WO2023008564A1 - 高増殖性細胞の製造方法、高増殖性細胞およびその用途 - Google Patents

高増殖性細胞の製造方法、高増殖性細胞およびその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2023008564A1
WO2023008564A1 PCT/JP2022/029317 JP2022029317W WO2023008564A1 WO 2023008564 A1 WO2023008564 A1 WO 2023008564A1 JP 2022029317 W JP2022029317 W JP 2022029317W WO 2023008564 A1 WO2023008564 A1 WO 2023008564A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
culture
ectodermal
inhibitor
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/029317
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
孝広 落谷
達也 篠田
和也 滝澤
Original Assignee
学校法人東京医科大学
昭和電工マテリアルズ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人東京医科大学, 昭和電工マテリアルズ株式会社 filed Critical 学校法人東京医科大学
Priority to EP22849624.6A priority Critical patent/EP4379045A1/en
Priority to CA3227868A priority patent/CA3227868A1/en
Priority to CN202280064750.8A priority patent/CN118043449A/zh
Priority to JP2023538641A priority patent/JPWO2023008564A1/ja
Priority to KR1020247006514A priority patent/KR20240040102A/ko
Publication of WO2023008564A1 publication Critical patent/WO2023008564A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing highly proliferative cells, highly proliferative cells, and uses thereof.
  • An object of the present disclosure is to provide a method for producing hyperproliferative cells, hyperproliferative cells, and uses thereof.
  • a method for producing highly proliferative cells comprising: (i) preparing ectodermal cells as a raw material; (ii) culturing in a medium containing a small molecule signaling pathway inhibitor in contact with said starting ectodermal cells, and (iii) After the contact, additional culturing is performed in a medium containing the inhibitor to obtain a culture containing highly proliferative cells with enhanced cell proliferation ability compared to the raw material ectodermal cells.
  • the high-proliferative cells are cultured under the same culture conditions for the same culture period except that the number of cells after a culture period of more than 28 days in contact with the inhibitor is not in contact with the inhibitor.
  • the hyperproliferative cells express at least one gene specific to mature cells to the same level as or more
  • a method for producing highly proliferative cells, highly proliferative cells, and uses thereof can be provided.
  • FIG. 1 shows the morphology of ectodermal cells after long-term culture according to Example 1.
  • FIG. 2 shows cell morphology of ectodermal cells before and after medium exchange to the recovery medium according to Example 2.
  • FIG. 3A shows the particle size distribution of particles in the culture supernatant collected after additional culture of the Normal group according to Example 2.
  • FIG. 3B shows the particle size distribution of particles in the culture supernatant collected after additional culture of the NHA-YA group according to Example 2.
  • FIG. Figure 4A shows proteins selected by proteome analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 4.
  • Figure 4B shows proteins selected by proteome analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 4.
  • FIG. 5 shows miRNAs as Parkinson's disease markers selected by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 5.
  • FIG. 6 shows miRNAs as Alzheimer's disease markers selected by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 5.
  • FIG. 7 shows miRNAs as Alzheimer's disease markers selected by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 5.
  • FIG. 8 shows miRNAs as Alzheimer's disease markers selected by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 5.
  • FIG. 9 shows miRNAs selected as Alzheimer's disease markers by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 5.
  • Figure 10 shows miRNA as a depression marker selected by miRNA analysis of NHA-YA-derived exosomes according to Example 5.
  • the method for producing highly proliferative cells comprises: (i) preparing ectodermal cells as a raw material; (ii) culturing in a medium containing a small molecule signaling pathway inhibitor in contact with said starting ectodermal cells, and (iii) After the contact, additional culturing is performed in a medium containing the inhibitor to obtain a culture containing highly proliferative cells with enhanced cell proliferation ability compared to the raw material ectodermal cells. .
  • the term "cell” should be interpreted as a term that includes at least one cell unless otherwise specified. Therefore, unless otherwise specified, the cell referred to by the term “cell” is not limited to being a single cell and can be used synonymously with a cell population.
  • cell population should be interpreted as a term containing at least one type of cell. Therefore, unless otherwise specified, the term “cell population” is not limited to cells of one type.
  • Ectoderm is one of the three germ layers that occur during metazoan development. Ectoderm originates from the outer layers of the embryo and develops into the skin, nervous system and sensory organs. Skin includes, for example, epidermis, hair, nails, and skin glands; nervous system includes, for example, cranial nerves, spinal cord, and peripheral nerves; and sensory organs, such as visual organs, auditory organs, and balance. organ, gustatory, olfactory and tactile.
  • Ectodermal cells as used in the present disclosure include, for example, cells of the nervous system, such as cells of the central nervous system and cells of the peripheral nervous system.
  • source ectodermal cells can include, for example, cells of the central nervous system.
  • the source ectodermal cells may include astrocytes.
  • the ectodermal cells used in the production method of the present disclosure may be provided from any source, for example, provided from mammals.
  • Mammals include, for example, humans, rats, mice, cats, dogs, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows and monkeys. Mammals are preferably humans, rats, mice, cats or dogs, more preferably humans, rats or mice.
  • ectodermal cells are cells that constitute “ectodermal tissue” and “ectodermal organs”.
  • Ectodermal tissue and “ectodermal organ” include, for example, central nerves (brain and spinal cord), pituitary gland, peripheral nerves, enteric nerves, adrenal medulla, melanocytes, facial cartilage, dentin of teeth, epidermis, hair , nails, skin, sebaceous glands, salivary glands, sweat glands, mammary glands, nasal cavities, nasal mucosa, oral epithelium, oral cavity, eyes, bladder, and anus.
  • the brain can be broadly divided into the cerebrum, cerebellum and brainstem.
  • the cerebrum is further divided into the telencephalon and diencephalon, and the brainstem is further divided into the midbrain, pons and medulla oblongata.
  • the central nervous system is composed of neurons and glial cells, and these cells can be chosen as starting material. These tissues or organs are rich in mature cells that have completed the terminal differentiation stage.
  • Ectodermal cells as raw materials are, for example, astrocytes, microglia, oligodendrocytes, oligodendrocyte progenitor cells (also called polydendrocytes) classified into glial cells, ependymal cells, Schwann cells and satellite cells. At least one selected from the group consisting of can be selected. These cells are primary cells obtained from living organisms, established cell lines, or ectodermal cells induced from pluripotent stem cells such as ES cells or induced pluripotent stem cells (iPS cells). good too.
  • the cells used in the method of the present disclosure may be, for example, cells isolated and purified from brains excised from mammals.
  • brains excised from adult rats aged 10 to 20 weeks it is preferable to use brains excised from adult rats aged 10 to 20 weeks, but brains derived from juvenile rats aged 2 months or less may also be used.
  • it can be obtained by biopsy or surgery.
  • both neuronal and glial cells can be obtained by biopsy.
  • excised adult brain tissue pieces can be used, as can brains excised from dead fetuses.
  • frozen cells can also be used.
  • the raw material ectodermal cells can be defined as cells that exhibit the characteristics of ectodermal cells. Characteristics of ectodermal cells include cell morphology, expression of cell-specific genes (sometimes referred to as “marker genes”), and the like. being an ectodermal cell, at any stage of differentiation, e.g., selected from the group consisting of GFAP, S100B, SLC1A2 (also known as "EAAT2" or "GLT-1"), and NG2 The presence of expression of at least one marker gene can be confirmed. Expression of marker genes for ectodermal cells may be confirmed on both gene and protein basis. Gene or protein expression can be confirmed by methods known in the art, such as the presence or absence of expression, the specific expression level depending on the measurement method, and comparison with the expression level of the same gene or protein in a specific cell. can.
  • the expression of the marker gene can be confirmed using techniques known in the art, for example, quantitative PCR (sometimes referred to as "qPCR"). It can be confirmed by measurement of expression level, measurement of protein amount using an immunoassay method such as ELISA, flow cytometry, and the like.
  • the raw material ectodermal cells prepared as described above are brought into contact with a low-molecular-weight signaling pathway inhibitor. Contacting may be in vitro.
  • Any low-molecular signaling pathway inhibitor that can be used in this method is not particularly limited and can be used.
  • Examples of low-molecular signaling pathway inhibitors include transforming growth factor (TGF) ⁇ receptor inhibitors, ROCK [Rho-associated protein kinase] inhibitors and glycogen synthase kinase 3 (Glycogen synthase kinase 3; GSK3) inhibitors.
  • the inhibitor may contain at least one compound selected from the group consisting of TGF ⁇ receptor inhibitors, ROCK inhibitors and GSK3 inhibitors. In the production method according to the present disclosure, the inhibitor may contain at least one compound selected from the group consisting of TGF ⁇ receptor inhibitors and ROCK inhibitors.
  • the TGF ⁇ receptor inhibitor is not particularly limited as long as it has the effect of inhibiting the function of the TGF ⁇ receptor.
  • -tert-butyl-1H-imidazol-4-yl)-6-methylpyridine 3-(6-methylpyridin-2-yl)-4-(4-quinolyl)-1-phenylthiocarbamoyl-1H-pyrazole ( A-83-01), [2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-4-(4-pyridylamino)]pteridine (SD-208), 3-(pyridin-2-yl)-4-(4 -Quinonyl)]-1H-pyrazole, 2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine (both Merck), SB431542 ( Sigma Aldrich) and CultureSure® A-83-01 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it has the effect of inhibiting the function of Rho-associated protein kinase. ), CultureSure® Y-27632 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and H-1152 dihydrochloride (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the ROCK inhibitor is preferably CultureSure® Y-27632. ROCK inhibitors may be used alone or in combination of two or more.
  • the GSK3 inhibitor is not particularly limited as long as it has the effect of inhibiting the function of glycogen synthase kinase (GSK) 3.
  • GSK3 inhibitors include, for example, SB216763 (Selleck), CHIR 98014 ( Axon medchem), CHIR 99021 (Axon medchem), SB415286 (Tocris Bioscience) and Kenpaullone (Cosmo Bio).
  • the GSK3 inhibitor is preferably CHIR 99021.
  • GSK3 inhibitors may be used alone or in combination of two or more.
  • the low-molecular-weight signaling pathway inhibitor used in this production method can be at least one selected from the group consisting of TGF ⁇ receptor inhibitors and ROCK inhibitors. That is, the low-molecular-weight signaling pathway inhibitor used in the present production method is - a combination of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor, • a TGF ⁇ receptor inhibitor, or • a ROCK inhibitor. In one aspect, the small molecule signaling pathway inhibitor used is a combination of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor. As used herein, the term "small molecule signaling pathway inhibitor" may be simply referred to as "inhibitor.”
  • aspects of the present disclosure include, for example, inhibitors of: (1) 2-(5-benzo[1,3]dioxol-4-yl-2-tert-butyl-1H-imidazol-4-yl)-6-methylpyridine, 3-(6-methylpyridine-2- yl)-4-(4-quinolyl)-1-phenylthiocarbamoyl-1H-pyrazole (A-83-01), [2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-4-(4-pyridylamino)] Pteridine (SD-208), 3-(pyridin-2-yl)-4-(4-quinonyl)]-1H-pyrazole, 2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazole- 4-yl)-1,5-naphthyridine, SB431542 and at least one compound selected from the group consisting of CultureSure® A-83-01; (2) 2-(5-benzo[1,3]di
  • the concentration of the TGF ⁇ receptor inhibitor in the medium is, for example, within the range of 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, 0.01 ⁇ M to 50 ⁇ M, or 0.05 ⁇ M to 30 ⁇ M, and can be adjusted as appropriate depending on the type of TGF ⁇ receptor used.
  • the concentration of the TGF ⁇ receptor inhibitor, eg, CultureSure® A-83-01, in the medium is 0.1 ⁇ M to 3 ⁇ M.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is, for example, within the range of 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, 0.01 ⁇ M to 80 ⁇ M, or 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and can be adjusted as appropriate depending on the type of ROCK inhibitor used.
  • the concentration of the ROCK inhibitor, eg, CultureSure® Y-27632, in the medium is between 1 ⁇ M and 30 ⁇ M.
  • the concentration of the GSK3 inhibitor in the medium is, for example, within the range of 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, 0.01 ⁇ M to 80 ⁇ M, or 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and can be adjusted as appropriate depending on the type of GSK3 inhibitor used.
  • the above concentration ranges are applicable both when the TGF ⁇ receptor inhibitor, ROCK inhibitor and GSK3 inhibitor are used alone and when these inhibitors are used in combination.
  • the inhibitor when it is water-insoluble or poorly water-soluble, it can be dissolved in a small amount of a low-toxic organic solvent (eg, DMSO, etc.) and then added to the medium to achieve the above final concentration.
  • a low-toxic organic solvent eg, DMSO, etc.
  • the contact between the raw material ectodermal cells and the low-molecular-weight signaling pathway inhibitor is carried out by culturing the raw material ectodermal cells in a medium containing the inhibitor. Specifically, the inhibitor is added to the medium at an effective concentration and cultured.
  • ectodermal cells After contacting the raw material ectodermal cells with a low-molecular-weight signaling pathway inhibitor, they are further cultured in a medium containing the inhibitor. Further culturing is here also referred to as “additional culturing” or “second culturing". In contrast, culturing of ectodermal cells as raw materials until they are brought into contact with a small molecule signaling pathway inhibitor, that is, culturing of ectodermal cells in a medium that does not contain a small molecule signaling pathway inhibitor. , also referred to as “pre-culture” or “first culture”. After contact with the inhibitor, additional culture is performed to obtain highly proliferative cells with enhanced cell proliferation ability. Since the inhibitor is contained in the medium even during the additional culture, the contact between the cells and the inhibitor continues.
  • a medium widely used for culturing animal cells can be used as a basal medium, and a commercially available basal medium may also be used.
  • Commercially available basal media include, for example, astrocyte growth medium (AGM), minimal essential medium (MEM), Dulbecco's modified minimal essential medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, Ham's F12 medium, William' Examples include sE medium and NS basal medium (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), but are not particularly limited to these.
  • AGM astrocyte growth medium
  • MEM minimal essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified minimal essential medium
  • RPMI1640 medium RPMI1640 medium
  • 199 medium Ham's F12 medium
  • William' Examples include sE medium and NS basal medium (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), but are not particularly limited to these.
  • the above medium may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Additives added to the medium include, for example, cytokines, growth factors (e.g., epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2)), hormones (e.g., insulin, estradiol, progesterone).
  • growth factors e.g., epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2)
  • hormones e.g., insulin, estradiol, progesterone
  • steroids eg, dexamethasone (Dex)
  • plasma-derived proteins eg, transferrin
  • amino acids eg, L-glutamine and L-proline
  • various inorganic salts eg, selenite and NaHCO 3
  • vitamins eg, nicotinamide and ascorbic acid derivatives
  • N2 supplement Ferjifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • NS supplement Ferjifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • B-27 Plus Supplement Thermo Fisher Scientific
  • antibiotics eg, penicillin and streptomycin
  • antifungal agents eg, amphotericin
  • buffers eg, Good's buffers such as HEPES
  • the medium used in the preculture (first culture) and additional culture (second culture) may be either a serum-added medium or a serum-free medium.
  • fetal bovine serum can be used as serum.
  • exosome-removed FBS can also be used.
  • concentration of serum in the medium is, for example, 0.5-25% (v/v), 1-25% (v/v), 1-20% (v/v), 1-15% (v/v ), 2-15% (v/v), 2-10% (v/v), 3-10% (v/v), 3-8% (v/v), and 3-5% (v /v). In one specific aspect, the concentration of serum in the medium is 3% (v/v).
  • serum replacement When using serum-free medium, serum replacement may be added.
  • serum substitutes include bovine serum albumin (BSA), knockout serum replacement (KSR), human serum albumin (HSA or human albumin, serum; HAS), and the like. mentioned.
  • human serum albumin human serum albumin isolated from human plasma or human serum albumin purified from rice expressing human serum albumin gene (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be used. Additional factors such as growth factors (such as hEGH), cytokines and hormones are usually added to the medium.
  • EGF epidermal growth factor
  • insulin transferrin
  • dexamethasone Dex
  • N2 supplement Flujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • NS Supplement Flujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • B-27 Serum Free Supplement Thermo Fisher Scientific
  • the culture vessel used for culture is not particularly limited as long as it is suitable for adherent culture. , chamber slides, Petri dishes, tubes, trays and culture bags.
  • As the culture vessel a culture vessel whose surface has been processed so that the cells cannot adhere in order to carry out suspension culture of cells can also be used.
  • the inner surface can be coated with a cell-supporting substrate for the purpose of improving adhesion to cells.
  • Such cell-supporting matrices include, for example, collagen, gelatin, matrigel, poly-L-lysine, laminin and fibronectin.
  • Preferred cell-supporting matrices are collagen or matrigel.
  • the ectodermal cells used as raw materials are, for example, 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , or 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 . It can be seeded onto culture vessels at a cell density of cm 2 .
  • conditions generally applied to culturing ectodermal cells can be applied as they are.
  • a CO 2 incubator can be used for the culture, and the culture temperature and CO 2 concentration in that case may be those commonly used, for example, 37° C. and 5% (v/v). be able to.
  • the culture period is the period of culturing with YA, and the period may be a continuous period or a discontinuous period, that is, a period obtained by summing a plurality of discontinuous periods.
  • the culture period may be greater than 28 days, for example 5 weeks or longer, 6 weeks or longer, or 7 weeks or longer.
  • the upper limit of the culture period can be, for example, about 3 months or 100 days.
  • Passaging can be appropriately performed depending on the cell density in the culture vessel, the state of the medium, the state of the cells, etc., and the passaging interval can be, for example, about 2 to 20 days.
  • HP cells Highly proliferating cells obtained by this production method are cells with enhanced proliferative ability, Compared to the control ectodermal cells cultured under the same conditions as the culture conditions of the cells except that a medium containing no agent is used, the cell growth activity is higher and the property of growing in a shorter time, that is, cells It means that the cell has the property of a shorter doubling time, the property of proliferating for a longer period of time, or the property of satisfying both.
  • the cell population contained in the culture obtained by this production method includes not only HP cells, but also cells whose proliferation ability has not been enhanced and has the same proliferation ability as the original cells, that is, non-HP cells.
  • Non-highly proliferating cells (sometimes referred to herein as "non-HP cells") can be included.
  • the proportion of HP cells in the cell population obtained by this production method may be 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more based on the number of cells.
  • the hyperproliferative cells are the number of cells after a culture period of more than 28 days (herein, “period T”) in contact with the inhibitor (herein, “the number of cells N”) is the number of ectodermal cells cultured for the same culture period under the same culture conditions except that they are not in contact with the inhibitor (herein, “cells of ectodermal cells number N′”).
  • the culture conditions in this case can be, for example, a seeding density of 4 ⁇ 10 3 cells/cm 2 , a culture temperature of 37° C., and a CO 2 concentration of 5%.
  • Any of the media used in the above preculture and additional culture can be used as the medium used for confirming the cell number N of the highly proliferative cells.
  • the two types of media used to confirm the cell number N of hyperproliferative cells and the cell number N' of ectodermal cells, respectively, may be the same composition other than the presence or absence of inhibitors. can.
  • the period T is, for example, 90 days, 80 days, 70 days, 60 days, 50 days, 45 days, 42 days, 40 days, 35 days, 32 days, 30 days or 29 days.
  • the cell number N of the hyperproliferative cells is not particularly limited as long as it is more than 1.0 times the cell number N' of the ectodermal cells, for example, 1.1 times or more the cell number N', 1 It may be .2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, or 1.5 times or more.
  • the cell number N of hyperproliferative cells is at least 1.5 times the cell number N' of ectodermal cells.
  • Hyperproliferative cells may be identified by the expression of cell-specific genes, ie marker genes.
  • the expression of the marker gene for hyperproliferative cells may be confirmed based on either the gene or the protein, as described hereinabove, and the method for confirming the expression of the gene or protein is the presence or absence of expression, the method for measuring specific expression level depending on the cell, comparison with the expression level of the same gene or protein in a specific cell, and the like.
  • the term “positive” or “negative” may be used for gene or protein expression.
  • “positive” means when there is expression of the gene or protein of interest, whereas “negative” is when there is no expression of the gene or protein of interest.
  • specific cells that differ from hyperproliferative cells can be used as controls.
  • Specific cells to be compared ie, “control cells”, may be cells in which the expression level of the gene or protein of interest is extremely low, It may be a germ layer cell, or it may be a mature cell or its progenitor cells.
  • highly proliferative cells are "positive” with respect to the expression of a marker gene, and the expression level of the marker gene after contact with a small molecule signaling pathway inhibitor is not in contact with the inhibitor. It can mean that the expression level of the marker gene in cultured ectodermal cells is 1.0 times or more.
  • the highly proliferative cells are “negative” with respect to the expression of the marker gene, the expression level of the marker gene after contact with the inhibitor is cultured without contact with the inhibitor. It can mean less than 1.0 times the expression level of the marker gene in ectodermal cells.
  • the culture conditions for the highly proliferative cells and the ectodermal cells not in contact with the inhibitor to be provided to the method for confirming the expression level can be the same except that they are in contact or not in contact with the inhibitor.
  • Appropriate adjustment should be made so that the target cells are in the same or extremely the same state, such as the same culture period, the same cell passage number, and the same cell density, etc., based on the cell state, proliferation, cell number, etc. can be selected by one of skill in the art based on the state of the cell.
  • the expression level of the marker gene after a certain period of culture period or longer in contact with the low-molecular-weight signaling pathway inhibitor is expressed as the expression level relative to the control gene.
  • control genes for example, beta-actin (ACTB) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) can be used.
  • the hyperproliferative cells express at least one gene characteristic of mature cells to the same or greater extent than the source ectodermal cells, and are sourced from at least one gene characteristic of progenitor cells. It can be expressed as much or more than ectodermal cells.
  • progenitor cell refers to a cell at a stage of differentiation up to a mature cell, which is a cell that develops from a stem cell and can differentiate into a terminally differentiated cell that constitutes the body. means.
  • Genes peculiar to mature cells include, for example, GFAP, S100B and SLC1A2.
  • Genes specific to progenitor cells, such as genes relatively highly expressed in oligodendrocyte progenitor cells, neuroepithelial cells and radial glial cells include, for example, NG2, Notch1, Nestin and SOX2.
  • the hyperproliferative cells may be cells characterized by any marker gene expression pattern as long as they are cells having high proliferation potential as described above, in other words, a cell population containing cells with any characteristics.
  • Hyperproliferative cells can include cells negative for at least one selected from the group consisting of Musashi1 (MSI1), Notch1, Nestin, and SOX2.
  • hyperproliferative cells can include GFAP-positive cells.
  • the hyperproliferative cells can include cells that are GFAP-positive and NG2-positive, or that express GFAP at levels equal to or greater than the source ectodermal cells, and , NG2 can be expressed as much as or more than the source ectodermal cells.
  • the hyperproliferative cells can comprise cells that are positive for GFAP and S100B and positive for NG2, or contain GFAP and S100B equal to or greater than the source ectodermal cells. and can express NG2 to the same level or higher than the ectodermal cells from which it is sourced.
  • the hyperproliferative cells express at least one gene specific to mature cells to the same level as or more than the source ectodermal cells, and at least one gene specific to progenitor cells. It can include cells that express as much as or more than the ectodermal cells to which it is derived.
  • the hyperproliferative cells can include NG2-positive cells, or cells that express NG2 at a higher level than the expression level of NG2 in small molecule signaling pathway inhibitor-uncontacted ectodermal cells.
  • the highly proliferative cells may have a higher NG2 expression level than the NG2 expression level in the ectodermal cells uncontacted with the small molecule signaling pathway inhibitor.
  • hyperproliferative cells can include cells that are positive for S100B and positive for NG2, or that express S100B as much as or more than the source ectodermal cells and source NG2. can be expressed as much as or more than other ectodermal cells.
