KR20240040102A - 고증식성 세포의 제조 방법, 고증식성 세포 및 그 용도 - Google Patents

고증식성 세포의 제조 방법, 고증식성 세포 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

고증식성 세포의 제조 방법으로서, (i) 원료가 되는 외배엽성 세포를 준비하는 것, (ii) 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하는 배지 중에서, 당해 저해제를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포에 접촉시켜 배양하는 것, 및, (iii) 상기 접촉 후, 상기 저해제를 포함하는 배지 중에서 추가 배양을 행하고, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포보다도 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 포함하는 배양물을 얻는 것을 포함하는, 고증식성 세포 또는 외배엽성 전구 세포의 제조 방법； 외배엽성 세포의 특징을 구비하고, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨 28일 초과 이상의 배양 기간 후의 세포수가, 당해 저해제와 비접촉인 이외는 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 기간에 걸쳐 배양된 외배엽성 세포의 세포수의 1.0배를 넘는 증식능을 가지는, 고증식성 세포； 이 고증식성 세포 또는 상기의 고증식성 세포의 제조 방법에 의하여 얻어지는 고증식성 세포에 유래하는 세포 분비물； 소정의 단백질 및/또는 miRNA를 포함하는 세포 분비물； 이것들의 세포 분비물을 포함하는, 말초 신경 세포 또는 중추 신경 세포에 관계하는 장해의 예방 또는 치료에 이용되는 의약 조성물； 및, 상기의 제조 방법에 의하여 얻어진 고증식성 세포 또는 상기의 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물을 신경 세포에 접촉시키는 것을 포함하는 교감 신경계의 억제 방법.

Description

고증식성 세포의 제조 방법, 고증식성 세포 및 그 용도
본 발명은, 고증식성 세포의 제조 방법, 고증식성 세포, 및 그 용도에 관한 것이다.
재생 의료의 분야에 있어서, 생체 내의 다양한 세포, 다양한 분화 단계의 세포, 또는 특정 방향으로 분화 유도된 세포 등이 이용되고 있다. 생체에서의 사용을 고려하면, 이것들의 세포에 관하여는, 유전자 개변을 수반하지 않는 것이 바람직하다. 지금까지, 내배엽성의 성숙 세포에 특정의 저분자 화합물을 접촉시키는 것에 의하여, 유전자 개변을 수반하는 것 없이, 당해 성숙 세포를, 줄기 세포 또는 전구 세포에 리프로그래밍할 수 있는 것이 보고되고 있다(WIPO 국제공개공보 제2017/119512호 및 WIPO 국제공개공보 제2020/080550호).
한편, 유전자 개변을 행하지 않고 얻을 수 있는 세포, 그 중에서도 비교적, 성숙 세포에 가까운 세포의 대부분은, 증식능에 제한이 있고, 장기(長期)에 걸쳐 생체 내외에서 유지할 수 없는 경향이 있다. 이 때문에, 세포의 기능의 장기 이용, 또는, 세포가 생성하는 유용 물질의 대량 생산 등에 유효한 고증식성의 세포에 대한 요청이, 여전히 남아 있다. 특히, 신경계의 세포를 포함하는 외배엽성 세포에 관하여는, 내배엽성 세포와 달리 충분히 이용되어 있지 않다.
본 개시의 목적은, 고증식성 세포를 제조하는 방법, 고증식성 세포, 및 그 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 예의(銳意) 연구를 행한 결과, 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 외배엽성 세포에 접촉시키는 것으로, 고증식성 세포를 얻을 수 있는 것을 찾아냈다.
즉, 본 개시는 이하의 형태를 포함한다：
[1] 고증식성 세포의 제조 방법으로서,
(i) 원료가 되는 외배엽성 세포를 준비하는 것,
(ii) 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하는 배지 중에서, 당해 저해제를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포에 접촉시켜 배양하는 것, 및,
(iii) 상기 접촉 후, 상기 저해제를 포함하는 배지 중에서 추가 배양을 행하고, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포보다도 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 포함하는 배양물을 얻는 것
을 포함하는, 고증식성 세포의 제조 방법；
[2] [1]에 있어서, 상기 고증식성 세포는, 상기 저해제와 접촉시킨 28일 초과의 배양 기간 후의 세포수가, 당해 저해제와 비접촉인 이외는 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 기간에 걸쳐 배양된 외배엽성 세포의 세포수의 1.0배를 넘는 증식능을 가지는, 제조 방법；
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포가, 중추 신경계의 세포를 포함하는, 제조 방법；
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포가, 아스트로사이트를 포함하는, 제조 방법；
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저해제가, TGFβ 수용체 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는, 제조 방법；
[6] [5]에 있어서, 상기 TGFβ 수용체 저해제의 농도가, 0.001μM ~ 100μM의 범위 내인, 제조 방법；
[7] [5] 또는 [6]에 있어서, 상기 ROCK 저해제의 농도가, 0.001μM ~ 100μM의 범위 내인, 제조 방법；
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고증식성 세포가, 성숙 세포에 특유의 적어도 하나의 유전자를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, 전구 세포에 특유의 적어도 하나의 유전자를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는, 제조 방법；
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고증식성 세포가, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 음성인, 제조 방법；
[10] 외배엽성 세포의 특징을 구비하고, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨 28일 초과의 배양 기간 후의 세포수가, 당해 저해제와 비접촉인 이외는 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 기간에 걸쳐 배양된 외배엽성 세포의 세포수의 1.0배를 넘는 증식능을 가지는, 고증식성 세포；
[11] [10]에 있어서, 상기 고증식성 세포가, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 음성인 세포를 포함하는, 세포；
