもよいし、Ｎｅｓｔｉｎ陽性でもよい。
（第２の高増殖性細胞）
　つぎに、本開示の第２の高増殖性細胞は、外胚葉性細胞の特徴を備え、外胚葉性細胞を前記低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日以下の培養期間後の細胞数が、前記阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞である。
　本開示の第２の高増殖性細胞は、前述の第１の高増殖性細胞と同様に、例えば、前記本開示の高増殖性細胞の製造方法により得ることができる。すなわち、例えば、外胚葉性細胞（前記原料細胞）を、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日以下の培養により、本開示の高増殖性細胞を得ることができる。そして、前記阻害剤存在下での２８日以下の前記培養により得られた前記高増殖性細胞は、前記阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える増殖能を有する。
　本開示の第２の高増殖性細胞においては、例えば、前記本開示の第１の高増殖性細胞における記載を全て、例示として援用できる。
　本開示の第２の高増殖性細胞は、例えば、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、前記阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である細胞を含む。
＜２＞高増殖性細胞の第１の製造方法
　本開示の高増殖性細胞の第１の製造方法は、高増殖性細胞の製造方法であって、
（ｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
を含み、
前記（ｉ）において、前記阻害剤の存在下での培養期間が、２８日以下である。
　本開示の製造方法によれば、前記（ｉ）の前記低分子シグナル伝達経路阻害剤存在下での培養により、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞（前記ＨＰ細胞）を得ることができる。すなわち、本開示の製造方法によれば、前記＜１＞で述べた本開示の高増殖性細胞を製造できる。なお、本開示の製造方法の説明は、前記＜１＞で述べた本開示の高増殖性細胞の製造方法を限定するものではない。
　本開示の高増殖性細胞の製造方法は、例えば、高増殖性の外胚葉性細胞の製造方法、または、細胞増殖能が高められた外胚葉性細胞の富化方法にも読み替え可能である。
　本開示の製造方法によれば、前述のように、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、２８日以下の培養期間、原料となる外胚葉性細胞を培養することによって、例えば、前記外胚葉性細胞への遺伝子導入または遺伝子改変等を伴うことなく、細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ることができる。このようにして得られた高増殖性細胞は、前記阻害剤の非存在下で培養した外胚葉性細胞と比較して、例えば、より長期間に亘って培養を行うことができ、また、より多くの数の細胞を得ることができる。
　また、本開示の製造方法によれば、前記（ｉ）の前記低分子シグナル伝達経路阻害剤存在下での培養により、例えば、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められ、且つ、前記原料となる外胚葉性細胞よりも未分化性が高められた性質を示す高増殖性細胞を得ることができる。このことから、本開示の高増殖性細胞の製造方法は、例えば、未分化性が高い高増殖性細胞の製造方法にも読み替え可能である。また、本開示において「高増殖性細胞」は、特に示さない限り、未分化性が高い高増殖性細胞を包含する。
　また、本開示の製造方法によれば、前記（ｉ）の前記低分子シグナル伝達経路阻害剤存在下での培養により、例えば、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められ、且つ、未成熟な分化段階の特徴を示す高増殖性細胞を得ることができる。このように、高増殖性を示し且つ未成熟な分化段階の高増殖性細胞は、例えば、前記＜１＞で例示した、前記高増殖性を示す外胚葉性前駆細胞（高増殖性前駆細胞）である。このことから、本開示の高増殖性細胞の製造方法は、例えば、高増殖性前駆細胞の製造方法にも読み替え可能である。また、本開示において「高増殖性細胞」は、特に示さない限り、高増殖性前駆細胞を包含する。
　本開示で用いられる前記外胚葉性細胞は、例えば、神経系の細胞を含み、具体例として、例えば、中枢神経系の細胞を含んでもよく、末梢神経系の細胞を含んでもよく、中枢神経系の細胞および末梢神経系の細胞を含んでもよい。したがって、本開示において、外胚葉性細胞は、例えば、中枢神経系の細胞を含むことができる。本開示において、外胚葉性細胞は、例えば、グリア細胞を含んでもよく、具体例として、後述するように、アストロサイトを含んでもよい。
　本開示で用いられる前記外胚葉性細胞は、いかなる起源から提供されてもよく、例えば、哺乳動物から提供される。哺乳動物としては、例えば、ヒト、または、非ヒト動物が挙げられる。前記非ヒト動物は、例えば、ラット、マウス、ネコ、イヌ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシおよびサル等が挙げられる。哺乳動物は、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ネコ、またはイヌであり、より好ましくは、ヒト、ラットまたはマウスである。
　本開示で用いられる前記外胚葉性細胞は、例えば、外胚葉性組織および外胚葉性器官を構成する細胞である。外胚葉性組織および外胚葉性器官としては、例えば、中枢神経（例えば、脳の中枢神経または脊髄の中枢神経）、下垂体、末梢神経、腸神経、副腎髄質、メラノサイト、顔面軟骨、歯の象牙質、表皮、髪、爪、皮膚、皮脂腺、唾液腺、汗腺、乳腺、鼻腔、鼻の粘膜、口上皮、口腔、目、膀胱、肛門等を挙げることができる。脳は、大脳、小脳および脳幹に大きく分けることができる。大脳は、さらに、終脳および間脳に分けることができ、脳幹は、さらに、中脳、橋および延髄に分けることができる。中枢神経は、神経細胞（ニューロン）およびグリア細胞から構成される。本開示の製造方法においては、例えば、これらの細胞、すなわち、神経細胞、グリア細胞、またはこれらの両方を、原料細胞（培養の出発材料ともいう）に選ぶことができる。例示したこれらの組織または器官には、最終分化段階を終えた成熟細胞が多く存在する。
　本開示において用いられる前記外胚葉性細胞は、特に制限されず、例えば、グリア細胞である。前記グリア細胞としては、例えば、アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞（あるいはポリデンドロサイトとも言われる。）、上衣細胞、シュワン細胞および衛星細胞からなる群より選択される少なくとも１つを選択することができる。前記グリア細胞は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上の混合物でもよい。これらの細胞は、例えば、生体から得られた初代細胞、樹立された細胞株、または、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から誘導された外胚葉性細胞でもよい。
　本開示において用いられる前記外胚葉性細胞は、例えば、哺乳動物より採取した脳サンプルから、単離精製等によって調製された細胞であってもよい。哺乳動物からの脳サンプルの採取は、例えば、哺乳動物の状態に応じて、脳全体の摘出でもよいし、脳組織片の切除でもよい。
　具体例として、前記哺乳動物がラットの場合、例えば、１０週齢～２０週齢の成体ラットから摘出した脳サンプルを用いることが好ましく、また、これには制限されず、例えば、１０週齢未満の幼若ラット由来の脳サンプルを用いてもよい。脳サンプルの採取は、例えば、生検による採取でも、外科手術による採取でもよい。ヒトの場合、脳サンプルは、例えば、生検または外科手術により得ることができる。例えば、神経細胞およびグリア細胞は、いずれも、生検により採取した脳組織片から得ることができる。外科手術の場合、前記外胚葉性細胞の調製には、例えば、切除した成人の脳組織片を用いることも、死亡胎児から摘出した脳を用いることもできる。また、例えば、これらの採取した脳サンプルから、神経細胞またはグリア細胞を単離精製した後、凍結し、その凍結した細胞を、前記外胚葉性細胞として用いることもできる。
　本開示において用いられる前記外胚葉性細胞は、例えば、外胚葉性細胞の特徴を示す細胞として定義することができる。外胚葉性細胞の特徴としては、例えば、細胞の形態、細胞に特有の遺伝子またはタンパク質（「マーカー遺伝子またはマーカータンパク質」と称する場合がある。）の発現等を挙げることができる。前記外胚葉性細胞であることは、分化段階のいずれかにおいて、例えば、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、およびＣＳＰＧ４からなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現があることで、確認できる。前記外胚葉性細胞のマーカー遺伝子の発現は、遺伝子およびタンパク質のいずれに基づいて確認してもよい。遺伝子またはタンパク質の発現の確認は、例えば、発現の有無、測定方法に依存した具体的な発現量、特定の細胞における同一遺伝子またはタンパク質の発現量との比較等、当業界で公知の方法によって行うことができる。
　なお、本明細書において、前記マーカーの発現は、当業界で公知の技術を用いて確認することができ、前記マーカー遺伝子の場合は、例えば、定量ＰＣＲ（「ｑＰＣＲ」と記載することがある。）等を用いた遺伝子の発現量の測定、前記マーカータンパク質の場合は、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー法等の免疫測定法を用いたタンパク質量の測定等によって、確認することができる。
　本開示の製造方法において、前記高増殖性細胞の製造に使用する、原料となる前記外胚葉性細胞（原料細胞）は、前述の通りである。前記原料細胞は、例えば、前記（ｉ）の培養を行う前において、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させていない外胚葉性細胞、すなわち、前記増殖未誘導の外胚葉性細胞である。
　本開示の製造方法においては、上記のようにして用意された原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）を、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させる。前記原料細胞と前記阻害剤との接触は、インビトロであってよい。本開示の製造方法に使用可能な前記阻害剤としては、特に制限はなく、シグナル伝達経路を阻害する低分子の阻害剤であれば、いずれも使用可能である。前記阻害剤としては、例えば、トランスフォーミング増殖因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＴＧＦ）β受容体阻害剤、ＲＯＣＫ［Ｒｈｏ結合タンパク質キナーゼ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）］阻害剤、およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ　３；ＧＳＫ３）阻害剤等が挙げられる。本開示の製造方法において、前記阻害剤は、例えば、いずれか１種類を使用してもよいし、２種類以上を併用してもよく、その組み合わせは、特に制限されない。
　本開示の製造方法において、前記阻害剤は、例えば、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含んでよい。本開示の製造方法において、前記阻害剤は、例えば、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含んでよい。
　ＴＧＦβ受容体阻害剤は、ＴＧＦβ受容体の機能を阻害する作用を有するものであれば、特に限定されない。前記ＴＧＦβ受容体阻害剤は、例えば、２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、［２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－（４－ピリジルアミノ）］プテリジン（ＳＤ－２０８）、３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（以上、いずれもメルク社）、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）およびＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１（富士フイルム和光純薬株式会社）が挙げられる。ＴＧＦβ受容体阻害剤は、好ましくはＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１である。ＴＧＦβ受容体阻害剤には、例えば、ＴＧＦβ受容体アンタゴニストも含まれる。ＴＧＦβ受容体阻害剤は、１種のみを用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ結合タンパク質キナーゼの機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されない。前記ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ａｘｏｎ　ｍｅｄｃｈｅｍ社）、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬株式会社）およびＨ－１１５２　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（富士フイルム和光純薬株式会社）が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくはＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２である。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種のみを用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＧＳＫ３阻害剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）３の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されない。前記ＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、ＳＢ２１６７６３（Ｓｅｌｌｅｃｋ社）、ＣＨＩＲ　９８０１４（Ａｘｏｎ　ｍｅｄｃｈｅｍ社）、ＣＨＩＲ　９９０２１（Ａｘｏｎ　ｍｅｄｃｈｅｍ社）、ＳＢ４１５２８６（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびＫｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（コスモ・バイオ社）が挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤は、好ましくはＣＨＩＲ　９９０２１である。ＧＳＫ３阻害剤は、１種のみを用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本開示の製造方法において用いられる前記低分子シグナル伝達経路阻害剤は、例えば、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つとすることができる。すなわち、本開示の製造方法において用いられる前記阻害剤は、例えば、
・ＴＧＦβ受容体阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤との組み合わせ、
・ＴＧＦβ受容体阻害剤、または
・ＲＯＣＫ阻害剤
でもよい。本開示の一態様において、用いられる前記阻害剤は、ＴＧＦβ受容体阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤との組み合わせである。
　本開示の一態様は、例えば、前記阻害剤として、以下の阻害剤が含まれる：
　（１）　２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、［２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－（４－ピリジルアミノ）］プテリジン（ＳＤ－２０８）、３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、ＳＢ４３１５４２およびＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１からなる群より選択される少なくとも１の化合物；
　（２）　２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、［２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－（４－ピリジルアミノ）］プテリジン（ＳＤ－２０８）、３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、ＳＢ４３１５４２およびＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１からなる群より選択される少なくとも１の化合物と、
　ＧＳＫ２６９９６２Ａ、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２およびＨ－１１５２　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる群より選択される少なくとも１の化合物との組み合わせ；ならびに、
　（３）　ＧＳＫ２６９９６２Ａ、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２およびＨ－１１５２　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる群より選択される少なくとも１の化合物。
　本開示の製造方法においては、前記阻害剤の存在下、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）の培養を行う。前記培養は、例えば、前記阻害剤を含む培地を使用でき、前記培地中で、前記阻害剤と前記原料細胞とを接触させた状態で培養できる。前記培地中の前記阻害剤の濃度は、特に制限されず、例えば、以下のような濃度が例示できる。すなわち、前記培地中の前記阻害剤の濃度は、下限が、例えば、０．００１μＭ、０．０５μＭであり、上限が、例えば、３０μＭ、５０μＭ、８０μＭ、１００μＭであり、その範囲が、例えば、０．００１μＭ～１００μＭ、０．０１μＭ～８０μＭ、０．０１μＭ～５０μＭ、０．０１～３０μＭ、または０．０５μＭ～３０μＭである。前記阻害剤の濃度は、例えば、使用する前記阻害剤の種類によって適宜調整できる。本明細書において、濃度の「Ｍ」は、いずれも「ｍｏｌ／Ｌ」に読み替え可能である。
　例示した前記阻害剤の濃度範囲は、例えば、１種類の阻害剤を単独で使用する場合、２種類以上の阻害剤を組み合わせて使用する場合のいずれにも適用できる。前記阻害剤は、例えば、そのまま培地に添加してもよいし、溶媒に溶解してから、前記最終濃度となるように培地に添加してもよい。前記溶媒は、例えば、水性溶媒および有機溶媒が挙げられる。水性溶媒は、例えば、水、緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。前記阻害剤が水不溶性または水難溶性である場合は、例えば、有機溶媒を使用する。前記有機溶媒は、例えば、低毒性であることが好ましく、具体例として、ＤＭＳＯ等が使用でき、前記阻害剤は、例えば、少量の前記有機溶媒に溶解することが好ましい。
　前記阻害剤がＴＧＦβ受容体阻害剤の場合、培地中のＴＧＦβ受容体阻害剤の濃度は、例えば、０．００１μＭ～１００μＭ、０．０１μＭ～５０μＭ、または０．０５μＭ～３０μＭの範囲内であり、用いるＴＧＦβ受容体の種類によって適宜調整可能である。一態様において、培地中のＴＧＦβ受容体阻害剤、例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１の濃度は、０．１μＭ～３μＭである。