  • the above-mentioned cells included in the hyperproliferative cells are negative for at least one selected from the group consisting of Musashi1 (MSI1), Notch1, Nestin, and SOX2. That is, the cells containing the hyperproliferative cells, after contact with the inhibitor, the expression level of at least one marker gene selected from the group consisting of Musashi1, Notch1, Nestin, and SOX2 is low-molecular-weight signaling It can be less than 1.0 times the expression level of the marker gene in ectodermal cells cultured without contact with the pathway inhibitor.
  • the hyperproliferative cells comprise two or more, three or more selected from the group consisting of Musashi1, Notch1, Nestin, and SOX2, or all of which are negative.
  • the expression level of cells negative for at least one selected from the group consisting of Musashi1, Notch1, Nestin, and SOX2 can be expressed as the expression level relative to the control gene.
  • "negative” is less than 1.0 times the expression level of the control gene when beta-actin (ACTB) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) are used as control genes, for example. .
  • the cell population of hyperproliferative cells includes both mature cells and progenitor cells, regardless of differentiation stage, as long as they are highly proliferative cells with high proliferative potential, particularly hyperproliferative ectodermal cells. It may be a heterogeneous cell population, or a cell population in which a large number of ectodermal cells of a plurality of types with relatively similar differentiation stages occupy the majority.
  • the cell population of highly proliferative cells obtained by the present production method is a population containing highly proliferative ectodermal progenitor cells as main constituents, or a population containing highly proliferative ectodermal progenitor cells and highly proliferative It may be a population containing both mature ectodermal cells.
  • the “major component” in a cell population means cells that occupy at least 50% of the cell population on a cell number basis.
  • very large majority means that the number of target cells in the cell population is 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or It means 99.5% or more.
  • the percentage of mature ectodermal cells in the resulting cell population of hyperproliferative cells is less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 10%, or less than 5% on a cell number basis. It's okay. Accordingly, the present disclosure also encompasses a method of enriching ectodermal cells with enhanced cell proliferation comprising contacting source ectodermal cells with a small molecule signaling pathway inhibitor. Contacting the source ectodermal cells with small molecule signaling pathway inhibitors can be done in vitro.
  • the cell population of highly proliferative cells may contain cells of the ectodermal cell lineage related to astrocytes.
  • Cells of the ectodermal cell lineage related to astrocytes include, for example, astrocytes, radial glial cells, oligodendrocyte progenitor cells (also called polydendrocytes), oligodendrocytes and neuroepithelial cells.
  • the cell population of the astrocyte-related ectodermal cell lineage possesses some of the characteristics found in ectodermal cells, as long as it is a cell population that exhibits enhanced cell proliferation, and Cells that cannot be classified as any of the cells identified above may also be included.
  • the highly proliferative cells may be the highly proliferative cells obtained by the production method described above, or may be the highly proliferative cells obtained by other production methods.
  • a hyperproliferative cell has characteristics of an ectodermal cell, wherein the number of cells after a culture period of greater than 28 days in contact with a small molecule signaling pathway inhibitor is They are hyperproliferative cells that have a proliferative capacity greater than 1.0 times the number of ectodermal cells cultured for the same culture period under the same culture conditions but without contact with inhibitors.
  • a small molecule signaling pathway inhibitor by contacting the ectodermal cell with a small molecule signaling pathway inhibitor, the cell proliferation ability is enhanced without gene introduction or genetic modification into the ectodermal cell cells can be obtained.
  • the inhibitor contact group can be cultured for a longer period of time, and the number of cells obtained in the inhibitor contact group is greater than that of the inhibitor contact group.
  • the number of cells is large compared to the number of cells in the non-contact group.
  • a cell group (inhibitor contact group) obtained by culturing human primary mature astrocytes in contact with a combination of a TGF ⁇ receptor inhibitor and a ROCK inhibitor, and human primary mature astrocytes Inhibitor contact group can be cultured for a longer period of time than the cell group obtained by culturing without contact with the combination of (inhibitor non-contact group). That is, in the inhibitor contact group, cell growth continues for a longer period of time than in the inhibitor non-contact group.
  • the number of cells in the inhibitor contact group is, for example, 2 times or more, 5 times or more, 10 times or more, 50 times the number of cells in the inhibitor non-contact group. 100 times or more, 200 times or more, or 400 times.
  • the obtained highly proliferative cells have enhanced cell proliferation ability, so a large number of cells can be obtained by long-term culture. Since hyperproliferative cells are capable of producing cellular secretions as described below, longer-term culture yielding a larger number of cells may also increase the amount of cellular secretions that can be collected.
  • the items described as the production result of this production method are applied as they are.
  • the cells have the characteristics of ectodermal cells, and the number of cells after a culture period of more than 28 days in contact with the inhibitor is the same culture period under the same culture conditions except that they are not in contact with the inhibitor. It is not limited to being the production result of the present production method as long as it has the ability to proliferate more than 1.0 times the number of ectodermal cells cultured over a period of time.
  • Hyperproliferative cells of the present disclosure can include cells positive for at least one selected from the group consisting of GFAP, NG2 and S100B, as described above.
  • Hyperproliferative cells can include, for example, at least one selected from the group consisting of cells (I) to (VII) below: (I) GFAP-positive cells, e.g., cells that express GFAP at levels equal to or greater than the ectodermal cells from which they are derived; (II) NG2-positive cells, e.g., cells that express NG2 at levels equal to or greater than the ectodermal cells from which they are derived; (III) S100B-positive cells, e.g., cells that express S100B at levels equal to or higher than the source ectodermal cells; (IV) GFAP-positive and NG2-positive cells, for example, expressing GFAP at the same level or higher than the ectodermal cells from which NG2 is used, and at the same level
  • hyperproliferative cells of the present disclosure can also include cells that are positive for SLC1A2. Specifically, hyperproliferative cells can also include cells that are positive for at least one of the above genes and positive for SLC1A2.
  • the expression level of the GFAP gene after contact with a small molecule signaling pathway inhibitor is cultured without contact with the inhibitor It is 1.0 times or more and less than 4.0 times the expression level of the GFAP gene in the ectodermal cells.
  • the hyperproliferative cells of the present disclosure are positive for at least one selected from the group consisting of GFAP, NG2, and S100B, and negative for at least one selected from Musashi1, Notch1, Nestin, and SOX2.
  • the cells (I) to (VII) above are negative for at least one selected from Musashi1, Notch1, Nestin, and SOX2.
  • FACS Fluorescence-activated A cell sorting
  • Ectodermal progenitor cells and method for producing the same exhibit characteristics of a differentiation stage that is immature compared to the ectodermal cells that serve as starting materials. It may contain cells.
  • Such immature-stage ectodermal cells i.e., ectodermal progenitor cells, are control ectodermal cells cultured under the same culture conditions as those of the cells, except that a medium containing no inhibitor is used. It has a higher cell proliferation activity than , and can have the property of proliferating in a shorter time, the property of proliferating over a longer period of time, or the property of satisfying both.
  • hyperproliferative progenitor cells Ectodermal progenitor cells exhibiting this hyperproliferative property are sometimes referred to herein as hyperproliferative progenitor cells.
  • hyperproliferative cells may include hyperproliferative progenitor cells. This allows the immature stage of ectodermal cells to grow for a longer period of time, e.g., the cell secretions produced by the ectodermal progenitor cells can be produced in a shorter period of time compared to control ectodermal cells. It has the advantage of being able to be obtained in large quantities.
  • Another aspect of the present disclosure relates to a method of producing ectodermal progenitor cells, wherein the ectodermal progenitor cells are hyperproliferative cells, the method comprising: (i) preparing ectodermal cells as a raw material; (ii) contacting the source ectodermal cells with a small molecule signaling pathway inhibitor in a medium containing the inhibitor for a period of more than 28 days; and (iii) After the contact, additional culturing is performed in a medium containing the inhibitor to obtain a culture containing highly proliferative cells with enhanced cell proliferation ability compared to the raw material ectodermal cells.
  • the method of producing ectodermal progenitor cells of the present disclosure may further comprise isolating said hyperproliferative cells from said culture.
  • the raw material ectodermal cells and the low-molecular-weight signaling pathway inhibitor include, for example, the raw materials described in relation to the method for producing highly proliferative cells of the present disclosure.
  • Ectodermal cells and small molecule signaling pathway inhibitors, respectively, can be used.
  • the highly proliferative cells obtained by the production method according to the present disclosure when the raw ectodermal cells, which are the starting materials, contain astrocytes that have reached the terminal differentiation stage, the highly proliferative cells obtained include: Cells that exhibit characteristics of a less mature differentiation stage than astrocytes may also be included.
  • Such immature stage ectodermal cells may further have the following properties (a) or (b): (a) the expression levels of the combination of GFAP and S100B, the combination of GFAP and SLC1A2, the combination of S100B and SLC1A2, the combination of GFAP and NG2, the combination of NG2 and SLC1A2, or the combination of NG2 and S100B compared to astrocytes; It has increased.
  • Yet another aspect of the present disclosure relates to ectodermal progenitor cells according to the present disclosure and uses thereof.
  • the ectodermal progenitor cells obtained by the above production method can be used, for example, in methods for evaluating therapeutic agents for neurological disorders.
  • the usefulness of the candidate neuropathy therapeutic agent can be evaluated by contacting the candidate neuropathy therapeutic agent with the ectodermal progenitor cells.
  • the present disclosure also relates to a method of evaluating a neurological disorder therapeutic agent, comprising contacting a candidate neurological disorder therapeutic agent with the ectodermal progenitor cells.
  • it also relates to a method of evaluating a neurological disease model, including using the aforementioned ectodermal progenitor cells.
  • the present disclosure further includes subjecting ectodermal progenitor cells obtained by the production method according to the present disclosure to maturation conditions to induce differentiation of ectodermal progenitor cells to obtain mature ectodermal progenitor cells, It also relates to a method for producing mature ectodermal cells.
  • differentiation conditions means culture conditions using known differentiation-inducing factors.
  • Differentiation-inducing factors include, for example, fibroblast growth factor-3 (FGF-2); leukemia inhibitory factor (LIF) or ciliary neurotrophic factor (CNTF) ); Bone morphogenetic protein (BMP) family cytokines such as BMP2 or BMP4, Notch family proteins; Wnt gene family proteins; Sonic hedgehog proteins;
  • Factors necessary for proliferation or maintenance of mature cells include, for example, nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4/5 (NT-4/5), and platelet-derived growth factor (PDGF) can be mentioned.
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 Neurotrophin-3
  • NT-4/5 Neurotrophin-4/5
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • differentiation-inducing conditions As culture conditions using a differentiation-inducing factor, known differentiation-inducing conditions applied in a differentiation-inducing method using a differentiation-inducing factor can be applied, and the differentiation-inducing conditions can be appropriately selected depending on the type of differentiation-inducing factor to be used. .
  • ⁇ 3> Use of Inhibitor The inhibitor used in the production method described above can be used to maintain or promote the proliferation ability of ectodermal cells.
  • an ectodermal cell proliferation regulator comprising at least one selected from the group consisting of small molecule signaling pathway inhibitors, such as TGF ⁇ receptor inhibitors and ROCK inhibitors Regarding.
  • the present disclosure also relates to growth regulators used to maintain or promote the growth potential of hyperproliferative cells or ectodermal cells obtained by the aforementioned production methods.
  • proliferative regulation as used herein can mean achieving at least one of cell growth maintenance and growth promotion.
  • the terms “maintaining growth” and “promoting growth” are indistinguishable so long as the cells maintain or increase in cell number over the culture period.
  • concentration of the proliferation-regulating agent used for regulating cell proliferation the concentration described with respect to the concentration used in the above-described production method can be applied as it is.
  • the present disclosure provides a method for culturing hyperproliferative cells or ectodermal cells obtained by the aforementioned manufacturing method, wherein the small molecule signaling pathway inhibitors, e.g., from the group consisting of TGF ⁇ receptor inhibitors and ROCK inhibitors
  • a culture method comprising subculturing said cell population or said cells in the presence of at least one selected inhibitor.
  • the "culturing method” includes a method for regulating proliferation of hyperproliferative cells or ectodermal cells.
  • the use concentration of the inhibitor when used in the main culture method the concentration described with respect to the use concentration in the production method described above can be applied as it is.
  • ⁇ 4> Cellular secretions and methods for producing the same
  • Yet another aspect of the present disclosure is to obtain a culture containing cellular secretions secreted from the hyperproliferative cells according to the present disclosure, and A method for producing a cell secretion comprising isolating from said culture.
  • This production method may further include any step as necessary.
  • the hyperproliferative cells according to the present disclosure are hyperproliferative cells with enhanced cell proliferation ability, they are cultured under the same culture conditions as the hyperproliferative cells except for using a medium that does not contain an inhibitor. Proliferate for a shorter period of time, proliferate for a longer period of time, or proliferate for a shorter period of time and proliferate for a longer period of time as compared to the control cells. Therefore, in the present method for producing cell secretions, a large amount of cell secretions secreted by highly proliferative cells can be obtained in a shorter period of time compared to control cells.
  • Cellular secretions also referred to as "secretome" are not particularly limited as long as they are substances secreted from cells, for example, exosomes, microvesicles, extracellular vesicles such as apoptotic vesicles; cytokines, hormones, antibodies and the like Examples include functional proteins.
  • the cellular secretions may be extracellular vesicles, among others, exosomes.
  • the culture prepared in the method for producing cell secretions according to the present disclosure contains cell secretions secreted from highly proliferative cells obtained by any of the above embodiments.
  • the culture containing cell secretions may be produced by carrying out the method for producing highly proliferative cells according to the present disclosure, and may be obtained by obtaining and culturing the highly proliferative cells according to the present disclosure.
  • the culture obtained by performing the production method according to the present disclosure may be obtained separately, and the culture of the hyperproliferative cells according to the present disclosure may be obtained separately. can be anything.
  • the term "culture” means a combination of cultured cells and culture supernatant (conditioned medium) obtained by culturing cells.
  • a method for producing a cell secretion according to the present disclosure includes separating the cell secretion from the culture.
  • Known separation methods such as removal of the supernatant and centrifugation can be used to separate the cell secretions from the culture.
  • Cell secretions separated from the culture may be obtained in the form of compositions containing cell secretions.
  • the cell secretion is a composition containing cell secretions, ie, a cell secretion-containing composition
  • the cell secretion-containing composition can comprise cell secretions and an aqueous medium.
  • the aqueous medium is not particularly limited as long as it is a known aqueous medium selected according to the type of cell secretion. ), saline and media.
  • the method for producing cell secretions can further comprise purifying or isolating the separated cell secretions.
  • purifying or isolating cell secretions known methods can be applied without particular limitation depending on the type of cell secretions.
  • Methods for isolating or purifying cell secretions include, for example, filtration and concentration.
  • filtration can be performed using membranes having size or molecular weight cut-off values to isolate or purify cellular secretions.
  • cell secretions may be filtered or concentrated using, for example, tangential flow filtration or ultrafiltration.
  • Cell secretions can be used in the form of compositions containing cell secretions or in the form of isolated cell secretions obtained after isolation or purification.
  • the cell secretions can be stored, refrigerated or frozen either in the form of compositions or isolated cell secretions, or by subjecting them to known processes such as spray-drying, freeze-drying processes and the like.
  • Cellular secretions according to the present disclosure are specifically cell secretions comprising proteins and/or miRNAs, wherein the proteins are selected from those shown in Figures 4A and 4B, and the miRNAs are selected from those shown in FIGS. 4A and 4B, the description in parentheses following each protein name means the accession number in UniProtKB/Swiss-Prot (https://www.uniprot.org/). 5 to 10, the description in parentheses following each miRNA name means the accession number in miRBase (Release 21) (https://www.mirbase.org/).
  • the cell secretion may contain at least one selected from these proteins or at least one selected from these miRNAs, and at least one selected from these proteins and selected from these miRNAs and at least one.
  • Group PA may include at least a combination of vinculin (P18206), integrin ⁇ -1, CD29 (P05556), pyruvate kinase M1/2 (P14618), and ephrin type-A receptor 2 (P29317) , Group PB: vinculin (P18206), integrin beta-1, CD29 (P05556), pyruvate kinase M1/2 (P14618), and ephrin type-A receptor 2 (P29317) in combination with aminopeptidase N (P15144) , annexin A2 (P07355), annexin A6 (P08133), myoferrin (Q9NZM1), and 5'-nucleotidase, CD73 (P21589).
  • Group PC vinculin (P18206), integrin beta-1, CD29 (P05556), pyruvate kinase M1/2 (P14618), and ephrin type-A receptor 2 (P29317) in combination with aminopeptidase N (P15144) , annexin A2 (P07355), annexin A6 (P08133), myoferrin (Q9NZM1), and a 5'-nucleotidase, CD73 (P21589), combined with moesin (P26038), integrin alpha-2, CD49b (P17301), integrin alpha -3, the group consisting of CD49c (P26006), 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (P09543), F actin capping protein beta subunit (P79136), neuropilin 1 (O14786) and tenascin C (P24821) and at least one selected from, or • PD group
  • the cell secretion, as miRNA, - RA group: hsa-miR-382-5p (MIMAT0000737), hsa-miR-155-5p (MIMAT0000646), hsa-miR-379-5p (MIMAT0000733), hsa-miR-16-5p (MIMAT0000069), hsa- miR-382-5p (MIMAT0000737), hsa-miR-16-5p (MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p (MIMAT0000737), hsa-miR-21-5p (MIMAT0000076), hsa-let-7a-5p ( MIMAT0000062), hsa-miR-16-5p (MIMAT0000069), hsa-miR-409-3p (MIMAT0001639), hsa-let-7a-5p (MIMAT0000062), and hsa-let-7f-5p (MIMAT0000067) may include
  • the cell secretion contains, as proteins, the above-described PA group, PB group, PC group, or PD group protein group, and as miRNAs, the above-described RA group, RB group, RC group, or RD group miRNA.
  • a group may be included.
  • the cell secretion according to one embodiment can be used as a pharmaceutical composition with known actions attributed to these proteins and miRNAs.
  • extracellular vesicles are vesicles comprising a lipid bilayer.
  • Extracellular vesicles have a diameter of, for example, 50 nm to 5 ⁇ m, or 50 nm to 1000 nm.
  • Exosomes which are one of the extracellular vesicles, have a diameter of, for example, 50 nm to 200 nm. Since exosomes contain various physiologically active substances such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, and lipids, they are expected to be used for treatment and diagnosis of diseases, pharmaceuticals, cosmetics, and the like.
  • Exosomes are secreted from adherent cells into the culture, especially into the culture supernatant. Also, exosomes are secreted from non-adherent cells into the culture supernatant or into the cell suspension if non-adherent cells are present in the cell suspension. Exosomes derived from adherent cells or non-adherent cells are not particularly limited as long as they are obtained from ectodermal adherent cells or ectodermal non-adherent cells. Examples include exosomes described in Journal of Controlled Release vol. 323, pp. 225-239 (2020).
  • Exosomes can be isolated based on molecular weight, size, shape, composition or biological activity. Specifically, fractionation of sediment by ultracentrifugation, fractionation by density gradient ultracentrifugation, fractionation using size exclusion chromatography, ion exchange chromatography (e.g., CIMmultus TM EV (manufactured by BIA separations ), fractionation by capture using proteins (e.g., MagCapture TM exosome isolation kit PS (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), fractionation by capture using antibodies, polyethylene glycol etc. It can be isolated by fractionating a precipitate using a polymer, etc. These methods can be carried out singly or in combination.
  • exosomes can be used to track the activity of exosomes in the production process of exosomes as cell secretions.
  • exosome activity can be confirmed using static light scattering, dynamic light scattering, UV-visible detectors, fluorescence detectors or differential refractive index detectors.
  • the culture medium containing the obtained highly proliferative cells can usually be replaced with a recovery medium for additional culture.
  • the recovery medium is specifically a culture supernatant recovery medium.
  • Additional culturing means short-time culturing in a recovery medium after culturing in a culture medium.
  • the period of additional culture can be, for example, 6 hours or more, 12 hours or more, 18 hours or more, 24 hours or more, 36 hours or more, 48 hours or more, or 60 hours or more, for example, 96 hours or less, or 72 hours.
  • the contamination rate of exosomes that are exosomes derived from a different origin from the highly proliferative cells and can be contained in the culture medium is reduced, and the purity of exosomes derived from the desired highly proliferative cells can be raised.
  • recovery media examples include serum-free media and exosome-removed media.
  • examples of commercially available exosome-depleted media include FBS exosome-depleted, OneShot format (Gibco (registered trademark), Thermo Fisher Scientific).
  • Exosomes can be obtained by subjecting to the isolation or purification method of.
  • ⁇ 5> Uses of highly proliferative cells and cell secretions
  • Cell secretions isolated from hyperproliferative cells according to one embodiment, for example, exosomes isolated or purified as described above, for various cell types It is expected to have various actions such as neurite outgrowth inhibitory action, neurite elongation action, neurite network formation action, neuronal cell death preventive action and neuronal proliferation promoting action. Based on these functions, it is expected to be useful as a pharmaceutical composition for prevention or treatment of disorders related to peripheral nerve cells or central nerve cells.
  • the neurite outgrowth inhibitory action of cell secretions isolated from hyperproliferative cells can inhibit the differentiation of less undifferentiated cells into peripheral neurons, especially sympathetic neurons. can.
  • peripheral nervous system especially the sympathetic nervous system
  • the cell secretions according to the present disclosure on peripheral nerve cells.
  • cell secretions isolated from highly proliferative cells for central nerve cells their neurite extension action, neurite network formation action, nerve cell death prevention action, and nerve cell growth promotion action, etc. Based on this, it can be expected to activate the central nervous system.
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount of cellular secretions separated from hyperproliferative cells and a pharmaceutically acceptable carrier, and treatment comprising administering the pharmaceutical composition to a subject
  • prophylactic methods are also encompassed within the scope of this disclosure.
  • treatment includes not only cure of the disorder but also amelioration of symptoms of the disorder, such as alleviation and remission.
  • Disorders to be treated or prevented may be disorders related to peripheral nerve cells or central nerve cells, for example, the group consisting of cancer, pain, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, schizophrenia and dementia. more selected.
  • Disorders associated with peripheral nerve cells, particularly sympathetic nerve cells include, for example, cancer and pain associated with sympathetic nerve cells.
  • Disorders involving central nervous cells are selected from the group consisting of, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, schizophrenia and dementia.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited, and those known in the art are used, such as physiological saline. Furthermore, in relation to the above action, a method of suppressing the sympathetic nervous system, including contacting cell secretions secreted from hyperproliferative cells, specifically exosomes, with nerve cells, for example, sympathetic nerve cells, neurites elongation suppression method, etc. are also included in the scope of the present disclosure.
  • a numerical range indicated using “to” indicates a range that includes the numerical values before and after “to” as the minimum and maximum values, respectively.
  • the upper limit or lower limit of the numerical range in one step can be arbitrarily combined with the upper limit or lower limit of the numerical range in another step.