[12] [10] 또는 [11]에 있어서, NG2의 발현량이, 상기 저해제 비접촉의 외배엽성 세포에 있어서의 NG2의 발현량보다도 높은, 세포；
[13] [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법으로부터 얻어지는 고증식성 세포 또는 [10] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물을 포함하는 배양물을 얻는 것, 및, 상기 세포 분비물을, 상기 배양물로부터 분리하는 것을 포함하는, 세포 분비물의 제조 방법；
[14] [13]에 있어서, 세포 분비물이, 엑소좀인, 방법；
[15] 외배엽성 전구 세포의 제조 방법으로서,
상기 외배엽성 전구 세포는, 고증식성 세포이고,
(i) 원료가 되는 외배엽성 세포를 준비하는 것,
(ii) 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하는 배지 중에서, 해당 저해제를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포에 접촉시켜, 28일 초과의 기간에 걸쳐 배양하는 것, 및
(iii) 상기 접촉 후, 상기 저해제를 포함하는 배지 중에서 추가 배양을 행하고, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포보다도 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 포함하는 배양물을 얻는 것
을 포함하는, 외배엽성 전구 세포의 제조 방법；
[16] [15]에 있어서, 상기 배양물로부터, 상기 고증식성 세포를 단리(單離)하는 것을 더 포함하는, 제조 방법；
[17] 단백질 및/또는 miRNA를 포함하는 세포 분비물로서,
상기 단백질은, 빈쿨린(P18206), 인테그린 β-1, CD29(P05556), 피루브산 키나아제 M1/2(P14618), 및 에프린 타입-A 수용체 2(P29317)의 조합을 포함하고,
상기 miRNA는, hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-155-5p(MIMAT0000646), hsa-miR-379-5p(MIMAT0000733), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-21-5p(MIMAT0000076), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-409-3p(MIMAT0001639), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), 및 hsa-let-7f-5p(MIMAT0000067)의 조합을 포함하는, 세포 분비물；
[18] [17]에 있어서, 엑소좀인, 세포 분비물；
[19] [1] 혹은 [2]에 기재된 제조 방법에 의하여 얻어진 고증식성 세포 또는 [10] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물과,
[17] 또는 [18]에 기재된 세포 분비물
중 어느 하나의 세포 분비물을 포함하는, 말초 신경 세포 또는 중추 신경 세포에 관계하는 장해의 예방 또는 치료에 이용되는 의약 조성물；
[20] [1] 혹은 [2]에 기재된 제조 방법에 의하여 얻어진 고증식성 세포 또는 [10] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물과,
[17] 또는 [18]에 기재된 세포 분비물
중 어느 하나의 세포 분비물을 신경 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 교감 신경계의 억제 방법.
본 개시에 의하면, 고증식성 세포를 제조하는 방법, 고증식성 세포, 및 그 용도를 제공할 수 있다.
도 1은, 실시예 1에 관련되는 장기 배양 후의 외배엽성 세포의 형태를 도시한다.
도 2는, 실시예 2에 관련되는 회수용 배지로의 배지 교환의 전후에 있어서의 외배엽성 세포의 세포 형태를 도시한다.
도 3a는, 실시예 2에 관련되는 Normal군의 추가 배양 후에 회수된 배양 상청 중의 입자의 입경(粒徑) 분포를 도시한다.
도 3b는, 실시예 2에 관련되는 NHA-YA군의 추가 배양 후에 회수된 배양 상청 중의 입자의 입경 분포를 도시한다.
도 4a는, 실시예 4에 관련되는 NHA-YA 유래 엑소좀의 프로테옴 해석에 의하여 선출된 단백질을 도시한다.
도 4b는, 실시예 4에 관련되는 NHA-YA 유래 엑소좀의 프로테옴 해석에 의하여 선출된 단백질을 도시한다.
도 5는, 실시예 5에 관련되는 NHA-YA 유래 엑소좀의 miRNA 해석에 의하여 선출된 파킨슨병 마커로서의 miRNA를 도시한다.
도 6은, 실시예 5에 관련되는 NHA-YA 유래 엑소좀의 miRNA 해석에 의하여 선출된 알츠하이머병 마커로서의 miRNA를 도시한다.
도 7은, 실시예 5에 관련되는 NHA-YA 유래 엑소좀의 miRNA 해석에 의하여 선출된 알츠하이머병 마커로서의 miRNA를 도시한다.
도 8은, 실시예 5에 관련되는 NHA-YA 유래 엑소좀의 miRNA 해석에 의하여 선출된 알츠하이머병 마커로서의 miRNA를 도시한다.
도 9는, 실시예 5에 관련되는 NHA-YA 유래 엑소좀의 miRNA 해석에 의하여 선출된 알츠하이머병 마커로서의 miRNA를 도시한다.
도 10은, 실시예 5에 관련되는 NHA-YA 유래 엑소좀의 miRNA 해석에 의하여 선출된 우울증 마커로서의 miRNA를 도시한다.
<1> 고증식성 세포의 제조 방법
본 개시에 관련되는 고증식성 세포의 제조 방법은,
(i) 원료가 되는 외배엽성 세포를 준비하는 것,
(ii) 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하는 배지 중에서, 당해 저해제를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포에 접촉시켜 배양하는 것, 및,
(iii) 상기 접촉 후, 상기 저해제를 포함하는 배지 중에서 추가 배양을 행하고, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포보다도 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 포함하는 배양물을 얻는 것
을 포함한다.
본 명세서에 있어서, 용어 「세포」에는, 특별히 언급하지 않는 한, 적어도 하나의 세포가 포함되는 용어로서 해석되어야 하다. 이 때문에, 특별히 언급하지 않는 한, 용어 「세포」가 의미하는 세포는, 한 세포인 것에 한정되지 않고, 세포 집단과 같은 의미로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 「세포 집단」에는, 언급하지 않는 한, 적어도 한 종류의 세포가 포함되는 용어로서 해석되어야 한다. 이 때문에, 특별히 언급하지 않는 한, 용어 「세포 집단」이 의미하는 세포는, 한 종류의 세포인 것에 한정되지 않는다.
「외배엽」이란, 후생동물의 발생 도중에 생기는 삼배엽의 하나이다. 외배엽은, 배아의 외측의 층에 유래하고, 피부, 신경계 및 감각기에 발달한다. 피부로서는, 예를 들어, 표피, 머리카락, 손톱 및 피부샘을 들 수 있고, 신경계로서는, 예를 들어, 뇌신경, 척수 및 말초 신경을 들 수 있고, 감각기로서는, 예를 들어, 시각기, 청각기, 평형각기(平衡覺器), 미각기, 후각기 및 촉각기를 들 수 있다.