　前記阻害剤がＲＯＣＫ阻害剤の場合、培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えば、０．００１μＭ～１００μＭ、０．０１μＭ～８０μＭ、または０．１μＭ～５０μＭの範囲内であり、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜調整可能である。一態様において、培地中のＲＯＣＫ阻害剤、例えば、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２の濃度は、１μＭ～３０μＭである。
　前記阻害剤がＧＳＫ３阻害剤の場合、培地中のＧＳＫ３阻害剤の濃度は、例えば、０．００１μＭ～１００μＭ、０．０１μＭ～８０μＭ、または０．１μＭ～５０μＭの範囲内であり、用いるＧＳＫ３阻害剤の種類によって適宜調整可能である。
　例示した上記濃度範囲は、例えば、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤がそれぞれ単独で使用される場合、および、これらの阻害剤が組み合わせて使用される場合のいずれにも適用可能である。また、前記阻害剤が、水不溶性または水難溶性である場合、前述のように、少量の低毒性の有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ等）に溶解した後、上記の最終濃度となるよう培地に添加することができる。
　本開示の製造方法は、前述のように、前記阻害剤の存在下、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）の培養が行われる。前記培養には、前記阻害剤を含む培地が使用でき、前記培地中において、前記阻害剤と接触させた状態で、前記原料細胞を培養できる。具体的には、培地に前記阻害剤を、例示したような濃度で添加して、前記原料細胞の培養を行うことが好ましい。前記原料細胞を前記阻害剤の存在下で培養することにより、培養の出発段階における前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）と比較して、細胞増殖能が高められた、前記外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞が得られる。
　本開示の製造方法においては、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）を用意して、そのまま、前記阻害剤の存在下での培養を行ってもよいし、まず、前記阻害剤非存在下での培養を行ってから、前記阻害剤存在下での培養を行ってもよい。後者の場合、前記原料細胞の前記阻害剤非存在下での培養、つまり、前記阻害剤と接触させるまでの培養を、「前培養」または「第１の培養」ともいう。そして、前記原料細胞の前記阻害剤存在下での培養、つまり、前記阻害剤と接触させた状態での培養を、「本培養」、または「第２の培養」ともいう。なお、前記本培養は、前記阻害剤存在下での所定時間の培養であり、前記培地中には前記阻害剤が含まれているため、前記本培養の間、細胞と阻害剤との接触は継続している。
　本開示において、前培養および本培養で用いる培地としては、特に制限されず、広く動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として使用でき、市販されている基礎培地を使用してもよい。市販の基礎培地としては、例えば、アストロサイト培地（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＡＧＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　Ｅ培地、および、ＮＳ基礎培地（富士フイルム和光純薬株式会社）等が挙げられるが、これらに特に限定されない。培地としては、上記のものを単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。前培養と本培養とは、例えば、同じ培地を用いても、異なる培地を用いてもよい。
　前記培地は、例えば、さらに添加剤を含んでもよい。培地に添加される添加剤としては、例えば、サイトカイン、増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、および線維芽細胞増殖因子－２（ＦＧＦ－２））、ホルモン（例えば、インスリン、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロンおよびチロキシン）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン（Ｄｅｘ））、血漿由来タンパク質（例えば、トランスフェリン）、各種アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミンおよびＬ－プロリン）、各種無機塩（例えば、亜セレン酸塩およびＮａＨＣＯ３）、各種ビタミン（例えば、ニコチンアミドおよびアスコルビン酸誘導体）、Ｎ２サプリメント（富士フイルム和光純薬株式会社）、ＮＳサプリメント（富士フイルム和光純薬株式会社）、Ｂ－２７　Ｐｌｕｓ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、各種抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、抗真菌剤（例えば、アンホテリシン）、ならびに緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝剤）が挙げられる。
　前培養（第１の培養）の培地および本培養（第２の培養）の培地には、例えば、それぞれ、血清添加培地または無血清培地のいずれを用いてもよい。
　血清添加培地を使用する場合、血清としては、例えば、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）を用いることができる。また、後述するように、培養後の細胞から細胞分泌物である細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を分離する場合には、例えば、エクソソーム分離を容易にするために、エクソソームを除去したＦＢＳを用いることもできる。市販のエクソソーム除去培地としては、例えば、ＦＢＳ　ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ，ＯｎｅＳｈｏｔ　ｆｏｒｍａｔ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を挙げることができる。培地中の血清の濃度は、例えば、０．５～２５％（ｖ／ｖ）、１～２５％（ｖ／ｖ）、１～２０％（ｖ／ｖ）、１～１５％（ｖ／ｖ）、２～１５％（ｖ／ｖ）、２～１０％（ｖ／ｖ）、３～１０％（ｖ／ｖ）、３～８％（ｖ／ｖ）、および、３～５％（ｖ／ｖ）である。具体的な一態様において、培地中の血清の濃度は、例えば、３％（ｖ／ｖ）である。
　無血清培地を使用する場合、前記培地には血清代替物を添加してもよい。血清代替物としては、例えば、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）、ノックアウト血清代替物（ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＫＳＲ）、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；ＨＳＡまたはＨｕｍａｎ　ａｌｂｕｍｉｎ，ｓｅｒｕｍ；ＨＡＳ）等が挙げられる。ヒト血清アルブミンとしては、例えば、ヒト血漿から分離されたヒト血清アルブミン、または、ヒト血清アルブミン遺伝子を発現するイネから精製されたヒト血清アルブミン（富士フイルム和光純薬）を使用することができる。無血清培地の場合、通常、増殖因子（ｈＥＧＨ等）、サイトカイン、ホルモン等の因子が更に添加される。これらの添加される因子としては、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン２１－ヘミコハク酸またはその塩、および、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、Ｎ２サプリメント（富士フイルム和光純薬株式会社）、ＮＳサプリメント（富士フイルム和光純薬株式会社）およびＢ－２７　Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが挙げられるが、これらに限定されない。
　培養に用いられる培養容器は、特に制限されず、例えば、接着培養に適したものが使用でき、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイおよび培養バック等が挙げられる。接着培養の場合は、例えば、細胞との接着性を向上させる目的で、その内表面が細胞支持用基質によりコーティングされたものも用いることができる。前記細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ－Ｌ－リジン、ラミニンおよびフィブロネクチンが挙げられる。好ましい細胞支持用基質は、コラーゲンまたはマトリゲルである。また、例えば、細胞の浮遊培養を行う場合、培養容器としては、細胞が接着できないように表面が加工された培養容器を用いることもできる。
　本開示の製造方法において、前記原料細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）の播種条件、例えば、播種する細胞密度は、特に制限されない。具体例として、前記原料細胞は、例えば、１×１０２～１×１０６細胞／ｃｍ２、１×１０３～１×１０５細胞／ｃｍ２、または１×１０３～１×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で、培養容器上に播種することができる。
　前記原料細胞の培養条件は、例えば、一般に外胚葉性細胞の培養に適用される条件をそのまま適用可能である。培養には、ＣＯ２インキュベーターを用いることができる。培養温度およびＣＯ２濃度としては、特に制限されず、一般的に用いられるものであればよく、例えば、３７℃および５％（ｖ／ｖ）とすることができる。
　本開示の製造方法において、前記本培養の培養期間（培養期間Ｔ）は、前記阻害剤の存在下、すなわち前記阻害剤と共に培養している期間である。前記培養期間Ｔは、例えば、連続する期間でもよく、不連続な期間、すなわち、不連続な複数の期間を合計した期間でもよい。前記本培養の培養期間Ｔは、その上限が、２８日であり、例えば、２０日、１８日、１４日とすることができる。前記本培養の培養期間Ｔの下限は、例えば、１日、４日、５日、７日とすることができる。前記本培養の培養期間Ｔの範囲は、例えば、１～２８日、４～２８日、５～２８日、７～２８日、７～２０日、７～１８日、７～１４日とすることができる。前記本培養において、培養中の細胞の継代は、特に制限されず、例えば、培養容器内の細胞密度、培地の状態、または細胞の状態等に応じて適宜行うことができ、継代間隔は、例えば、２～２０日間程度とすることができる。
　本開示の製造方法において、本培養に先だって、前培養を行う場合、前記阻害剤の非存在下での培養期間は、特に制限されない。
　本開示の高増殖性細胞の製造方法は、例えば、前記（ｉ）の本培養の後、さらに、下記（ｉｉ）を含んでもよい。
（ｉｉ）前記（ｉ）の低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下での培養により得られた培養物から、前記高増殖性細胞を単離すること
　本開示の製造方法によれば、前記本培養により前記高増殖性細胞が得られる。そして、前記本培養の培養物には、前記高増殖性細胞を含む細胞集団が含まれる。このため、本開示の製造方法においては、例えば、前記培養物から、さらに前記高増殖性細胞を単離してもよい。前記高増殖性細胞の単離は、例えば、前記高増殖性細胞を含む細胞集団としての単離でもよいし、前記高増殖性細胞の単離精製でもよい。
　前記（ｉｉ）の単離において、前記高増殖性細胞の単離には、例えば、特定の細胞を単離する公知の手段を適用することができる。前記単離方法は、例えば、前記高増殖性細胞に特有の前述したマーカー遺伝子に由来するタンパク質の発現に基づく蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）法、および、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）等を用いた磁気細胞分離法等を利用できる。
　本開示の製造方法によれば、前述のように、本開示の高増殖性細胞を得ることができる。そして、本開示の製造方法により得られる高増殖性細胞の特性は、前記＜１＞に記載した高増殖性細胞の特性を援用できる。なお、本開示の製造方法により得られる高増殖性細胞の特性は、例えば、前記原料となる外胚葉性細胞との比較により示すことができる。前記高増殖性細胞と比較する「原料となる外胚葉性細胞」とは、例えば、前記＜１＞で述べた前記対照細胞が挙げられ、具体的には、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞、つまり、前記増殖未誘導の外胚葉性細胞である。また、前記高増殖性細胞と比較する「原料となる外胚葉性細胞」とは、例えば、本開示の製造方法における前記本培養を行っていない外胚葉性細胞、つまり、前記阻害剤存在下での培養を行っていない外胚葉性細胞であり、前記増殖未誘導の外胚葉性細胞が該当する。前記高増殖性細胞と比較する「原料となる外胚葉性細胞」は、例えば、前記高増殖性細胞の製造において実際に原料として使用した外胚葉性細胞には限定されず、本開示の製造方法において原料として使用し得る、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）であればよい。このため、本明細書において、前記高増殖性細胞との比較における「原料となる外胚葉性細胞」とは、特に示さない限り、実際に前記高増殖性細胞の製造に原料として使用したか否かには限定されず、原料として使用し得る外胚葉性細胞（前記増殖未誘導の外胚葉性細胞）を意味する。
　本開示の製造方法により得られた前記高増殖性細胞の増殖能の評価は、前述のように、前記本開示の高増殖性細胞において記載した方法を援用できる。また、前記本開示の製造方法により得られた前記高増殖性細胞の増殖能は、前述のように、例えば、前記高増殖性細胞の細胞数（前記Ｎ１、Ｎ２、またはＮ）が、前記対照細胞の細胞数（前記Ｎ１’、Ｎ２’、またはＮ’）に対する前記高増殖性細胞の細胞数（前記Ｎ１、Ｎ２、またはＮ）の倍率（前記Ｎ１／Ｎ１’、Ｎ２／Ｎ２’、またはＮ／Ｎ’）が、１．０倍を超え、例えば、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、または１．５倍以上でもよい。前記対照細胞は、例えば、前述のように、前記増殖未誘導の外胚葉性細胞である。
　本開示の製造方法により得られる高増殖性細胞は、例えば、前述のように、細胞に特有のマーカーによって特定してもよい。本開示において、前記高増殖性細胞のマーカーの種類、前記マーカーの発現の確認方法、発現挙動等は、前記＜１＞の本開示の高増殖性細胞における記載を援用できる。
　本開示の製造方法において、原料となる外胚葉性細胞がアストロサイトである場合、例えば、前記高増殖性細胞の前記細胞集団には、アストロサイトに関連する外胚葉性細胞系統の細胞が含まれてもよい。アストロサイトに関連する前記外胚葉性細胞系統の細胞は、例えば、アストロサイト、放射状グリア細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ポリデンドロサイトとも言われる）、オリゴデンドロサイトおよび神経上皮細胞が挙げられる。また、アストロサイトに関連する前記外胚葉性細胞系統の細胞集団は、例えば、高められた細胞増殖能を示す細胞集団である限り、外胚葉性細胞に見られる特徴の一部を備え、かつ、上述した細胞のいずれにも分類できない細胞が含まれてもよい。
　一態様において、本開示の製造方法は、例えば、前記原料細胞として、ヒト初代成熟アストロサイトを使用し、前記阻害剤として、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを使用する。この態様において得られる前記高増殖性細胞（阻害剤接触群ともいう）は、前記阻害剤の非存在下で前記原料細胞を培養して得られた細胞（阻害剤非接触細胞群ともいう）と比較して、例えば、より長期間に亘って培養を行うことができる。すなわち、この態様において得られる高増殖性細胞（阻害剤接触群）では、例えば、前記阻害剤非接触群と比較して、より長期間、細胞の増殖が継続できる。また、増殖によって最終的に得られる細胞数については、前記阻害剤接触群の細胞数は、前記阻害剤非接触群の細胞数に対して、例えば、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、または４００倍である。
＜３＞高増殖性細胞の第２の製造方法
　本開示の高増殖性細胞の第２の製造方法は、
高増殖性細胞の製造方法であって、
（ｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
を含み、
前記（ｉ）において、条件ａ１、条件ｂ１および条件ｃ１からなる群より選択される少なくとも１つを充たすまで、前記阻害剤の存在下での培養を行う。
（ａ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）およびコントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）によって決定される相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、下記表２で表される基準範囲を充たす。
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 （ｂ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞の細胞数が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える。
（ｃ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である。
　本開示の第２の製造方法によれば、前記（ｉ）の前記低分子シグナル伝達経路阻害剤存在下での培養により、前記本開示の第１の製造方法と同様に、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞（前記ＨＰ細胞）を得ることができる。すなわち、本開示の製造方法によれば、前記＜１＞で述べた本開示の高増殖性細胞を製造できる。なお、本開示の製造方法の説明は、前記＜１＞で述べた本開示の高増殖性細胞の製造方法を限定するものではない。
　本開示の第２の製造方法は、前記（ｉ）において、少なくとも条件ａ１および条件ｂ１を充たす、または、少なくとも条件ｂ１および条件ｃ１を充たすまで、前記阻害剤の存在下での培養を行うことが好ましい。
　前記（ｉ）における前記原料細胞（外胚葉性細胞）の前記阻害剤存在下での培養は、培養中の細胞が、条件ｂ１または条件ｃ１を充たすまで行われる。条件ｂ１または条件ｃ１を判断するにあたって、前記阻害剤の非存在下で培養された前記原料細胞（外胚葉性細胞）の細胞数または前記マーカー遺伝子の発現量は、例えば、前記（ｉ）における前記原料細胞の前記阻害剤存在下での培養と並行して、前記原料細胞の前記阻害剤非存在下での培養を行うことにより、得てもよい。また、前記（ｉ）で使用する原料細胞（外胚葉性細胞）について、別途、前記阻害剤非存在下での培養を行い、細胞数または前記マーカー遺伝子の発現量の情報を得てもよい。
　本開示の第２の製造方法は、例えば、特に示さない限り、前記＜１＞の本開示の高増殖性細胞および前記＜２＞の本開示の第２の高増殖性細胞の製造方法における記載を援用できる。
　本開示は、例えば、高増殖性細胞の評価方法を含んでもよい。本開示の評価方法によれば、例えば、評価対象の細胞が、本開示の高増殖性細胞か否かを評価することができる。本開示の評価方法における以下の各工程は、例えば、本開示の高増殖性細胞の製造方法における記載を援用できる。
　すなわち、本開示の高増殖性細胞の評価方法は、
原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
前記低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、前記原料となる外胚葉性細胞を培養すること、
培養中の細胞が、条件ａ１、条件ｂ１および条件ｃ１からなる群より選択される少なくとも１つを充たす場合、前記細胞を、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞であると評価すること、を含む。
（ａ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）およびコントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）によって決定される相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、前記表２で表される基準範囲を充たす。