  • Example 1 Long-Term Culture of Human Astrocytes Using Inhibitor-Added Medium Long-term culture of human astrocytes was performed using the following materials, reagents, and culture products.
  • NHA-Y group Inhibitor Y only added group
  • NHA-A group inhibitor A only added group
  • NHA-YA group inhibitor A added group
  • NHA-YA group no Divided into 4 groups of addition group
  • Normal group suspended again in culture medium, 4.2 ⁇ 10 to 6 well plate (multi dish for cell culture 6 well (140675, Thermo Fisher Scientific, hereinafter omitted))
  • the cells were seeded at a seeding density of 3 cells/cm 2.
  • the medium was changed to culture medium with (or without) each inhibitor for each group as described in Table 2 (concentrations of each inhibitor were determined as described above). ), and the culture was continued.During the culture period, the cells were observed and photographed under a microscope.
  • the medium was changed every 1 or 2 days with fresh culture medium containing (or not containing) the inhibitor.
  • the cells reached 80-90% confluence, the cells were detached using a cell detachment agent, suspended in a culture medium containing (or not containing) each inhibitor, and transferred to a 6-well plate at 4.2 ⁇ 10 3 cells/cm. A seeding density of 2 was passaged.
  • the cells were cultured in culture media containing (or not containing) each inhibitor for 41 days with alternate passages.
  • FIG. 1 shows the cell morphology (magnified 100 times) on day 41 after the start of culture.
  • P indicates the number of passages, for example, "Y-P5" means a cell group cultured using a medium containing inhibitor Y, which is passage 5 cells. do.
  • Example 2 Collection and confirmation of exosomes in culture supernatant ⁇ Collection of culture supernatant of human astrocyte cells> Culture supernatants obtained by culturing human astrocyte cells using a YA-containing culture medium or an inhibitor-free medium were collected according to the following procedure.
  • Example 1 Collection of culture supernatant in culture of human astrocyte cells in YA-containing culture medium Similar to Example 1, human astrocyte cells that had been frozen were thawed, washed once with medium, and then the cells were lysed. It was resuspended in culture medium and seeded in a 60 mm cell culture dish at a seeding density of 3.5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 . The next day, the medium was replaced with a YA-containing culture medium, and the culture was continued. When the cells reached 80-90% confluence, the cells were detached using a cell detachment agent, suspended in a YA-containing culture medium, and transferred to a 100 mm cell culture dish at a seeding density of 3.5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 . replaced. As in Example 1, the cell group cultured in the YA-containing culture medium is referred to as the NHA-YA group.
  • the NHA - YA group was subcultured 5 times and cultured in a YA-containing culture medium for a total of 60 days. sown with The number of cells seeded at this time was 1.16 ⁇ 10 6 cells per dish, and since 6 dishes were used, the total number of seeded cells was 6.96 ⁇ 10 6 cells.
  • the medium was changed from the YA-containing culture medium to the recovery medium at a volume of 20 ml/150 mm dish, and additional culture was started.
  • As the recovery medium a medium obtained by removing only FBS from the YA-containing culture medium was used.
  • the culture supernatant of the additional culture was collected from the dish, transferred to a tube, centrifuged at 2,000 xg for 10 minutes at 4°C, filtered through a 0.22 ⁇ m filter system, Stored at 4°C. Cells remaining on the dish after collection of the culture supernatant were peeled off using a cell detachment agent, and the number of cells was counted. , the survival rate relative to the total number of disseminated cells was 73.3%.
  • Example 2 Collection of culture supernatant in human astrocyte cell culture in inhibitor-free culture medium (control) Frozen human astrocyte cells were thawed in the same manner as in Example 1, and the culture medium was collected once. After washing with , the cells were resuspended in culture medium and seeded in a 60 mm cell culture dish at a seeding density of 3.5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 . As in Example 1, the cell group cultured in the culture medium containing no inhibitor is referred to as the Normal group.
  • the Normal group was subcultured twice, cultured in a culture medium containing no inhibitor for a total of 26 days, and seeded in a 150 mm cell culture dish at a seeding density of 8 ⁇ 10 3 cells/cm 2 . At this time, the number of seeded cells was 1.16 ⁇ 10 6 cells per dish, and since two dishes were used, the total number of seeded cells was 2.32 ⁇ 10 6 cells.
  • the culture medium was replaced with a recovery medium containing DMEM with N-2 supplement at a volume of 20 ml/150 mm dish to initiate additional culture.
  • the culture supernatant of the additional culture was collected from the dish, transferred to a tube, centrifuged at 2,000 xg for 10 minutes at 4°C, filtered through a 0.22 ⁇ m filter system, Stored at 4°C. Cells remaining on the dish after collection of the culture supernatant were peeled off using a cell detachment agent, and the number of cells was counted. The survival rate relative to the total number of cells was 35.6%.
  • the supernatant was centrifuged at 2000 xg for 10 minutes at 4°C, then filtered through a 0.22 ⁇ m filter system and stored at 4°C.
  • Fig. 2 shows cell morphology before and after replacement with the recovery medium.
  • ⁇ Measurement of cell number, particle number and particle size distribution in culture supernatant The culture supernatant of each additional culture of the Normal group and NHA-YA group collected above was diluted 5-fold with cell buffer (filtered with a 0.22 ⁇ m filter before use), and then added to NanoSight LM10 (Malvern Panalytical) was used to confirm the number of particles and the particle size distribution. As a blank, the number of particles in the cell buffer was also measured, and the number of particles in the culture supernatant was calculated by subtracting the number of particles in the cell buffer from each culture supernatant measurement. The number of particles and the confirmation of the particle size distribution were each performed twice.
  • Table 3 shows an example of the particle number and particle size of the particles contained in the collected culture supernatant of the additional culture, and the particle size distribution is shown in FIGS. 3A and 3B.
  • the number of particles (10 6 /mL) is shown on the vertical axis
  • the particle size (nm) is shown on the horizontal axis.
  • Example 3-1 Confirmation of ectodermal cell markers by quantitative PCR (1) Regarding the astrocyte cell group used as the starting material for the culture of Example 1 and the obtained ectodermal cell group, the expression levels of the following ectodermal cell marker genes were examined. A detection primer was prepared based on the sequence registered with the accession number of RefSeq, which is the database of NCBI described below.
  • ⁇ Notch1 including vX1 (NM_017617) ⁇ Nestin (NM_006617) ⁇ SOX2 (SRY-box transcription factor 2) (NM_003106) ⁇ S100B (S100 calcium binding protein B) (NM_006272) ⁇ NG2 (Chondroitin sulfate proteoglycon 4) (NM_001897) ⁇ GFAP (Glial fibrillary acidic protein) (v1.v4, vX1, vX3) (NM_002055)
  • NHA Normal Human Astrocytes
  • ⁇ NHA-YA Purchased primary cells were awakened, proliferated, frozen, reawakened, cultured in a medium containing YA for 28 days, and then frozen. cultured for days. It was passaged once during the 14-day culture period.
  • ⁇ Quantitative PCR> The prepared detection primers are shown in Table 4 below. Using these primers, expression of ectodermal cell marker genes was examined by quantitative PCR. Preparation of RNA samples and setting of reaction conditions followed the protocol attached to the product.
  • Quantitative PCR confirmed the expression of Notch1, Nestin, and SOX2 markers for neuroepithelial cells, Nestin markers for radial glial cells, and GFAP and S100B, which are astrocyte markers, and oligodendrocytes.
  • Tables 5 and 6 show the results of confirming the expression of NG2, which is a marker for site precursor cells, respectively.
  • Tables 5 and 6 the expression level of each marker gene in NHA-YA (expression level relative to the control gene) is shown as a relative value when each expression level in NHA is set to "1".
  • Table 5 shows the expression level of each marker when using the ACTB gene as the control gene
  • Table 6 shows the expression level of each marker when using the GAPDH gene as the control gene.
  • the astrocyte markers GFAP and S100B and oligodendrocytes were found to be higher than the astrocyte (NHA) used as a raw material. Higher expression was observed for both NG2, a marker for cytoprogenitor cells.
  • the obtained cell population (NHA-YA) combines the characteristics of astrocytes, which are mature cells, and the characteristics of oligodendrocyte progenitor cells, which are progenitor cells, and has higher proliferative potential than astrocytes. turned out to be cells.
  • the NHA-YA can proliferate more in a short period of time than astrocytes. Also, to obtain more exosomes in a short time, it can be seen that using NHA-YA is advantageous.
  • Example 3-2 Confirmation of ectodermal cell markers by quantitative PCR (2) Regarding the astrocyte cell population used as the starting material for the culture of Example 1 and the obtained ectodermal cell population, the expression levels of the following ectodermal cell marker genes were determined in the same manner as in Example 3-1. Measured by quantitative PCR. A detection primer for each marker gene was prepared based on a sequence registered with an accession number of RefSeq, which is a database of NCBI described below.
  • SLC1A2 (solute carrier family 1 member 2) (including v1, v2, v3, vX1 to vX7) (NM_004171)
  • SLC1A3 (solute carrier family 1 member 3) (v1-v5, vX1, vX2, vX3) (NM_004172)
  • OLIG2 oligodendrocyte transcription factor 2
  • PAX6 paired box 6
  • ALD1L1 aldehyde dehydrogenase 1 family member L1
  • NM_001270364 ⁇ Musashi1 (musashi RNA binding protein 1; MSI1) (v1, vX1 to vX10) (NM_002442)
  • the prepared detection primers are shown in Table 7 below. Using these primers, expression of ectodermal cell marker genes was examined by quantitative PCR. Preparation of RNA samples and setting of reaction conditions followed the protocol attached to the product. As a measurement instrument for quantitative PCR, for Musashi1, SimpliAmp Thermal Cycler (Applied Biosystems) or CFX96 Touch Real-time PCR Detection system (Bio-Rad) is used. The same measuring equipment as used in 3-1 was used.
  • Tables 8 and 9 The results are shown in Tables 8 and 9.
  • the expression level of each marker gene in NHA-YA expression level relative to the control gene
  • Table 8 shows the expression level of each marker when using the ACTB gene as the control gene
  • Table 9 shows the expression level of each marker when using the GAPDH gene as the control gene.
  • Example 4 Proteome analysis of NHA-YA-derived exosomes ⁇ Collection of exosomes derived from NHA-YA>
  • the frozen tube storing the cell culture medium containing NHA was thawed in a water bath at 37°C. Then, the lysed cells were transferred to a total of 10 mL of YA-containing culture medium, subjected to centrifugation at 180 ⁇ g for 3 minutes at 25° C., and then the medium was removed.
  • the resulting NHA was suspended in YA-containing culture medium and passaged to a 6-well plate at a seeding density of 4.2 ⁇ 10 3 cells/cm 2 .
  • the cells were cultured in a YA-containing culture medium for 11 days with two passages.
  • the medium was changed from the YA-containing culture medium to the recovery medium at a volume of 20 mL/150 mm dish, and additional culture was performed at 37° C. for 72 hours.
  • a recovery medium a medium containing exosome-depleted FBS [3% (v/v)] was used instead of FBS in the YA-containing culture medium.
  • Additional culture was performed at a seeding density of 1.16 ⁇ 10 5 cells/150 mm dish.
  • the culture supernatant of the additional culture was collected from the dish, transferred to a tube, centrifuged at 2,000 x g for 10 minutes at 4°C, filtered through a 0.22 ⁇ m filter system, and the exosome-containing solution was exosome-containing solution. prepared.
  • Exosome proteome analysis 1> The exosome-containing solution obtained above was subjected to precipitation treatment with trichloroacetic acid, then a 5 mM dithiosteitol Tris buffer solution was added, and reduction treatment was performed at 35° C. for 2 hours. A solution of 14 mM iodoacetamide in Tris buffer was added to the sample after reduction, and reaction was carried out at 25° C. for 30 minutes under light-shielding conditions. Then, trypsinization was performed at 37° C. for 20 hours to degrade the exosomes. The resulting exosome degradation product was subjected to solvent replacement with a cation exchange column, desalted and concentrated, and subjected to LC-MS/MS analysis.
  • EASY-nLC 1200 System (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) was used as the HPLC apparatus, and EASY-Spray column, 15 cm ⁇ 75 ⁇ m ID, 3 ⁇ m particles, 100 ⁇ pore size (Thermo Fisher Scientific, USA) was used as the column. bottom.
  • MASCOT server https://www.matrixscience.com/help.html
  • Step of selecting proteins characteristic of the cerebrum (a1) The 520 proteins extracted above were searched by Tissue Enrich (https://tissueenrich.gdcb.iastate.edu). Here, the Human Protein Atlas dataset and all tissue-specific genes were searched; (a2) 22 genes specific to the cerebrum were selected; (a3) Among the 22 genes selected in (a2) above, 12 genes that were not detected in the medium sample were selected; (a4) Among the 12 genes selected in (a3) above, select 8 genes that are highly likely to be human proteins; (a5) Among the 8 genes selected in (a4) above, 5 genes highly associated with diseases were selected. Proteins encoded by the five genes selected in steps (a1) to (a5) above are shown in FIG.
  • b Step of selecting proteins characteristic of membrane proteins, extracellular regions, etc.
  • Characteristic proteins were selected in a selection step c different from the selection steps a and b.
  • Characteristic protein selection step (c1) 103 exosome fractions with a Quantitative Value of 20 or more were selected from a total of 1562 sequences combining SwissProt_Homo sapiens and UniProtKB_Bos taurus; (c2) Among the 103 sequences selected in (c1) above, 65 Quantitative Values of 10 or less in the medium sample were selected; (c3) For the 65 sequences selected in step (c2) above, those related to central nervous system diseases or brain, nerve Twenty cells presumed to be involved in cell proliferation, development, differentiation, morphogenesis, migration, metabolism, etc. were selected. Of the 20 selected, 14 overlap with the proteins selected in steps (b1) to (b4) above. Twenty proteins selected by the above steps (c1) to (c3) are shown in FIG.
  • a total of 46 proteins could be selected by the above selection steps a to c (see Fig. 4).
  • Example 5 miRNA analysis of exosomes derived from NHA-YA ⁇ Collection of exosomes derived from NHA-YA>
  • the frozen tube storing the cell culture medium containing NHA was thawed in a water bath at 37°C. Then, the lysed cells were transferred to a total of 10 mL of YA-containing culture medium, subjected to centrifugation at 180 ⁇ g for 3 minutes at 25° C., and then the medium was removed.
  • the resulting NHA was suspended in YA-containing culture medium and passaged to a 6-well plate at a seeding density of 4.2 ⁇ 10 3 cells/cm 2 .
  • the cells were cultured in a YA-containing culture medium for 47 days with 4 passages.
  • the medium was changed from the YA-containing culture medium to the recovery medium at a volume of 20 mL/150 mm dish, and additional culture was performed at 37° C. for 48 hours.
  • the recovery medium used in Example 4 was used as the recovery medium.
  • Additional culture was performed at a seeding density of 1.16 ⁇ 10 6 cells/150 mm dish.
  • the culture supernatant of the additional culture was collected from the dish, transferred to a tube, centrifuged at 2,000 x g for 10 minutes at 4°C, filtered through a 0.22 ⁇ m filter system, and the exosome-containing solution was exosome-containing solution. prepared.
  • RNA extraction from exosomes derived from NHA-YA> 205 mL of the exosome-containing solution obtained above was subjected to centrifugation at 250,000 x g for 70 minutes at 4°C using an ultracentrifuge Optima XE-90 (Beckman Coulter), and then the supernatant was removed. , to obtain the exosome fraction.
  • RNA was then extracted from the resulting exosome fraction using the miRNeasy Mini Kit (217004, Qiagen). As a result, 41.8 ng of total RNA was recovered from 230 ⁇ L of the exosome fraction.
  • RNA analysis> The quality of the RNA obtained above was checked by Agilent 2100 Bioanalyzer using Agilent RNA 6000 pico kit (Agilent Technologies) and Agilent small RNA kit (Agilent Technologies). After quality check, an RNA library was prepared from the total RNA obtained above using an RNA library preparation kit for directional (Stranded), NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina. mRNA-Seq analysis was performed using the prepared RNA library, and 6538 mRNAs were detected.
  • a miRNA library was prepared from the total RNA obtained above. Using the prepared miRNA library, miRNA-Seq analysis was performed and 370 miRNAs were detected.
  • the quality check of the sequence library was performed with the Agilent 2100 Bioanalyzer using the High Sensitivity DNA kit (Agilent Technologies).
  • NGS was performed using NextSeq500 and Illumina (single-end, 75 bp, average number of reads about 10 million).
  • the data after sequencing is subjected to read quality evaluation (FastQC), aligned (mapped) to the reference genome (Human hg38) at GeneGlobe: Data Analysis Center (QIAGEN), and trimmed mean of M values (TMM) Expression levels were normalized, and an Excel format file was created containing annotation information for each miRNA and classification summary of Small RNA composition (analysis tools: StrandNGS v4.0, R v3.6.2; annotation information: miRBase Release 21 compliant) . After that, as data analysis, GO analysis from target gene prediction and Pathway analysis were carried out after extraction of expression-changed genes.
  • miRNAs as Parkinson's disease markers With reference to the following literature, 42 miRNAs whose expression is decreased in human brain tissue with Parkinson's disease were selected. By administering exosomes containing the miRNA to the cells of Parkinson's disease patients, the function of the miRNA is exogenously complemented in Parkinson's disease patients, and a therapeutic effect on Parkinson's disease is expected.
  • Literature MicroRNAs in Parkinson's disease and emerging therapeutic targets. Neural Regeneration Research, 12(12), pp. 1945-1959 (2017)
  • miRNAs as Alzheimer's disease markers Using IMOTA (https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/), proteins associated with Alzheimer's disease pathology, especially multiple proteins that contribute to the pharmacological action of Alzheimer's disease drugs
  • miRNAs as Alzheimer's disease markers (1) Using IMOTA, 70 miRNAs associated with amyloid precursor protein (APP) in the cerebral cortex were selected. APP is a major component of senile plaques, which are one of the causes of Alzheimer's disease, ie deposits of amyloid ⁇ protein.
  • miRNAs as Alzheimer's disease markers (2) Using IMOTA, 42 miRNAs associated with BACE1 ( ⁇ -site APP cleaving enzyme) in the cerebral cortex were selected. At the onset of Alzheimer's disease, BACE1 cleaves the N-terminal portion of APP to produce abnormal amyloid ⁇ protein.
  • miRNAs as Alzheimer's disease markers (3) Using IMOTA (https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/), 66 miRNAs associated with NMDA receptors (N-methyl-D-aspartate receptor) in the cerebral cortex were selected. .
  • NMDA receptors N-methyl-D-aspartate receptor
  • GSK-3 ⁇ Glycogen synthase kinase-3 ⁇
  • IMOTA https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/
  • 58 miRNAs were selected.
  • GSK-3 ⁇ is an enzyme that phosphorylates various proteins, and has various functions in maintaining cell life and regulating physiological functions through regulation of multiple pathways. In Alzheimer's disease, it promotes the deposition of amyloid ⁇ protein in the brain and the accumulation of tau protein in neurons. As a result, it induces neuronal apoptosis.
  • Example 6 Neurite outgrowth inhibition test of PC-12 cells with NHA-YA-derived exosomes
  • NHA-YA-derived exosomes rat adrenal pheochromocytoma-derived cell line, PC-12 cells (RCB0009, RIKEN Bank ) was tested for inhibition of neurite outgrowth.
  • PC-12 cells RB0009, RIKEN Bank
  • exosomes derived from NHA cells used in Example 1 were used.
  • ⁇ Reagents and culture products The following reagents and culture products were used.
  • ⁇ Proliferation medium Composition: basal medium, 10% (w/v) FBS, 10% (w/v) HS, antibiotics, Basal medium: DMEM, high glucose, pyruvate (11995-073; Gibco), FBS: Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil (10270-106; Gibco); HS: Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin (26050-088; Gibco); Antibiotics: Antibiotic-Antimycotic (100X) (15240-062; Gibco) - Cell detachment agent 1: Accutase (AT104, ICT), - Cell detachment agent 2: TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red-free (12604-013, Gibco), Cell buffer: phosphate buffered saline solution (Dulbecco; without calcium and magnesium) (BNDSBN200, KAC), ⁇ Assay medium: Composition: basal medium, additive
  • CM Control medium
  • NHA AGM P6 obtained by ultracentrifugation of the culture supernatant of NHA at passage 6
  • NHA-YA P6 Obtained by ultracentrifugation of the culture supernatant of NHA-YA at passage 6.
  • the ultracentrifugation used in the preparation of each evaluation sample of (1) to (3) above was 250,000 using an ultracentrifuge (body: Optima XE-90, rotor: SW41 Ti; BeckmanCoulter). xg for 70 minutes at 4°C.
  • the culture supernatant was collected according to the following procedure. A cryotube of human astrocyte cells (NHA) was thawed in a 37° C. water bath. Then, the lysed cells were transferred to a culture medium to a total volume of 10 mL, subjected to centrifugation at 180 xg for 3 minutes at room temperature, and then the medium was removed. Cells were suspended in culture medium and seeded into T-75 culture flasks (Corning) at a seeding density of 1.25 ⁇ 10 4 cells/cm 2 . After that, culture was performed at 37° C.
  • NHA human astrocyte cells
  • NHA-YA group Inhibitor A addition group
  • NHA group No addition group
  • the medium was changed every 1 day or 2 days, and the medium was replaced with fresh culture medium containing (or not containing) the inhibitor.
  • the cells (passage number: 1) were detached using cell detachment agent 1 and suspended in inhibitor-containing culture medium, that is, YA-containing culture medium and inhibitor-free culture medium. and subcultured to a 150 mm cell culture dish at a seeding density of 3.3 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • the culture was subcultured for 5 days at a seeding density of 3.3-6.6 ⁇ 10 4 cells/cm 2 into a 150 mm cell culture dish, and the subculture was repeated for a total of 5 times. It took a total of 31 days.
  • the cell group cultured in the YA-containing culture medium is called the NHA-YA group
  • the cell group cultured in the inhibitor-free culture medium is called the Normal group.
  • the NHA-YA group was seeded at a seeding density of 3.3 ⁇ 10 4 cells/cm 2 and the normal group at a seeding density of 2.3 ⁇ 10 4 cells/cm 2 in five 150 mm cell culture dishes.
  • the total number of seeded cells was 5.0 ⁇ 10 6 cells in the NHA-YA group and 3.5 ⁇ 10 6 cells in the Normal group.
  • the cells were cultured for 4 days, and on the 35th day after induction (after contact with the inhibitor), 40 to 60% confluency was confirmed, and the medium was transferred from the culture medium to the medium for collecting the culture supernatant by 20 mL. /150 mm dish volume was exchanged, and additional culture was started. 48 hours after the start of additional culture, the culture supernatant of the additional culture was collected from the dish, and then the collected culture supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter system to remove cell debris, exosome-containing culture supernatant. Obtained. The resulting filtered exosome-containing culture supernatant was stored at 4°C.
  • a new medium for collection of culture supernatant was added to the cells remaining in the dish, culture was performed for 48 hours, and a filtered exosome-containing culture supernatant was obtained by the same method. The same operation was performed a total of 3 times, and about 300 mL of filtered exosome-containing culture supernatant was collected. On the 41st day after the induction, the culture supernatant was collected, and the cells remaining on the dish were peeled off using the cell detachment agent 1, and the number of cells was counted.
  • Control medium (CM) As a control medium (Control medium (CM)) for evaluating exosome function, 20 mL/150 mm dish of culture supernatant collection medium was added to a 150 mm cell culture dish in which cells were not seeded. The culture supernatant was recovered under the conditions.
  • CM Control medium
  • the suspension derived from the culture supernatant concentrated by the above method was diluted 100-fold with a phosphate buffered saline solution filtered through a 0.22 ⁇ m filter before use. After that, the number of particles in the diluted solution was measured by ZetaView X20 (Particle Metrix). The total number of particles in the suspension was calculated by multiplying the number of particles obtained by the measurement by the dilution ratio, that is, 100. Culture supernatants were obtained by measuring the number of particles in the assay medium after 100-fold dilution with phosphate-buffered saline solution and subtracting the resulting number of particles in the assay medium from each culture supernatant measurement.
  • the number of particles inside was calculated.
  • the absorbance at 280 nm was measured by NanoDrop (Thermo Scientific) to measure the protein concentration in the suspension.
  • the total protein content in the suspension was calculated by multiplying the protein concentration obtained by the measurement by the liquid volume of the suspension.
  • Table 10 shows the measurement results.
  • the notation "aE+b" in the "total number of particles" column of Table 10 means a ⁇ 10 b .
  • the NHA-YA group contained the largest amount of total protein, and the number of particles was also significantly higher than in the control medium (CM).
  • ⁇ Evaluation experiment protocol> The PC-12 cell cryotubes described above were thawed in a 37° C. water bath. Then, the lysed cells were transferred to a growth medium to a total volume of 10 mL, subjected to centrifugation at 180 xg for 5 minutes at room temperature, and then the medium was removed. Cells were then suspended in growth medium and seeded in 100 mm cell culture dishes at a seeding density of approximately 5,300 cells/cm 2 . Culture was performed at 37° C. while exchanging the medium every 2 or 3 days, and the cells were grown while being subcultured.
  • the resulting PC-12 cells were detached using cell detachment agent 2, washed with assay medium, and resuspended in assay medium at a density of 3.96 ⁇ 10 4 cells/mL.
  • the suspended cells were seeded in a 96-well plate at a seeding density of 1.98 ⁇ 10 3 cells/50 ⁇ L medium per well, i.e., 6000 cells/cm 2 , and the medium was removed after allowing the cells to attach for approximately 12 hours. It was replaced with each of the evaluation samples described above.
  • the cells were cultured at 37° C., and the conditions of the PC-12 cells on the 3rd, 4th, and 5th days from the start of the culture were observed with a microscope (BZ-X710, KEYENCE) to obtain observation images.
  • the length and number of cells of the neurite-like processes in the image are measured using the Multi-point tool (number of cells) and Straight tool (extension process length) of the image analysis software Fiji (ImageJ2 ver. 2.3.0). bottom.
  • Microsoft-Excel was used for statistical processing.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