본 개시에서 이용되는 「외배엽성 세포」는, 예를 들어 신경계의 세포, 예를 들어, 중추 신경계의 세포 및 말초 신경계의 세포를 포함한다. 따라서, 본 개시에 있어서, 「원료가 되는 외배엽성 세포」는, 예를 들어 중추 신경계의 세포를 포함할 수 있다. 원료가 되는 외배엽성 세포는, 아스트로사이트를 포함하여도 무방하다.
본 개시의 제조 방법에서 이용하는 외배엽성 세포는, 어떠한 기원으로부터 제공되어도 무방하고, 예를 들어, 포유동물로부터 제공된다. 포유동물로서는, 예를 들어, 인간, 래트, 마우스, 고양이, 개, 모르모트, 토끼, 양, 말, 돼지, 소 및 원숭이를 들 수 있다. 포유동물은, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 고양이, 또는 개이고, 보다 바람직하게는 인간, 래트 또는 마우스이다.
본 개시에서 사용되는 「외배엽성 세포」는, 「외배엽성 조직」 및 「외배엽성 기관」을 구성하는 세포이다. 「외배엽성 조직」 및 「외배엽성 기관」으로서는, 예를 들어, 중추 신경(뇌 및 척수), 하수체, 말초 신경, 장 신경, 부신 수질, 멜라노사이트, 안면 연골, 치아의 상아질, 표피, 머리카락, 손톱, 피부, 피지선, 타액선, 한선, 유선, 비강, 코의 점막, 구상피(口上皮), 구강, 눈, 방광, 항문을 들 수 있다. 뇌는, 대뇌, 소뇌 및 뇌간으로 크게 나눌 수 있다. 대뇌는, 종뇌 및 간뇌로 더 나눌 수 있고, 뇌간은, 중뇌, 교뇌 및 연수로 더 나눌 수 있다. 중추 신경은, 신경 세포 및 글리아 세포로 구성되고, 이것들의 세포를 출발 재료로 선택할 수 있다. 이것들의 조직 또는 기관에는, 최종 분화 단계를 끝낸 성숙 세포가 많이 존재한다.
원료가 되는 외배엽성 세포는, 예를 들어, 글리아 세포로 분류되는 아스트로사이트, 마이크로글리아, 올리고덴드로사이트, 올리고덴드로사이트 전구 세포(혹은 폴리덴드로사이트라고도 한다.), 상의 세포, 슈반 세포 및 위성 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 선택할 수 있다. 이것들의 세포는, 생체로부터 얻어진 초대 세포, 수립된 세포주, 또는, ES 세포 등의 다능성 줄기 세포 혹은 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)로부터 유도된 외배엽성 세포여도 무방하다.
본 개시의 방법에 이용하는 세포는, 예를 들어, 포유동물로부터 적출한 뇌로부터 단리 정제된 세포여도 무방하다.
예를 들어 래트의 경우, 10주령 ~ 20주령의 성체 래트로부터 적출한 뇌를 이용하는 것이 바람직하지만, 2개월령 이하의 유약(幼若) 래트 유래의 뇌를 이용하여도 무방하다. 인간의 경우, 생검 또는 외과 수술에 의하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 신경 세포 및 글리아 세포는, 모두 생검에 의하여 채취할 수 있다. 외과 수술의 경우는, 절제한 성인의 뇌조직편을 이용하는 것도, 사망 태아로부터 절제한 뇌를 이용할 수도 있다. 혹은, 이것들 적출한 뇌로부터 신경 세포 또는 글리아 세포를 단리 정제한 후, 동결한 세포를 이용할 수도 있다.
원료가 되는 외배엽성 세포는, 외배엽성 세포의 특징을 나타내는 세포로서 정의할 수 있다. 외배엽성 세포의 특징으로서는, 세포의 형태, 세포에 특유의 유전자(「마커 유전자」라고 칭하는 경우가 있다.)의 발현 등을 들 수 있다. 외배엽성 세포인 것은, 분화 단계 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어, GFAP, S100B, SLC1A2(「EAAT2」 또는 「GLT-1」로서도 기지(旣知)이다.), 및 NG2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 있는 것으로, 확인할 수 있다. 외배엽성 세포의 마커 유전자의 발현은, 유전자 및 단백질 중 어느 것에 기초하여 확인하여도 무방하다. 유전자 또는 단백질의 발현의 확인은, 발현의 유무, 측정 방법에 의존한 구체적인 발현량, 특정의 세포에 있어서의 동일 유전자 또는 단백질의 발현량과의 비교 등, 당업계에서 공지의 방법에 의하여 행할 수 있다.
덧붙여, 본 명세서에 있어서, 마커 유전자의 발현은, 당업계에서 공지의 기술을 이용하여 확인할 수 있고, 예를 들어, 정량 PCR(「qPCR」라고 기재하는 경우가 있다.) 등을 이용한 유전자의 발현량의 측정, ELISA, 플로 사이토메트리법 등의 면역 측정법을 이용한 단백질량의 측정 등에 의하여, 확인할 수 있다.
상기와 같이 하여 준비된 원료가 되는 외배엽성 세포를, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨다. 접촉은, 인 비트로(in vitro)여도 무방하다. 본 방법에 사용 가능한 저분자 시그널 전달 경로 저해제로서는 특별히 제한은 없고, 모두 사용 가능하다. 저분자 시그널 전달 경로 저해제로서는, 예를 들어, 트랜스포밍 증식 인자(Transforming growth factor；TGF) β 수용체 저해제, ROCK［Rho 결합 단백질 키나아제(Rho-associated protein kinase)］ 저해제 및 글리코겐 합성 효소 키나아제 3(Glycogen synthase kinase 3；GSK3) 저해제를 들 수 있다.
본 개시에 관련되는 제조 방법에 있어서, 상기 저해제는, TGFβ 수용체 저해제, ROCK 저해제 및 GSK3 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하여도 무방하다. 본 개시에 관련되는 제조 방법에 있어서, 상기 저해제는, TGFβ 수용체 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하여도 무방하다.