（ｂ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞の細胞数が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える。
（ｃ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である。
　本開示の高増殖性細胞の評価方法は、例えば、前記培養中の細胞が、さらに、前記＜１＞の本開示の高増殖性細胞において例示した各種マーカーの発現を充たす場合に、前記高増殖性細胞であると評価できる。
＜４＞高増殖性外胚葉性前駆細胞の用途
　本開示の高増殖性細胞としては、例えば、前記＜１＞に示すように、前記高増殖性外胚葉性前駆体（前記高増殖性前駆細胞）が挙げられる。前記高増殖性前駆細胞は、例えば、以下のような用途に供することができる。なお、本開示は、これらの用途には何ら制限されない。
　本開示の外胚葉性前駆細胞は、例えば、神経障害治療剤の評価方法に使用できる。具体的には、例えば、神経障害治療剤の候補薬剤を、前記外胚葉性前駆細胞と接触させることにより、前記候補薬剤の有用性を評価できる。したがって、本開示は、神経障害治療剤の候補薬剤の評価方法に関し、神経障害治療剤の候補薬剤を、前記本開示の外胚葉性前駆細胞と接触させることを含む。本開示の評価方法によれば、例えば、前記候補薬剤の接触によって、障害を受けた神経（例えば、コルチコステロンによって障害を受けた細胞）が、障害を受けて低下した機能を回復するとなれば、前記候補薬剤が有用であると評価することができる。
　本開示は、さらに、神経疾患モデルの評価方法に関し、前記高増殖性外胚葉性前駆細胞を使用することを含む。例えば、神経疾患に関連する遺伝子が同定されている場合、当該遺伝子に変異をもったマウスを人工的に作出し、当該遺伝子変異マウスに対して、前記高増殖性外胚葉性前駆細胞を投与し、神経疾患に対応する神経機能やマウスの行動等を評価することが含まれる。
　本開示は、さらに、外胚葉性成熟細胞の製造方法に関し、前記高増殖性外胚葉性前駆細胞を使用し、前記高増殖性外胚葉性前駆細胞の分化を誘導することにより、外胚葉性成熟細胞を得ることを含む。前記分化誘導の条件は、特に制限されず、一般的な分化誘導の方法が採用でき、例えば、前記高増殖性外胚葉性前駆細胞を、成熟化への分化を誘導する成熟条件下、培養すればよい。
　ここで、「成熟条件下」とは、特に制限されず、既知の分化誘導因子を用いた培養条件を意味する。前記分化誘導因子としては、例えば、線維芽細胞成長因子－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－３；ＦＧＦ－２）；白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）または毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＣＮＴＦ）等のＩＬ－６ファミリーサイトカイン；ＢＭＰ２またはＢＭＰ４等のＢｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）ファミリーサイトカイン、Ｎｏｔｃｈファミリータンパク質；Ｗｎｔ遺伝子ファミリータンパク質；ソニック・ヘッジホッグタンパク質；およびレチノイン酸が挙げられる。さらに成熟細胞の増殖または維持に必要な因子として、例えば、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－４／５（ＮＴ－４／５）、および血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）を挙げることができる。
　前記分化誘導因子を用いた培養条件としては、例えば、分化誘導因子による分化誘導方法において適用される既知の分化誘導条件を選択でき、前記分化誘導条件は、例えば、用いる分化誘導因子の種類によって適宜選択できる。
＜５＞阻害剤の用途
　本開示の製造方法で使用される低分子シグナル伝達経路阻害剤は、前述したように、外胚葉性細胞の増殖能の維持または促進に用いることができる。したがって、本開示の更なる側面は、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む、外胚葉性細胞の増殖性調整剤に関する。具体的に、本開示は、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む、前述の高増殖性細胞、または外胚葉性細胞の増殖能の維持または促進に使用される、増殖性調整剤にも関する。前記阻害剤は、例えば、前記＜２＞の本開示の第１の製造方法で例示列挙した阻害剤を援用でき、また、前記阻害剤の組み合わせも、例示列挙した組み合わせを援用できる。前記阻害剤は、例えば、一例として、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤を含む。ここで、本明細書において、用語「増殖性調整」とは、細胞の増殖維持および増殖促進の少なくとも一方を達成することを意味することができる。用語「増殖維持」および「増殖促進」については、例えば、細胞が培養期間にわたって細胞数が維持または増加している限り、特に区別されない。細胞の増殖性調整のための前記増殖性調整剤の使用濃度としては、特に制限されず、例えば、前述した本開示の第１製造方法において記述した、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤の濃度をそのまま適用できる。
＜６＞細胞分泌物およびその製造方法
　本開示のさらに別の側面は、細胞分泌物の製造方法に関し、前記本開示の高増殖性細胞の培養物を得ること、または、前記本開示の高増殖性細胞の製造方法を実施して高増殖性細胞の培養物を得ること、および、前記高増殖性細胞由来の細胞分泌物を、前記培養物から分離することを含む。本開示の製造方法は、例えば、必要に応じて任意の工程をさらに含んでもよい。前記本開示の高増殖性細胞は、細胞増殖能が高められた高増殖性細胞であるので、例えば、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞と比較して、より短時間で増殖し、より長期間に亘って増殖し、または、より短時間で増殖すると共に長期間に亘って増殖する。したがって、本開示の細胞分泌物の製造方法では、例えば、前記高増殖性細胞が分泌する細胞分泌物を、対照となる細胞と比較して、より短時間で大量に得ることができる。前記対照となる細胞は、例えば、前述した前記対照細胞であり、前記阻害剤と非接触の外胚葉性細胞である。
　細胞分泌物は、一般的に、「セクレトーム」とも称される。前記本開示の細胞分泌物は、前記本開示の高増殖性細胞から分泌される物質であれば、特に制限されず、例えば、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小胞等の細胞外小胞；サイトカイン、ホルモン、抗体等の機能性タンパク質等が挙げられる。本開示の一形態では、前記細胞分泌物は、例えば、前記細胞外小胞でよく、なかでも、エクソソームでもよい。
　本開示の細胞分泌物の製造方法において、用意される培養物は、本開示の高増殖性細胞の培養物であり、前記培養物は、前記高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を含む。前記細胞分泌物を含む培養物は、例えば、本開示の高増殖性細胞の製造方法を実施して製造したものでもよく、本開示の高増殖性細胞を入手して、それを培養することで製造したものでもよく、本開示の高増殖性細胞の製造方法を実施することで得られた培養物を別途入手したものであってもよく、本開示の高増殖性細胞の培養物を別途入手したものでもよい。本明細書において「培養物」とは、例えば、細胞を培養することによって得られる培養細胞と培養上清（馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ））との組み合わせを意味する。
　本開示の細胞分泌物の製造方法は、前述のように、前記細胞分泌物を、前記培養物から分離することを含む。前記培養物からの前記細胞分泌物の分離方法は、特に制限されず、例えば、前記培養物からの上清の回収、および遠心分離等の公知の分離方法を使用できる。前記培養物から分離された細胞分泌物は、例えば、前記細胞分泌物を含有する組成物の形態で得てもよい。前記細胞分泌物が、前記細胞分泌物を含有する組成物、すなわち細胞分泌物含有組成物である場合、細胞分泌物含有組成物は、例えば、前記細胞分泌物および水性媒体を含むことができる。前記水性媒体としては、特に制限されず、例えば、前記細胞分泌物の種類等に応じて選択される公知の水性媒体であり、具体例として、前記培養物における培養上清、水、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液）、生理食塩水および培地等を挙げることができる。
　本開示の細胞分泌物の製造方法は、さらに、前記培養物から分離された前記細胞分泌物を、精製または単離することを含むことができる。前記細胞分泌物の精製方法または単離方法としては、特に制限されず、前記細胞分泌物の種類に応じて、公知の方法を適用できる。
　前記細胞分泌物の単離または精製方法としては、例えば、ろ過、および濃縮等を挙げることができる。単離または精製には、例えば、前記培養物から分離した、前記細胞分泌物含有組成物を供することができる。前記ろ過の場合、例えば、目的の細胞分泌物の大きさ等に応じて、サイズまたは分子量カットオフ値を有する膜を用いて、前記細胞分泌物含有組成物のろ過を行い、前記細胞分泌物を単離または精製できる。他の方法として、例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーションまたは限外ろ過を用いて、前記細胞分泌物含有組成物をろ過または濃縮し、前記細胞分泌物を単離または精製してもよい。単離または精製された前記細胞分泌物は、例えば、単離細胞分泌物ともいう。
　前記細胞分泌物は、例えば、前記細胞分泌物を含有する組成物の形態、または単離もしくは精製後に得られる前記単離細胞分泌物の形態で、使用できる。前記細胞分泌物は、例えば、前記組成物もしくは前記単離細胞分泌物の形態のままで保存できる。また、前記細胞分泌物の組成物または前記単離細胞分泌物は、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥処理等の公知の処理を行い、乾燥体としてもよく、前記乾燥体として使用してもよく、また前記乾燥体として保存してもよい。保存方法は、特に制限されず、例えば、常温保存、冷蔵保存、または冷凍保存等が挙げられる。
　本開示の前記高増殖性細胞由来の細胞分泌物は、具体的には、以下に示すタンパク質およびｍｉＲＮＡの少なくとも一方を含む細胞分泌物であり、または、以下に示すタンパク質およびｍｉＲＮＡの両方を含む細胞分泌物である。前記タンパク質は、例えば、図２～図４に示すものから選択され、前記ｍｉＲＮＡは、例えば、図５～１０および図１２に示すものから選択される。図２～図４において、記号は、タンパク質の略語であり、名称は、タンパク質の名称、アクセッション番号は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）におけるアクセッション番号である。図５～図１０および図１２において、ｍｉＲＮＡの欄は、ｍｉＲＮＡ名であり、アクセッション番号は、ｍｉＲＢａｓｅ（Ｒｅｌｅａｓｅ　２１）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）におけるアクセッション番号である。本開示の細胞分泌物は、例えば、これらのタンパク質から選択される少なくとも１つ、またはこれらのｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つを含むものであればよく、これらのタンパク質から選択される少なくとも１つと、これらのｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つとを含むものでもよい。
　本開示の細胞分泌物は、一実施形態においては、タンパク質として、
　・ＰＡ群：糖タンパク質Ｍ６Ｂ（Ｑ１３４９１）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲα鎖（Ｐ０１９０３）、トゥイーティーホモログ１（Ｑ９Ｈ３１３）、フィブリリン－２（Ｐ３５５５６）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲＢ１β鎖（Ｐ０１９１１）、およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｐ０５１０９）の組み合わせを少なくとも含むものであってよく、
　・ＰＢ群：糖タンパク質Ｍ６Ｂ（Ｑ１３４９１）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲα鎖（Ｐ０１９０３）、トゥイーティーホモログ１（Ｑ９Ｈ３１３）、フィブリリン－２（Ｐ３５５５６）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲＢ１β鎖（Ｐ０１９１１）、およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｐ０５１０９）の組み合わせと、エンドフィリン－Ａ２（Ｑ９９９６１）、ＮＥＤＤ４様Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｑ９６ＰＵ５）、インテグリンサブユニットβ８（Ｐ２６０１２）、細胞間接着分子１（Ｐ０５３６２）、エフリン－Ｂ２（Ｐ５２７９９）、ＤｎａＪホモログサブファミリーＡメンバー２（Ｏ６０８８４）、コイルドコイル領域含有タンパク質５０（Ｑ８ＩＶＭ０）、潜在的トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２（Ｑ１４７６７）、ミッドカイン（Ｐ２１７４１）、および基底細胞接着分子（Ｐ５０８９５）からなる群より選択される少なくとも１つと、を含むものであってもよく、
　・ＰＣ群：糖タンパク質Ｍ６Ｂ（Ｑ１３４９１）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲα鎖（Ｐ０１９０３）、トゥイーティーホモログ１（Ｑ９Ｈ３１３）、フィブリリン－２（Ｐ３５５５６）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲＢ１β鎖（Ｐ０１９１１）、およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｐ０５１０９）の組み合わせと、エンドフィリン－Ａ２（Ｑ９９９６１）、ＮＥＤＤ４様Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｑ９６ＰＵ５）、インテグリンサブユニットβ８（Ｐ２６０１２）、細胞間接着分子１（Ｐ０５３６２）、エフリン－Ｂ２（Ｐ５２７９９）、ＤｎａＪホモログサブファミリーＡメンバー２（Ｏ６０８８４）、コイルドコイル領域含有タンパク質５０（Ｑ８ＩＶＭ０）、潜在的トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２（Ｑ１４７６７）、ミッドカイン（Ｐ２１７４１）、および基底細胞接着分子（Ｐ５０８９５）の組み合わせと、テトラスパニン－３（Ｏ６０６３７）、ラディキシン（Ｐ３５２４１）、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーＣグループ５メンバーＢ（Ｑ９ＮＺＨ０）、テトラスパニン－６（Ｏ４３６５７）、ガレクチン－３結合タンパク質（Ｑ０８３８０）、リン脂質スクランブラーゼ１（Ｏ１５１６２）、エフリンＢ１（Ｐ９８１７２）、グリア由来ネキシン（Ｐ０７０９３）、フィブリリン－１（Ｐ３５５５５）、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－５Ａ（Ｐ２０３３９）、ガレクチン－７（Ｐ４７９２９）、Ｔｏｌｌ相互作用タンパク質（Ｑ９Ｈ０Ｅ２）、クラスタリン（Ｐ１０９０９）、ＣＤ４７（Ｑ０８７２２）、カドヘリン－１３（Ｐ５５２９０）、エズリン（Ｐ１５３１１）、および液胞タンパク質選別タンパク質３７Ｃ（Ａ５Ｄ８Ｖ６）からなる群より選択される少なくとも１つと、を含むものであってもよく、あるいは、
　・ＰＤ群：図２、図３、または図４に記載された全てのタンパク質を含むものであってもよい。
　本開示の細胞分泌物に含まれるｍｉＲＮＡは、例えば、図１２に列挙するｍｉＲＮＡが挙げられる。図１２に列挙するｍｉＲＮＡのうち、パーキンソン病の治療に関与するｍｉＲＮＡは、例えば、図５に列挙したｍｉＲＮＡが例示でき、アルツハイマー病の治療に関与するｍｉＲＮＡは、例えば、図６～図９に列挙したｍｉＲＮＡが例示でき、うつ病の治療に関与するｍｉＲＮＡは、例えば、図１０に列挙したｍｉＲＮＡが例示できる。
　本開示の細胞分泌物は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡとして、
　・ＲＡ群：ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６（ＭＩＭＡＴ００００４６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２６５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７０７）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５５）の組み合わせを少なくとも含むものであってよく、
　・ＲＢ群：ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６（ＭＩＭＡＴ００００４６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２６５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７０７）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５５）の組み合わせと、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６８１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４９２６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２７５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４８４（ＭＩＭＡＴ００１９０１８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２６１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４５６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４（ＭＩＭＡＴ０００２１７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４９５５）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９３）からなる群より選択される少なくとも１つと、を含むものであってもよく、
　・ＲＣ群：ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６（ＭＩＭＡＴ００００４６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２６５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７０７）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５５）の組み合わせと、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６８１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４９２６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２７５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４８４（ＭＩＭＡＴ００１９０１８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２６１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４５６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４（ＭＩＭＡＴ０００２１７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４９５５）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９３）の組み合わせと、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２７９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００３３９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００２１７５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３４（ＭＩＭＡＴ００１９０７３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ（ＭＩＭＡＴ００００５１０）からなる群より選択される少なくとも１つと、を含むものであってもよく、あるいは、