高増殖性細胞の製造方法であって、（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で、該阻害剤を前記原料となる外胚葉性細胞に接触させて培養すること、および、（ｉｉｉ）前記接触後、前記阻害剤を含む培地中で追加培養を行い、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を含む培養物を得ることを含む、高増殖性細胞または外胚葉性前駆細胞の製造方法；外胚葉性細胞の特徴を備え、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日超以上の培養期間後の細胞数が、該阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数の１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞；この高増増殖性細胞または上記の高増殖性細胞の製造方法により得られる高増増殖性細胞に由来する細胞分泌物；所定のタンパク質および／またはｍｉＲＮＡを含む細胞分泌物；これらの細胞分泌物を含む、末梢神経細胞または中枢神経細胞に関係する障害の予防または治療に用いられる医薬組成物；ならびに、上記の製造方法により得られた高増殖性細胞または上記の高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を神経細胞に接触させることを含む交感神経系の抑制方法。

Description

高増殖性細胞の製造方法、高増殖性細胞およびその用途
　本発明は、高増殖性細胞の製造方法、高増殖性細胞、およびその用途に関する。
　再生医療の分野において、生体内の種々の細胞、種々の分化段階の細胞、または特定方向へ分化誘導された細胞などが利用されている。生体での使用を考慮すれば、これらの細胞については、遺伝子改変を伴わないことが望ましい。これまで、内胚葉性の成熟細胞に特定の低分子化合物を接触させことにより、遺伝子改変を伴うことなく、該成熟細胞を、幹細胞または前駆細胞にリプログラミングできることが報告されている（国際公開第２０１７／１１９５１２号および国際公開第２０２０／０８０５５０号）。
　一方、遺伝子改変を行わずに得られる細胞、なかでも比較的、成熟細胞に近い細胞の多くは、増殖能に制限があって、長期にわたって生体内外で維持できない傾向がある。このため、細胞の機能の長期利用、または、細胞が生成する有用物質の大量生産などに有効な高増殖性の細胞に対する要請が、依然として残されている。特に、神経系の細胞を含む外胚葉性細胞については、内胚葉性細胞と異なり十分に利用できていない。
　本開示の目的は、高増殖性細胞を製造する方法、高増殖性細胞、およびその用途を提供することである。
　本発明者らは、鋭意研究を行った結果、低分子シグナル伝達経路阻害剤を外胚葉性細胞に接触させることで、高増殖性細胞が得られることを見出した。
　すなわち、本開示は以下の形態を含む：
［１］高増殖性細胞の製造方法であって、
　（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
　（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で、該阻害剤を前記原料となる外胚葉性細胞に接触させて培養すること、および、
　（ｉｉｉ）前記接触後、前記阻害剤を含む培地中で追加培養を行い、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を含む培養物を得ること
を含む、高増殖性細胞の製造方法；
［２］前記高増殖性細胞は、前記阻害剤と接触させた２８日超の培養期間後の細胞数が、該阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数の１．０倍を超える増殖能を有する、［１］に記載の製造方法；
［３］前記原料となる外胚葉性細胞が、中枢神経系の細胞を含む、［１］または［２］に記載の製造方法；
［４］前記原料となる外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載の製造方法；
［５］前記阻害剤が、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む、［１］～［４］のいずれか１項に記載の製造方法；
［６］前記ＴＧＦβ受容体阻害剤の濃度が、０．００１μＭ～１００μＭの範囲内である、［５］に記載の製造方法；
［７］前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、０．００１μＭ～１００μＭの範囲内である、［５］または［６］に記載の製造方法；
［８］前記高増殖性細胞が、成熟細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を前記原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、前駆細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を前記原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する、［１］～［７］のいずれか１項に記載の製造方法；
［９］前記高増殖性細胞が、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つが陰性である、［１］～［８］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１０］外胚葉性細胞の特徴を備え、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日超の培養期間後の細胞数が、該阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数の１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞；
［１１］前記高増殖性細胞が、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つが陰性である細胞を含む、［１０］に記載の細胞；
［１２］ＮＧ２の発現量が、前記阻害剤非接触の外胚葉性細胞におけるＮＧ２の発現量よりも高い、［１０］または［１１］に記載の細胞；
［１３］［１］～［９］のいずれか１項に記載の製造方法より得られる高増殖性細胞または［１０］～［１２］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を含む培養物を得ること、および、前記細胞分泌物を、前記培養物から分離することを含む、細胞分泌物の製造方法；
［１４］細胞分泌物が、エクソソームである、［１３］に記載の方法；
［１５］外胚葉性前駆細胞の製造方法であって、
　前記外胚葉性前駆細胞は、高増殖性細胞であり、
　（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
　（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で、該阻害剤を前記原料となる外胚葉性細胞に接触させて、２８日超の期間にわたり培養すること、および
　（ｉｉｉ）前記接触後、前記阻害剤を含む培地中で追加培養を行い、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を含む培養物を得ること
を含む、外胚葉性前駆細胞の製造方法；
［１６］前記培養物から、前記高増殖性細胞を単離することを更に含む、［１５］に記載の製造方法；
［１７］タンパク質および／またはｍｉＲＮＡを含む細胞分泌物であって、
　前記タンパク質は、ビンキュリン（Ｐ１８２０６）、インテグリンβ－１，ＣＤ２９（Ｐ０５５５６）、ピルビン酸キナーゼＭ１／２（Ｐ１４６１８）、およびエフリンタイプ－Ａ受容体２（Ｐ２９３１７）の組み合わせを含み、
　前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００７６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００１６３９）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６７）の組み合わせを含む、細胞分泌物；
［１８］エクソソームである、［１７］に記載の細胞分泌物；
［１９］［１］もしくは［２］に記載の製造方法により得られた高増殖性細胞または［１０］～［１２］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物と、
　［１７］または［１８］に記載の細胞分泌物と、
のいずれかの細胞分泌物を含む、末梢神経細胞または中枢神経細胞に関係する障害の予防または治療に用いられる医薬組成物；
［２０］［１］もしくは［２］に記載の製造方法により得られた高増殖性細胞または［１０］～［１２］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物と、
　［１７］または［１８］に記載の細胞分泌物と、
のいずれかの細胞分泌物を神経細胞に接触させることを含む、交感神経系の抑制方法。
　本開示によれば、高増殖性細胞を製造する方法、高増殖性細胞、およびその用途を提供することができる。
図１は、実施例１に係る長期培養後の外胚葉性細胞の形態を示す。 図２は、実施例２に係る回収用培地への培地交換の前後における外胚葉性細胞の細胞形態を示す。 図３Ａは、実施例２に係るＮｏｒｍａｌ群の追加培養後に回収された培養上清中の粒子の粒径分布を示す。 図３Ｂは、実施例２に係るＮＨＡ－ＹＡ群の追加培養後に回収された培養上清中の粒子の粒径分布を示す。 図４Ａは、実施例４に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのプロテオーム解析により選出されたタンパク質を示す。 図４Ｂは、実施例４に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのプロテオーム解析により選出されたタンパク質を示す。 図５は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたパーキンソン病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図６は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたアルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図７は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたアルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図８は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたアルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図９は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたアルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。 図１０は、実施例５に係るＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析により選出されたうつ病マーカーとしてのｍｉＲＮＡを示す。
　＜１＞高増殖性細胞の製造方法
　本開示に係る高増殖性細胞の製造方法は、
　（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
　（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で、該阻害剤を前記原料となる外胚葉性細胞に接触させて培養すること、および、
　（ｉｉｉ）前記接触後、前記阻害剤を含む培地中で追加培養を行い、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を含む培養物を得ること
を含む。
　本明細書において、用語「細胞」には、特に断らない限り、少なくともひとつの細胞が含まれる用語として解釈されるべきである。このため、特に断らない限り、用語「細胞」が意味する細胞は、一細胞であることに限定されず、細胞集団と同義として使用され得る。
　本明細書において、用語「細胞集団」には、特に断らない限り、少なくとも１種類の細胞が含まれる用語として解釈されるべきである。このため、特に断らない限り、用語「細胞集団」が意味する細胞は、１種類の細胞であることに限定されない。
　「外胚葉」とは、後生動物の発生途中に生ずる三胚葉の一つである。外胚葉は、胚の外側の層に由来し、皮膚、神経系および感覚器に発達する。皮膚としては、例えば、表皮、髪、爪および皮膚腺が挙げられ、神経系としては、例えば、脳神経、脊髄および末梢神経が挙げられ、感覚器としては、例えば、視覚器、聴覚器、平衡覚器、味覚器、嗅覚器および触覚器が挙げられる。
　本開示で用いられる「外胚葉性細胞」は、例えば神経系の細胞、例えば、中枢神経系の細胞および末梢神経系の細胞を含む。したがって、本開示において、「原料となる外胚葉性細胞」は、例えば中枢神経系の細胞を含むことができる。原料となる外胚葉性細胞は、アストロサイトを含んでもよい。
　本開示の製造方法で用いる外胚葉性細胞は、いかなる起源から提供されてもよく、例えば、哺乳動物から提供される。哺乳動物としては、例えば、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシおよびサルが挙げられる。哺乳動物は、好ましくはヒト、ラット、マウス、ネコ、またはイヌであり、より好ましくはヒト、ラットまたはマウスである。
　本開示で使用される「外胚葉性細胞」は、「外胚葉性組織」および「外胚葉性器官」を構成する細胞である。「外胚葉性組織」および「外胚葉性器官」としては、例えば、中枢神経（脳および脊髄）、下垂体、末梢神経、腸神経、副腎髄質、メラノサイト、顔面軟骨、歯の象牙質、表皮、髪、爪、皮膚、皮脂腺、唾液腺、汗腺、乳腺、鼻腔、鼻の粘膜、口上皮、口腔、目、膀胱、肛門を挙げることができる。脳は、大脳、小脳および脳幹に大きく分けることができる。大脳はさらに、終脳および間脳に分けられ、脳幹はさらに、中脳、橋および延髄に分けられる。中枢神経は、神経細胞およびグリア細胞から構成され、これらの細胞を出発材料に選ぶことができる。これらの組織または器官には、最終分化段階を終えた成熟細胞が多く存在する。
　原料となる外胚葉性細胞は、例えば、グリア細胞に分類されるアストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞（あるいはポリデンドロサイトとも言われる。）、上衣細胞、シュワン細胞および衛星細胞からなる群より選択される少なくとも１つを選択することができる。これらの細胞は、生体から得られた初代細胞、樹立された細胞株、または、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から誘導された外胚葉性細胞であってもよい。
　本開示の方法に用いる細胞は、例えば、哺乳動物から摘出した脳から単離精製された細胞であってもよい。
　例えばラットの場合、１０週齢～２０週齢の成体ラットから摘出した脳を用いることが好ましいが、２ヶ月齢以下の幼若ラット由来の脳を用いてもよい。ヒトの場合、生検または外科手術により得ることができる。例えば、神経細胞およびグリア細胞は、いずれも生検により採取することができる。外科手術の場合は、切除した成人の脳組織片を用いることも、死亡胎児から切除した脳を用いることもできる。あるいは、これら摘出した脳から神経細胞またはグリア細胞を単離精製した後、凍結した細胞を用いることもできる。
　原料となる外胚葉性細胞は、外胚葉性細胞の特徴を示す細胞として定義することができる。外胚葉性細胞の特徴としては、細胞の形態、細胞に特有の遺伝子（「マーカー遺伝子」と称する場合がある。）の発現等を挙げることができる。外胚葉性細胞であることは、分化段階のいずれかにおいて、例えば、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＳＬＣ１Ａ２（「ＥＡＡＴ２」または「ＧＬＴ－１」としても既知である。）、およびＮＧ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現があることで、確認することができる。外胚葉性細胞のマーカー遺伝子の発現は、遺伝子およびタンパク質のいずれに基づいて確認してもよい。遺伝子またはタンパク質の発現の確認は、発現の有無、測定方法に依存した具体的な発現量、特定の細胞における同一遺伝子またはタンパク質の発現量との比較など、当業界で公知の方法によって行うことができる。
　なお、本明細書において、マーカー遺伝子の発現は、当業界で公知の技術を用いて確認することができ、例えば、定量ＰＣＲ（「ｑＰＣＲ」と記載することがある。）等を用いた遺伝子の発現量の測定、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー法等の免疫測定法を用いたタンパク質量の測定などによって、確認することができる。
　上記のようにして用意された原料となる外胚葉性細胞を、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させる。接触は、インビトロであってよい。本方法に使用可能な低分子シグナル伝達経路阻害剤としては特に制限はなく、いずれも使用可能である。低分子シグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、トランスフォーミング増殖因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＴＧＦ）β受容体阻害剤、ＲＯＣＫ［Ｒｈｏ結合タンパク質キナーゼ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）］阻害剤およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ　３；ＧＳＫ３）阻害剤が挙げられる。
　本開示に係る製造方法において、前記阻害剤は、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含んでよい。本開示に係る製造方法において、前記阻害剤は、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含んでよい。
　ＴＧＦβ受容体阻害剤は、ＴＧＦβ受容体の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、［２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－（４－ピリジルアミノ）］プテリジン（ＳＤ－２０８）、３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（以上、いずれもメルク社）、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）およびＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１（富士フイルム和光純薬株式会社）が挙げられる。ＴＧＦβ受容体阻害剤は、好ましくはＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１である。ＴＧＦβ受容体阻害剤には、ＴＧＦβ受容体アンタゴニストも含まれる。これらのＴＧＦβ受容体阻害剤は、１種のみを用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ結合タンパク質キナーゼの機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ａｘｏｎ　ｍｅｄｃｈｅｍ社）、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬株式会社）およびＨ－１１５２　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（富士フイルム和光純薬株式会社）が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくはＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２である。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種のみを用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＧＳＫ３阻害剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）３の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、ＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、ＳＢ２１６７６３（Ｓｅｌｌｅｃｋ社）、ＣＨＩＲ　９８０１４（Ａｘｏｎ　ｍｅｄｃｈｅｍ社）、ＣＨＩＲ　９９０２１（Ａｘｏｎ　ｍｅｄｃｈｅｍ社）、ＳＢ４１５２８６（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびＫｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（コスモ・バイオ社）が挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤は、好ましくはＣＨＩＲ　９９０２１である。ＧＳＫ３阻害剤は、１種のみを用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本製造方法において用いられる低分子シグナル伝達経路阻害剤は、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つとすることができる。すなわち、本製造方法において使用される低分子シグナル伝達経路阻害剤は、
・ＴＧＦβ受容体阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤との組み合わせ、
・ＴＧＦβ受容体阻害剤、または
・ＲＯＣＫ阻害剤
であってよい。一態様において、使用される低分子シグナル伝達経路阻害剤は、ＴＧＦβ受容体阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤との組み合わせである。本明細書において、「低分子シグナル伝達経路阻害剤」の語は、単に「阻害剤」と称することもある。
　本開示の態様としては、例えば、以下の阻害剤が含まれる：
　（１）　２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、［２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－（４－ピリジルアミノ）］プテリジン（ＳＤ－２０８）、３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、ＳＢ４３１５４２およびＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１からなる群より選択される少なくとも１の化合物；
　（２）　２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、［２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－（４－ピリジルアミノ）］プテリジン（ＳＤ－２０８）、３－（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、ＳＢ４３１５４２およびＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１からなる群より選択される少なくとも１の化合物と、
　ＧＳＫ２６９９６２Ａ、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２およびＨ－１１５２　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる群より選択される少なくとも１の化合物との組み合わせ；ならびに、
　（３）　ＧＳＫ２６９９６２Ａ、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２およびＨ－１１５２　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる群より選択される少なくとも１の化合物。
　培地中のＴＧＦβ受容体阻害剤の濃度は、例えば０．００１μＭ～１００μＭ、０．０１μＭ～５０μＭ、または０．０５μＭ～３０μＭの範囲内であり、用いるＴＧＦβ受容体の種類によって適宜調整可能である。一態様において、培地中のＴＧＦβ受容体阻害剤、例えばＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１の濃度は、０．１μＭ～３μＭである。
　培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えば０．００１μＭ～１００μＭ、０．０１μＭ～８０μＭ、または０．１μＭ～５０μＭの範囲内であり、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜調整可能である。一態様において、培地中のＲＯＣＫ阻害剤、例えばＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２の濃度は、１μＭ～３０μＭである。
　培地中のＧＳＫ３阻害剤の濃度は、例えば０．００１μＭ～１００μＭ、０．０１μＭ～８０μＭ、または０．１μＭ～５０μＭの範囲内であり、用いるＧＳＫ３阻害剤の種類によって適宜調整可能である。
　上記濃度範囲は、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤がそれぞれ単独で使用される場合、および、これらの阻害剤が組み合わせて使用される場合のいずれにも適用可能である。また、上記阻害剤が、水不溶性または水難溶性である場合、少量の低毒性の有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ等）に溶解した後、上記の最終濃度となるよう培地に添加することができる。
　原料となる外胚葉性細胞と低分子シグナル伝達経路阻害剤との接触は、上記阻害剤を含む培地中で、原料となる外胚葉性細胞を培養することによって行われる。具体的には、培地中に、上記阻害剤を有効な濃度で添加して培養を行う。
　原料となる外胚葉性細胞を低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた後、該阻害剤を含む培地中で更なる培養に供する。ここで、更なる培養は、「追加培養」または「第２の培養」とも称する。これに対して、原料となる外胚葉性細胞を低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させるまでの培養、すなわち、低分子シグナル伝達経路阻害剤を含まない培地中での外胚葉性細胞の培養を、「前培養」または「第１の培養」とも称する。該阻害剤との接触後、追加培養を行うことにより、細胞増殖能が高められた高増殖性細胞が得られる。なお、追加培養中においても、培地中には阻害剤が含まれているため、細胞と阻害剤との接触は継続している。
　本開示において、前培養および追加培養で用いる培地としては、広く動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として使用することができ、市販されている基礎培地を使用してもよい。市販の基礎培地としては、例えば、アストロサイト培地（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＡＧＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　Ｅ培地、および、ＮＳ基礎培地（富士フイルム和光純薬株式会社）が挙げられるが、これらに特に限定されない。培地としては、上記のものを単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　培地に添加される添加剤としては、例えば、サイトカイン、増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、および線維芽細胞増殖因子－２（ＦＧＦ－２））、ホルモン（例えば、インスリン、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロンおよびチロキシン）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン（Ｄｅｘ））、血漿由来タンパク質（例えば、トランスフェリン）、各種アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミンおよびＬ－プロリン）、各種無機塩（例えば、亜セレン酸塩およびＮａＨＣＯ３）、各種ビタミン（例えば、ニコチンアミドおよびアスコルビン酸誘導体）、Ｎ２サプリメント（富士フイルム和光純薬株式会社）、ＮＳサプリメント（富士フイルム和光純薬株式会社）、Ｂ－２７　Ｐｌｕｓ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、各種抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、抗真菌剤（例えば、アンホテリシン）、ならびに緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝剤）が挙げられる。
　前培養（第１の培養）および追加培養（第２の培養）で用いられる培地には、血清添加培地または無血清培地のいずれを用いてもよい。
　血清添加培地を使用する場合、血清としては、例えば、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）を用いることができる。また、エクソソーム分離を容易にするために、エクソソームを除去したＦＢＳを用いることもできる。市販のエクソソーム除去培地としては、例えば、ＦＢＳ　ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ，ＯｎｅＳｈｏｔ　ｆｏｒｍａｔ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を挙げることができる。培地中の血清の濃度は、例えば、０．５～２５％（ｖ／ｖ）、１～２５％（ｖ／ｖ）、１～２０％（ｖ／ｖ）、１～１５％（ｖ／ｖ）、２～１５％（ｖ／ｖ）、２～１０％（ｖ／ｖ）、３～１０％（ｖ／ｖ）、３～８％（ｖ／ｖ）、および、３～５％（ｖ／ｖ）である。具体的な一態様において、培地中の血清の濃度は、３％（ｖ／ｖ）である。
　無血清培地を使用する場合、血清代替物を添加してもよい。血清代替物としては、例えば、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）、ノックアウト血清代替物（ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＫＳＲ）、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；ＨＳＡまたはＨｕｍａｎ　ａｌｂｕｍｉｎ，ｓｅｒｕｍ；ＨＡＳ）等が挙げられる。ヒト血清アルブミンとしては、ヒト血漿から分離されたヒト血清アルブミン、または、ヒト血清アルブミン遺伝子を発現するイネから精製されたヒト血清アルブミン（富士フイルム和光純薬）を使用することができる。通常、増殖因子（ｈＥＧＨ等）、サイトカイン、ホルモンなどの因子が培地に更に添加される。これらの添加される因子としては、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン２１－ヘミコハク酸またはその塩、および、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、Ｎ２サプリメント（富士フイルム和光純薬株式会社）、ＮＳサプリメント（富士フイルム和光純薬株式会社）およびＢ－２７　Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが挙げられるが、それらに限定されない。
　培養に用いられる培養容器は、接着培養に適したものであれば特に限定されず、例えば、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイおよび培養バックが挙げられる。培養容器としては、細胞の浮遊培養を行うために細胞が接着できないように表面が加工された培養容器を用いることもできる。あるいは、接着培養の場合は、内表面が、細胞との接着性を向上させる目的で細胞支持用基質によりコーティングされたものを用いることができる。かかる細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ－Ｌ－リジン、ラミニンおよびフィブロネクチンが挙げられる。好ましい細胞支持用基質は、コラーゲンまたはマトリゲルである。
　原料となる外胚葉性細胞は、例えば１×１０２～１×１０６細胞／ｃｍ２、１×１０３～１×１０５細胞／ｃｍ２、または１×１０３～１×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で培養容器上に播種することができる。
　培養には、一般に外胚葉性細胞の培養に適用される条件をそのまま適用可能である。培養には、ＣＯ２インキュベータを用いることができ、その場合の培養温度およびＣＯ２濃度としては、一般的に用いられるものであればよく、例えば、３７℃および５％（ｖ/ｖ）とすることができる。