TGFβ 수용체 저해제는, TGFβ 수용체의 기능을 저해하는 작용을 가지는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어, 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-4-일-2-tert-부틸-1H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘, 3-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)-1-페닐티오카르바모일-1H-피라졸(A-83-01), [2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-4-(4-피리딜아미노)]프테리딘(SD-208), 3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)]-1H-피라졸, 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘(이상, 모두 머크사(Merck & Co.)), SB431542(Sigma Aldrich사) 및 CultureSure(등록 상표) A-83-01(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation))을 들 수 있다. TGFβ 수용체 저해제는, 바람직하게는 CultureSure(등록 상표) A-83-01이다. TGFβ 수용체 저해제에는, TGFβ 수용체 안타고니스트도 포함된다. 이것들의 TGFβ 수용체 저해제는, 1종만을 이용하여도, 2종 이상을 조합하여 이용하여도 무방하다.
ROCK 저해제는, Rho 결합 단백질 키나아제의 기능을 저해하는 작용을 가지는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, ROCK 저해제로서는, 예를 들어, GSK269962A(Axon medchem사), Fasudil hydrochloride(Tocris Bioscience사), CultureSure(등록 상표) Y-27632(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤) 및 H-1152 dihydrochloride(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤)를 들 수 있다. ROCK 저해제는, 바람직하게는 CultureSure(등록 상표) Y-27632이다. ROCK 저해제는, 1종만을 이용하여도, 2종 이상을 조합하여 이용하여도 무방하다.
GSK3 저해제는, 글리코겐 합성 효소 키나아제(GSK)3의 기능을 저해하는 작용을 가지는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, GSK3 저해제로서는, 예를 들어, SB216763(Selleck사), CHIR 98014(Axon medchem사), CHIR 99021(Axon medchem사), SB415286(Tocris Bioscience사) 및 Kenpaullone(코스모ㆍ바이오사(Cosmo Bio Co., Ltd.))를 들 수 있다. GSK3 저해제는, 바람직하게는 CHIR 99021이다. GSK3 저해제는, 1종만을 이용하여도, 2종 이상을 조합하여 이용하여도 무방하다.
본 제조 방법에 있어서 이용되는 저분자 시그널 전달 경로 저해제는, TGFβ 수용체 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 할 수 있다. 즉, 본 제조 방법에 있어서 사용되는 저분자 시그널 전달 경로 저해제는,
ㆍ TGFβ 수용체 저해제와 ROCK 저해제와의 조합,
ㆍ TGFβ 수용체 저해제, 또는
ㆍ ROCK 저해제
여도 무방하다. 일 태양(態樣)에 있어서, 사용되는 저분자 시그널 전달 경로 저해제는, TGFβ 수용체 저해제와 ROCK 저해제와의 조합이다. 본 명세서에 있어서, 「저분자 시그널 전달 경로 저해제」의 말은, 단지 「저해제」라고 칭하는 경우도 있다.
본 개시의 태양으로서는, 예를 들어, 이하의 저해제가 포함된다：
(1) 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-4-일-2-tert-부틸-1H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘, 3-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)-1-페닐티오카르바모일-1H-피라졸(A-83-01), [2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-4-(4-피리딜아미노)]프테리딘(SD-208), 3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)]-1H-피라졸, 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘, SB431542 및 CultureSure(등록 상표) A-83-01로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물；
(2) 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-4-일-2-tert-부틸-1H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘, 3-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)-1-페닐티오카르바모일-1H-피라졸(A-83-01), [2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-4-(4-피리딜아미노)]프테리딘(SD-208), 3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)]-1H-피라졸, 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘, SB431542 및 CultureSure(등록 상표) A-83-01로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물과,
GSK269962A, Fasudil hydrochloride, CultureSure(등록 상표) Y-27632 및 H-1152 dihydrochloride로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물과의 조합；및,
(3) GSK269962A, Fasudil hydrochloride, CultureSure(등록 상표) Y-27632 및 H-1152 dihydrochloride로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물.
배지 중의 TGFβ 수용체 저해제의 농도는, 예를 들어 0.001μM ~ 100μM, 0.01μM ~ 50μM, 또는 0.05μM ~ 30μM의 범위 내이고, 이용하는 TGFβ 수용체의 종류에 의하여 적의(適宜) 조정 가능하다. 일 태양에 있어서, 배지 중의 TGFβ 수용체 저해제, 예를 들어 CultureSure(등록 상표) A-83-01의 농도는, 0.1μM ~ 3μM이다.
배지 중의 ROCK 저해제의 농도는, 예를 들어 0.001μM ~ 100μM, 0.01μM ~ 80μM, 또는 0.1μM ~ 50μM의 범위 내이고, 이용하는 ROCK 저해제의 종류에 의하여 적의 조정 가능하다. 일 태양에 있어서, 배지 중의 ROCK 저해제, 예를 들어 CultureSure(등록 상표) Y-27632의 농도는, 1μM ~ 30μM이다.
배지 중의 GSK3 저해제의 농도는, 예를 들어 0.001μM ~ 100μM, 0.01μM ~ 80μM, 또는 0.1μM ~ 50μM의 범위 내이고, 이용하는 GSK3 저해제의 종류에 의하여 적의 조정 가능하다.
상기 농도 범위는, TGFβ 수용체 저해제, ROCK 저해제 및 GSK3 저해제가 각각 단독으로 사용되는 경우, 및, 이것들의 저해제가 조합되어 사용되는 경우 중 어느 쪽에도 적용 가능하다. 또한, 상기 저해제가, 수불용성 또는 수난용성인 경우, 소량의 저독성의 유기 용매(예를 들어, DMSO 등)에 용해한 후, 상기의 최종 농도가 되도록 배지에 첨가할 수 있다.
원료가 되는 외배엽성 세포와 저분자 시그널 전달 경로 저해제와의 접촉은, 상기 저해제를 포함하는 배지 중에서, 원료가 되는 외배엽성 세포를 배양하는 것에 의하여 행하여진다. 구체적으로는, 배지 중에, 상기 저해제를 유효한 농도로 첨가하여 배양을 행한다.