　・ＲＤ群：図５～図１０のいずれか１つの図に記載された全てのｍｉＲＮＡ、または図１２に記載された全てのｍｉＲＮＡを含むものであってもよい。
　本開示の細胞分泌物は、他の一実施形態において、タンパク質として、上述したＰＡ群、ＰＢ群、ＰＣ群またはＰＤ群のタンパク質群と、ｍｉＲＮＡとして、上述したＲＡ群、ＲＢ群、ＲＣ群またはＲＤ群のｍｉＲＮＡ群とを含むものであってよい。これにより、一実施形態に係る前記細胞分泌物は、例えば、これらのタンパク質およびｍｉＲＮＡに起因した既知の作用を有する医薬組成物として使用できる。
　本開示の細胞分泌物は、一態様において、前記細胞外小胞であり、具体的には、脂質二重層を含む小胞である。前記細胞外小胞の直径は、例えば、５０ｎｍ～５μｍ、または５０ｎｍ～１０００ｎｍである。前記細胞外小胞のひとつであるエクソソームの直径は、例えば、５０ｎｍ～２００ｎｍである。エクソソームは、例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質等の様々な生理活性物質を含むことから、疾患の治療および診断法、医薬品、化粧品等への利用が期待される。
　エクソソームは、由来となる細胞が接着細胞の場合、前記接着細胞から培養物中、特に、培養上清中に分泌される。また、エクソソームは、由来となる細胞が非接着細胞であり、前記非接着細胞が細胞懸濁液中に存在する場合、前記非接着細胞から培養上清中または細胞懸濁液中に分泌される。本開示の細胞分泌物において、前記接着細胞または前記非接着細胞に由来する細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を含む場合、例えば、前記本開示の高増殖性細胞として、接着細胞（高増殖性の外胚葉性接着細胞ともいう）または非接着細胞（高増殖性の外胚葉性非接着細胞ともいう）を調製し、前記接着細胞または前記非接着細胞から前記細胞外小胞を得ることができる。前記エクソソームとしては、例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース　３２３巻、２２５頁～２３９頁（２０２０年）に記載されているエクソソームが挙げられる。
　エクソソームは、例えば、分子量、大きさ、形状、組成または生物活性に基づいて単離できる。具体的には、超遠心分離による沈降物の分取、密度勾配超遠心による分画の分取、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた分取、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓＴＭ　ＥＶ（ＢＩＡ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製）を用いた分取、タンパク質（例えば、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅＴＭ　エクソソームアイソレーションキット　ＰＳ（富士フイルム和光純薬株式会社））を用いた捕捉による分取、抗体を用いた捕捉による分取、ポリエチレングリコール等のポリマーを用いた沈澱物の分取等によって、単離できる。これらの方法は、例えば、１つまたは複数を組み合わせて実施できる。
　本開示の細胞分泌物の製造方法において、前記細胞分泌物としてエクソソームを製造する場合、エクソソームの性質は、エクソソームの活性を追跡するために使用し得る。エクソソームの活性は、例えば、静的光散乱、動的光散乱、紫外可視検出器、蛍光検出器または示差屈折率検出器を使用して確認できる。
　本開示の細胞分泌物の製造方法は、例えば、前記本開示の高増殖性細胞の製造方法における本培養後の培養物から、前記細胞分泌物を分離してもよいし、得られた前記高増殖性細胞をさらに追加培養し、その培養物から、前記細胞分泌物を分離してもよい。前記細胞分泌物としてエクソソームを純度よく得る観点から、エクソソームの単離または精製に際し、例えば、前記高増殖性細胞が含まれる培養物について、前記培養物の培養用培地（例えば、前記本培養における培地）を、さらに、回収用培地に交換して、追加培養を行うことができる。前記回収用培地は、具体的には、培養上清回収用培地である。前記追加培養は、例えば、前記培養用培地による培養後に行う、前記回収用培地による培養を意味する。前記追加培養の期間は、特に制限されず、前記本培養よりも短時間の培養であり、例えば、６時間以上、１２時間以上、１８時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、または６０時間以上とすることができ、例えば、９６時間以下、または７２時間以下とすることができる。前記追加培養をすることによって、例えば、前記高増殖性細胞とは異なる起源に由来するエクソソームであって、前記本培養で使用した前記本培養用培地に含まれ得るエクソソームの混入率を下げて、目的とする前記高増殖性細胞に由来するエクソソームの純度を上げることができる。
　前記回収用培地としては、例えば、血清無添加の培地、およびエクソソーム除去処理済みの培地を挙げることができる。市販のエクソソーム除去処理済み培地としては、例えば、ＦＢＳ　ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ，ＯｎｅＳｈｏｔ　ｆｏｒｍａｔ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を挙げることができる。前記回収用培地は、例えば、前記低分子シグナル伝達経路阻害剤を未含有であることが好ましい。
　前記血清無添加の培地は、例えば、非ヒト哺乳類の血清、具体例としては、ウシ胎児血清等のウシ血清を含まない培地を使用することが好ましい。一般的に、細胞の培養に使用する培地には、細胞増殖を促すための因子を含んだウシ胎児血清等が添加されるため、前記培地に、ウシ由来のエクソソームが混入する場合がある。また、ヒト由来のエクソソームと牛由来のエクソソームとは、分離が困難である。このため、例えば、ヒト細胞からエクソソームを分離する場合には、前記本培養の後、あらためて、例えば、ウシ胎児血清を含まない回収用培地を使用した短期間の追加培養を行うことによって、ヒト細胞由来のエクソソームをさらに純度よく単離することができる。
　前記回収用培地を用いた場合、例えば、前記追加培養後に、追加培養の培養物に対して、遠心分離を実施して、エクソソーム含有組成物として培養上清を分取し、必要に応じて、分取された培養上清を、上述したエクソソームの単離または精製方法に供することによって、エクソソームを得ることができる。
＜７＞高増殖性細胞および細胞分泌物の用途
　前述した本開示の高増殖性細胞由来の細胞分泌物は、例えば、種々の細胞種に対する種々の作用、例えば、神経保護作用、神経突起伸長抑制作用、神経突起伸張作用、神経突起ネットワーク形成作用、神経細胞死予防作用および神経細胞増殖促進作用を有することが予想される。これらの機能に基づいて、前記高増殖性細胞由来の細胞分泌物は、例えば、末梢神経細胞または中枢神経細胞に関係する障害に対する予防または治療用の医薬組成物としての有用性が期待される。前記高増殖性細胞由来の細胞分泌物は、特に制限されず、前記＜６＞で列挙したものが挙げられ、中でもエクソソームが好ましい。
　前記神経保護作用は、例えば、神経細胞が障害を受にくくする、あるいは神経障害の進行を遅延する作用である。例えば、コルチコステロン等の一部のホルモンは、中枢において局所的に過剰となることによって、ホルモンレセプターの過剰刺激による神経障害と機能障害とにより、うつ病等の中枢疾患の原因となりうることが知られている。本開示の細胞分泌物が神経細胞死を抑制する効果を有する場合、神経細胞が障害を受にくくする、あるいは神経障害の進行を遅延することによって、神経を保護することが期待される。
　前記神経突起伸張抑制作用は、例えば、末梢神経細胞の分化に関して、より未分化な細胞から末梢神経細胞、特に交感神経細胞への分化を抑制する作用である。このため、本開示の細胞分泌物を、例えば、末梢神経細胞に対して用いることによって、末梢神経系、特に交感神経系を抑制することが期待できる。また、例えば、本開示の細胞分泌物を、例えば、中枢神経細胞に対して用いることによって、その神経突起伸張作用、神経突起ネットワーク形成作用、神経細胞死予防作用および神経細胞増殖促進作用等に基づいて、中枢神経系を活性化することが期待できる。
　したがって、本開示は、医薬組成物に関し、治療または予防としての有効量の本開示の細胞分泌物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を含み、また、本開示は、治療または予防方法に関し、前記本開示の医薬組成物を対象へ投与することを含む。本明細書において「治療」との文言には、障害の根治だけでなく、緩和および寛解等、障害の症状の改善も含まれる。
　治療または予防の対象の前記障害としては、特に制限されず、末梢神経細胞または中枢神経細胞に関係する障害であり、例えば、がん、疼痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、統合失調症および痴呆症からなる群より選択される障害が挙げられる。末梢神経細胞に関係する障害、特に、交感神経細胞に関係する障害としては、例えば、交感神経細胞に関係するがん、疼痛等が挙げられる。中枢神経細胞に関係する障害は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、統合失調症および痴呆症からなる群より選択される。
　前記薬学的に許容可能な担体としては、特に制限されず、例えば、当該分野で公知のものが使用でき、例えば、生理食塩水等が挙げられる。さらに、本開示は、例えば、上記作用に関連して、交感神経の抑制方法または神経突起の伸長抑制方法に関し、前記高増殖性細胞由来の細胞分泌物（具体的には、エクソソーム）を、神経細胞（例えば交感神経細胞）に接触させることを含む。
　本開示の治療または予防方法において、投与対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり、前記非ヒト動物は、例えば、前述の例示が援用できる。本開示の治療または予防方法において、投与形態は、特に制限されず、例えば、経口投与、または非経口投与がある。前記非経口投与は、例えば、患部注射、静脈注射、皮下注射、皮内注射、点滴注射、経皮投与等が挙げられる。
　本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値または下限値は、他の段階の数値範囲の上限値または下限値と任意に組み合わせることができる。
　本開示に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、参照によりその全体が本開示に組み入れられる。
［実施例１］阻害剤添加培地によるヒトアストロサイトの培養
　以下に示す材料、試薬、および培養用製品を用いて、ヒトアストロサイトの培養を行った。特に示さない限り、実施例１以降の実施例においても、同様の材料、試薬、培養用製品、装置等を使用した。
＜材料＞
　・Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ（ＮＨＡ）（ＣＣ－２５６５、Ｌｏｎｚａ）
＜使用試薬および培養用製品＞
・培養用培地：ＡＧＭ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ＣＣ－３１８６、Ｌｏｎｚａ）（ＡＧＭの組成：基礎培地、ＦＢＳ（３％（ｖ/ｖ））、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、インスリン、抗生物質）
・阻害剤Ｙ：ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２（０３４－２４０２４、富士フイルム和光純薬株式会社）、終濃度：１０μＭ
・阻害剤Ａ：ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１（０３５－２４１１３、富士フイルム和光純薬株式会社）、終濃度：０．５μＭ
・細胞剥離剤：Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＡＴ１０４、ＩＣＴ）
・細胞用緩衝液：リン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ（－）；ダルベッコ；カルシウムおよびマグネシウム不含）（１４１９０２５０、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・細胞凍結用培地：ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　１（ＣＢ０１１ ＴａＫａＲａ、日本全薬工業株式会社）
・細胞培養用ディッシュ　６０ｍｍ（１５０４６２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・細胞培養用ディッシュ　１００ｍｍ（１５０４６６、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・細胞培養用ディッシュ　１５０ｍｍ（１５０４６８、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・細胞培養用フラスコ　Ｔ－７５（３２９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）
・Ｓｔｅｒｉｃｕｐ　Ｑｕｉｃｋ　Ｒｅｌｅａｓｅ－ＧＰ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｖａｃｕｕｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標、Ｓ２ＧＰＵ０２ＲＥ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
・培養上清回収用阻害剤非含有培地：ＡＧＭ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ＣＣ－３１８６、Ｌｏｎｚａ）（ＡＧＭの組成：基礎培地、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、インスリン、抗生物質、付属のＦＢＳの代わりにエクソソームが除去されたＦＢＳ［３％（ｖ／ｖ）］（Ａ２７２０８０３、Ｇｉｂｃｏ）を添加）
・遠心分離機：Ｏｐｔｉｍａ　ＸＥ－９０、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ
＜培養装置＞
・ＣＯ２インキュベーター： ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ、ＰＨＣ株式会社
＜培養条件＞
温度３７℃、ＣＯ２濃度５％
＜細胞観察・撮影装置＞
・蛍光顕微鏡　ＢＺ－Ｘ８１０、ＣＫＸ５３、オリンパス株式会社
＜培養の手順＞
　培養は下記の手順に従って行った。ヒトアストロサイト細胞（ＮＨＡ）の凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。次いで、溶解後の細胞を計１０ｍＬになるよう培養用培地に移し、１８０×ｇ、５分間、室温で遠心分離に供した後、前記培地を除去した。細胞を再度、新たな培養用培地に懸濁し、１５０ｍｍ細胞培養用ディッシュへ５．８×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。培養１０日目に細胞剥離剤を用いて前記ディッシュから細胞を剥がし、新たな培養用培地に懸濁した。この細胞懸濁液を、遺伝子発現・タンパク発現の解析用として、６０ｍｍ細胞培養用ディッシュへ４．８×１０３～１．４×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、また、前記細胞懸濁液を、継代用として、１００ｍｍ細胞培養用ディッシュへ５．５×１０３／ｃｍ２の播種密度で播種した。翌日、解析用のディッシュおよび継代用のディッシュのそれぞれを、Ｎｏｒｍａｌ群（ＮＨＡ群ともいう）、ＹＡ群（ＮＨＡ－ＹＡ群ともいう）、Ｙ群（ＮＨＡ－Ｙ群ともいう）、Ａ群（ＮＨＡ－Ａ群ともいう）にわけ、それぞれの群に応じた本培養用培地に交換し（培養日数０日）、本培養を行った。前記Ｎｏｒｍａｌ群には、阻害剤非含有の培養用培地を、前記ＹＡ群には、前記阻害剤Ｙおよび前記阻害剤Ａを添加した含有するＹＡ含有本培養用培地を、前記Ｙ群には、前記阻害剤Ｙを添加した培養用培地を、前記Ａ群には、前記阻害剤Ａを添加した培養用培地を、それぞれ本培養用培地として使用した。前記本培養用培地における前記阻害剤の濃度は、前述の通りとした。以下、阻害剤ＹＡとの記載は、前記阻害剤Ｙと前記阻害剤Ａの両方の添加を意味する。培養期間中、２日または３日おきに培地交換を行った。この際、新鮮な本培養用培地（阻害剤含有または非含有）に交換するとともに、顕微鏡による細胞の観察と写真撮影(ＫＥＹＥＮＣＥ、ＢＺ－Ｘ８１０、または、トミー精工、ＭＸ－３０７)を行った。
　継代用の細胞は、7日目毎に細胞剥離剤を用いて前記ディッシュから剥がし、前記本培養用培地（阻害剤含有または非含有）に懸濁した。そして、前記細胞懸濁液を、新たに遺伝子発現・タンパク発現の解析用として、６０ｍｍ細胞培養用ディッシュへ４．８×１０３～１．４×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、新たに継代用として、１００ｍｍ細胞培養用ディッシュへ５．５×１０３／ｃｍ２の播種密度で播種することにより、継代した。前記の工程を繰り返しながら、前記阻害剤存在下または前記阻害剤非存在下で、最大２８日間の本培養を行った。
　遺伝子発現・タンパク発現解析用の細胞は、前記６０ｍｍ細胞培養用ディッシュで最大１４日間培養を継続し、それ以降は、前述のように、継代用の細胞を新たに播種して培養を継続した。そして、前記本培養用培地（阻害剤含有または非含有）を使用した本培養において、１、３、５、７、９、１１、１４、２１、２８日目に、解析用のディッシュから細胞を剥がし、細胞数の測定、ＲＮＡ回収、タンパクの免疫染色を行った。サンプリングされた細胞の一部を、後の解析のために凍結保存した。
　本培養の培養日数と各群の総細胞数との関係を表４に示す。総細胞数は、継代時に全ての細胞を継代したと仮定した累積として示す（以下、同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　前記表４に示すように、ＹＡ群では、前記阻害剤存在下での本培養５日間を経過した以降に、増殖率が増加し始め、その後、本培養２８日間まで、細胞の増殖率が高いまま継続したことがわかった。また、ＹＡ群の細胞数は、本培養７日目には、Ｎｏｒｍａｌ群の増殖率の１．２倍となり、１４日目には２４倍、２１日目には９２倍、２８日目には３２６倍となった。これらの結果から、前記阻害剤存在下での本培養により得られた細胞集団は、増殖性が向上した高増殖性細胞を含むことがわかった。また、Ｙ群およびＡ群においても、本培養によって増殖性の向上が確認できた。
　全ての実験群について、本培養開始から２８日目まで、細胞の観察を行った。図１（図１－１および図１－２）に、本培養開始から所定日数（３日目、７日目、１４日目、２８日目）の細胞について、顕微鏡写真を示す。図１－１において、各写真は、４０倍の拡大写真であり、図中のバーは、２００μｍであり、図１－２において、各写真は、１００倍の拡大写真であり、図中のバーは、１００μｍである。図１において、ＡＧＭは、Ｎｏｒｍａｌ群の写真であり、ＹＡは、ＹＡ群の写真、Ｙは、Ｙ群の写真である。図１から、前記阻害剤存在下で培養したＹＡ群、Ｙ群、Ａ群は、前記阻害剤非存在下で培養したＮｏｒｍａｌ群と比較して、以下のような特徴が確認できた。