　培養期間は、ＹＡと共に培養している期間であり、当該期間は、連続する期間でもよく、不連続な期間、すなわち、不連続な複数の期間を合計した期間であってよい。培養期間は、２８日超であればよく、例えば５週間以上、６週間以上または７週間以上とすることができる。培養期間の上限としては、例えば３か月程度または１００日間とすることができる。継代は、培養容器内の細胞密度、培地の状態または細胞の状態などに応じて適宜行うことができ、継代間隔は、例えば、２～２０日間程度とすることができる。
　本製造方法で得られる高増殖性細胞（ｈｉｇｈｌｙ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）（本明細書では、「ＨＰ細胞」と称することがある）とは、増殖能が高められた細胞であり、低分子シグナル伝達経路阻害剤を含まない培地を用いる以外は当該細胞の培養条件と同一の条件下で培養した対照となる外胚葉性細胞と比較して、細胞増殖活性が高く、より短時間で増殖する性質、すなわち細胞倍加時間がより短いという性質、より長期間に亘って増殖する性質、またはこれら双方を満たす性質を備えている細胞であることを意味する。本製造方法で得られる培養物に含まれる細胞集団は、ＨＰ細胞だけでなく、ＨＰ細胞に加えて、増殖能が高められておらず、元の細胞の増殖能と変わらない細胞、即ち、非高増殖性細胞（ｎｏｎ－ｈｉｇｈｌｙ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）（本明細書では、「ｎｏｎ－ＨＰ細胞」と称することがある）を含むことができる。本製造方法で得られる細胞集団におけるＨＰ細胞の割合は、細胞数基準で５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上であってもよい。
　高増殖性細胞は、阻害剤と接触させた２８日超の培養期間（本明細書では、「期間Ｔ」とする。）後の細胞数（本明細書では、「高増殖性細胞の細胞数Ｎ」とする。）が、阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数（本明細書では、「外胚葉性細胞の細胞数Ｎ’」とする。）の１．０倍を超える増殖能を有することができる。この場合の培養条件としては、例えば、４×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度、３７℃の培養温度、５％ＣＯ２濃度とすることができる。高増殖性細胞の細胞数Ｎを確認する際に用いられる培地には、上記前培養および追加培養に用いられる培地として挙げたもののいずれも用いることができる。高増殖性細胞の細胞数Ｎと外胚葉性細胞の細胞数Ｎ’とをそれぞれ確認する際に用いられる２種類の培地には、阻害剤の有無以外の組成は同一となる培地を用いることができる。
　一態様において、期間Ｔは、例えば９０日間、８０日間、７０日間、６０日間、５０日間、４５日間、４２日間、４０日間、３５日間、３２日間、３０日間または２９日間である。
　一態様において、高増殖性細胞の細胞数Ｎは、外胚葉性細胞の細胞数Ｎ’の１．０倍超であれば特に制限はなく、例えば細胞数Ｎ’の１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上または１．５倍以上であってもよい。好ましくは、高増殖性細胞の細胞数Ｎが、外胚葉性細胞の細胞数Ｎ’の１．５倍以上である。
　高増殖性細胞は、細胞特有遺伝子、すなわちマーカー遺伝子の発現によって特定してもよい。高増殖性細胞のマーカー遺伝子の発現は、本明細書において前述したように、遺伝子およびタンパク質のいずれに基づいて確認してもよく、遺伝子またはタンパク質の発現の確認方法は、発現の有無、測定方法に依存した具体的な発現量、特定の細胞における同一遺伝子またはタンパク質の発現量との比較などよって行うことができる。
　本明細書では、遺伝子またはタンパク質の発現に関して「陽性」または「陰性」と表現することがある。遺伝子またはタンパク質の発現に関して、「陽性」とは、対象となる遺伝子またはタンパク質の発現が認められる場合を意味し、一方、「陰性」とは、対象となる遺伝子またはタンパク質の発現が認められない場合を意味する。遺伝子またはタンパク質の発現に関して「発現が高い」もしくは「陽性」、または「発現が低い」もしくは「陰性」と表現する場合に、高増殖性細胞とは異なる特定の細胞を比較対照とすることができる。比較対照となる特定の細胞、すなわち、「対照細胞」は、対象となる遺伝子またはタンパク質の発現量が極めて低い細胞であってもよく、原料となる外胚葉性細胞、すなわち阻害剤非接触の外胚葉性細胞であってよく、または、成熟細胞もしくはその前駆細胞であってもよい。
　例えば、高増殖性細胞が、マーカー遺伝子の発現に関し、「陽性」であるとは、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた後の該マーカー遺伝子の発現量が、該阻害剤と非接触で培養された外胚葉性細胞での該マーカー遺伝子の発現量の１．０倍以上であることを意味することができる。これに対し、高増殖性細胞が、マーカー遺伝子の発現に関し、「陰性」であるとは、前記阻害剤と接触させた後の該マーカー遺伝子の発現量が、該阻害剤と非接触で培養された外胚葉性細胞での該マーカー遺伝子の発現量の１．０倍未満であることを意味することができる。
　発現量の確認方法に供与する高増殖性細胞および阻害剤と非接触の外胚葉性細胞の培養条件は、阻害剤と接触または非接触であること以外は同一とすることができるが、例えば、細胞の状態、増殖性および細胞数等に基づいて、同一の培養期間、同一の細胞継代数および同様の細胞密度など、対象となる細胞が同一または極めて同一の状態となるように適宜調整することができ、当業者は細胞の状態に基づいて選択可能である。
　ここで、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた一定期間以上の培養期間後の該マーカー遺伝子の発現量は、コントロール遺伝子に対する発現量として表される。コントロール遺伝子としては、例えば、ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ（ＡＣＴＢ）およびＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）が使用可能である。
　一態様において高増殖性細胞は、成熟細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、前駆細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現することができる。
　本明細書において「前駆細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）」とは、成熟細胞に至るまでの分化段階の細胞であって、幹細胞から発生して体を構成する最終分化細胞へと分化することができる細胞を意味する。
　成熟細胞に特有の遺伝子、例えばアストロサイト等で比較的高く発現している遺伝子としては、例えば、ＧＦＡＰ、Ｓ１００ＢおよびＳＬＣ１Ａ２を挙げることができる。前駆細胞に特有の遺伝子、例えば、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経上皮細胞および放射状グリア細胞で比較的高く発現している遺伝子としては、例えば、ＮＧ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＮｅｓｔｉｎおよびＳＯＸ２を挙げることができる。
　高増殖性細胞は、上述したような高い増殖能を有する細胞であれば、如何なるマーカー遺伝子の発現パターンを特徴として備える細胞であってもよく、換言すれば、如何なる特徴を備える細胞を含む細胞集団であってもよい。高増殖性細胞は、次に挙げるようなマーカー遺伝子の発現パターンを示すものであってよい。これらのマーカー遺伝子の発現パターンにしたがって、本開示に係る高増殖性細胞を、迅速に特定し、抽出することができる。
　高増殖性細胞は、Ｍｕｓａｓｈｉ１（ＭＳＩ１）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つが陰性である細胞を含むことができる。
　例えば、高増殖性細胞は、ＧＦＡＰ陽性細胞を含むことができる。他の一態様では、高増殖性細胞は、ＧＦＡＰが陽性、かつ、ＮＧ２が陽性の細胞を含むことができ、または、ＧＦＡＰを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＮＧ２を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現することができる。他の一態様では、高増殖性細胞は、ＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂが陽性、かつ、ＮＧ２が陽性の細胞を含むことができ、または、ＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂを、原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＮＧ２を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現することができる。
　別の一態様において高増殖性細胞は、成熟細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、前駆細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する細胞を含むことができる。
　一態様において、高増殖性細胞は、ＮＧ２が陽性の細胞を含むことができ、または、ＮＧ２を低分子シグナル伝達経路阻害剤非接触の外胚葉性細胞におけるＮＧ２の発現量よりも多く発現する細胞を含むことができる。すなわち、この態様において、高増殖性細胞は、ＮＧ２の発現量が、低分子シグナル伝達経路阻害剤非接触の外胚葉性細胞におけるＮＧ２の発現量よりも高いものであってもよい。
　例えば、高増殖性細胞は、Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、ＮＧ２が陽性の細胞を含むことができ、またはＳ１００Ｂを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＮＧ２を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現することができる。
　一態様において、高増殖性細胞が含む上述の細胞は、Ｍｕｓａｓｈｉ１（ＭＳＩ１）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つが陰性である。すなわち、高増殖性細胞が含む細胞は、前記阻害剤と接触させた後の、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触で培養された外胚葉性細胞での該マーカー遺伝子の発現量の１．０倍未満であることができる。好ましい態様において、高増殖性細胞が含む上述の細胞は、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される２以上、３以上、またはこれらすべてが陰性である。
　一態様において、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つが陰性である細胞の発現量は、コントロール遺伝子に対する発現量として表されることができる。この場合、「陰性」とは、コントロール遺伝子としては、例えば、ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ（ＡＣＴＢ）およびＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を使用したときに、コントロール遺伝子の発現量の１．０倍未満である。
　本開示に係る高増殖性細胞の細胞集団は、高い増殖能を有する高増殖性細胞、特に高増殖性外胚葉性細胞であれば分化段階は問わず、成熟細胞および前駆細胞の両方が含まれたヘテロな細胞集団であってもよく、あるいは比較的分化段階の近い複数種の外胚葉性細胞が極めて大多数を占める細胞集団であってもよい。
　一態様では、本製造方法により得られる高増殖性細胞の細胞集団は、高増殖性外胚葉性前駆細胞を主要な構成成分として含む集団、または、高増殖性外胚葉性前駆細胞および高増殖性外胚葉性成熟細胞の双方を含む集団であってよい。ここで細胞集団における「主要な構成成分」とは、細胞集団において細胞数基準で少なくとも５０％を占める細胞を意味する。本明細書において「極めて大多数」とは、細胞集団において、対象となる細胞の細胞数が、細胞数基準で９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上であることを意味する。
　得られた高増殖性細胞の細胞集団における外胚葉性成熟細胞の割合は、細胞数基準で、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満であってよい。したがって、本開示は、原料となる外胚葉性細胞に低分子シグナル伝達経路阻害剤を接触させることを含む、細胞増殖能が高められた外胚葉性細胞の富化方法も包含する。原料となる外胚葉性細胞の低分子シグナル伝達経路阻害剤との接触はインビトロで行うことができる。
　本製造方法において、原料となる外胚葉性細胞がアストロサイトである場合、高増殖性細胞の細胞集団には、アストロサイトに関連する外胚葉性細胞系統の細胞が含まれていてもよい。アストロサイトに関連する外胚葉性細胞系統の細胞としては、例えば、アストロサイト、放射状グリア細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ポリデンドロサイトとも言われる）、オリゴデンドロサイトおよび神経上皮細胞が挙げられる。加えて、アストロサイトに関連する外胚葉性細胞系統の細胞集団には、高められた細胞増殖能を示す細胞集団である限り、外胚葉性細胞に見られる特徴の一部を備え、かつ、上述した細胞のいずれにも分類できない細胞が含まれてもよい。
　本開示の別の側面は、高増殖性細胞に関する。本高増殖性細胞は、先述の製造方法により得られる高増殖性細胞であってもよく、その他の製造方法によって得られる高増殖性細胞であってもよい。
　本開示の一側面に係る高増殖性細胞は、外胚葉性細胞の特徴を備え、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日超の培養期間後の細胞数が、低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数の１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞である。上記のように、低分子シグナル伝達経路阻害剤と外胚葉性細胞とを接触させることによって、外胚葉性細胞への遺伝子導入または遺伝子改変を伴うことなく、細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ることができる。これにより、阻害剤非接触群と比較して、阻害剤接触群では、より長期間に亘って培養を行うことができ、得られる細胞数についても、阻害剤接触群の細胞数は、阻害剤非接触群の細胞数に対して多い。
　一態様では、ヒト初代成熟アストロサイトをＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせと接触させて培養して得られた細胞群（阻害剤接触群）と、ヒト初代成熟アストロサイトを該阻害剤の組み合わせと接触させずに培養して得られた細胞群（阻害剤非接触群）とを比較して、阻害剤接触群では、より長期間に亘って培養を行うことができる。すなわち、阻害剤接触群では、阻害剤非接触群に比較して、より長期間、細胞の増殖が継続する。また、増殖によって最終的に得られる細胞数については、阻害剤接触群の細胞数は、阻害剤非接触群の細胞数に対して、例えば２倍以上、５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、または４００倍である。
　このように、得られた高増殖性細胞は細胞増殖能が高められているため、長期培養によって多数の細胞が得られる。高増殖性細胞は、以下で説明するような細胞分泌物を生成可能であるため、長期培養によって多数の細胞が得られれば、回収できる細胞分泌物の量も増加し得る。
　本側面に係る高増殖性細胞については、本製造方法の製造結果物として記載した事項をそのまま適応する。ただし、細胞として、外胚葉性細胞の特徴を備え、阻害剤と接触させた２８日超の培養期間後の細胞数が、阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数の１．０倍を超える増殖能を有する限り、本製造方法の製造結果物であることに限定されない。
　本開示の高増殖性細胞は、上述したように、ＧＦＡＰ、ＮＧ２およびＳ１００Ｂからなる群より選択される少なくとも１つが陽性である細胞を含むことができる。高増殖性細胞は、例えば以下の細胞（Ｉ）～（ＶＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１つを含むことができる：
　（Ｉ）ＧＦＡＰ陽性細胞、例えば、ＧＦＡＰを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する細胞；
　（ＩＩ）ＮＧ２陽性細胞、例えば、ＮＧ２を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する細胞；
　（ＩＩＩ）Ｓ１００Ｂ陽性細胞、例えば、Ｓ１００Ｂを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する細胞；
　（ＩＶ）ＧＦＡＰが陽性、かつ、ＮＧ２が陽性の細胞、例えば、ＧＦＡＰを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＮＧ２を原料となる外胚葉性細胞と同じかかそれ以上に発現する細胞；
　（Ｖ）ＧＦＡＰが陽性、かつ、Ｓ１００Ｂが陽性の細胞、例えば、ＧＦＡＰを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、Ｓ１００Ｂを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する細胞；
　（ＶＩ）Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、ＮＧ２が陽性の細胞、例えば、Ｓ１００Ｂを、原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＮＧ２を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する細胞；
　（ＶＩＩ）ＧＦＡＰが陽性、Ｓ１００Ｂが陽性、かつ、ＮＧ２が陽性の細胞、例えば、ＧＦＡＰを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、Ｓ１００Ｂを原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、ＮＧ２を原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する細胞。
　本開示の高増殖性細胞は、ＳＬＣ１Ａ２が陽性である細胞を含むこともできる。具体的には、高増殖性細胞は、上記の遺伝子の少なくとも１つが陽性であり、かつ、ＳＬＣ１Ａ２が陽性である細胞を含むこともできる。
　本開示の高増殖性細胞が、少なくともＧＦＡＰが陽性の細胞を含む場合、好ましくは、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた後のＧＦＡＰ遺伝子の発現量が、該阻害剤と非接触で培養された外胚葉性細胞でのＧＦＡＰ遺伝子の発現量の１．０倍以上４．０倍未満である。
　本開示の高増殖性細胞は、ＧＦＡＰ、ＮＧ２、およびＳ１００Ｂからなる群より選択される少なくとも１つが陽性であり、かつ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２から選択される少なくとも１つが陰性である細胞を含むことができる。すなわち、この態様において、上記（Ｉ）～（ＶＩＩ）の細胞は、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２から選択される少なくとも１つが陰性である。
　高増殖性細胞の単離には、特定の細胞を単離する公知の手段を適用することができ、例えば、前述したマーカー遺伝子に由来するタンパク質の発現に基づく蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）法、および、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）等を用いた磁気細胞分離法を利用することができる。得られる高増殖性細胞の増殖能が高いため、長期培養を行うことによって高増殖性細胞の割合が極めて高い細胞集団を得ることで、高増殖性細胞を実質的に単離するものであってもよい。
　＜２＞外胚葉性前駆細胞およびその製造方法
　本開示に係る製造方法により得られる高増殖性細胞には、出発材料である原料となる外胚葉性細胞よりも未成熟な分化段階の特徴を示す細胞が含まれていてもよい。このような未成熟段階の外胚葉性細胞、すなわち外胚葉性前駆細胞は、阻害剤を含まない培地を用いる以外は当該細胞の培養条件と同一の培養条件で培養した対照となる外胚葉性細胞と比較して細胞増殖活性が高く、より短時間で増殖する性質、より長期間に亘って増殖する性質、またはこれら双方を満たす性質を備えることできる。この高増殖性を示す外胚葉性前駆細胞を、本明細書では高増殖性前駆細胞と称することがある。本明細書における「高増殖性細胞」には、高増殖性前駆細胞を包含することがある。これにより、未成熟段階の外胚葉性細胞をより長期にわたって成育させて、例えば、外胚葉性前駆細胞が生成する細胞分泌物を、対照となる外胚葉性細胞と比較して、より短時間で大量に得ることができるなどの利点を有する。
　本開示の別の側面は、外胚葉性前駆細胞の製造方法に関し、前記外胚葉性前駆細胞は、高増殖性細胞であり、該製造方法は、
　（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
　（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で、該阻害剤を前記原料となる外胚葉性細胞に接触させて、２８日超の期間にわたり培養すること、および、
　（ｉｉｉ）前記接触後、前記阻害剤を含む培地中で追加培養を行い、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を含む培養物を得ること
を含む。本開示の外胚葉性前駆細胞の製造方法は、前記培養物から、前記高増殖性細胞を単離することを更に含んでもよい。
　本開示の外胚葉性前駆細胞の製造方法における、原料となる外胚葉性細胞、および、低分子シグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、本開示の高増殖性細胞の製造方法に関して記載した、原料となる外胚葉性細胞、および、低分子シグナル伝達経路阻害剤をそれぞれ使用することができる。
　高増殖性前駆細胞の単離には、特定の細胞を単離する公知の手段を適用することができ、例えば、前駆細胞に特有の前述したマーカー遺伝子に由来するタンパク質の発現に基づく蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）法、および、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）等を用いた磁気細胞分離法を利用することができる。得られる高増殖性前駆細胞の増殖能が高いため、長期培養を行うことによって高増殖性前駆細胞の割合が極めて高い細胞集団を得ることで、高増殖性前駆細胞を実質的に単離するものであってもよい。
　本開示に係る製造方法により得られる高増殖性細胞では、出発材料である原料となる外胚葉性細胞が、最終分化段階に到達したアストロサイトを含む場合、得られた高増殖性細胞には、アストロサイトよりも未成熟な分化段階の特徴を示す細胞が含まれていてもよい。このような未成熟段階の外胚葉性細胞は、高められた増殖能を有することに加え、更に、以下の（ａ）または（ｂ）の特性を有することができる：
　（ａ）アストロサイトと比較して、ＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂの組み合わせ、ＧＦＡＰおよびＳＬＣ１Ａ２の組み合わせ、Ｓ１００ＢおよびＳＬＣ１Ａ２の組み合わせ、ＧＦＡＰおよびＮＧ２の組み合わせ、ＮＧ２およびＳＬＣ１Ａ２の組み合わせ、またはＮＧ２およびＳ１００Ｂの組み合わせの発現量が増加している。
　（ｂ）アストロサイトと比較して、ＧＦＡＰ、Ｓ１００ＢおよびＮＧ２の組み合わせ、ＧＦＡＰ、ＳＬＣ１Ａ２およびＮＧ２の組み合わせ、Ｓ１００Ｂ、ＳＬＣ１Ａ２およびＮＧ２の組み合わせ、またはＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＳＬＣ１Ａ２およびＮＧ２の組み合わせの発現量が増加している。
　本開示のさらに別の側面は、本開示に係る外胚葉性前駆細胞およびその用途に関する。
　上記製造方法により得られた外胚葉性前駆細胞は、例えば、神経障害治療剤の評価方法に使用することができる。具体的には、神経障害治療剤の候補薬剤を、前記外胚葉性前駆細胞と接触させることにより、神経障害治療剤の候補薬剤の有用性を評価することができる。したがって、本開示は、神経障害治療剤の候補薬剤を、前記外胚葉性前駆細胞と接触させることを含む、神経障害治療剤の評価方法にも関する。更には、先述の外胚葉性前駆細胞を使用することを含む、神経疾患モデルの評価方法にも関する。
　本開示はさらに、本開示に係る製造方法により得られた外胚葉性前駆細胞を、成熟条件下に供して外胚葉性前駆細胞の分化を誘導し、外胚葉性成熟細胞を得ることを含む、外胚葉性成熟細胞の製造方法にも関する。
　ここで「成熟条件下」とは、既知の分化誘導因子を用いた培養条件を意味する。分化誘導因子としては、例えば、線維芽細胞成長因子－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－３；ＦＧＦ－２）；白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ；ＬＩＦ）または毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＣＮＴＦ）などのＩＬ－６ファミリーサイトカイン；ＢＭＰ２またはＢＭＰ４などのＢｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）ファミリーサイトカイン、Ｎｏｔｃｈファミリータンパク質；Ｗｎｔ遺伝子ファミリータンパク質；ソニック・ヘッジホッグタンパク質；およびレチノイン酸が挙げられる。さらに成熟細胞の増殖または維持に必要な因子として、例えば、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－４／５（ＮＴ－４／５）、および血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）を挙げることができる。
　分化誘導因子を用いた培養条件としては、分化誘導因子による分化誘導方法において適用される既知の分化誘導条件を適用することができ、該分化誘導条件は、用いる分化誘導因子の種類によって適宜選択できる。
　＜３＞阻害剤の用途
　先述の製造方法で使用される阻害剤は、外胚葉性細胞の増殖能を維持または促進させるために用いることができる。したがって、本開示の更なる側面は、低分子シグナル伝達経路阻害剤、例えばＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つを含む、外胚葉性細胞の増殖性調整剤に関する。具体的に、本開示は、先述の製造方法により得られる高増殖性細胞、または外胚葉性細胞の増殖能を維持または促進させるために使用される、増殖性調整剤にも関する。ここで、本明細書において、用語「増殖性調整」とは、細胞の増殖維持および増殖促進の少なくとも一方を達成することを意味することができる。用語「増殖維持」および「増殖促進」については、細胞が培養期間にわたって細胞数が維持または増加している限り、特に区別されない。細胞の増殖性調整のための増殖性調整剤の使用濃度としては、先述した製造方法における使用濃度に関して記述した濃度をそのまま適用することができる。
　さらに本開示は、先述の製造方法により得られる高増殖性細胞または外胚葉性細胞の培養方法であって、低分子シグナル伝達経路阻害剤、例えばＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの阻害剤の存在下で、前記細胞集団または前記細胞を継代培養することを含む、培養方法に関する。ここで、「培養方法」には、高増殖性細胞または外胚葉性細胞の増殖性調整方法が包含されるものとする。本培養方法に用いる場合の阻害剤の使用濃度としては、先述した製造方法における使用濃度に関して記述した濃度をそのまま適用することができる。
　＜４＞細胞分泌物およびその製造方法
　本開示のさらに別の側面は、本開示に係る高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を含む培養物を得ること、および、前記細胞分泌物を、前記培養物から分離することを含む、細胞分泌物の製造方法に関する。本製造方法は、必要に応じて任意の工程をさらに含んでもよい。本開示に係る高増殖性細胞は、細胞増殖能が高められた高増殖性細胞であるので、阻害剤を含まない培地を用いる以外は当該高増殖性細胞の培養条件と同一の培養条件で培養した対照となる細胞と比較して、より短時間で増殖し、より長期間に亘って増殖し、またはより短時間で増殖すると共に長期間に亘って増殖する。したがって、本細胞分泌物の製造方法では、高増殖性細胞が分泌する細胞分泌物を、対照となる細胞と比較して、より短時間で大量に得ることができる。
　細胞分泌物は、「セクレトーム」とも称され、細胞から分泌される物質であれば特に制限されず、例えば、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小胞等の細胞外小胞；サイトカイン、ホルモン、抗体等の機能性タンパク質などが挙げられる。一形態では、細胞分泌物は、細胞外小胞であってもよく、なかでも、エクソソームであってもよい。
　本開示に係る細胞分泌物の製造方法において用意される培養物は、上記のいずれかの態様により得られた高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を含む。細胞分泌物を含む培養物は、本開示に係る高増殖性細胞の製造方法を実施して製造したものであってもよく、本開示に係る高増殖性細胞を入手して培養することで得たものであってもよく、本開示に係る製造方法を実施することで得られた培養物を別途入手したものであってもよく、本開示に係る高増殖性細胞の培養物を別途入手したものであってもよい。本明細書において「培養物」とは、細胞を培養することによって得られる培養細胞と培養上清（馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ））との組み合わせを意味する。
　本開示に係る細胞分泌物の製造方法は、前記細胞分泌物を、前記培養物から分離することを含む。培養物からの細胞分泌物の分離方法には、例えば、上清の除去および遠心分離などの公知の分離方法を使用することができる。培養物から分離された細胞分泌物は、細胞分泌物を含有する組成物の形態で得てもよい。細胞分泌物が細胞分泌物を含有する組成物、すなわち細胞分泌物含有組成物である場合、細胞分泌物含有組成物は、細胞分泌物および水性媒体を含むことができる。水性媒体としては、細胞分泌物の種類等に応じて選択される公知の水性媒体であれば特に制限はなく、例えば、培養上清、水、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液）、生理食塩水および培地を挙げることができる。
　細胞分泌物の製造方法は、さらに、分離された細胞分泌物を精製または単離することを含むことができる。細胞分泌物の精製方法または単離方法としては、細胞分泌物の種類に応じて公知の方法を、特に制限なく適用することができる。
　細胞分泌物の単離または精製方法としては、例えば、ろ過および濃縮を挙げることができる。例えば、サイズまたは分子量カットオフ値を有する膜を用いてろ過を行って、細胞分泌物を単離または精製することができる。他の方法として、例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーションまたは限外ろ過を用いて、細胞分泌物をろ過または濃縮してもよい。細胞分泌物は、細胞分泌物を含有する組成物の形態、または単離もしくは精製後に得られる単離細胞分泌物の形態で、使用することができる。細胞分泌物は、組成物もしくは単離細胞分泌物の形態のままで、または噴霧乾燥、凍結乾燥処理等の公知の処理に供することによって、保管、冷蔵保存または冷凍保存することができる。
　本開示に係る細胞分泌物は、具体的には、タンパク質および／またはｍｉＲＮＡを含む細胞分泌物であって、タンパク質は、図４Ａおよび図４Ｂに示すものから選択され、ｍｉＲＮＡは、図５～１０に示すものから選択される。図４Ａおよび図４Ｂにおいて、各タンパク質名に続くカッコ内の記載は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）におけるアクセッション番号を意味する。図５～図１０において、各ｍｉＲＮＡ名に続くカッコ内の記載は、ｍｉＲＢａｓｅ（Ｒｅｌｅａｓｅ　２１）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）におけるアクセッション番号を意味する。細胞分泌物は、これらのタンパク質から選択される少なくともひとつ、またはこれらのｍｉＲＮＡから選択される少なくともひとつを含むものであればよく、これらのタンパク質から選択される少なくともひとつと、これらのｍｉＲＮＡから選択される少なくともひとつと、を含むものであってよい。
　一実施形態において細胞分泌物は、タンパク質として、
　・ＰＡ群：ビンキュリン（Ｐ１８２０６）、インテグリンβ－１，ＣＤ２９（Ｐ０５５５６）、ピルビン酸キナーゼＭ１／２（Ｐ１４６１８）、およびエフリンタイプ－Ａ受容体２（Ｐ２９３１７）の組み合わせを少なくとも含むものであってよく、