원료가 되는 외배엽성 세포를 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨 후, 당해 저해제를 포함하는 배지 중에서 가일층의 배양에 제공한다. 여기서, 가일층의 배양은, 「추가 배양」 또는 「제2 배양」이라고도 칭한다. 이것에 대하여, 원료가 되는 외배엽성 세포를 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킬 때까지의 배양, 즉, 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하지 않는 배지 중에서의 외배엽성 세포의 배양을, 「전(前) 배양」 또는 「제1 배양」이라고도 칭한다. 당해 저해제와의 접촉 후, 추가 배양을 행하는 것에 의하여, 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 얻을 수 있다. 덧붙여, 추가 배양 중에 있어서도, 배지 중에는 저해제가 포함되어 있기 때문에, 세포와 저해제와의 접촉은 계속하고 있다.
본 개시에 있어서, 전 배양 및 추가 배양에서 이용하는 배지로서는, 널리 동물 세포의 배양에 이용되는 배지를 기초 배지로서 사용할 수 있고, 시판되고 있는 기초 배지를 사용하여도 무방하다. 시판의 기초 배지로서는, 예를 들어, 아스트로사이트 배지(Astrocyte Growth Medium；AGM), 최소 필수 배지(MEM), 둘베코 개변 최소 필수 배지(DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지, Ham′s F12 배지, William′s E 배지, 및, NS 기초 배지(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤)를 들 수 있지만, 이것들에 특별히 한정되지 않는다. 배지로서는, 상기의 것을 단독으로 이용하여도, 2종 이상을 조합하여 이용하여도 무방하다.
배지에 첨가되는 첨가제로서는, 예를 들어, 사이토카인, 증식 인자(예를 들어, 상피 증식 인자(EGF), 및 섬유아세포 증식 인자-2(FGF-2)), 호르몬(예를 들어, 인슐린, 에스트라디올, 프로게스테론, 테스토스테론 및 티록신), 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손(Dex)), 혈장 유래 단백질(예를 들어, 트랜스페린), 각종 아미노산(예를 들어, L-글루타민 및 L-프롤린), 각종 무기염(예를 들어, 아셀렌산염 및 NaHCO3), 각종 비타민(예를 들어, 니코틴아미드 및 아스코르브산 유도체), N2 서플리먼트(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤), NS 서플리먼트(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤), B-27 Plus Supplement(Thermo Fisher Scientific), 각종 항생 물질(예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신), 항진균제(예를 들어, 암포테리신), 및 완충제(예를 들어, HEPES 등의 굿 완충제)를 들 수 있다.
전 배양(제1 배양) 및 추가 배양(제2 배양)에서 이용되는 배지에는, 혈청 첨가 배지 또는 무혈청 배지 중 어느 것을 이용하여도 무방하다.
혈청 첨가 배지를 사용하는 경우, 혈청으로서는, 예를 들어, 소 태아 혈청(Fetal bovine serum；FBS)을 이용할 수 있다. 또한, 엑소좀 분리를 용이하게 하기 위하여, 엑소좀을 제거한 FBS를 이용할 수도 있다. 시판의 엑소좀 제거 배지로서는, 예를 들어, FBS exosome-depleted, OneShot format(Gibco(등록 상표), Thermo Fisher Scientific)를 들 수 있다. 배지 중의 혈청의 농도는, 예를 들어, 0.5 ~ 25%(v/v), 1 ~ 25%(v/v), 1 ~ 20%(v/v), 1 ~ 15%(v/v), 2 ~ 15%(v/v), 2 ~ 10%(v/v), 3 ~ 10%(v/v), 3 ~ 8%(v/v), 및, 3 ~ 5%(v/v)이다. 구체적인 일 태양에 있어서, 배지 중의 혈청의 농도는, 3%(v/v)이다.
무혈청 배지를 사용하는 경우, 혈청 대체물을 첨가하여도 무방하다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어, 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin；BSA), 녹아웃 혈청 대체물(KnockOut Serum Replacement；KSR), 인간 혈청 알부민(Human serum albumin；HSA 또는 Human albumin, serum；HAS) 등을 들 수 있다. 인간 혈청 알부민으로서는, 인간 혈장으로부터 분리된 인간 혈청 알부민, 또는, 인간 혈청 알부민 유전자를 발현하는 벼로부터 정제된 인간 혈청 알부민(후지후이루무 와코 준야쿠)을 사용할 수 있다. 통상(通常), 증식 인자(hEGH 등), 사이토카인, 호르몬 등의 인자가 배지에 더 첨가된다. 이것들의 첨가되는 인자로서는, 예를 들어, 상피 증식 인자(EGF), 인슐린, 트랜스페린, 히드로코르티손 21-헤미숙신산 또는 그 염, 및, 덱사메타손(Dex), N2 서플리먼트(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤), NS 서플리먼트(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤) 및 B-27 Serum Free Supplement(Thermo Fisher Scientific)를 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다.
배양에 이용되는 배양 용기는, 접착 배양에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 디시(dish), 페트리 디시, 조직 배양용 디시, 멀티 디시, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이 및 배양 백을 들 수 있다. 배양 용기로서는, 세포의 부유 배양을 행하기 위하여 세포를 접착할 수 없도록 표면이 가공된 배양 용기를 이용할 수도 있다. 혹은, 접착 배양의 경우는, 내표면(內表面)이, 세포와의 접착성을 향상시키는 목적으로 세포 지지용 기질에 의하여 코팅된 것을 이용할 수 있다. 이러한 세포 지지용 기질로서는, 예를 들어, 콜라겐, 젤라틴, 마트리겔, 폴리-L-리신, 라미닌 및 피브로넥틴을 들 수 있다. 바람직한 세포 지지용 기질은, 콜라겐 또는 마트리겔이다.
원료가 되는 외배엽성 세포는, 예를 들어 1×102 ~ 1×106세포/cm2, 1×103 ~ 1×105세포/cm2, 또는 1×103 ~ 1×104세포/cm2의 세포 밀도로 배양 용기 상(上)에 파종할 수 있다.