　Ｙ群、およびＹＡ群では、前記阻害剤の添加翌日（１日目）から細胞形態の変化が始まり、細胞が細い神経突起様の構造を伸ばす像が認められた。図１においては、３日目にその特徴が顕著であった。また、Ａ群の細胞では、若干の細胞の萎縮が生じた。その後、添加から５～７日目を経過する頃になると、Ｙ群、Ａ群、およびＹＡ群において、細胞の中から小型で密集した細胞集団が現れ、形態の異なる複数の細胞集団がコロニー状に増殖していく様子が観察された。図１においては、７日目と１４日目に、その特徴が観察された。また、Ｙ群およびＹＡ群において、細胞形態の異なる集団は、それぞれに増殖を続けるが、Ｎｏｒｍａｌ群と比較して顕著に細胞増殖が促進された。これに対して、Ｎｏｒｍａｌ群では、細胞がやや大型化し、増殖が抑制される細胞密度に達しても、神経突起様の構造を持つ細胞群が、小型で密集した細胞層の上部に立体的に増殖を続けていく様子が観察された。また、Ａ群においても、小型で密集した細胞層は形成されるが、神経突起様の構造を持つ細胞群の増殖は、Ｙ群またはＹＡ群と比べて限定的であった。図１においては、２８日目の細胞像に、前記の特徴が認められた。
［実施例２］定量ＰＣＲによる外胚葉性細胞マーカーの確認
　前記実施例１と同様に前記阻害剤存在下での本培養により得られた高増殖性細胞を含む細胞集団（ＹＡ群）と前記阻害剤非存在で培養した細胞集団（Ｎｏｒｍａｌ群）について、外胚葉性細胞マーカー遺伝子の発現量を検討した。
　以下の細胞検体より常法に従ってＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡ試料を用いてｃＤＮＡを合成した。ＲＮＡ試料の調製および反応条件の設定は、製品添付のプロトコールにしたがった。
細胞検体：
・Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ（ＮＨＡ）
　前記実施例１において、前記阻害剤非存在下での本培養により得られた細胞集団（Ｎｏｒｍａｌ群）を使用した。なお、２８日間の本培養期間中、２回の継代を行った。
・ＮＨＡ－ＹＡ
　前記実施例１において、前記阻害剤ＹＡの存在下での本培養により得られた細胞集団（ＹＡ群）を使用した。なお、２８日間の本培養期間中、２回の継代を行った。
＜トータルＲＮＡの回収＞
試薬：ＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（登録商標、製品番号：１２１８３０１８Ａ、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ（登録商標、製品番号：１２１８５０１０、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
機器：冷却遠心機　ＭＸ－３０７、Ｂｉｏ・Ｒａｄ社、分光光度計　Ｎａｎｏｄｏｒｏｐ（商標）、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社
＜ｃＤＮＡの合成＞
試薬：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（登録商標、製品番号：ＲＲ０３７Ａ、タカラ・バイオ社）
機器：ＣＦＸ９６　Ｔｏｕｃｈ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド社）
＜定量ＰＣＲ＞
　前記トータルＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーおよびプローブを用いて、定量ＰＣＲによって、外胚葉性細胞マーカー遺伝子の発現を確認した。前記トータルＲＮＡの調製および反応条件の設定は、製品添付のプロトコールに従った。
試薬：ＴａｑＭａｎ　Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（製品番号：４４４４５５７、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
機器：ＣＦＸ９６　Ｔｏｕｃｈ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド社）
プライマー／プローブセット：
　・ＴａｑＭａｎ（登録商標、以下同じ）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１（製品番号：４３３１１８２、Ｔｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　ＧＦＡＰ：Ｈｓ００９０９２３３＿ｍ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　ＳＯＸ２：Ｈｓ０１０５３０４９＿ｓ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　ＮＥＳ：Ｈｓ０４１８７８３１＿ｇ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　ＭＳＩ１：Ｈｓ０１０４５８９４＿ｍ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　Ｎｏｔｃｈ１：Ｈｓ０１０６２０１４＿ｍ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　Ｓ１００ｂ：Ｈｓ００９０２９０１＿ｍ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　ＳＬＣ１Ａ３：Ｈｓ００９０４８２３＿ｇ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　ＣＳＰＧ４：Ｈｓ００３６１５４１＿ｇ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　ＰＡＸ６：Ｈｓ０１０８８１１４＿ｍ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
　・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　Ｏｌｉｇ２：Ｈｓ００３７７８２０＿ｍ１（製品番号：同上、ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）
統計処理：遺伝子の発現量の算出はＥｘｃｅｌ(Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ)を用いて行った。
（２－１）コントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）に対するマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）の相対値（Ｅ１／ＥＣ）
　各種マーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）を、内部標準のコントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現量（ＥＣ）に対する相対値（Ｅ１／ＥＣ）として算出した。その結果を表５（５－１、５－２）に示す。表５において、太字の数値は、後述する表６に示す最高値と最低値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　培養日数２８日超（３５日から６３日）の表５－２の結果から、各マーカー遺伝子の発現量の相対値（Ｅ１／ＥＣ）の最高値と最低値を抽出した。一方、培養日数２８日以下（１日から２８日）の表５－１の結果について、下記（１）および（２）の基準にしたがって、各マーカー遺伝子の発現量の相対値（Ｅ１／ＥＣ）の最高値と最低値とを抽出し、各マーカー遺伝子について、培養日数２８日超の結果と差別化するカットオフ値を決定した。これらの結果を、下記表６に示す。下記表において、カットオフ値は、例えば、かっこ内の値でもよい。
（１）２８日超での培養で、前記マーカー遺伝子が発現している範囲を除く。
（２）２８日以下の培養で、前記マーカー遺伝子が発現している範囲である。
ただし、２８日以下の培養の全ての期間で、２８日超での培養での前記マーカー遺伝子が発現している範囲が除かれている必要はない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　前記カットオフ値は、前記阻害剤存在下での２８日以下の培養により得られる細胞を、前記阻害剤存在下での２８日超の培養により得られる細胞と区別する条件となり得る。このため、前記カットオフ値は、本開示の高増殖性細胞を特定するための、マーカー遺伝子の発現挙動の基準範囲とすることができる。
（２－２）Ｎｏｒｍａｌ群でのマーカー遺伝子の発現量（ＥＮ）に対するＹＡ群でのマーカー遺伝子の発現量（ＥＹＡ）の相対値（ＥＹＡ／ＥＮ）
　定量ＰＣＲによる、神経幹細胞のマーカーであるＭｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、神経上皮細胞のマーカーであるＮｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ２、および放射状グリア細胞のマーカーであるＮｅｓｔｉｎの発現確認の結果、ならびに、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂ、ＳＬＣ１Ａ３、およびオリゴデンドロサイト前駆体細胞のマーカーであるＮＧ２の発現確認の結果を表７に示す。
　表７では、本培養５日目、７日目、９日目、１４日目、２８日目の各マーカー遺伝子の発現量を示す。マーカー遺伝子の発現量は、マーカー遺伝子の発現量の測定値をコントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現量の測定値により補正したものを用いた。そして、同じ培養日における、Ｎｏｍａｌ群のマーカー遺伝子の補正した発現量（ＥＮ）を「１」として、ＹＡ群の同マーカー遺伝子の補正した発現量（ＥＹＡ）の相対値（ＥＹＡ／ＥＮ）として示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表７に示すように、前記阻害剤存在下で得られた細胞集団（ＹＡ群）においては、前記阻害剤非存在下で培養したアストロサイト（Ｎｏｒｍａｌ群）と比較して、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、Ｓ１００ＢおよびＳＬＣ１Ａ３の発現が高く、対してオリゴデンドロサイト前駆体細胞のマーカーであるＮＧ２の発現は低かった。また、神経細胞の発生において、アストロサイトの上流に存在する放射状グリア細胞のマーカーおよび神経上皮細胞のマーカーでもあるＮｅｓｔｉｎ、同じく神経上皮細胞のマーカーであるＮｏｔｃｈ１およびＳＯＸ２、さらに神経幹細胞のマーカーであるＭｕｓａｓｈｉ１が、いずれも高く発現することが認められた。
　これらの結果から、前記阻害剤存在下で得られた細胞集団（ＹＡ群）は、成熟細胞であるアストロサイト（Ｎｏｒｍａｌ群）よりも前駆細胞に近く、高い増殖能を有する細胞であることがわかった。この細胞集団（ＹＡ群）は、高い増殖能を有することから、アストロサイトよりも短時間でより多く増殖することができる。また、短時間でより多くのエクソソームを得るには、前記ＹＡ群を用いることが有利であることがわかった。
［実施例３］免疫染色による外胚葉性細胞マーカーの確認
　前記実施例１と同様の方法により、前記阻害剤存在下での本培養により得られた高増殖性細胞を含む細胞集団（ＹＡ群）と前記阻害剤非存在で培養した細胞集団（Ｎｏｒｍａｌ群）を調製し、それぞれの細胞集団について、免疫染色法を用いて外胚葉性細胞のマーカータンパク質の発現を確認した。
＜使用試薬および培養用製品＞
試薬：
・細胞固定液および細胞膜処理液：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｘｐ３　／　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（商標、製品番号：００－５５２３－００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液(ＰＦＡ)（製品番号：１６１－２０１４１、富士フイルム和光純薬）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００　（製品番号：９３４４３、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、大塚蒸留水（製品番号：０５２０６９０３、大塚製薬）
・細胞洗浄液：リン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ（－）: カルシウムおよびマグネシウム不含、以下同様）（製品番号：１６６－２３５５５、富士フイルム和光純薬）、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　Ｔｗｅｅｎ　２０　（ＰＢＳ－Ｔ）（製品番号：Ｔ９１８３、富士フイルム和光純薬）
・一次抗体：
　・Ｒａｂｂｉｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＧＦＡＰ（製品番号：ａｂ６８４２８、Ａｂｃａｍ）
　・Ｒａｂｂｉｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＳＯＸ２（製品番号：ａｂ９２４９４、Ａｂｃａｍ）
　・Ｒａｂｂｉｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＮＯＴＣＨ１（製品番号：ａｂ５２６２７、Ａｂｃａｍ）
　・Ｒａｂｂｉｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｓａｓｈｉ１（製品番号：ａｂ５２８６５、Ａｂｃａｍ）
　・Ｒａｂｂｉｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｕｒａｌ／Ｇｌｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　２(ＮＧ２)（製品番号：ａｂ２７５０２４、Ａｂｃａｍ）
　・Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（製品番号：ａｂ１７２７３０、Ａｂｃａｍ）
　・Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（製品番号：４０１４０１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＧＦＡＰ（製品番号：５３－９７９２－８２、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）
　・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉ－ＳＯＸ２（製品番号：６５６１０９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｓａｓｈｉ１（製品番号：ａｂ１９９７８１、Ａｂｃａｍ）
　・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｕｒａｌ／Ｇｌｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　２(ＮＧ２)（製品番号：５３－４５０４－８０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　・ＰＥ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉ－Ｎｅｓｔｉｎ（製品番号：６５６８０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　・ＦＩＴＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（製品番号：４００１０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　・ＰＥ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（製品番号：４００１１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　・ＡＰＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（製品番号：４００１１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（製品番号：５０－６７１４－８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
　・ＰＥ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２a　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（製品番号：４００２１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　・Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　ｐｌａｓ　４８８（製品番号：Ａ３２７９６、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）
・二次抗体：
　・Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　ｐｌａｓ　４８８（製品番号：Ａ３２７６６、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）
　・Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　ｐｌａｓ　４８８（製品番号：Ａ３２７９０、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）
・核染色液：７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｄｙｅ（製品番号：Ａ０７７０４、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）
・ＦＡＣＳ溶液：リン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ（－））にＦＢＳ［２％（ｖ／ｖ）］と２ｍＭのＥＤＴＡ（製品番号：３１１－９００７５、ニッポンジーン）を添加し、０．２２μｍのＡＳＦＩＬシリンジフィルタ(２－８５６－０１　ＡＺＯＮＥ)でろ過したもの。
・細胞培養用ディッシュ　１００ｍｍ（１５０４６６、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・プロテオセーブ　ＳＳ １．５ｍLマイクロチューブ（ＭＳ－４２６５Ｍ、住友ベークライト）
装置：
・遠心分離機：ＭＸ－３０７、トミー精工
・細胞解析装置：フローサイトメーター　ＢＤ　ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、商標、日本ベクトン・ディッキンソン
・解析ソフトウェア：ＢＤ　ＦＡＣＳｉｕｔｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．３、ＦｌｏｗＪｏ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１０．８．１(商標、日本ベクトン・ディッキンソン)
＜免疫染色＞
・前記実施例１と同様にして、ヒトアストロサイト細胞（ＮＨＡ）について、前記阻害剤ＹＡの存在下および前記阻害剤非存在下での７日間の本培養を行った（Ｎｏｒｍａｌ群およびＹＡ群の調製）。そして、本培養７日間の細胞を、細胞剥離剤を用いてディッシュから剥がし、一部の細胞を１５ｍＬ遠沈管に回収し、１３ｍＬの増殖用培地（前記実施例１における前記阻害剤非含有の培養用培地）に懸濁した後、１，５００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離に供し、細胞を洗浄した。
・前記遠沈管の細胞を前記ＦＡＣＳ溶液で懸濁し、細胞濃度が１．０×１０７個／ｍＬとなるように調整した。
・１．５ｍLミクロチューブ内に濃度調整後の細胞懸濁液１００μＬ(１．０×１０6個)を分注し、さらに前記一次抗体を１／１００～１／２５０容量となるように加えて、４℃で１時間反応させた。なお、前記一次抗体に、直接、蛍光色素が標識されている場合、遮光下で反応させた。
・前記チューブに、ＰＢＳを１ｍＬ加えて、１，２００ｒｐｍ、３分間、４℃で遠心分離に供し、細胞を洗浄した。
・前記チューブ内の細胞を１００μＬのＰＢＳ（－）に懸濁し、さらに、９００μＬの前記４％ＰＦＡを加え、室温で３０分間のインキュベートにより前記細胞を固定した後、１，２００ｒｐｍ、３分間、４℃で遠心分離に供した。遠心分離後、上清を除去し、前記チューブにＰＢＳ（－）を１ｍＬ加えて、細胞を洗浄した。