　・ＰＢ群：ビンキュリン（Ｐ１８２０６）、インテグリンβ－１，ＣＤ２９（Ｐ０５５５６）、ピルビン酸キナーゼＭ１／２（Ｐ１４６１８）、およびエフリンタイプ－Ａ受容体２（Ｐ２９３１７）の組み合わせと、アミノペプチダーゼＮ（Ｐ１５１４４）、アネキシンＡ２（Ｐ０７３５５）、アネキシンＡ６（Ｐ０８１３３）、ミオフェルリン（Ｑ９ＮＺＭ１）、および５’－ヌクレオチダーゼ，ＣＤ７３（Ｐ２１５８９）からなる群より選択される少なくとも１つとを少なくとも含むものであってもよく、
　・ＰＣ群：ビンキュリン（Ｐ１８２０６）、インテグリンβ－１，ＣＤ２９（Ｐ０５５５６）、ピルビン酸キナーゼＭ１／２（Ｐ１４６１８）、およびエフリンタイプ－Ａ受容体２（Ｐ２９３１７）の組み合わせと、アミノペプチダーゼＮ（Ｐ１５１４４）、アネキシンＡ２（Ｐ０７３５５）、アネキシンＡ６（Ｐ０８１３３）、ミオフェルリン（Ｑ９ＮＺＭ１）、および５’－ヌクレオチダーゼ，ＣＤ７３（Ｐ２１５８９）の組み合わせと、モエシン（Ｐ２６０３８）、インテグリンα－２，ＣＤ４９ｂ（Ｐ１７３０１）、インテグリンα－３，ＣＤ４９ｃ（Ｐ２６００６）、２’，３’－環状ヌクレオチド３’－ホスホジエステラーゼ（Ｐ０９５４３）、Ｆアクチンキャッピングタンパク質βサブユニット（Ｐ７９１３６）、ニューロピリン１（Ｏ１４７８６）およびテネイシンＣ（Ｐ２４８２１）からなる群より選択される少なくとも１つと、を含むものであってもよく、あるいは、
　・ＰＤ群：図４Ａおよび図４Ｂに記載されたすべてのタンパク質を含むものであってもよい。
　一実施形態において細胞分泌物は、ｍｉＲＮＡとして、
　・ＲＡ群：ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００７６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００１６３９）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６７）の組み合わせを少なくとも含むものであってよく、
　・ＲＢ群：ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００７６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００１６３９）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６７）の組み合わせと、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４４１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２５５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４４１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００１０１）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８２）からなる群より選択される少なくとも１つと、を少なくとも含むものであってもよく、
　・ＲＣ群：ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００７６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００１６３９）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６７）の組み合わせと、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４４１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２５５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４４１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００１０１）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８２）の組み合わせと、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２７９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８１－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００７８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００８０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６５）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００４８１４）からなる群より選択される少なくとも１つと、を少なくとも含むものであってもよく、あるいは、
　・ＲＤ群：図５～図１０に記載されたすべてのｍｉＲＮＡを含むものであってもよい。
　他の一実施形態において細胞分泌物は、タンパク質として、上述したＰＡ群、ＰＢ群、ＰＣ群またはＰＤ群のタンパク質群と、ｍｉＲＮＡとして、上述したＲＡ群、ＲＢ群、ＲＣ群またはＲＤ群のｍｉＲＮＡ群とを含むものであってよい。これにより、一実施形態に係る細胞分泌物は、これらのタンパク質およびｍｉＲＮＡに起因した既知の作用を有する医薬組成物として使用することができる。
　一態様において、細胞外小胞は、脂質二重層を含む小胞である。細胞外小胞の直径は、例えば、５０ｎｍ～５μｍ、または５０ｎｍ～１０００ｎｍである。細胞外小胞のひとつであるエクソソームの直径は、例えば５０ｎｍ～２００ｎｍである。エクソソームは、タンパク質、核酸、糖質、脂質等の様々な生理活性物質を含むことから、疾患の治療および診断法、医薬品、化粧品等への利用が期待される。
　エクソソームは、接着細胞から培養物中、特に、培養上清中に分泌される。また、エクソソームは、非接着細胞が細胞懸濁液中に存在する場合、非接着細胞から培養上清中または細胞懸濁液中に分泌される。接着細胞または非接着細胞に由来するエクソソームとしては、外胚葉性接着細胞または外胚葉性非接着細胞から得られるものであれば特に制限されない。例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース　３２３巻、２２５頁～２３９頁（２０２０年）に記載されているエクソソームが挙げられる。
　エクソソームは、分子量、大きさ、形状、組成または生物活性に基づいて単離することができる。具体的には、超遠心分離による沈降物の分取、密度勾配超遠心による分画の分取、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた分取、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓＴＭ　ＥＶ（ＢＩＡ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製）を用いた分取、タンパク質（例えば、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅＴＭ　エクソソームアイソレーションキット　ＰＳ（富士フイルム和光純薬株式会社））を用いた捕捉による分取、抗体を用いた捕捉による分取、ポリエチレングリコール等のポリマーを用いた沈澱物の分取などによって単離することができる。これらの方法は、１つまたは複数を組み合わせて実施することができる。
　エクソソームの性質は、細胞分泌物としてのエクソソームの製造方法において、エクソソームの活性を追跡するために使用し得る。例えば、エクソソームの活性は、静的光散乱、動的光散乱、紫外可視検出器、蛍光検出器または示差屈折率検出器を使用して確認することができる。
　純度よくエクソソームを得る観点から、エクソソームの単離または精製に際し、通常、得られた高増殖性細胞が含まれる培養用培地を、回収用培地に交換して、追加培養を行うことができる。回収用培地は、具体的には、培養上清回収用培地である。追加培養は、培養用培地による培養後に行う回収用培地による短時間の培養を意味する。追加培養の期間は、例えば６時間以上、１２時間以上、１８時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、または６０時間以上とすることができ、例えば、９６時間以下、または７２時間以下とすることができる。追加培養をすることによって、高増殖性細胞とは異なる起源に由来するエクソソームであって培養用培地に含まれ得るエクソソームの混入率を下げて、目的とする高増殖性細胞に由来するエクソソームの純度を上げることができる。
　回収用培地としては、例えば、血清無添加の培地およびエクソソーム除去処理済みの培地を挙げることができる。市販のエクソソーム除去処理済み培地としては、例えば、ＦＢＳ　ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ，ＯｎｅＳｈｏｔ　ｆｏｒｍａｔ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を挙げることができる。
　回収用培地を用いた場合には、追加培養後に、遠心分離を実施して、エクソソーム含有組成物として培養上清を分取し、必要に応じて、分取された培養上清を上述したエクソソームの単離または精製方法に供することによって、エクソソームを得ることができる。
＜５＞高増殖性細胞および細胞分泌物の用途
　一実施形態に係る高増殖性細胞から分離された細胞分泌物、例えば、上記のようにして分離または精製されたエクソソームは、種々の細胞種に対する種々の作用、例えば、神経突起伸長抑制作用、神経突起伸張作用、神経突起ネットワーク形成作用、神経細胞死予防作用および神経細胞増殖促進作用を有することが予想される。これらの機能に基づいて末梢神経細胞または中枢神経細胞に関係する障害に対する予防または治療用の医薬組成物としての有用性が期待される。
　例えば、高増殖性細胞から分離された細胞分泌物の神経突起伸張抑制作用は、末梢神経細胞の分化に関して、より未分化な細胞から末梢神経細胞、特に交感神経細胞への分化を抑制することができる。このため、本開示に係る細胞分泌物を末梢神経細胞に対して用いることによって、末梢神経系、特に交感神経系を抑制することが期待できる。また例えば、高増殖性細胞から分離された細胞分泌物を中枢神経細胞に対して用いることによって、その神経突起伸張作用、神経突起ネットワーク形成作用、神経細胞死予防作用および神経細胞増殖促進作用等に基づいて、中枢神経系を活性化することが期待できる。
　したがって、高増殖性細胞から分離された治療または予防としての有効量の細胞分泌物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物、ならびに、本医薬組成物を対象へ投与することを含む治療または予防方法も本開示の範囲に包含される。本明細書において「治療」との文言には、障害の根治だけでなく、緩和および寛解など、障害の症状の改善も含まれる。
　治療または予防対象の障害としては、末梢神経細胞または中枢神経細胞に関係する障害であればよく、例えば、がん、疼痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、統合失調症および痴呆症からなる群より選択される。末梢神経細胞、特に、交感神経細胞に関係する障害としては、例えば、交感神経細胞に関係するがん、疼痛等が挙げられる。中枢神経細胞に関係する障害は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、統合失調症および痴呆症からなる群より選択される。
　薬学的に許容可能な担体としては、特に制限はなく、当該分野で公知のものが使用され、例えば生理食塩水等が挙げられる。さらに、上記作用に関連して、高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物、具体的にはエクソソームを神経細胞、例えば交感神経細胞に接触させることを含む、交感神経系の抑制方法、神経突起の伸長抑制方法等も本開示の範囲に包含される。
　本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値または下限値は、他の段階の数値範囲の上限値または下限値と任意に組み合わせることができる。
　本開示は、以下の日本国特許出願に基づくものであって、当該日本国特許出願による優先権の利益を享受するものである。また、以下の日本国特許出願の全体の内容が参照により本開示に組み入れられる：
　「高増殖性細胞の製造方法、高増殖性細胞およびその用途」と題して２０２１年７月２９日に提出された日本国特許出願第２０２１－１２４１７２。
　本開示に記載されたすべての文献、特許出願、および技術規格は、参照によりその全体が本開示に組み入れられる。
　実施例１：阻害剤添加培地によるヒトアストロサイトの長期培養
　以下に示す材料および試薬、培養用製品を用いて、ヒトアストロサイトの長期培養を行った。
　＜材料＞
　・Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ（ＮＨＡ）（ＣＣ－２５６５、Ｌｏｎｚａ）
　＜使用試薬および培養用製品＞
　・培養用培地：ＡＧＭ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ＣＣ－３１８６、Ｌｏｎｚａ）（ＡＧＭの組成：基礎培地、ＦＢＳ（３％（ｖ/ｖ））、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、インスリン、抗生物質）、
　・阻害剤Ｙ：ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２（０３４－２４０２４、富士フイルム和光純薬株式会社）、終濃度：１０μＭ、
　・阻害剤Ａ：ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１（０３５－２４１１３、富士フイルム和光純薬株式会社）、終濃度：０．５μＭ、
　・細胞剥離剤：Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＡＴ１０４、ＩＣＴ）、
　・細胞用緩衝液：リン酸緩衝塩水溶液（ダルベッコ；カルシウムおよびマグネシウム不含）（ＢＮＤＳＢＮ２００、ＫＡＣ）、
　・細胞凍結用培地：ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　１（ＣＢ０１１ ＴａＫａＲａ（日本全薬工業株式会社））、
　・細胞培養用ディッシュ　６０ｍｍ（１５０４６２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、
　・細胞培養用ディッシュ　１００ｍｍ（１５０４６６、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、
　・細胞培養用ディッシュ　１５０ｍｍ（１５０４６８、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、
　・Ｓｔｅｒｉｃｕｐ　Ｑｕｉｃｋ　Ｒｅｌｅａｓｅ－ＧＰ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｖａｃｕｕｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓ２ＧＰＵ０２ＲＥ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、
　・培養上清回収用阻害剤非含有培地：ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｃ１１９９５５００ＣＰ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＮ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（１７５０２－０４８、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
　＜長期培養の手順＞
　長期培養は下記の手順に従って行った。ヒトアストロサイト細胞（ＮＨＡ）の凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。次いで、溶解後の細胞を計１０ｍＬになるよう培養用培地に移し、１８０×ｇ、３分間、室温で遠心分離に供した後、培地を除去した。細胞を阻害剤Ｙのみ添加群（以下、ＮＨＡ－Ｙ群）、阻害剤Ａのみ添加群（以下、ＮＨＡ－Ａ群）、阻害剤Ｙ＋阻害剤Ａ添加群（以下、ＮＨＡ－ＹＡ群）、無添加群（Ｎｏｒｍａｌ群）の４群に分けて、再度、培養用培地に懸濁し、６ウェルプレート（細胞培養用マルチディッシュ　６　ｗｅｌｌ（１４０６７５、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。以下、省略）へ４．２×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。翌日、培地を、表２に記載のとおりに各群に対して各阻害剤含有（または非含有）培養用培地（各阻害剤の濃度は、上述のとおり）に交換し、培養を継続させた。培養期間中、顕微鏡による細胞の観察と写真撮影を行った。
　培地交換は、１日または２日おきにとし、それぞれ阻害剤含有（または非含有）の新鮮な培養用培地に交換した。８０～９０％コンフルエントに達したあたりで細胞剥離剤を用いて細胞を剥がし、各阻害剤含有（または非含有）培養用培地に懸濁して、６ウェルプレートへ４．２×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で継代した。継代を交えながら４１日間、各阻害剤含有（または非含有）培養用培地で培養を行った。
　各群の細胞の継代回数と最終継代日までの日数を下記表１に、培養日数と総細胞数との関係を表２に、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示されるとおり、Ｎｏｒｍａｌ群では、阻害剤接触後２２日間経過後に増殖が停止したが、ＮＨＡ－ＹＡ群では、最大阻害時接触後３７日間、細胞の増殖が継続したことがわかった。さらに、表２からわかるとおり、増殖によって得られた細胞数についても、ＮＨＡ－ＹＡ群の細胞数は、Ｎｏｒｍａｌ群の細胞数の約４００倍であった。全ての実験群において、最終継代日以降、培地交換しながら培養開始後４１日目まで観察し続けた。培養開始後４１日目の細胞形態（１００倍に拡大）を図１に示す。なお、図１において「Ｐ」は継代数を示し、例えば「Ｙ－Ｐ５」とは、５継代細胞であって、阻害剤Ｙを含む培地を用いて培養された細胞群であることを意味する。
　実施例２：培養上清中のエクソソームの回収および確認
　＜ヒトアストロサイト細胞の培養上清の回収＞
　以下の手順に沿って、ＹＡ含有培養用培地または阻害剤非含有培地を用いてヒトアストロサイト細胞を培養したときの培養上清をそれぞれ回収した。
　（１）ＹＡ含有培養用培地でのヒトアストロサイト細胞の培養における培養上清回収
　凍結しておいたヒトアストロサイト細胞を、実施例１と同様に、融解して一度培地でウォッシュ後、細胞を培養用培地に再度懸濁し、６０ｍｍ細胞培養用ディッシュに、３．５×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。翌日、ＹＡ含有培養用培地で培地交換し、培養を継続させた。８０～９０％コンフルエントに達したあたりで細胞剥離剤を用いて細胞を剥がし、ＹＡ含有培養用培地に懸濁して１００ｍｍ細胞培養用ディッシュへ３．５×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で継代した。ＹＡ含有培養用培地で培養された細胞群を、実施例１と同様に、ＮＨＡ－ＹＡ群と称する。
　ＮＨＡ－ＹＡ群について、５回継代し、計６０日ＹＡ含有培養用培地で培養してかなりの細胞数が確保できたため、１５０ｍｍ細胞培養用ディッシュへ８×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。このとき播種した細胞数は１ディッシュあたり１．１６×１０６細胞であり、ディッシュを６枚使用したため、播種総細胞総数は６．９６×１０６細胞であった。
　翌日、培地をＹＡ含有培養用培地から回収用培地に、２０ｍｌ／１５０ｍｍディッシュの容量で交換し、追加培養を開始した。なお、回収用培地として、ＹＡ含有培養用培地からＦＢＳのみを除いた培地を用いた。追加培養開始の２日後に、ディッシュから追加培養の培養上清を回収してチューブに移し、２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した後、０．２２μｍフィルターシステムでろ過し、４℃で保存した。培養上清回収後のディッシュ上に残った細胞を、細胞剥離剤を用いて剥がし、細胞数をカウントしたところ、ＮＨＡ－ＹＡ群として得られた総細胞数は５．１０×１０６細胞であり、播種総細胞総数に対する残存率は７３．３％であった。
　（２）阻害剤非含有培養用培地（対照）中でのヒトアストロサイト細胞の培養における培養上清回収
　凍結しておいたヒトアストロサイト細胞を、実施例１と同様に、融解して一度培地でウォッシュ後、細胞を培養用培地に再度懸濁し、６０ｍｍ細胞培養用ディッシュへ３．５×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。阻害剤を含まない培養用培地で培養された細胞群を、実施例１と同様に、Ｎｏｒｍａｌ群と称する。
　Ｎｏｒｍａｌ群について、２回継代し、計２６日間阻害剤を含まない培養用培地で培養し、１５０ｍｍ細胞培養用ディッシュへ８×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。このとき播種した細胞数は１ディッシュあたり１．１６×１０６細胞であり、ディッシュを２枚使用したため、播種総細胞総数は２．３２×１０６細胞であった。
　翌日、培地を培養用培地から、ＤＭＥＭにＮ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを加えた回収用培地に、２０ｍｌ／１５０ｍｍディッシュの容量で交換して追加培養を開始した。追加培養開始の２日間後に、ディッシュから追加培養の培養上清を回収してチューブに移し、２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した後、０．２２μｍフィルターシステムでろ過し、４℃で保存した。培養上清回収後のディッシュ上に残った細胞を、細胞剥離剤を用いて剥がし、細胞数をカウントしたところ、Ｎｏｒｍａｌ群として得られた総細胞数は８．２５×１０５細胞であり、播種総細胞総数に対する残存率は３５．６％であった。上清を２０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心した後、０．２２μｍフィルターシステムでろ過し、４℃で保存した。回収用培地に交換する前後の細胞形態を図２に示す。
　＜培養上清中の細胞数、粒子数および粒径分布の測定＞
　上記で回収されたＮｏｒｍａｌ群およびＮＨＡ－ＹＡ群それぞれの追加培養の培養上清を、細胞用緩衝液（使用前に０．２２μｍフィルターでろ過したもの）で５倍希釈した後、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）により、粒子数と粒径分布を確認した。ブランクとして、細胞用緩衝液中の粒子数も測定し、各培養上清の測定値から細胞用緩衝液中の粒子数を減算することによって、培養上清中の粒子数を計算した。粒子数と粒径分布の確認はそれぞれ２回行った。回収された追加培養の培養上清に含まれる粒子の粒子数と粒子サイズの一例を表３に、粒径分布を図３Ａおよび図３Ｂにそれぞれ示す。なお図３Ａおよび図３Ｂにおいて、粒子数（１０６個／ｍＬ）を縦軸に示し、粒子サイズ（ｎｍ）を横軸に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３および図３Ｂから明らかなように、ＮＨＡ－ＹＡ群の培養上清中には、粒径１００ｎｍ～２００ｎｍに複数のピークが確認でき、エクソソームが含まれていることがわかった。また、ＮＨＡ－ＹＡ群の培養上清中に含まれるエクソソームの量は、Ｎｏｒｍａｌ群と比較して多いことも確認できた。その後、タンジェンシャルフローフィルトレーション、限外ろ過等の精製方法によって、後述するように、粒径１００ｎｍ～２００ｎｍのピークの粒子を単離または精製することができた。
　実施例３－１：定量ＰＣＲによる外胚葉性細胞マーカーの確認（１）
　実施例１の培養に出発材料として用いたアストロサイトの細胞群と、得られた外胚葉性細胞集団について、以下の外胚葉性細胞マーカー遺伝子について発現量を検討した。以下に記載したＮＣＢＩのデータベースであるＲｅｆＳｅｑのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号で登録されている配列を元に検出用プライマーを作製した。
　・Ｎｏｔｃｈ１（ｖＸ１も含む）(ＮＭ＿０１７６１７)
　・Ｎｅｓｔｉｎ（ＮＭ＿００６６１７）
　・ＳＯＸ２（ＳＲＹ－ｂｏｘ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　２）（ＮＭ＿００３１０６）
　・Ｓ１００Ｂ（Ｓ１００　ｃａｌｃｉｕｍ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂ）（ＮＭ＿００６２７２）
　・ＮＧ２（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　４）（ＮＭ＿００１８９７）
　・ＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｖ１．ｖ４，ｖＸ１，ｖＸ３）（ＮＭ＿００２０５５）
　＜ｃＤＮＡの合成＞
　以下のサンプルより常法に従ってＲＮＡを抽出し、当該ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。ＲＮＡ試料の調製および反応条件の設定は、製品添付のプロトコールにしたがった。
サンプル：
　・Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ（ＮＨＡ）（購入した初代細胞を起眠して増殖させ凍結したものを、再び起眠し４日間培養したもの。継代なし。)、
　・ＮＨＡ－ＹＡ（購入した初代細胞を起眠して増殖させ凍結したものを、再び起眠しＹＡを含む培地で２８日間培養した後凍結したものを、再々起眠しＹＡを含む培地で１４日間培養したもの。
１４日間の培養期間中、１回継代した。）
　試薬：Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（アプライド・バイオシステムズ）、
　機器：ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（アプライド・バイオシステムズ）
　＜定量ＰＣＲ＞
　作製した検出用プライマーを下記表４に示す。これらプライマーを用いて、定量ＰＣＲによって外胚葉性細胞マーカー遺伝子の発現を検討した。ＲＮＡ試料の調製および反応条件の設定は、製品添付のプロトコールに従った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　試薬：Ｐｌａｔｉｎｕｍ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ｑＰＣＲ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧ（インビトロジェン）、
　機器：ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（アプライド・バイオシステムズ）
　定量ＰＣＲによる、神経上皮細胞のマーカーであるＮｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ２の各マーカーならびに放射状グリア細胞のマーカーであるＮｅｓｔｉｎの各マーカーの発現確認結果、および、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂならびにオリゴデンドロサイト前駆体細胞のマーカーであるＮＧ２の発現確認結果を、それぞれ、表５および表６に示す。
　表５および表６では、ＮＨＡ－ＹＡでの各マーカー遺伝子の発現量（コントロール遺伝子に対する発現量）を、ＮＨＡでの各発現量を「１」としたときの相対値として示した。表５は、コントロール遺伝子としてＡＣＴＢ遺伝子を用いた場合の各マーカーの発現量を、表６は、コントロール遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた場合の各マーカーの発現量を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５および表６に示されるように、得られた細胞集団（ＮＨＡ－ＹＡ）においては、原料として用いたアストロサイト（ＮＨＡ）と比較して、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰおよびＳ１００Ｂとオリゴデンドロサイト前駆体細胞のマーカーであるＮＧ２との双方において、より高い発現が認められた。
　これらの結果から、得られた細胞集団（ＮＨＡ－ＹＡ）は、成熟細胞であるアストロサイトの特徴と前駆細胞であるオリゴデンドロサイト前駆細胞の特徴とを兼ね備え、アストロサイトよりも高い増殖能を有する細胞であることがわかった。このＮＨＡ－ＹＡは、アストロサイトよりも短時間でより多く増殖することができる。また、短時間でより多くのエクソソームを得るには、ＮＨＡ－ＹＡを用いることが有利であることがわかる。
　実施例３－２：定量ＰＣＲによる外胚葉性細胞マーカーの確認（２）
　実施例１の培養に出発材料として用いたアストロサイトの細胞群と、得られた外胚葉性細胞集団について、実施例３－１と同様にして、以下の外胚葉性細胞マーカー遺伝子の発現量を定量ＰＣＲによって測定した。各マーカー遺伝子の検出用プライマーは、以下に記載したＮＣＢＩのデータベースであるＲｅｆＳｅｑのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号で登録されている配列を元に作製した。
　・ＳＬＣ１Ａ２（ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　１　ｍｅｍｂｅｒ　２）（ｖ１、ｖ２、ｖ３、ｖＸ１～ｖＸ７も含む）（ＮＭ＿００４１７１）
　・ＳＬＣ１Ａ３（ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　１　ｍｅｍｂｅｒ　３）（ｖ１～ｖ５、ｖＸ１、ｖＸ２、ｖＸ３）（ＮＭ＿００４１７２）
　・ＯＬＩＧ２（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　２）（ＮＭ＿００５８０６）
　・ＰＡＸ６（ｐａｉｒｅｄ　ｂｏｘ　６）（ｖ１～ｖ４８）（ＮＭ＿０００２８０）
　・ＡＬＤＨ１Ｌ１（ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　１　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　Ｌ１）（ｖ１、ｖ２、ｖ３、ｖＸ１，ｖＸ２，ｖＸ３）（ＮＭ＿００１２７０３６４）
　・Ｍｕｓａｓｈｉ１（ｍｕｓａｓｈｉ　ＲＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１；ＭＳＩ１）（ｖ１、ｖＸ１～ｖＸ１０）（ＮＭ＿００２４４２）
　作製した検出用プライマーを下記表７に示す。これらプライマーを用いて、定量ＰＣＲによって外胚葉性細胞マーカー遺伝子の発現を検討した。ＲＮＡ試料の調製および反応条件の設定は、製品添付のプロトコールに従った。なお、定量ＰＣＲの測定機器としては、Ｍｕｓａｓｈｉ１については、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（アプライド・バイオシステムズ）またはＣＦＸ９６　Ｔｏｕｃｈ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド）を使用し、その他のマーカー遺伝子については、実施例３－１で使用したのと同じ測定機器を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　結果を表８および表９に示す。表８および表９では、ＮＨＡ－ＹＡでの各マーカー遺伝子の発現量（コントロール遺伝子に対する発現量）を、ＮＨＡでの各発現量を「１」としたときの相対値として示した。表８は、コントロール遺伝子としてＡＣＴＢ遺伝子を用いた場合の各マーカーの発現量を、表９は、コントロール遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた場合の各マーカーの発現量を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例４：ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのプロテオーム解析
＜ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームの回収＞
　ＮＨＡを含有する細胞培養液が保管された凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。次いで、溶解後の細胞を計１０ｍＬになるようＹＡ含有培養用培地に移し、１８０×ｇ、３分間、２５℃で遠心分離に供した後、培地を除去した。得られたＮＨＡをＹＡ含有培養用培地に懸濁させ、６ウェルプレートへ４．２×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で継代した。２回の継代を交えながら１１日間、ＹＡ含有培養用培地で培養を行った。
　その後、培地をＹＡ含有培養用培地から回収用培地に、２０ｍＬ／１５０ｍｍディッシュの容量で交換し、追加培養を３７℃で７２時間行った。回収用培地として、ＹＡ含有培養用培地中のＦＢＳの代わりにエクソソームが除去されたＦＢＳ［３％（ｖ／ｖ）］を含有する培地を使用した。追加培養は１．１６×１０５細胞／１５０ｍｍディッシュの播種密度で行った。追加培養後、ディッシュから追加培養の培養上清を回収してチューブに移し、２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した後、０．２２μｍフィルターシステムでろ過し、エクソソーム含有溶液を調製した。