배양에는, 일반적으로 외배엽성 세포의 배양에 적용되는 조건을 그대로 적용 가능하다. 배양에는, CO2 인큐베이터를 이용할 수 있고, 그 경우의 배양 온도 및 CO2 농도로서는, 일반적으로 이용되는 것이면 되고, 예를 들어, 37℃ 및 5%(v/v)로 할 수 있다.
배양 기간은, YA와 함께 배양하고 있는 기간이고, 당해 기간은, 연속하는 기간이어도 무방하고, 불연속인 기간, 즉, 불연속인 복수의 기간을 합계한 기간이어도 무방하다. 배양 기간은, 28일 초과이면 되고, 예를 들어 5주간 이상, 6주간 이상 또는 7주간 이상으로 할 수 있다. 배양 기간의 상한으로서는, 예를 들어 3개월 정도 또는 100일간으로 할 수 있다. 계대는, 배양 용기 내의 세포 밀도, 배지의 상태 또는 세포의 상태 등에 따라 적의 행할 수 있고, 계대 간격은, 예를 들어, 2 ~ 20일간 정도로 할 수 있다.
본 제조 방법에서 얻어지는 고증식성 세포(highly proliferating cells)(본 명세서에서는, 「HP 세포」라고 칭하는 경우가 있다)란, 증식능이 높여진 세포이고, 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하지 않는 배지를 이용하는 이외는 당해 세포의 배양 조건과 동일한 조건하에서 배양한 대조가 되는 외배엽성 세포와 비교하여, 세포 증식 활성이 높고, 보다 단시간에 증식하는 성질, 즉 세포 배가 시간이 보다 짧다고 하는 성질, 보다 장기간에 걸쳐 증식하는 성질, 또는 이것들 쌍방을 만족시키는 성질을 구비하고 있는 세포인 것을 의미한다. 본 제조 방법에서 얻어지는 배양물에 포함되는 세포 집단은, HP 세포뿐만 아니라, HP 세포에 더하여, 증식능이 높여져 있지 않고, 원래의 세포의 증식능과 다르지 않은 세포, 즉, 비고증식성 세포(non-highly proliferating cells)(본 명세서에서는, 「non-HP 세포」라고 칭하는 경우가 있다)를 포함할 수 있다. 본 제조 방법에서 얻어지는 세포 집단에 있어서의 HP 세포의 비율은, 세포수 기준으로 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이어도 무방하다.
고증식성 세포는, 저해제와 접촉시킨 28일 초과의 배양 기간(본 명세서에서는, 「기간 T」로 한다.) 후의 세포수(본 명세서에서는, 「고증식성 세포의 세포수 N」로 한다.)가, 저해제와 비접촉인 이외는 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 기간에 걸쳐 배양된 외배엽성 세포의 세포수(본 명세서에서는, 「외배엽성 세포의 세포수 N′」로 한다.)의 1.0배를 넘는 증식능을 가질 수 있다. 이 경우의 배양 조건으로서는, 예를 들어, 4×103세포/cm2의 파종 밀도, 37℃의 배양 온도, 5% CO2 농도로 할 수 있다. 고증식성 세포의 세포수 N을 확인할 때에 이용되는 배지에는, 상기 전 배양 및 추가 배양에 이용되는 배지로서 예로 든 것 중 모두 이용할 수 있다. 고증식성 세포의 세포수 N과 외배엽성 세포의 세포수 N′을 각각 확인할 때에 이용되는 2종류의 배지에는, 저해제의 유무 이외의 조성은 동일하게 되는 배지를 이용할 수 있다.
일 태양에 있어서, 기간 T는, 예를 들어 90일간, 80일간, 70일간, 60일간, 50일간, 45일간, 42일간, 40일간, 35일간, 32일간, 30일간 또는 29일간이다.
일 태양에 있어서, 고증식성 세포의 세포수 N은, 외배엽성 세포의 세포수 N′의 1.0배 초과이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 세포수 N′의 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상 또는 1.5배 이상이어도 무방하다. 바람직하게는, 고증식성 세포의 세포수 N이, 외배엽성 세포의 세포수 N′의 1.5배 이상이다.
고증식성 세포는, 세포 특유 유전자, 즉 마커 유전자의 발현에 의하여 특정하여도 무방하다. 고증식성 세포의 마커 유전자의 발현은, 본 명세서에 있어서 전술한 바와 같이, 유전자 및 단백질 중 어느 것에 기초하여 확인하여도 무방하고, 유전자 또는 단백질의 발현의 확인 방법은, 발현의 유무, 측정 방법에 의존한 구체적인 발현량, 특정의 세포에 있어서의 동일 유전자 또는 단백질의 발현량과의 비교 등에 의하여 행할 수 있다.
본 명세서에서는, 유전자 또는 단백질의 발현에 관하여 「양성」 또는 「음성」이라고 표현하는 일이 있다. 유전자 또는 단백질의 발현에 관하여, 「양성」이란, 대상이 되는 유전자 또는 단백질의 발현이 인정되는 경우를 의미하고, 한편, 「음성」이란, 대상이 되는 유전자 또는 단백질의 발현이 인정되지 않는 경우를 의미한다. 유전자 또는 단백질의 발현에 관하여 「발현이 높다」 혹은 「양성」, 또는 「발현이 낮다」 혹은 「음성」이라고 표현하는 경우에, 고증식성 세포와는 다른 특정의 세포를 비교 대조로 할 수 있다. 비교 대조가 되는 특정의 세포, 즉, 「대조 세포」는, 대상이 되는 유전자 또는 단백질의 발현량이 극히 낮은 세포여도 무방하고, 원료가 되는 외배엽성 세포, 즉 저해제 비접촉의 외배엽성 세포여도 무방하고, 또는, 성숙 세포 혹은 그 전구 세포여도 무방하다.