・前記チューブ内の細胞を１ｍＬの０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ溶液でゆっくり懸濁し、室温で１５分間、細胞膜の透過処理をした。処理後、前記チューブに１ｍＬのＦＡＣＳ溶液を添加し、１，５００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離に供し、細胞を洗浄した。なお、市販試薬（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｘｐ３　／　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ）を使用して、細胞の固定、細胞膜の透過処理を行う場合は、製品添付のプロトコールに従った。
・前記チューブ内の細胞を１００μＬのＦＡＣＳ溶液に懸濁し、さらに、前記二次抗体を１／５０～１／１７５容量となるように加えて、４℃で３０分間～１時間反応させた。なお、この際も、前記一次抗体に、直接、蛍光色素が標識されている場合、遮光下で反応させた。
・前記チューブに、ＰＢＳ（－）を１ｍＬ加えて、１，５００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離に供し、細胞を２回洗浄した。
・前記チューブ内の細胞を５００μＬのＦＡＣＳ溶液に懸濁した。なお、生細胞の判別が必要な場合は、前記ＦＡＣＳ溶液に代えて、１／５０容量の７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ＤｙｅをＦＡＣＳ溶液に懸濁した懸濁液を加えた。
・そして、懸濁した細胞について、前記フローサイトメーターを使用して、マーカー陽性細胞の比率を計測し、前記解析ソフトを用いて細胞集団の構成を解析した。
　表８に、本培養７日目の前記Ｎｏｒｍａｌ群の細胞集団と前記ＹＡ群の細胞集団のそれぞれについて、マーカータンパク質の発現が陽性である細胞の割合（細胞陽性率）と、前記Ｎｏｒｍａｌ群の細胞陽性率に対する比率（対Ｎｏｒｍａｌ比）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表８に示すように、ＹＡ群においては、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、放射状グリア細胞のマーカーおよび神経上皮細胞のマーカーであるＮｅｓｔｉｎ、同じく神経上皮細胞のマーカーであるＮｏｔｃｈ１、およびＳＯＸ２、さらに神経幹細胞のマーカーであるＭｕｓａｓｈｉ１のいずれもが、Ｎｏｒｍａｌ群と比較して高い陽性細胞率を示した。これに対して、オリゴデンドロサイト前駆体細胞のマーカーであるＮＧ２の陽性細胞率は、Ｎｏｒｍａｌ群と比較して低くかった。これらの結果から、培養７日目のＮｏｒｍａｌ群に対するＹＡ群における各種外胚葉性細胞マーカータンパクの発現量の比は、前記実施例２（２－２）における、培養７日目のマーカー遺伝子の発現量の相対値（ＥＹＡ／ＥＮ）と一致することが確認された。
［実施例４］培養上清中のエクソソームの回収および確認
＜ヒトアストロサイト細胞の培養上清の回収＞
　以下の手順に沿って、前記阻害剤ＹＡ含有または前記阻害剤非含有の前記本培養用培地を用いてヒトアストロサイト細胞を培養し、その培養上清をそれぞれ回収した。
　まず、前記実施例１と同様に、ＮＨＡの凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。融解後の細胞を３０ｍＬの培養用培地に懸濁し、Ｔ－７５細胞培養用フラスコに、１．３×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、培養した。翌日、前記本培養用培地（前記阻害剤ＹＡ含有または非含有）により、１５ｍＬ／フラスコの容量で培地交換し、２－３日毎に同様の培地交換を行いながら培養を継続した。前記本培養用培地で７日間培養後、細胞剥離剤を用いて細胞を剥がし、細胞を前記本培養用培地に懸濁し、１５０ｍｍ細胞培養用ディッシュへ、６．６×１０３細胞／ｃｍ２かつ２０ｍＬ／ディッシュの容量の播種密度で継代した（２継代目）。前記阻害剤ＹＡ含有および前記阻害剤非含有の条件毎にディッシュを各５枚使用したため、播種した総細胞総数は、各５×１０６細胞ずつであった。前記実施例１と同様に、前記阻害剤ＹＡ含有本培養用培地で培養された細胞群をＹＡ群、前記阻害剤ＹＡを含まない本培養用培地で培養された細胞群をＮｏｒｍａｌ群と称する。
　前記２継代目からの３日間の培養後（本培養：合計１０日）、前記ディッシュの培地を、前記本培養用培地から前記培養上清回収用の阻害剤非含有培地（以下、回収用培地と称する）に、２０ｍＬ／ディッシュの容量で交換し、エクソソーム回収用の追加培養を開始した。
　前記追加培養の開始から４８時間後、前記ディッシュから培養上清を回収し、０．２２μｍフィルターシステム(Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)でろ過し、ろ液を４℃で保存した。さらに、前記培養上清回収後の前記ディッシュには、新鮮な前記回収用培地を２０ｍＬ／ディッシュの容量で添加し、追加培養を継続した。このような方法により、前記培養上清の回収は、合計６日間、計３回行い、各条件下で合計３００ｍＬの培養上清Ｐ２（エクソソーム含有溶液）を得た。ここで、Ｐ２とは、継代培養を２回行ったことを意味する。同様に、ＰＮ（ここで、Ｎとは正の整数を表す）とは、継代培養をＮ回行ったことを意味し、これ以降も同様である。したがって、ここでの「培養上清Ｐ２」とは、継代培養を２回行って得られた培養上清を意味する。
［実施例５]ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのプロテオーム解析
　前記実施例４の細胞上清Ｐ２（エクソソーム含有溶液）を用いて、エクソソームに含まれるタンパク質のプロテオーム解析を行った。
＜上清中のエクソソームの精製＞
　前記実施例４で得られた前記ＹＡ群および前記Ｎｏｒｍａｌ群の各培養上清Ｐ２（エクソソーム含有溶液）から、市販キット（ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳ：商標、２９３－７７６０、富士フイルム和光純薬)を使用してエクソソームを精製した。精製したエクソソーム検体は、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ　ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）により粒径および粒子濃度を測定した。なお、各培養上清Ｐ２の粒子濃度は、培養上清回収用の阻害剤非含有培地の粒子濃度を減算することによって求めた。表９に、各群のエクソソーム検体における粒子径および粒子濃度の測定結果を示す。また、前記エクソソーム検体の一部を用いてＢＣＡ－Ａｓｓａｙを行い、エクソソームが含有するタンパクのクオリティーチェックを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表９に示すように、前記ＹＡ群および前記Ｎｏｒｍａｌ群のいずれのエクソソーム検体においても、粒径１００ｎｍ～２００ｎｍに平均値（Ｍｅａｎ）および最頻値（Ｍｏｄｅ）を有する粒子が含まれており、エクソソームの存在が確認できた。また、前記ＹＡ群のエクソソーム検体は、前記Ｎｏｒｍａｌ群のエクソソーム検体と比較して、前記粒子径の粒子の含有量が約２．２倍程度を示した。このことから、前記阻害剤ＹＡ存在下での培養により得られた前記ＹＡ群の細胞集団によれば、効率よく、エクソソームを調製できることがわかった。
＜エクソソームのプロテオーム解析＞
　前記実施例４で得られた培養上清Ｐ２（エクソソーム含有溶液）に、還元処理液を加え、５７℃、３０分間の還元処理を行った。前記還元処理液は、１．５ｍｇのＤＴＴを１ｍＬの１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムに溶解して調製した。還元後のサンプルに、アルキル化処理液を加え、２５℃、３０分間反応を行った。前記アルキル化処理液は、１０ｍｇのヨードアセトアミドを１ｍＬの１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムに溶解して調製した。次いで、前記反応液にトリプシン消化液１００μＬ、および５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム１００Ｌを順に添加し、３０℃で１６時間処理することで、エクソソームを分解した。得られたエクソソームの分解物を遠心濃縮機で乾燥し、０．１％ぎ酸を３０μＬ加えて撹拌後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分間）を行い、上清を回収し、これを分析試料として、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
　ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）にＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００、質量分析装置（ＭＳ）にＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ　Ｐｌｕｓを用い、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）でＬＣおよびＭＳを制御して、測定を実施した。ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳの分析条件およびＰｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　Ｖｅｒ２．５（サーモフィッシャーサイエンティフィック）によるデータベース検索を実施した。次いで、検索結果をエクスポートして、Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｖｅｒ５．２．０（プロテオームサイエンス）で定量比較解析を実施した。分析試料のＭＳ／ＭＳデータについて、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを使用し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＿Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ（ＩＤ：９６０６）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ＿Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ（ＩＤ：９９１３）、およびこれらを混合したＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＿Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ（ＩＤ：９６０６）＋ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ＿Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ（ＩＤ：９９１３）の３種のデータベースを検索した。
・ヒト由来タンパク質：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（配列数２０３７６）
・ウシ由来タンパク質：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（配列数４７０４３）
　解析のＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｍｅｔｈｏｄには、ｉＢＡＱ（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ－Ｂａｓｅｄ　Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）値を使用し、検索結果として、Ｎｏｒｍａｌ群由来のエクソソーム画分とＮＨＡ－ＹＡ群由来のエクソソーム画分と培地成分とを合わせた全てのタンパク質断片を同定した。前記データベース上で検出された全タンパクから、Ｎｏｒｍａｌ群よりもＹＡ群由来のエクソソーム画分において多く検出されるものを選び、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｖａｌｕｅ（検出されたスペクトル数。補正あり。）が５．０以上のものを、高いものから順に選出した。さらに、選出したタンパク質の中から、さらにヒト由来タンパク質を選出し、もし対象がウシ由来タンパク質であった場合には、ヒト由来タンパク質での同定確率を検討し、同定確率が高いものを選出した。以下に、その後に行った、特徴的なタンパク質の選出ステップについて述べる。
ａ：膜タンパク質、および細胞外領域等に特徴的なタンパク質の選出ステップ
　ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ上の検索結果として、Ｎｏｒｍａｌ群由来のエクソソーム画分とＹＡ群由来のエクソソーム画分と培地成分とを合わせて、合計１９６６種類のタンパク質断片を検出した。検出された全１９６６個のタンパク質から、Ｎｏｒｍａｌ群よりもＹＡ群由来のエクソソーム画分において多く検出され、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｖａｌｕｅ（検出されたスペクトル数。補正あり。）が５．０以上のものを選出し、４１個のタンパク質を抽出した。
（ａ１）　上記で抽出した４１個のタンパク質のうち、Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｖｉｅｗｅｒのＧＯで「ｍｅｍｂｒａｎｅ」に括られているタンパク質として、２９個のタンパク質を選出した；
（ａ２）　上記で抽出した４１個のタンパク質のうち、Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｖｉｅｗｅｒのＧＯで「ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｇｉｏｎ」に括られているタンパク質として、３５個のタンパク質を選出した；
（ａ３）　上記で抽出した４１個のタンパク質のうち、Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｖｉｅｗｅｒのＧＯで「ｍｅｍｂｒａｎｅ」および「ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｇｉｏｎ」のいずれにも括られていないタンパク質として、１個のタンパク質を選出した；
（ａ４）　上記ステップ（ａ１）、（ａ２）および（ａ３）で抽出したタンパク質のうち、前記培地に含まれていないタンパク質として、１２個のタンパク質を選出した。そのうち、８個については、下記のステップ（ｂ１）～（ｂ４）により選出されたタンパク質と重複した。
　上記ステップ（ａ１）～（ａ５）により選出された１２個のタンパク質を図２に記す。
　上記選出ステップａとは異なる選出ステップｂで特徴的なタンパク質を選出した。
ｂ：中枢神経疾患に対して薬理効果を持つと予想される特徴的なタンパク質の選出ステップ
（ｂ１）　ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＿Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓとＵｎｉＰｒｏｔＫＢ＿Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓとを合わせた検索結果として、Ｎｏｒｍａｌ群由来のエクソソーム画分およびＹＡ群由来のエクソソーム画分と培地成分とを合わせて、合計１６４２種類のタンパク質断片を検出した。検出された全１６４２個の配列から、Ｎｏｒｍａｌ群よりもＹＡ群由来のエクソソーム画分において多く検出され、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｖａｌｕｅ（検出されたスペクトル数。補正あり。）が５．０以上のものを選出し、３５個のタンパク質を抽出した。
（ｂ２）　上記（ｂ１）で選出した３５個の配列について、論文検索サイトＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により、中枢神経疾患と関連するもの、または、脳、神経細胞の増殖、発生、分化、形態形成、移動、代謝等に関与していることが推定されるものを、３０個選出した。選出した３０個のうち、９個については、上記ステップ（ａ１）～（ａ５）により選出されたタンパク質と重複した。
　上記ステップ（ｂ１）～（ｂ３）により選出された３０個のタンパク質を図３に記す。
　上記選出ステップａとｂを合わせて、合計３３個のタンパク質を選出することができた。これらを図４に示す。
［実施例６]ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析
　前記実施例４の培養上清Ｐ２（エクソソーム含有溶液Ｐ２）を用いて、エクソソームに含まれるＳｍａｌｌ－ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、その他のＲＮＡを含む）の解析を行った。
＜前記ＹＡ群由来エクソソームからのＲＮＡの抽出＞
　前記実施例４のエクソソーム含有溶液Ｐ２から、ｅｘｏＲＮｅａｓｙ　Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ　ｋｉｔ（７７１４４、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。
＜ＲＮＡ解析＞
　得られたトータルＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ　ＲＮＡ　６０００　ｐｉｃｏ　ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡｇｉｌｅｎｔ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ　ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによりクオリティーチェックを行った。クオリティーチェック後、ディレクショナル（Ｓｔｒａｎｄｅｄ）用ＲＮＡライブラリー調製キット、ＮＥＢＮｅｘｔ　Ｕｌｔｒａ　ＩＩ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｉｌｌｕｍｉｎａを用いて、前記トータルＲＮＡからＲＮＡライブラリーを調製した。調製したＲＮＡライブラリーを用いて、ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行った。
　同様に、ｍｉＲＮＡライブラリー調製キット、ＱＩＡｓｅｑ　ｍｉＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、およびＱＩＡｓｅｑ　ｍｉＲＮＡ　ＮＳＧ　９６　Ｉｎｄｅｘ　ＩＬ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、前記トータルＲＮＡからｍｉＲＮＡライブラリーを調製した。調製したｍｉＲＮＡライブラリーを用いて、ｍｉＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行った。
　シークエンスライブラリーのクオリティーチェックは、Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ＤＮＡ　ｋｉｔ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより行った。
　ＮＧＳは、ＮｅｘｔＳｅｑ５００、およびＩｌｌｕｍｉｎａを用いて行った（シングルエンド、７５ｂｐ、平均リード数約１，０００万リード）。
　シーケンス後のデータは、リードの品質評価（ＦａｓｔＱＣ）を行った後、ＧｅｎｅＧｌｏｂｅ：Ｄａｔａ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）にてリファレンスゲノム（Ｈｕｍａｎ　ｈｇ３８）にアライメント（マッピング）し、Ｔｒｉｍｍｅｄ　ｍｅａｎ　ｏｆ　Ｍ　ｖａｌｕｅｓ（ＴＭＭ）で発現量を正規化した。そして、各ｍｉＲＮＡのアノテーション情報とＳｍａｌｌ　ＲＮＡ組成の分類集計とを含むＥｘｃｅｌ形式のファイルを作成した（解析ツール：ＳｔｒａｎｄＮＧＳ　ｖ４．０、Ｒ　ｖ３．６．２；アノテーション情報：ｍｉＲＢａｓｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ２１準拠）。その後、データ解析として、発現変動遺伝子の抽出後、ターゲット遺伝子予測からのＧＯ解析、およびＰａｔｈｗａｙ解析を実施した。