＜エクソソームのプロテオーム解析１＞
　上記で得たエクソソーム含有溶液をトリクロロ酢酸で沈殿処理し、次いで、５ｍＭ　ジチオステイトールのＴｒｉｓ緩衝液溶液を加え、３５℃、２時間の還元処理を行った。還元後のサンプルに、１４ｍＭ　ヨードアセトアミドのＴｒｉｓ緩衝液溶液を加え、遮光条件下、２５℃、３０分間反応を行った。次いで、トリプシン処理を３７℃で、２０時間行い、エクソソームを分解した。得られたエクソソームの分解物を陽イオン交換カラムにて溶媒置換した後、脱塩および濃縮し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。ＨＰＬＣ装置にはＥＡＳＹ－ｎＬＣ　１２００　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を、カラムには、ＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ　ｃｏｌｕｍｎ、１５ｃｍ×７５μｍＩＤ、３μｍ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、１００Å　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られたスペクトルのプロダクトイオン測定データを元に、ＭＡＳＣＯＴ　ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）を用いてデータベース検索を行った。続いて、得られた結果を以下の２つのデータベースに照らし合わせて、エクソソーム画分と培地成分とを合わせて合計１７９８種類のタンパク質断片を検出した。
・ヒト由来タンパク質：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（配列数２０３７６）
・ウシ由来タンパク質：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（配列数４７０４３）
　エクソソーム画分のＳｗｉｓｓＰｒｏｔ上で検出された全１２８５個のマーカタンパク質からＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｖａｌｕｅ（検出されたスペクトル数。補正あり。）が５以上のものを選出し、５２０個のマーカタンパク質を抽出した。抽出した５２０個のタンパク質の中から、特徴的なタンパク質を選出し、選出したタンパク質が培地中の成分ではないことを確認すると共に、ウシ由来タンパク質であった場合には、ヒト由来タンパク質での同定確率を検討し、同定確率が高いものを選出した。以下に、特徴的なタンパク質の選出ステップについて述べる。
ａ：　大脳に特徴的なタンパク質の選出ステップ
（ａ１）　上記で抽出した５２０個のタンパク質をＴｉｓｓｕｅ　Ｅｎｒｉｃｈ（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｉｓｓｕｅｅｎｒｉｃｈ．ｇｄｃｂ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ）で検索した。ここで、Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｔｌａｓのデータセット、および組織特異的遺伝子の全てを検索対象とした；
（ａ２）　大脳に特異的な遺伝子を２２個選出した；
（ａ３）　上記（ａ２）で選出した２２個の遺伝子のうち、培地サンプルで検出されなかった遺伝子を１２個選出した；
（ａ４）　上記（ａ３）で選出した１２個の遺伝子のうち、ヒトタンパク質である可能性が高い遺伝子を８個選出した；
（ａ５）　上記（ａ４）で選出した８個の遺伝子のうち、疾患との関連が高い遺伝子を５個選出した。
　上記ステップ（ａ１）～（ａ５）により選出された５個の遺伝子がコードするタンパク質を図４に記す。
ｂ：　膜タンパク質、細胞外領域等に特徴的なタンパク質の選出ステップ
（ｂ１）　上記で抽出した５２０個のタンパク質のうち、Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｖｉｅｗｅｒのＧＯで「ｍｅｍｂｒａｎｅ」に括られているタンパク質として４０９個のタンパク質を選出した；
（ｂ２）　上記で抽出した５２０個のタンパク質のうち、Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｖｉｅｗｅｒのＧＯで「ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｇｉｏｎ」に括られているタンパク質として４４３個のタンパク質を選出した；
（ｂ３）　上記で抽出した５２０個のタンパク質のうち、Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｖｉｅｗｅｒのＧＯで「ｍｅｍｂｒａｎｅ」と「ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｇｉｏｎ」のいずれにも括られていないタンパク質として１５個のタンパク質を選出した；
（ｂ４）　上記ステップ（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）で抽出したタンパク質のうち、培地サンプルに含まれていないタンパク質として３５個のタンパク質を選出した。選出した３５個のうち、１４個については、下記のステップ（ｃ１）～（ｃ３）により選出されたタンパク質と重複する。
　上記ステップ（ｂ１）～（ｂ４）により選出された３５個のタンパク質を図４に記す。
＜エクソソームのプロテオーム解析２＞
　上記選出ステップａおよび選出ステップｂとは異なる選出ステップｃで特徴的なタンパク質を選出した。
ｃ：　特徴的なタンパク質の選出ステップ
（ｃ１）　ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＿Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓとＵｎｉＰｒｏｔＫＢ＿Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓとを合わせた、全１５６２個の配列からエクソソーム画分のＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｖａｌｕｅが２０以上のものを１０３個選出した；
（ｃ２）　上記（ｃ１）で選出した１０３個の配列の中で、培地サンプルでのＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｖａｌｕｅが１０以下のものを６５個選出した；
（ｃ３）　上記ステップ（ｃ２）で選出した６５個の配列について、論文検索サイトＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により中枢神経疾患と関連するもの、または脳、神経細胞の増殖、発生、分化、形態形成、移動、代謝などに関与していることが推定されるものを２０個選出した。選出した２０個のうち、１４個については、上記ステップ（ｂ１）～（ｂ４）により選出されたタンパク質と重複する。
　上記ステップ（ｃ１）～（ｃ３）により選出された２０個のタンパク質を図４に記す。
　上記選出ステップａ～ｃによって、合計４６個のタンパク質を選出することができた（図４参照）。
　実施例５：ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームのｍｉＲＮＡ解析
＜ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームの回収＞
　ＮＨＡを含有する細胞培養液が保管された凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。次いで、溶解後の細胞を計１０ｍＬになるようＹＡ含有培養用培地に移し、１８０×ｇ、３分間、２５℃で遠心分離に供した後、培地を除去した。得られたＮＨＡをＹＡ含有培養用培地に懸濁させ、６ウェルプレートへ４．２×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で継代した。４回の継代を交えながら４７日間、ＹＡ含有培養用培地で培養を行った。
　その後、培地をＹＡ含有培養用培地から回収用培地に、２０ｍＬ／１５０ｍｍディッシュの容量で交換し、追加培養を３７℃で４８時間行った。回収用培地として、実施例４で用いた回収用培地を使用した。追加培養は１．１６×１０６細胞／１５０ｍｍディッシュの播種密度で行った。追加培養後、ディッシュから追加培養の培養上清を回収してチューブに移し、２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した後、０．２２μｍフィルターシステムでろ過し、エクソソーム含有溶液を調製した。
＜ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームからのＲＮＡの抽出＞
　上記で得られたエクソソーム含有溶液２０５ｍＬを、超遠心機Ｏｐｔｉｍａ　ＸＥ－９０（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、２５０，０００×ｇ、７０分間、４℃で遠心分離に供した後、上清を除去し、エクソソーム画分を得た。次いで、ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（２１７００４、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、得られたエクソソーム画分からＲＮＡを抽出した。その結果、エクソソーム画分２３０μＬからトータルＲＮＡ４１．８ｎｇを回収した。
＜ＲＮＡ解析＞
　上記で得られたＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ　ＲＮＡ　６０００　ｐｉｃｏ　ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡｇｉｌｅｎｔ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ　ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによりクオリティーチェックを行った。クオリティーチェック後、ディレクショナル（Ｓｔｒａｎｄｅｄ）用ＲＮＡライブラリー調製キット、ＮＥＢＮｅｘｔ　Ｕｌｔｒａ　ＩＩ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｉｌｌｕｍｉｎａを用いて、上記で得られたトータルＲＮＡからＲＮＡライブラリーを調製した。調製したＲＮＡライブラリーを用いてｍＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行い、６５３８個のｍＲＮＡを検出した。
　同様にｍｉＲＮＡライブラリー調製キット、ＱＩＡｓｅｑ　ｍｉＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、およびＱＩＡｓｅｑ　ｍｉＲＮＡ　ＮＳＧ　９６　Ｉｎｄｅｘ　ＩＬ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、上記で得られたトータルＲＮＡからｍｉＲＮＡライブラリーを調製した。調製したｍｉＲＮＡライブラリーを用いてｍｉＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行い、３７０個のｍｉＲＮＡを検出した。
　シークエンスライブラリーのクオリティーチェックはＨｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ＤＮＡ　ｋｉｔ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより行った。
　ＮＧＳはＮｅｘｔＳｅｑ５００、Ｉｌｌｕｍｉｎａを用いて行った（シングルエンド、７５ｂｐ、平均リード数約１，０００万リード）。
　シーケンス後のデータは、リードの品質評価（ＦａｓｔＱＣ）を行った後、ＧｅｎｅＧｌｏｂｅ：Ｄａｔａ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）にてリファレンスゲノム（Ｈｕｍａｎ　ｈｇ３８）にアライメント（マッピング）し、Ｔｒｉｍｍｅｄ　ｍｅａｎ　ｏｆ　Ｍ　ｖａｌｕｅｓ（ＴＭＭ）で発現量を正規化し、各ｍｉＲＮＡのアノテーション情報とＳｍａｌｌ　ＲＮＡ組成の分類集計を含むＥｘｃｅｌ形式のファイルを作成した（解析ツール：ＳｔｒａｎｄＮＧＳ　ｖ４．０、Ｒ　ｖ３．６．２；アノテーション情報：ｍｉＲＢａｓｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ２１準拠）。その後、データ解析として発現変動遺伝子抽出後、ターゲット遺伝子予測からのＧＯ解析、およびＰａｔｈｗａｙ解析を実施した。
＜機能的マーカーｍｉＲＮＡの選出＞
１．パーキンソン病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ
　以下の文献を参照し、パーキンソン病のヒト脳組織で発現が低下しているｍｉＲＮＡを４２個選出した。当該ｍｉＲＮＡを含有するエクソソームをパーキンソン病患者の細胞に投与することにより、パーキンソン病患者において、外因性に当該ｍｉＲＮＡの機能が補完され、パーキンソン病の治療効果が期待される。
文献：ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｉｎ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔｓ．　Ｎｅｕｒａｌ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１２（１２），　ｐｐ．１９４５－１９５９　（２０１７）
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを１６個選出した。選出した１６個のｍｉＲＮＡを図５に示す。
２．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ
　ＩＭＯＴＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ－ｗｅｂ．ｃｓ．ｕｎｉ－ｓａａｒｌａｎｄ．ｄｅ／ｉｍｏｔａ／）を用いて、アルツハイマー病の病態に関連するタンパク質、特にアルツハイマー病治療薬の薬理作用に寄与する複数のタンパク質と関連することが知られる下記のタンパク質と関連付けられるｍｉＲＮＡを選抜した。
２－１．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ（１）
　ＩＭＯＴＡを用いて、大脳皮質においてアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）と関連付けられるｍｉＲＮＡを７０個選出した。ＡＰＰは、アルツハイマー病発症の原因の一つに上げられる老人斑、すなわち、アミロイドβタンパクの沈着物の主要構成成分である。
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを２３個選出した。選出した２３個のｍｉＲＮＡを図６に示す。
２－２．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ（２）
　ＩＭＯＴＡを用いて、大脳皮質においてＢＡＣＥ１（β－ｓｉｔｅ　ＡＰＰ　ｃｌｅａｖｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）と関連付けられるｍｉＲＮＡを４２個選出した。アルツハイマー病発症時ＢＡＣＥ１はＡＰＰのＮ末端部分を切断することにより、異常なアミロイドβタンパクを産生する。
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを２０個選出した。選出した２０個のｍｉＲＮＡを図７に示す。
２－３．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ（３）
　ＩＭＯＴＡ　（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ－ｗｅｂ．ｃｓ．ｕｎｉ－ｓａａｒｌａｎｄ．ｄｅ／ｉｍｏｔａ／）を用いて、大脳皮質においてＮＭＤＡ受容体（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と関連付けられるｍｉＲＮＡを６６個選出した。アルツハイマー病発症時、脳内に異常なタンパク質が蓄積することで、神経を興奮させる物質が過剰に放出される。この興奮物質によりＮＭＤＡ受容体が過剰に活性化されることで、神経伝達や記憶が障害される。
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを２７個選出した。選出した２７個のｍｉＲＮＡを図８に示す。
２－４．アルツハイマー病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ（４）
　ＩＭＯＴＡ　（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ－ｗｅｂ．ｃｓ．ｕｎｉ－ｓａａｒｌａｎｄ．ｄｅ／ｉｍｏｔａ／）を用いて、大脳皮質においてグルコーゲン合成酵素キナーゼ－３－β（ＧＳＫ－３β：Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ－３β）と関連付けられるｍｉＲＮＡを５８個選出した。ＧＳＫ－３βは、様々な蛋白質をリン酸化する酵素で，複数のパスウェイ制御を介して細胞の生命維持や生理機能の調節に多様な働きをしている。アルツハイマー病においては脳内でのアミロイドβタンパクの沈着や神経細胞中にタウタンパク質の蓄積を促進する。その結果として神経細胞のアポトーシスを誘発する。
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを２４個選出した。選出した２４個のｍｉＲＮＡを図９に示す。
３．うつ病マーカーとしてのｍｉＲＮＡ
　以下の文献を参照し、うつ病の個人における血漿中で発現が低下しているｍｉＲＮＡを２４個選出した。当該ｍｉＲＮＡを含有するエクソソームをうつ病患者の細胞に投与することにより、うつ病患者において、外因性に当該ｍｉＲＮＡの機能が補完され、うつ病の治療効果が期待される。
文献：ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐａｔｈｗａｙｓ：Ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅｖｉｅｗ　ａｎｄ　ａ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ　１００　（２０１９）　１０１６５０）
　次いで、この中から、ＮＨＡ－ＹＡ由来のエクソソームｍｉＲＮＡとして検出されるｍｉＲＮＡを１３個選出した。選出した１３個のｍｉＲＮＡを図１０に示す。
　実施例６：ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームによるＰＣ－１２細胞の神経突起伸長抑制試験
　ＮＨＡ－ＹＡ由来エクソソームによる機能性評価試験として、ラット副腎褐色細胞腫由来細胞株、ＰＣ－１２細胞（ＲＣＢ０００９、ＲＩＫＥＮ　Ｂａｎｋ）に対する神経突起伸長抑制試験を行った。コントロールとしては、実施例１で使用したＮＨＡ細胞に由来するエクソソームを用いた。
＜試薬および培養用製品＞
　以下の試薬および培養用製品を使用した。
・増殖用培地：
組成：基礎培地、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ、１０％（ｗ／ｖ）ＨＳ、抗生物質、
　基礎培地：ＤＭＥＭ，ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ，ｐｙｒｕｖａｔｅ（１１９９５－０７３；Ｇｉｂｃｏ）、
　ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ，ｑｕａｌｉｆｉｅｄ，Ｂｒａｚｉｌ（１０２７０－１０６；Ｇｉｂｃｏ）、
　ＨＳ：Ｈｏｒｓｅ　Ｓｅｒｕｍ，ｈｅａｔ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　ｏｒｉｇｉｎ（２６０５０－０８８；Ｇｉｂｃｏ）、
　抗生物質：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ）（１５２４０－０６２；Ｇｉｂｃｏ）
・細胞剥離剤１：Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＡＴ１０４、ＩＣＴ）、
・細胞剥離剤２：ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｘ），フェノールレッド非含有（１２６０４－０１３、Ｇｉｂｃｏ）、
・細胞用緩衝液：リン酸緩衝塩水溶液（ダルベッコ；カルシウムおよびマグネシウム不含）（ＢＮＤＳＢＮ２００、ＫＡＣ）、
・アッセイ用培地：
　組成：基礎培地、添加剤、抗生物質、
　　　基礎培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ（１２４９１－０１５、Ｇｉｂｃｏ）、
　　　添加剤：ＧｌｕｔａＭＡＸ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）（３５０５０－０６１、Ｇｉｂｃｏ）、
　　　抗生物質：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ）（１５２４０－０６２、Ｇｉｂｃｏ）、
・陽性コントロール試薬：ラット由来神経成長因子（ＮＧＦ）－β（Ｎ２５１３－．１ＭＧ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、
・培養用培地：ＡＧＭ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ＣＣ－３１８６、Ｌｏｎｚａ）（ＡＧＭの組成：基礎培地、ＦＢＳ（３％（ｖ/ｖ））、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、インスリン、抗生物質）（実施例１で使用したのと同じもの）、
・阻害剤Ｙ：ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ｙ－２７６３２（０３４－２４０２４、富士フイルム和光純薬株式会社）、終濃度：１０μＭ（実施例１で使用したのと同じもの）、
・阻害剤Ａ：ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ－８３－０１（０３５－２４１１３、富士フイルム和光純薬株式会社）、終濃度：０．５μＭ（実施例１で使用したのと同じもの）、
・エクソソーム除去ウシ血清：Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｄｅｐｌｅｔｅｄ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ　Ｏｎｅ　ｓｈｏｔ（Ａ２７２０８０３、Ｇｉｂｃｏ）、
・０．２２μｍフィルターシステム：Ｓｔｅｒｉｃｕｐ　Ｑｕｉｃｋ　Ｒｅｌｅａｓｅ－ＧＰ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｖａｃｕｕｍ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓ２ＧＰＵ０２ＲＥ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、
・培養上清回収用培地：ＡＧＭ　Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ＣＣ－３１８６、Ｌｏｎｚａ）中の成分であるウシ血清（ＦＢＳ）の代りに３％（ｗ／ｖ）のエクソソーム除去ウシ血清（Ａ２７２０８０３；Ｇｉｂｃｏ）が添加されたもの、
・９６ウェルプレート：コラーゲンＩコート９６ウェルプレート（４８６０－０１０、ＩＷＡＫＩ）、
・細胞培養用フラスコ　Ｔ－７５（４３０６４１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）、
・細胞培養用ディッシュ　１００ｍｍ：１５０４６６、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（実施例１で使用したのと同じもの）、
・細胞培養用ディッシュ　１５０ｍｍ：１５０４６８、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（実施例１で使用したのと同じもの）。
＜評価用サンプルの調製＞
　下記の手順に従い、以下の評価用サンプルを調製し、神経突起伸長抑制試験に使用した。
（１）対照培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ））：培養上清回収用培地を超遠心分離して得られたもの。
（２）ＮＨＡ　ＡＧＭ　Ｐ６：６回継代目のＮＨＡの培養上清を超遠心分離して得られたもの。
（３）ＮＨＡ－ＹＡ　Ｐ６：６回継代目のＮＨＡ－ＹＡの培養上清を超遠心分離して得られたもの。
上記（２）および（３）は、エクソソーム量の最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようアッセイ用培地に添加して調製した。また、上記（１）～（３）の各評価用サンプルの調製に際して使用した超遠心分離は、超遠心機（本体：Ｏｐｔｉｍａ　ＸＥ－９０、ローター：ＳＷ４１　Ｔｉ；ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して２５０，０００×ｇ、７０分間、４℃の条件で行った。
＜培養上清中のエクソソームの回収および確認＞
　以下に示す材料、試薬、および培養用製品を用いて、ＹＡ含有培養用培地または阻害剤非含有培地を用いてヒトアストロサイト細胞を培養したときの培養上清をそれぞれ回収した。
１．材料
　ＮＨＡとして、実施例１で使用したのと同じ材料を使用した。
２．ヒトアストロサイト細胞の培養上清の回収
　培養上清の回収は以下の手順に沿って行った。ヒトアストロサイト細胞（ＮＨＡ）の凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。次いで、溶解後の細胞を計１０ｍＬになるよう培養用培地に移し、１８０×ｇ、３分間、室温で遠心分離に供した後、培地を除去した。細胞を培養用培地に懸濁し、Ｔ－７５培養用フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へ１．２５×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。その後、３７℃で約１２時間培養を行い、細胞を接着させた後、培地を「阻害剤Ｙ＋阻害剤Ａ添加群（以下、ＮＨＡ－ＹＡ群）」および「無添加群（ＮＨＡ群）」のいずれかの培養用培地（各阻害剤の濃度は、上述のとおり）に交換し、培養を継続させた。
　培地交換は、１日または２日おきとし、それぞれ阻害剤含有（または非含有）の新鮮な培養用培地に交換した。７日間培養後、細胞剥離剤１を用いて細胞（継代数：１）を剥がし、阻害剤含有培養用培地、すなわちＹＡ含有培養用培地、および阻害剤非含有培養用培地の各培地に懸濁して、１５０ｍｍ細胞培養ディッシュへ３．３×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で継代培養した。９日間培養後、同様の方法で、１５０ｍｍ細胞培養ディッシュへ３．３～６．６×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で５日間培養の継代を繰り返し、全５回の継代培養を合計３１日間かけて行った。実施例１と同じくＹＡ含有培養用培地で培養された細胞群をＮＨＡ－ＹＡ群、阻害剤非含有培養用培地で培養された細胞群をＮｏｒｍａｌ群と称する。
　６継代目として１５０ｍｍ細胞培養ディッシュ５枚へＮＨＡ－ＹＡ群を３．３×１０４細胞／ｃｍ２、Ｎｏｒｍａｌ群を２．３×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。播種総細胞総数はＮＨＡ－ＹＡ群で５．０×１０６細胞、Ｎｏｒｍａｌ群で３．５×１０６細胞であった。
　播種後、４日間培養し、誘導後（阻害剤との接触後）３５日目に、４０～６０％コンフルエントに達したことを確認し、培地を培養用培地から培養上清回収用培地に２０ｍＬ／１５０ｍｍディッシュの容量で交換し、追加培養を開始した。追加培養開始の４８時間後に、ディッシュから追加培養の培養上清を回収し、その後、回収した培養上清を０．２２μｍフィルターシステムでろ過し、細胞残渣が除去された、エクソソーム含有培養上清を得た。得られたろ過済みのエクソソーム含有培養上清を４℃で保存した。次いで、ディッシュに残った細胞に新しい培養上清回収用培地を添加し、培養を４８時間行い、同様の方法によりろ過済みのエクソソーム含有培養上清を得た。同様の操作を合計３回行い、ろ過済みのエクソソーム含有培養上清を約３００ｍＬ回収した。誘導後４１日目に、培養上清を回収した後、ディッシュ上に残った細胞を、細胞剥離剤１を用いて剥がし、細胞数をカウントしたところ、得られた総細胞数はＮＨＡ－ＹＡ群で４．４２×１０７細胞、ＮＨＡ群で１．５１×１０７細胞であり、播種総細胞総数に対する残存率はＮＨＡ－ＹＡ群で９４．１％、Ｎｏｒｍａｌ群で８４．０％であった。
　エクソソーム機能評価の際の対照培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ））として、細胞を播種していない１５０ｍｍ細胞培養ディッシュに培養上清回収用培地を２０ｍＬ／１５０ｍｍディッシュの容量で加え、細胞培養時と全く同条件で培養上清を回収した。
３．培養上清中のエクソソームの濃縮
　上記で回収されたＮＨＡ－ＹＡ群、ＮＨＡ群、およびＣＭの培養上清１８０ｍＬ分をチューブに移し、前記超遠心機を使用して２５０，０００×ｇ、７０分間、４℃で遠心分離を行った。上清を除去した後、得られた沈降物を洗浄するために、当該沈殿物にリン酸緩衝塩水溶液を添加した後、２５０，０００×ｇ、７０分間、４℃で遠心分離を行った。上清を除去し、洗浄された沈殿物を得た。洗浄された沈降物は培養上清容積の凡そ１／１０００となるようリン酸緩衝塩水溶液にて再懸濁した。
４．懸濁液中の粒子数、およびタンパク量の測定
　上記の方法により濃縮された培養上清由来の懸濁液を、使用前に０．２２μｍフィルターでろ過したリン酸緩衝塩水溶液で１００倍希釈した後、希釈液中の粒子数をＺｅｔａＶｉｅｗ　Ｘ２０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｍｅｔｒｉｘ）により測定した。測定で得られた粒子数に希釈率、すなわち１００を乗じて懸濁液中の総粒子数を算出した。アッセイ用培地中の粒子数を、リン酸緩衝塩水溶液で１００倍希釈した後に測定し、得られたアッセイ用培地中の粒子数を各培養上清の測定値から減算することによって、培養上清中の粒子数を計算した。また併せて、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により２８０ｎｍでの吸光度を測定し、懸濁液中のタンパク濃度を測定した。測定で得られたタンパク濃度に懸濁液の液量を乗じて懸濁液中の総タンパク量を算出した。測定結果を表１０に示す。表１０の「総粒子数」の欄における「ａＥ＋ｂ」なる表記は、ａ×１０ｂを意味する。表１０に示されるように、ＮＨＡ－ＹＡ群では総タンパク量が最も多く含まれており、また、粒子数も対照培地（ＣＭ）に比較して顕著に多いことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
＜評価実験プロトコール＞
　上記のＰＣ－１２細胞の凍結チューブを３７℃のウォーターバスで融解した。次いで、溶解後の細胞を計１０ｍＬになるよう増殖用培地に移し、１８０×ｇ、５分間、室温で遠心分離に供した後、培地を除去した。続いて細胞を増殖用培地に懸濁し、細胞培養用ディッシュ　１００ｍｍに凡そ５，３００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。２日または３日おきに培地を交換しながら３７℃で培養を行い、継代を交えながら細胞を増殖させた。得られたＰＣ－１２細胞を、細胞剥離剤２を用いて剥がし、アッセイ用培地にて洗浄した後、アッセイ用培地にて３．９６×１０４個／ｍＬの密度で再懸濁した。懸濁した細胞を９６ウェルプレート中に１ウェルあたり１．９８×１０３個／５０μＬ培地、すなわち、６０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種し、約１２時間細胞を接着させた後、培地を上記の各評価用サンプルに交換した。その後、３７℃で培養を行い、培養開始３日目、４日目、および５日目のＰＣ－１２細胞の状況を顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、ＫＥＹＥＮＣＥ）にて観察し、観察画像を取得した。当該画像における神経様突起の長さおよび細胞数を、画像解析ソフトＦｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ２　ｖｅｒ．　２．３．０）のＭｕｌｔｉ－ｐｏｉｎｔツール（細胞数）とＳｔｒａｉｇｈｔツール（伸長突起長）を使用して計測した。統計処理にはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ－Ｅｘｃｅｌを使用した。
　その結果、交感神経細胞であるＰＣ－１２細胞株に対して、エクソソームを含む上記（２）および（３）では、（１）と比較して有意な神経突起伸長が観測されず、神経突起の伸張を抑制していることが示された。
　したがって、本開示のエクソソームが、ＰＣ－１２細胞の神経突起を伸長する機能を備えておらず、むしろ、神経突起の伸張を抑制する機能を備えていることが示唆された。これにより、本開示のエクソソームは、交感神経系を抑制することができる。