예를 들어, 고증식성 세포가, 마커 유전자의 발현에 관하여, 「양성」이라는 것은, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨 후의 당해 마커 유전자의 발현량이, 당해 저해제와 비접촉으로 배양된 외배엽성 세포에서의 당해 마커 유전자의 발현량의 1.0배 이상인 것을 의미할 수 있다. 이것에 대하여, 고증식성 세포가, 마커 유전자의 발현에 관하여, 「음성」이라는 것은, 상기 저해제와 접촉시킨 후의 당해 마커 유전자의 발현량이, 당해 저해제와 비접촉으로 배양된 외배엽성 세포에서의 당해 마커 유전자의 발현량의 1.0배 미만인 것을 의미할 수 있다.
발현량의 확인 방법에 공여하는 고증식성 세포 및 저해제와 비접촉의 외배엽성 세포의 배양 조건은, 저해제와 접촉 또는 비접촉인 것 이외는 동일하게 할 수 있지만, 예를 들어, 세포의 상태, 증식성 및 세포수 등에 기초하여, 동일한 배양 기간, 동일한 세포 계대수 및 마찬가지의 세포 밀도 등, 대상이 되는 세포가 동일 또는 극히 동일한 상태가 되도록 적의 조정할 수 있고, 당업자는 세포의 상태에 기초하여 선택 가능하다.
여기서, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨 일정 기간 이상의 배양 기간 후의 당해 마커 유전자의 발현량은, 컨트롤 유전자에 대한 발현량으로서 나타내진다. 컨트롤 유전자로서는, 예를 들어, beta-actin(ACTB) 및 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)가 사용 가능하다.
일 태양에 있어서 고증식성 세포는, 성숙 세포에 특유의 적어도 하나의 유전자를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, 전구 세포에 특유의 적어도 하나의 유전자를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「전구 세포(Progenitor cell)」란, 성숙 세포에 이르기까지의 분화 단계의 세포이고, 줄기 세포로부터 발생하여 몸을 구성하는 최종 분화 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다.
성숙 세포에 특유의 유전자, 예를 들어 아스트로사이트 등에서 비교적 높게 발현하고 있는 유전자로서는, 예를 들어, GFAP, S100B 및 SLC1A2를 들 수 있다. 전구 세포에 특유의 유전자, 예를 들어, 올리고덴드로사이트 전구 세포, 신경 상피 세포 및 방사상 글리아 세포에서 비교적 높게 발현하고 있는 유전자로서는, 예를 들어, NG2, Notch1, Nestin 및 SOX2를 들 수 있다.
고증식성 세포는, 상술한 바와 같은 높은 증식능을 가지는 세포이면, 어떠한 마커 유전자의 발현 패턴을 특징으로서 구비하는 세포여도 무방하고, 환언하면, 어떠한 특징을 구비하는 세포를 포함하는 세포 집단이어도 무방하다. 고증식성 세포는, 다음에 예로 드는 것과 같은 마커 유전자의 발현 패턴을 나타내는 것이어도 무방하다. 이것들의 마커 유전자의 발현 패턴에 따라, 본 개시에 관련되는 고증식성 세포를, 신속하게 특정하고, 추출할 수 있다.
고증식성 세포는, Musashi1(MSI1), Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 음성인 세포를 포함할 수 있다.
예를 들어, 고증식성 세포는, GFAP 양성 세포를 포함할 수 있다. 다른 일 태양에서는, 고증식성 세포는, GFAP가 양성, 또한, NG2가 양성의 세포를 포함할 수 있고, 또는, GFAP를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, NG2를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현할 수 있다. 다른 일 태양에서는, 고증식성 세포는, GFAP 및 S100B가 양성, 또한, NG2가 양성의 세포를 포함할 수 있고, 또는, GFAP 및 S100B를, 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, NG2를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현할 수 있다.
다른 일 태양에 있어서 고증식성 세포는, 성숙 세포에 특유의 적어도 하나의 유전자를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, 전구 세포에 특유의 적어도 하나의 유전자를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는 세포를 포함할 수 있다.
일 태양에 있어서, 고증식성 세포는, NG2가 양성의 세포를 포함할 수 있고, 또는, NG2를 저분자 시그널 전달 경로 저해제 비접촉의 외배엽성 세포에 있어서의 NG2의 발현량보다도 많이 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 즉, 이 태양에 있어서, 고증식성 세포는, NG2의 발현량이, 저분자 시그널 전달 경로 저해제 비접촉의 외배엽성 세포에 있어서의 NG2의 발현량보다도 높은 것이어도 무방하다.
예를 들어, 고증식성 세포는, S100B가 양성, 또한, NG2가 양성의 세포를 포함할 수 있고, 또는 S100B를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 도한, NG2를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현할 수 있다.
일 태양에 있어서, 고증식성 세포가 포함되는 상술의 세포는, Musashi1(MSI1), Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 음성이다. 즉, 고증식성 세포가 포함되는 세포는, 상기 저해제와 접촉시킨 후의, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현량이, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 비접촉으로 배양된 외배엽성 세포에서의 당해 마커 유전자의 발현량의 1.0배 미만일 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, 고증식성 세포가 포함되는 상술의 세포는, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 이상, 3 이상, 또는 이것들 모두가 음성이다.
일 태양에 있어서, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 음성인 세포의 발현량은, 컨트롤 유전자에 대한 발현량으로서 나타내질 수 있다. 이 경우, 「음성」이란, 컨트롤 유전자로서는, 예를 들어, beta-actin(ACTB) 및 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 사용하였을 때에, 컨트롤 유전자의 발현량의 1.0배 미만이다.
본 개시에 관련되는 고증식성 세포의 세포 집단은, 높은 증식능을 가지는 고증식성 세포, 특히 고증식성 외배엽성 세포이면 분화 단계는 불문하고, 성숙 세포 및 전구 세포의 양방(兩方)이 포함된 이질의 세포 집단이어도 무방하고, 혹은 비교적 분화 단계가 가까운 복수종의 외배엽성 세포가 극히 대다수를 차지하는 세포 집단이어도 무방하다.