　前記エクソソーム含有溶液Ｐ２から検出された遺伝子数は、Ｎｏｒｍａｌ群で１３５０個、前記ＹＡ群で１３４６個であった。次いで、前記Ｎｏｒｍａｌ群と前記ＹＡ群とで比較した場合、Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ　１．１以上の遺伝子が３７７個検出された。そのうち、前記ＹＡ群において、Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ　２以上で発現が亢進するものが１２１個検出された。
＜機能的マーカーｍｉＲＮＡの選出＞
１．パーキンソン病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ
　以下の文献を参照し、パーキンソン病のヒト脳組織で発現が低下しているｍｉＲＮＡを３９個選出した。前記ｍｉＲＮＡを含有するエクソソームをパーキンソン病患者の細胞に投与することにより、パーキンソン病患者において、外因性に前記ｍｉＲＮＡの機能が補完され、パーキンソン病の治療効果が期待される。
参照文献：
・ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｉｎ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔｓ．　Ｎｅｕｒａｌ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１２（１２），　ｐｐ．１９４５－１９５９　（２０１７）
・"Ｌｅｉ Ｚｈｏｕ ｅｔ al. ＭｉｃｒｏＲＮＡ―１２８　Ｐｒｏｔｅｃｔｓ　Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ　ｆｒｏｍ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　４　ｉｎ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ‘ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ｂｙ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ＡＸＩＮ１．　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２０１８；５１（５）：２２７５－２２８９．
・Ｅａｓｈｉｔａ　Ｄａｓ　ｅｔ　ａｌ．　ＭｉｃｒｏＲＮＡ－４３２　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ　ｔｏ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｃｏｃｋｔａｉｌ　ａｎｄ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＮＥＳＴＩＮ　ａｎｄ　ＲＣＯＲ１　ｇｅｎｅｓ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２０１４　Ｍａｙ　２；５８８（９）：１７０６－１４．
・Ａｎｎａ－Ｅｌｉｓａ　Ｒｏｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　ｍｉＲ－１８２－５ｐ　ａｎｄ　ｍｉＲ－１８３－５ｐ　Ａｃｔ　ａｓ　ＧＤＮＦ Ｍｉｍｉｃｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ．　Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．　２０１８　Ｊｕｎ　１；１１：９－２２．
・Ｓｉｆａｎ　Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．　ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２１２－５ｐ　Ｐｒｅｖｅｎｔｓ　Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ　Ｎｅｕｒｏｎ　Ｄｅａｔｈ　ｂｙ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＳＩＲＴ２　ｉｎ　ＭＰＴＰ－Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｍｏｕｓｅ　Ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ‘ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｆｒｏｎｔ　Ｍｏｌ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２０１８　Ｏｃｔ　１１；１１：３８１．
　次いで、この中から、前記ＹＡ群由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを３個選出した。選出した３個のｍｉＲＮＡを図５に示す。
２．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ
　ＩＭＯＴＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ－ｗｅｂ．ｃｓ．ｕｎｉ－ｓａａｒｌａｎｄ．ｄｅ／ｉｍｏｔａ／）を用いて、アルツハイマー病の病態に関連するタンパク質、特にアルツハイマー病治療薬の薬理作用に寄与する複数のタンパク質と関連することが知られる下記のタンパク質と関連付けられるｍｉＲＮＡを選抜した。
２－１．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ（１）
　ＩＭＯＴＡを用いて、大脳皮質においてアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）と関連付けられるｍｉＲＮＡを７０個選出した。ＡＰＰは、アルツハイマー病発症の原因の一つに上げられる老人斑、すなわち、アミロイドβタンパクの沈着物の主要構成成分である。
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを５個選出した。選出した５個のｍｉＲＮＡを図６に示す。
２－２．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ（２）
　ＩＭＯＴＡを用いて、大脳皮質においてＢＡＣＥ１（β－ｓｉｔｅ　ＡＰＰ　ｃｌｅａｖｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）と関連付けられるｍｉＲＮＡを４２個選出した。アルツハイマー病発症時ＢＡＣＥ１はＡＰＰのＮ末端部分を切断することにより、異常なアミロイドβタンパクを産生する。
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを２個選出した。選出した２個のｍｉＲＮＡを図７に示す。
２－３．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ（３）
　ＩＭＯＴＡ　（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ－ｗｅｂ．ｃｓ．ｕｎｉ－ｓａａｒｌａｎｄ．ｄｅ／ｉｍｏｔａ／）を用いて、大脳皮質においてＮＭＤＡ受容体（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と関連付けられるｍｉＲＮＡを６６個選出した。アルツハイマー病発症時、脳内に異常なタンパク質が蓄積することで、神経を興奮させる物質が過剰に放出される。この興奮物質によりＮＭＤＡ受容体が過剰に活性化されることで、神経伝達や記憶が障害される。
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを３個選出した。選出した３個のｍｉＲＮＡを図８に示す。
２－４．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ（４）
　ＩＭＯＴＡ　（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ－ｗｅｂ．ｃｓ．ｕｎｉ－ｓａａｒｌａｎｄ．ｄｅ／ｉｍｏｔａ／）を用いて、大脳皮質においてグルコーゲン合成酵素キナーゼ－３－β（ＧＳＫ－３β：Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ－３β）と関連付けられるｍｉＲＮＡを５８個選出した。ＧＳＫ－３βは、様々な蛋白質をリン酸化する酵素で，複数のパスウェイ制御を介して細胞の生命維持や生理機能の調節に多様な働きをしている。アルツハイマー病においては脳内でのアミロイドβタンパクの沈着や神経細胞中にタウタンパク質の蓄積を促進する。その結果として神経細胞のアポトーシスを誘発する。
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを２個選出した。選出した２個のｍｉＲＮＡを図９に示す。
３．うつ病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ
　以下の文献を参照し、うつ病の個人における血漿中で発現が低下しているｍｉＲＮＡを２４個選出した。当該ｍｉＲＮＡを含有するエクソソームをうつ病患者の細胞に投与することにより、うつ病患者において、外因性に当該ｍｉＲＮＡの機能が補完され、うつ病の治療効果が期待される。
文献：ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐａｔｈｗａｙｓ：Ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅｖｉｅｗ　ａｎｄ　ａ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ　１００　（２０１９）　１０１６５０）
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを１個選出した。選出した１個のｍｉＲＮＡを図１０に示す。
［実施例７］ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームによるコルチコステロン障害性に対する神経保護効果の検証
　ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームによる機能性評価試験として、ラット副腎褐色細胞腫由来細胞株であるＰＣ－１２細胞（ＲＣＢ０００９、ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）に対する神経突起伸長抑制試験を行った。コルチコステロンは副腎皮質で合成される副腎皮質ホルモン(糖質コルチコイド)であり、規定量を培地に添加することによりＰＣ－１２細胞に対して毒性を示し、細胞のアポトーシスを誘導する。アポトーシスの誘導の定量化はＣａｓｐａｓｅ－３およびＣａｓｐａｓｅ－７の活性を測定することで行った。
＜試薬および培養用製品＞
　以下の試薬および培養用製品を使用した。
ＰＣ－１２細胞の培養
・増殖用培地の組成：基礎培地、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０％（ｖ／ｖ）ＨＳ、抗生物質
　基礎培地：ＤＭＥＭ，ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ，ｐｙｒｕｖａｔｅ（１１９９５－０７３；Ｇｉｂｃｏ）
　ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ，ｑｕａｌｉｆｉｅｄ，Ｂｒａｚｉｌ（１０２７０－１０６；Ｇｉｂｃｏ）
　ＨＳ：Ｈｏｒｓｅ　Ｓｅｒｕｍ，ｈｅａｔ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　ｏｒｉｇｉｎ（２６０５０－０８８；Ｇｉｂｃｏ）
　抗生物質：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ）（１５２４０－０６２；Ｇｉｂｃｏ）
・細胞剥離剤１：Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＡＴ１０４、ＩＣＴ）
・細胞剥離剤２：ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｘ），フェノールレッド非含有（１２６０４－０１３、Ｇｉｂｃｏ）
・細胞用緩衝液：リン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ（－）、ダルベッコ；カルシウムおよびマグネシウム不含）（ＢＮＤＳＢＮ２００、ＫＡＣ）
・細胞凍結用培地: ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ 1 (ＣＢ０１１    Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　(日本全薬工業))
・アッセイ用培地の組成：基礎培地、添加剤、抗生物質
　基礎培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ（１２４９１－０１５、Ｇｉｂｃｏ）
　添加剤：ＧｌｕｔａＭＡＸ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）（３５０５０－０６１、Ｇｉｂｃｏ）
　抗生物質：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ）（１５２４０－０６２、Ｇｉｂｃｏ）
・アポトーシス誘導試薬：Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ－１００ＭＧ (C０３８８－１００ＭＧ 東京化成工業)
・溶解溶媒： Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ(ＤＭＳＯ)(４７２３０１－１００ＭＬ ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ)
・アポトーシス測定試薬： Ｃａｓｐａｓｅ－ＧｌＯ ３／７ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ(Ｇ８０９１ Ｐｒｏｍｅｇａ)
器材
・増殖用:細胞培養用ディッシュ１００ｍｍ(１５０４６６ ＴＨＥＲＭＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)
・アッセイ用:コラーゲンＩコート製品９６ウェルプレート(４８６０－０１０ ＩＷＡＫＩ)
・発光量測定機器：Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４(ＢｉｏＴｅｃｋ)
エクソソーム回収用アストロサイト細胞の培養
　使用した培地、試薬、および機材は、前記実施例４に準じた。
・培養用培地：ＡＧＭ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ＣＣ－３１８６、Ｌｏｎｚａ）（ＡＧＭの組成：基礎培地、ＦＢＳ（３％（ｖ/ｖ））、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、インスリン、抗生物質）（実施例１で使用したのと同じもの）
・阻害剤Ｙ：ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２（０３４－２４０２４、富士フイルム和光純薬株式会社）、終濃度：１０μＭ（実施例１で使用したのと同じもの）
・阻害剤Ａ：ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１（０３５－２４１１３、富士フイルム和光純薬株式会社）、終濃度：０．５μＭ（実施例１で使用したのと同じもの）
・エクソソーム除去ウシ血清：Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｄｅｐｌｅｔｅｄ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ　Ｏｎｅ　ｓｈｏｔ（Ａ２７２０８０３、Ｇｉｂｃｏ）
・０．２２μｍフィルターシステム：Ｓｔｅｒｉｃｕｐ　Ｑｕｉｃｋ　Ｒｅｌｅａｓｅ－ＧＰ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｖａｃｕｕｍ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓ２ＧＰＵ０２ＲＥ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
・培養上清回収用培地：ＡＧＭ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ＣＣ－３１８６、Ｌｏｎｚａ）中の成分であるウシ血清（ＦＢＳ）の代りに３％（ｖ／ｖ）のエクソソーム除去ウシ血清（Ａ２７２０８０３；Ｇｉｂｃｏ）が添加されたもの
・洗浄用緩衝液 ：ダルベッコＰＢＳ（－) 粉末「ニッスイ」 (０５９１３日水製薬)
・９６ウェルプレート：コラーゲンＩコート９６ウェルプレート（４８６０－０１０、ＩＷＡＫＩ）
・細胞培養用フラスコ　Ｔ－７５（４３０６４１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）
・細胞培養用ディッシュ　１００ｍｍ：１５０４６６、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（実施例１で使用したのと同じもの）
・細胞培養用ディッシュ　１５０ｍｍ：１５０４６８、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（実施例１で使用したのと同じもの）
器材
・超遠心機 ： Ｏｐｔｉｍａ ＸＥ－９０ (Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ)
・ローター ： ＳＷ－４１Ｔｉ ６×１３．２ ｍＬ (Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ)
・遠心用チューブ ： Ｕｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ Ｔｕｂｅ (３４４０５９ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ)
・保存用チューブ ： プロキープ タンパク質低吸着チューブ １．５ｍＬ (ＰＫ－１５Ｃ－５００Ｎ ワトソン)
＜培養上清中のエクソソームの回収および確認＞
　実施例４で使用したのと同じ、材料、試薬、培養用製品、およびプロトコールにしたがって、前記阻害剤ＹＡ含有本培養用培地または阻害剤非含有本培養培地を用いて、ヒトアストロサイト細胞を培養したときの培養上清をそれぞれ回収した。具体的な方法を以下に示す。
１．材料
　ＮＨＡとして、実施例１で使用したのと同じ材料を使用した。
２．ヒトアストロサイト細胞の培養上清の回収
　ＮＨＡを含有する細胞培養液が保管された凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。融解後の細胞を３０ｍＬの培養用培地に再度懸濁し、Ｔ－７５細胞培養用フラスコに、１．４×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、培養した。翌日、前記阻害剤ＹＡ含有の本培養用培地、および前記阻害剤非含有の本培養用培地（以下、本培養用培地と称する）に１５ｍＬ／フラスコの容量で培地交換し、２日または３日おきに培地交換を行いながら、本培養を継続した。
　前記本培養用培地で７日間培養後、細胞剥離剤を用いて細胞を剥がし、新鮮な前記本培養用培地に懸濁して、１５０ｍｍ細胞培養用ディッシュへ、３．３×１０３細胞／ｃｍ２、２０ｍＬ／ディッシュの容量の播種密度で継代した（２継代目）。前記阻害剤ＹＡ含有、および前記阻害剤非含有の条件毎にディッシュを各５枚使用したため、播種した総細胞総数は、各５×１０６細胞ずつであった。前記実施例１と同様に、前記ＹＡ含有本培養用培地で培養された細胞群をＹＡ群、前記ＹＡを含まない本培養用培地で培養された細胞群をＮｏｒｍａｌ群と称する。
　前記２継代目からの３日間の培養後（本培養：合計１０日）、前記ディッシュの培地を、前記本培養用培地から前記培養上清回収用の阻害剤非含有の回収用培地（以下、回収用培地と称する）に、２０ｍＬ／ディッシュの容量で交換し、エクソソーム回収用の追加培養を開始した。なお、前記回収用培地は、前記実施例１と同様のものを使用した。
　前記追加培養の開始から４８時間後、前記ディッシュから培養上清を回収して、０．２２μｍフィルターシステム（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、ろ液を４℃で保存した。さらに、前記培養上清回収後の前記ディッシュには、新鮮な前記回収用培地を２０ｍＬ／ディッシュの容量で添加し、追加培養を継続した。このような方法により、前記培養上清の回収は、合計６日間、計３回行い、各条件下で合計３０５ｍＬの培養上清Ｐ２（エクソソーム含有溶液）を得た。