Claims (20)

  1. 　高増殖性細胞の製造方法であって、
    　（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
    　（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で、該阻害剤を前記原料となる外胚葉性細胞に接触させて培養すること、および、
    　（ｉｉｉ）前記接触後、前記阻害剤を含む培地中で追加培養を行い、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を含む培養物を得ること
    を含む、高増殖性細胞の製造方法。
  2. 　前記高増殖性細胞は、前記阻害剤と接触させた２８日超の培養期間後の細胞数が、該阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数の１．０倍を超える増殖能を有する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記原料となる外胚葉性細胞が、中枢神経系の細胞を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　前記原料となる外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記阻害剤が、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記ＴＧＦβ受容体阻害剤の濃度が、０．００１μＭ～１００μＭの範囲内である、請求項５に記載の製造方法。
  7. 　前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、０．００１μＭ～１００μＭの範囲内である、請求項５または６に記載の製造方法。
  8. 　前記高増殖性細胞が、成熟細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を前記原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現し、かつ、前駆細胞に特有の少なくとも１つの遺伝子を前記原料となる外胚葉性細胞と同じかそれ以上に発現する、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記高増殖性細胞が、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つが陰性である、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　外胚葉性細胞の特徴を備え、低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日超の培養期間後の細胞数が、該阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数の１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞。
  11. 　前記高増殖性細胞が、Ｍｕｓａｓｈｉ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＯＸ２からなる群より選択される少なくとも１つが陰性である細胞を含む、請求項１０に記載の細胞。
  12. 　ＮＧ２の発現量が、前記阻害剤非接触の外胚葉性細胞におけるＮＧ２の発現量よりも高い、請求項１０または１１に記載の細胞。
  13. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法より得られる高増殖性細胞または請求項１０～１２のいずれか１項に記載の高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を含む培養物を得ること、および、前記細胞分泌物を、前記培養物から分離することを含む、細胞分泌物の製造方法。
  14. 　細胞分泌物が、エクソソームである、請求項１３に記載の方法。
  15. 　外胚葉性前駆細胞の製造方法であって、
    　前記外胚葉性前駆細胞は、高増殖性細胞であり、
    　（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
    　（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で、該阻害剤を前記原料となる外胚葉性細胞に接触させて、２８日超の期間にわたり培養すること、および
    　（ｉｉｉ）前記接触後、前記阻害剤を含む培地中で追加培養を行い、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を含む培養物を得ること
    を含む、外胚葉性前駆細胞の製造方法。
  16. 　前記培養物から、前記高増殖性細胞を単離することを更に含む、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　タンパク質および／またはｍｉＲＮＡを含む細胞分泌物であって、
    　前記タンパク質は、ビンキュリン（Ｐ１８２０６）、インテグリンβ－１，ＣＤ２９（Ｐ０５５５６）、ピルビン酸キナーゼＭ１／２（Ｐ１４６１８）、およびエフリンタイプ－Ａ受容体２（Ｐ２９３１７）の組み合わせを含み、
    　前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００６４６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３７）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００７６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ（ＭＩＭＡＴ０００１６３９）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６２）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００６７）の組み合わせを含む、細胞分泌物。
  18. 　エクソソームである、請求項１７に記載の細胞分泌物。
  19. 　請求項１もしくは２に記載の製造方法により得られた高増殖性細胞または請求項１０～１２のいずれか１項に記載の高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物と、
    　請求項１７または１８に記載の細胞分泌物と、
    のいずれかの細胞分泌物を含む、末梢神経細胞または中枢神経細胞に関係する障害の予防または治療に用いられる医薬組成物。
  20. 　請求項１もしくは２に記載の製造方法により得られた高増殖性細胞または請求項１０～１２のいずれか１項に記載の高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物と、
    　請求項１７または１８に記載の細胞分泌物と、
    のいずれかの細胞分泌物を神経細胞に接触させることを含む、交感神経系の抑制方法。
PCT/JP2022/029317 2021-07-29 2022-07-29 高増殖性細胞の製造方法、高増殖性細胞およびその用途 WO2023008564A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22849624.6A EP4379045A1 (en) 2021-07-29 2022-07-29 Method for producing highly proliferative cell, and highly proliferative cell and use thereof
CA3227868A CA3227868A1 (en) 2021-07-29 2022-07-29 Method for producing highly proliferative cell, and highly proliferative cell and use thereof
CN202280064750.8A CN118043449A (zh) 2021-07-29 2022-07-29 高增殖细胞的制造方法、高增殖细胞及其用途
JP2023538641A JPWO2023008564A1 (ja) 2021-07-29 2022-07-29
KR1020247006514A KR20240040102A (ko) 2021-07-29 2022-07-29 고증식성 세포의 제조 방법, 고증식성 세포 및 그 용도

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-124172 2021-07-29
JP2021124172 2021-07-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023008564A1 true WO2023008564A1 (ja) 2023-02-02

Family

ID=85086877

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/029317 WO2023008564A1 (ja) 2021-07-29 2022-07-29 高増殖性細胞の製造方法、高増殖性細胞およびその用途

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4379045A1 (ja)
JP (1) JPWO2023008564A1 (ja)
KR (1) KR20240040102A (ja)
CN (1) CN118043449A (ja)
CA (1) CA3227868A1 (ja)
WO (1) WO2023008564A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024117055A1 (ja) * 2022-12-01 2024-06-06 学校法人東京医科大学 高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013121941A (ja) * 2011-11-09 2013-06-20 Sun Chlorella Corp 交感神経抑制剤及び交感神経抑制用飲食組成物
WO2017119512A1 (ja) 2016-01-08 2017-07-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 低分子化合物による成熟肝細胞からの肝幹／前駆細胞の作製方法
WO2020080550A1 (ja) 2018-10-15 2020-04-23 Cynity株式会社 低分子化合物による内胚葉組織又は器官由来細胞からの幹／前駆細胞の作製方法
JP2021124172A (ja) 2020-02-05 2021-08-30 トヨタ自動車株式会社 締結部材

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013121941A (ja) * 2011-11-09 2013-06-20 Sun Chlorella Corp 交感神経抑制剤及び交感神経抑制用飲食組成物
WO2017119512A1 (ja) 2016-01-08 2017-07-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 低分子化合物による成熟肝細胞からの肝幹／前駆細胞の作製方法
WO2020080550A1 (ja) 2018-10-15 2020-04-23 Cynity株式会社 低分子化合物による内胚葉組織又は器官由来細胞からの幹／前駆細胞の作製方法
JP2021124172A (ja) 2020-02-05 2021-08-30 トヨタ自動車株式会社 締結部材

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMRITA DATTA CHAUDHURI; RAHA M. DASGHEYB; LAUREN R. DEVINE; HONGHAO BI; ROBERT N. COLE; NORMAN J. HAUGHEY: "Stimulus‐dependent modifications in astrocyte‐derived extracellular vesicle cargo regulate neuronal excitability", GLIA, WILEY-LISS, INC., US, vol. 68, no. 1, 30 August 2019 (2019-08-30), US , pages 128 - 144, XP071753066, ISSN: 0894-1491, DOI: 10.1002/glia.23708 *
JOURNAL OF CHEMICAL NEUROANATOMY, vol. 100, 2019, pages 101650
JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 323, 2020, pages 225 - 239
NEURAL REGENERATION RESEARCH, vol. 12, no. 12, 2017, pages 1945 - 1959
NIPPON-RINSHO CO., OSAKA. ; 1 January 1997 (1997-01-01), KAWASAKI, HIROMU.: "Central sympathetic depressants", XP009543049 *
RICH J N, ZHANG M, DATTO M B, BIGNER D D, WANG X F: "Transforming growth factor-beta-mediated p15(INK4B) induction and growth inhibition in astrocytes is SMAD3-dependent and a pathway prominently altered in human glioma cell lines", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 274, no. 49, 3 December 1999 (1999-12-03), US , pages 35053 - 35058, XP093030663, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.274.49.35053 *
YU ZHIYUAN, LIU MIAO, FU PEICAI, XIE MINJIE, WANG WEI, LUO XIANG: "ROCK inhibition with Y27632 promotes the proliferation and cell cycle progression of cultured astrocyte from spinal cord", NEUROCHEMISTRY INTERNATIONAL, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 61, no. 7, 1 December 2012 (2012-12-01), AMSTERDAM, NL , pages 1114 - 1120, XP093030661, ISSN: 0197-0186, DOI: 10.1016/j.neuint.2012.08.003 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024117055A1 (ja) * 2022-12-01 2024-06-06 学校法人東京医科大学 高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP4379045A1 (en) 2024-06-05
CA3227868A1 (en) 2023-02-02
JPWO2023008564A1 (ja) 2023-02-02
KR20240040102A (ko) 2024-03-27
CN118043449A (zh) 2024-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6644851B2 (ja) 幹細胞微粒子
EP2175868B1 (en) Bone marrow derived cells for use in treating neural degeneration
JP6362596B2 (ja) 神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞の作製方法
CN105392881B (zh) 体细胞基于小分子转化为神经嵴细胞
JP7055638B2 (ja) 幹細胞からの筋肉系列細胞の生成
US20150250824A1 (en) Methods and compositions for expansion of stem cells and other cells
US20100021434A1 (en) Isolated Oligodendrocyte-Like Cells and Populations Comprising Same for the Treatment of CNS Diseases
US20240009248A1 (en) Methods for generating neural progenitor cells with a spinal cord identity
KR101870240B1 (ko) 지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법
JP2016507550A (ja) 微粒子の製造方法
WO2023008564A1 (ja) 高増殖性細胞の製造方法、高増殖性細胞およびその用途
TW201908479A (zh) 藉由利用地標轉錄因子之幹細胞分化誘導神經先驅細胞、寡樹突細胞先驅細胞及寡樹突細胞
WO2024117055A1 (ja) 高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途
WO2005095587A1 (ja) 胚性幹細胞から分化した体性幹細胞の製造方法、及びその用途
Johnstone A comparative study of the biological and molecular properties of mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and the olfactory system
MESSAT et al. Transdifferentiation of Human Dental Pulp Mesenchymal Stem Cells into Spiral Ganglion-like Neurons
EP3660145A1 (en) Use of oligodendrocytes from oral neuroectodermal stem cells in the repair of the nervous system
KR20130039467A (ko) 태반의 양막 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시키는 방법
Hou et al. and Hung-Chih Kuo
Jessberger et al. Eva C. Thoma,* Claudia Merkl, Tobias Heckel, Rachel Haab, Frederic Knoflach, Corinne Nowaczyk, Nicholas Flint, Ravi Jagasia, Sannah Jensen Zoffmann, Hoa Hue Truong, Pascal Petitjean
Slesinger et al. Julia TCW, Minghui Wang, 4, 7 Anna A. Pimenova, Kathryn R. Bowles, Brigham J. Hartley, 3, 7 Emre Lacin, Saima I. Machlovi, Rawan Abdelaal, 5 Celeste M. Karch, 6 Hemali Phatnani, 5
WO2014163380A1 (ko) 샤르코-마리-투스 질환 치료제의 스크리닝 방법 및 이에 이용되는 자가분화운동신경세포

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22849624

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023538641

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: P6000204/2024

Country of ref document: AE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3227868

Country of ref document: CA

Ref document number: 2401000609

Country of ref document: TH

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20247006514

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022849624

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022849624

Country of ref document: EP

Effective date: 20240229