　計３回の培養上清を回収した後の前記ディッシュ上に残った細胞を、細胞剥離剤を用いて剥がし、細胞数をカウントした。その結果、Ｎｏｒｍａｌ群として得られた総細胞数は６．４×１０６細胞であり、播種総細胞総数に対する残存率は７３．６％であったのに対して、前記ＹＡ群として得られた総細胞数は７．１×１０７細胞であり、播種総細胞総数に対する残存率は９６．７％であり、前記Ｎｏｒｍａｌ群よりも高い結果が得られた。
３．培養上清中のエクソソームの濃縮
　上記で回収された前記ＹＡ群、および前記Ｎｏｒｍａｌ群、の培養上清Ｐ２（エクソソーム含有溶液）３０５ｍＬ分をチューブに移し、超遠心機（本体：Ｏｐｔｉｍａ　ＸＥ－９０、ローター：ＳＷ４１　Ｔｉ；ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して、２５０，０００×ｇ、７０分間、４℃で遠心分離を行った。上清を除去して沈殿物を回収した後、得られた沈殿物を洗浄するために、前記沈殿物に前記洗浄用緩衝液（ＰＢＳ（－））を添加した後、２５０，０００×ｇ、７０分間、４℃で遠心分離を行った。上清を除去し、洗浄された沈殿物を得た。洗浄された沈降物は、前記培養上清Ｐ２の容積の凡そ１／１０００となるよう、ＰＢＳ（－）にて再懸濁した。再懸濁したものを、評価用サンプルとした。前記評価用サンプルのコントロールは、ＰＢＳ（－）を使用した。
＜評価実験プロトコール＞
　前記ＰＣ－１２細胞の凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。溶解後の細胞を計１０ｍＬになるよう前記増殖用培地に移し、１８０×ｇ、５分間、室温で遠心分離に供した後、前記培地を除去した。細胞を再度、新鮮な増殖用培地に懸濁し、１００ｍｍ細胞培養用ディッシュに凡そ５，３００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。２日または３日おきに培地を交換しながら３７℃で培養を行い、継代を交えながら細胞を増殖させた。得られたＰＣ－１２細胞を、前記細胞剥離剤２を用いて剥がし、前記アッセイ用培地にて洗浄した後、新鮮なアッセイ用培地で再懸濁した。懸濁した細胞を、９６ウェルプレート（コラーゲンＩコート９６ウェルプレート）に１ウェルあたり２．０×１０４個／１００μＬ培地、すなわち、６１，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、約２４時間のインキュベートにより細胞を接着させた後、前記ウェルの培地を、１００μＭコルチコステロンおよび前記各評価用サンプルを含むアッセイ用培地５０μＬ（タンパク質量：１０μｇ／ｍＬ）に交換した。その後、前記評価用サンプルを含むアッセイ培地において、３７℃で２日間培養を行い、得られた培養物における細胞の障害状況を、カスパーゼ３／７活性を測定することにより評価した。
　カスパーゼ３／７活性は、市販のアポトーシス測定試薬を用いて、前記測定試薬に付随のプロトコールに基づき測定した。前記測定試薬は、カスパーゼ３／７活性を測定する発光ホモジニアスアッセイ用試薬を使用した。カスパーゼ３／７活性の活性化は、アポトーシス誘導の指標となるため、カスパーゼ３／７活性の測定結果（発光量）をアポトーシスの程度の間接的な結果として、表１０に示す。表１０において、ＹＡは、ＹＡ群由来の評価用サンプルを使用した結果、Ｎｏｒｍａｌは、Ｎｏｒｍａｌ群由来の評価用サンプルを使用した結果、ＰＢＳは、コントロール（ＰＢＳ（－））を使用した結果である。表１０において、発光量は、コントロールの平均発光量を１とした発光量相対値として示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　その結果、表１０に示すように、前記Ｎｏｒｍａｌ群由来の評価用エクソソームサンプルおよび前記ＹＡ群由来の評価用エクソソームサンプルでは、コントロール（ＰＢＳ（－））と比較して、発光量相対値が、Ｎｏｒｍａｌ群で２５％減、ＮＨＡ－ＹＡ群で２７％減と顕著に低下した。また、前記ＹＡ群由来の評価用エクソソームサンプルは、前記Ｎｏｒｍａｌ群由来の評価用エクソソームと比較して、さらに発光量の低下が確認できた。
　コルチコステロンにより細胞（ＰＣ－１２）が障害を受けると、カスパーゼ３／７経路が活性化され、細胞が死ぬ方向に向かう。すなわち、アポトーシスが誘導される。カスパーゼ３／７がより活性化されると、前述のような活性評価においては、発光量もより増える。すなわち、発光量が相対的に多いことは、対象の細胞が障害を受けている度合いが強く、アポトーシスに向かっていることを意味する。したがって、本開示のエクソソームを含む前記ＹＡ群由来の評価用サンプルを使用した場合、対象細胞であるＰＣ－１２が、コントロール（ＰＢＳ（－））および前記Ｎｏｒｍａｌ群由来の評価用サンプルを使用した場合と比較して、障害の度合いが最も小さいことを示した。よって、前記ＹＡ群の細胞から分泌される本開示のエクソソームは、細胞がコルチコステロンにより障害を受けることを抑制し、細胞を保護する機能を有することが分かった。
［実施例８]ＹＡ誘導細胞の形質安定性の確認
　前記阻害剤ＹＡ含有本培養用培地によって培養された外胚葉性細胞集団の形質が、前記阻害剤非存在下においても維持されるかを確認した。
＜検体＞
　・Ｎｏｒｍａｌ
　前記実施例１において、前記阻害剤非存在下での本培養により得られた細胞集団（Ｎｏｒｍａｌ群）。本培養開始９日目(２継代目、Ｎ－Ｄ９)、２８日目(４継代目、Ｎ－Ｄ２８)の細胞を凍結チューブで保存したものを使用した。以下、前者をＮ－Ｄ９（Ｐ２)、後者をＮ－Ｄ２８（Ｐ４)と表す。
　・ＮＨＡ－ＹＡ
　前記実施例１において、前記阻害剤Ｙおよび前記阻害剤Ａの存在下での本培養により得られた細胞集団（Ｎｏｒｍａｌ群）。本培養開始９日目(２継代目、ＹＡ－Ｄ９)、２８日目(４継代目、ＹＡ－Ｄ２８))の細胞を凍結チューブで保存したものを使用した。
＜使用試薬および培養用製品＞
　・培養用培地：ＡＧＭ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ＣＣ－３１８６、Ｌｏｎｚａ）（ＡＧＭの組成：基礎培地、ＦＢＳ（３％（ｖ/ｖ））、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、インスリン、抗生物質）
　・細胞剥離剤：Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＡＴ１０４、ＩＣＴ）
　・細胞用緩衝液：リン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ（－）、ダルベッコ；カルシウムおよびマグネシウム不含）（１４１９０２５０、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
　・細胞凍結用培地：ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　１（ＣＢ０１１ ＴａＫａＲａ（日本全薬工業株式会社））
　・細胞培養用ディッシュ１００ｍｍ（１５０４６６、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
　・遠心分離機：Ｏｐｔｉｍａ　ＸＥ－９０、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ
＜培養装置＞
　・ＣＯ２インキュベーター： ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ、ＰＨＣ株式会社
＜培養条件＞
　温度３７℃、ＣＯ２濃度５％
＜細胞観察・撮影装置＞
　・蛍光顕微鏡　ＣＫＸ５３、オリンパス株式会社
＜培養の手順＞
　培養の手順は、特に示さない限り実施例１に倣って行った。前記Ｎ－Ｄ９（Ｐ２）、前記Ｎ－Ｄ２８（Ｐ２）、前記ＹＡ－Ｄ９（Ｐ４）、前記ＹＡ－Ｄ２８（Ｐ４）のそれぞれの凍結チューブを、３７℃のウォーターバスで融解した。次いで、溶解後の細胞を計１０ｍＬになるよう培養用培地に移し、１８０×ｇ、５分間、室温で遠心分離に供した後、培地を除去した。細胞を再度、新鮮な培養用培地に懸濁し、１００ｍｍ細胞培養用ディッシュへ播種した。その際、ＹＡ－Ｄ９、およびＹＡ－Ｄ２８は、同じ細胞を２つに分けて、それぞれを１００ｍｍ細胞培養用ディッシュへ播種した。翌日、前記ディッシュの培地を、前記阻害剤非含有の培養用培地に交換し（培養開始０日目）、培養を継続させた。これ以降も、Ｎ－Ｄ９、Ｎ－Ｄ２８、ＹＡ－Ｄ９、およびＹＡ－Ｄ２８は、前記阻害剤非含有の培養用培地で培養した。培養期間中、２日または３日おきに、前記阻害剤非含有の培養用培地への培地交換を行い、５～７日間培養した後、継代を重ね、２４日間、４継代分培養した。培養期間中、培地交換を行うとともに、顕微鏡による細胞の観察および写真撮影(トミー精工、ＭＸ－３０７)を行った。
　そして、２継代であるＮ－Ｄ９およびＹＡ－Ｄ９について、前記阻害剤非存在下でさらに４継代培養した培養期間中の各継代（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６）の増殖率、４継代であるＮ－Ｄ２８およびＹＡ－Ｄ２８について、前記阻害剤非存在下でさらに４継代培養した培養期間中の各継代（Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８）の増殖率を算出した。そして、ＹＡ－Ｄ９およびＹＡ－Ｄ２８の各継代における阻害剤非存在下（ＹＡ（－））の増殖率について、それぞれ、Ｎｏｒｍａｌ群の同じ継代の増殖率を１として相対値を算出した。これらの結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１１に示すように、前記実施例１において前記阻害剤存在下の培養により得られた前記ＹＡ群（ＹＡ－Ｄ９およびＹＡ－Ｄ２８）は、さらに前記阻害剤ＹＡ非存在下での培養においても、前記Ｎｏｒｍａｌ群（Ｎ－Ｄ９およびＮ－Ｄ２８）に対して、高い増殖率を維持できた。
　代表例として、図１１として、図１１－１に、Ｎ－Ｄ９およびＹＡ－Ｄ９の３継代目（Ｐ３）とＮ－Ｄ２８およびＹＡ－Ｄ２８の５継代目（Ｐ５）の細胞の形態を、また、図１１－２に、Ｎ－Ｄ９およびＹＡ－Ｄ９の６継代目（Ｐ６）と、Ｎ－Ｄ２８およびＹＡ－Ｄ２８の８継代目（Ｐ８）の細胞の形態を示す。ＹＡ－Ｄ９およびＹＡ－Ｄ２８では、いずれの継代においても、小型で密集した細胞集団に加えて、突起様の形態を持つ細胞が立体的に増殖する像が認められた。一方、Ｎ－Ｄ９（Ｐ４）およびＮ－Ｄ２８（Ｐ６）では、いずれの継代においても、細胞が大きくなり、突起様の形態を持つ細胞は減少した。また、ＹＡ－Ｄ９およびＹＡ－Ｄ２８は、いずれの継代でも、小型の細胞は減少するものの、突起様の形態を持つ細胞は、Ｎ－Ｄ９、Ｎ－Ｄ２８よりも多く維持された。ＹＡ－Ｄ９およびＹＡ－Ｄ２８の形態は、前記実施例１で確認した形態と類似していることから、本開示の高増殖性細胞を、さらに前記阻害剤の非存在下で培養しても、前記高増殖性細胞の増殖性および形態は維持できることがわかった。
＜定量ＰＣＲによる外胚葉性細胞マーカーの確認＞
　本実施例において、前記阻害剤非存在下で培養したＮ－Ｄ９の４継代目（Ｐ４）およびＹＡ－Ｄ９の４継代目（Ｐ４）と、前記阻害剤非存在下で培養したＮ－Ｄ２８の６継代目（Ｐ６）およびＹＡ－Ｄ２８の６継代目（Ｐ６）の各細胞からＲＮＡ試料を抽出し、以下の外胚葉性細胞マーカー遺伝子について発現量を検討した。
　前記ＲＮＡ試料の調製および定量ＰＣＲの反応条件の設定は、前記実施例２に準じて行った。前記ＲＮＡ試料について、神経幹細胞のマーカーであるＭｕｓａｓｈｉ１、およびＮｏｔｃｈ１、神経上皮細胞のマーカーであるＮｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２、放射状グリア細胞のマーカーであるＮｅｓｔｉｎ、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、およびＳＬＣ１Ａ３、ならびにオリゴデンドロサイト前駆体細胞のマーカーであるＮＧ２の発現量を測定し、内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの発現量で補正した（Ｅ１／ＥＣ）。また、同様に、継代を開始する前の、前記Ｎ－Ｄ９（Ｐ２）、前記Ｎ－Ｄ２８（Ｐ２）、前記ＹＡ－Ｄ９（Ｐ４）および前記ＹＡ－Ｄ２８（Ｐ４）について、前記阻害剤非含有の培養用培地に交換した培養開始０日目の細胞からも、同様にＲＮＡ試料を調製して、前記マーカー遺伝子の発現量を測定し、補正した（Ｅ１／ＥＣ）。つぎに、培養０日目の細胞における補正した相対値と、継代後のＮ－Ｄ９（Ｐ４）、ＹＡ－Ｄ９（Ｐ４）、Ｎ－Ｄ２８（Ｐ６）およびＹＡ－Ｄ２８（Ｐ６）の細胞における補正した相対値とから、増減量を求めた。そして、Ｎ－Ｄ９の発現の増減量に対するＹＡ－Ｄ９の発現の増減量、Ｎ－Ｄ２８の発現の増減量に対するＹＡ－Ｄ２８の発現の増減量を、相対値（ＥＹＡ／ＥＮ）として計算した。これらの結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１２に示すように、ＹＡ－Ｄ９（Ｐ４）では、ＧＦＡＰ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓ１００Ｂ、およびＳＬＣ１Ａ３の発現量が、Ｎ－Ｄ９（Ｐ４）よりも高く、前述した実施例２の結果と一致した。一方、ＹＡ－Ｄ９（Ｐ４）では、ＳＯＸ２の発現量がＮｏｒｍａｌよりもやや低く、ＮＧ２の発現量がやや高い結果となった。また、ＹＡ－Ｄ２８（Ｐ６）では、ＧＦＡＰ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓ１００Ｂ、およびＳＬＣ１Ａ３の全ての発現量が、Ｎ－２８（Ｐ６）よりも高く、ＮＧ２の発現量がＮ－２８（Ｐ６）よりも低く、前記実施例２において確認されたＹＡ阻害剤存在下で培養された細胞の遺伝子発現パターンと一致した。
　これらの結果から、前記阻害剤ＹＡ含有の本培養用培地によって培養された外胚葉性細胞集団の形質は、その後、前記阻害剤非存在下で培養した場合においても、維持されることを確認した。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０２２年１２月１日に出願された日本出願特願２０２２－１９２５９５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　本開示によれば、高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途を提供することができる。

 

Claims (14)

  1. 外胚葉性細胞の特徴を備え、以下のＡ１の発現挙動を示す、外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞。
    （Ａ１）前記高増殖性細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）およびコントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）によって決定される相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、下記表１で表される基準範囲を充たす。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  2. 外胚葉性細胞の特徴を備え、外胚葉性細胞を低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日以下の培養期間後の細胞数が、前記阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞。
  3. 前記高増殖性細胞が、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である細胞を含む、請求項１または２に記載の高増殖性細胞。
  4. 前記高増殖性細胞が、外胚葉性前駆細胞を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の高増殖性細胞。
  5. 前記外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の高増殖性細胞。
  6. 高増殖性細胞の製造方法であって、
    （ｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
    を含み、
    前記（ｉ）において、前記阻害剤の存在下での培養期間が、２８日以下である、高増殖性細胞の製造方法。
  7. 高増殖性細胞の製造方法であって、
    （ｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
    を含み、
    前記（ｉ）において、条件ａ１、条件ｂ１および条件ｃ１からなる群より選択される少なくとも１つを充たすまで、前記阻害剤の存在下での培養を行う、高増殖性細胞の製造方法。
    （ａ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ１）およびコントロール遺伝子の発現量（ＥＣ）によって決定される相対値（Ｅ１／ＥＣ）が、下記表２で表される基準範囲を充たす。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
     （ｂ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞の細胞数が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える。
    （ｃ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である。
  8. 前記原料となる外胚葉性細胞が、中枢神経系の細胞を含む、請求項６または７に記載の高増殖性細胞の製造方法。
  9. 前記原料となる外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
  10. 前記阻害剤が、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項６～９のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
  11. 前記（ｉ）において、前記阻害剤の存在下での培養が、前記阻害剤を含む培地を用いた培養であり、前記培地における前記阻害剤の濃度が、０．００１μＭ～１００μＭの範囲内である、請求項６～１０のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
  12. （Ｉ）請求項１～５のいずれか１項に記載の外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞の培養物を得ること、または、請求項６～１１のいずれか１項に記載の製造方法を実施して高増殖性細胞の培養物を得ること、および
    （ＩＩ）前記培養物から、前記高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を分離すること
    を含む、高増殖性細胞由来の細胞分泌物の製造方法。
  13. 前記細胞分泌物が、エクソソームを含む、請求項１２に記載の細胞分泌物の製造方法。
  14. タンパク質およびｍｉＲＮＡの少なくとも一方を含む細胞分泌物であって、
    前記タンパク質は、
    糖タンパク質Ｍ６Ｂ（Ｑ１３４９１）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲα鎖（Ｐ０１９０３）、トゥイーティーホモログ１（Ｑ９Ｈ３１３）、フィブリリン－２（Ｐ３５５５６）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲＢ１β鎖（Ｐ０１９１１）、およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｐ０５１０９）の組み合わせを含み、
    前記ｍｉＲＮＡは、
    ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６（ＭＩＭＡＴ００００４６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２６５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７０７）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５５）の組み合わせを含む、細胞分泌物。
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