일 태양에서는, 본 제조 방법에 의하여 얻어지는 고증식성 세포의 세포 집단은, 고증식성 외배엽성 전구 세포를 주요한 구성 성분으로서 포함하는 집단, 또는, 고증식성 외배엽성 전구 세포 및 고증식성 외배엽성 성숙 세포의 쌍방을 포함하는 집단이어도 무방하다. 여기서 세포 집단에 있어서의 「주요한 구성 성분」이란, 세포 집단에 있어서 세포수 기준으로 적어도 50%를 차지하는 세포를 의미한다. 본 명세서에 있어서 「극히 대다수」란, 세포 집단에 있어서, 대상이 되는 세포의 세포수가, 세포수 기준으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상인 것을 의미한다.
얻어진 고증식성 세포의 세포 집단에 있어서의 외배엽성 성숙 세포의 비율은, 세포수 기준으로, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만이어도 무방하다. 따라서, 본 개시는, 원료가 되는 외배엽성 세포에 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 증식능이 높여진 외배엽성 세포의 부화(富化) 방법도 포함한다. 원료가 되는 외배엽성 세포의 저분자 시그널 전달 경로 저해제와의 접촉은 인 비트로로 행할 수 있다.
본 제조 방법에 있어서, 원료가 되는 외배엽성 세포가 아스트로사이트인 경우, 고증식성 세포의 세포 집단에는, 아스트로사이트에 관련하는 외배엽성 세포 계통의 세포가 포함되어 있어도 무방하다. 아스트로사이트에 관련하는 외배엽성 세포 계통의 세포로서는, 예를 들어, 아스트로사이트, 방사상 글리아 세포, 올리고덴드로사이트 전구 세포(폴리덴드로사이트라고도 한다), 올리고덴드로사이트 및 신경 상피 세포를 들 수 있다. 덧붙여, 아스트로사이트에 관련하는 외배엽성 세포 계통의 세포 집단에는, 높여진 세포 증식능을 나타내는 세포 집단인 한, 외배엽성 세포에 볼 수 있는 특징의 일부를 구비하고, 또한, 상술한 세포 중 어느 것에도 분류할 수 없는 세포가 포함되어도 무방하다.
본 개시의 다른 측면은, 고증식성 세포에 관한 것이다. 본 고증식성 세포는, 전술의 제조 방법에 의하여 얻어지는 고증식성 세포여도 무방하고, 그 외의 제조 방법에 의하여 얻어지는 고증식성 세포여도 무방하다.
본 개시의 일 측면에 관련되는 고증식성 세포는, 외배엽성 세포의 특징을 구비하고, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨 28일 초과의 배양 기간 후의 세포수가, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 비접촉인 이외는 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 기간에 걸쳐 배양된 외배엽성 세포의 세포수의 1.0배를 넘는 증식능을 가지는, 고증식성 세포이다. 상기와 같이, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 외배엽성 세포를 접촉시키는 것에 의하여, 외배엽성 세포로의 유전자 도입 또는 유전자 개변을 수반하는 일 없이, 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 얻을 수 있다. 이것에 의하여, 저해제 비접촉군과 비교하여, 저해제 접촉군에서는, 보다 장기간에 걸쳐 배양을 행할 수 있고, 얻어지는 세포수에 관하여도, 저해제 접촉군의 세포수는, 저해제 비접촉군의 세포수에 대하여 많다.
일 태양에서는, 인간 초대 성숙 아스트로사이트를 TGFβ 수용체 저해제 및 ROCK 저해제의 조합과 접촉시켜 배양하여 얻어진 세포군(저해제 접촉군)과, 인간 초대 성숙 아스트로사이트를 당해 저해제의 조합과 접촉시키지 않고 배양하여 얻어진 세포군(저해제 비접촉군)을 비교하여, 저해제 접촉군에서는, 보다 장기간에 걸쳐 배양을 행할 수 있다. 즉, 저해제 접촉군에서는, 저해제 비접촉군에 비교하여, 보다 장기간, 세포의 증식이 계속한다. 또한, 증식에 의하여 최종적으로 얻어지는 세포수에 관하여는, 저해제 접촉군의 세포수는, 저해제 비접촉군의 세포수에 대하여, 예를 들어 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 또는 400배이다.
이와 같이, 얻어진 고증식성 세포는 세포 증식능을 높여져 있기 때문에, 장기 배양에 의하여 다수의 세포를 얻을 수 있다. 고증식성 세포는, 이하에서 설명하는 바와 같은 세포 분비물을 생성 가능하기 때문에, 장기 배양에 의하여 다수의 세포가 얻어지면, 회수할 수 있는 세포 분비물의 양도 증가할 수 있다.
본 측면에 관련되는 고증식성 세포에 관하여는, 본 제조 방법의 제조 결과물로서 기재한 사항을 그대로 적응한다. 다만, 세포로서, 외배엽성 세포의 특징을 구비하고, 저해제와 접촉시킨 28일 초과의 배양 기간 후의 세포수가, 저해제와 비접촉인 이외는 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 기간에 걸쳐 배양된 외배엽성 세포의 세포수의 1.0배를 넘는 증식능을 가지는 한, 본 제조 방법의 제조 결과물인 것에 한정되지 않는다.
본 개시의 고증식성 세포는, 상술한 바와 같이, GFAP, NG2 및 S100B로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 양성인 세포를 포함할 수 있다. 고증식성 세포는, 예를 들어 이하의 세포 (I) ~ (VII)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다：
(I) GFAP 양성 세포, 예를 들어, GFAP를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는 세포；
(II) NG2 양성 세포, 예를 들어, NG2를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는 세포；
(III) S100B 양성 세포, 예를 들어, S100B를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는 세포；
(IV) GFAP가 양성, 또한, NG2가 양성의 세포, 예를 들어, GFAP를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, NG2를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는 세포；
(V) GFAP가 양성, 또한, S100B가 양성의 세포, 예를 들어, GFAP를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, S100B를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는 세포；
(VI) S100B가 양성, 또한, NG2가 양성의 세포, 예를 들어, S100B를, 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, NG2를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는 세포；
(VII) GFAP가 양성, S100B가 양성, 또한, NG2가 양성의 세포, 예를 들어, GFAP를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, S100B를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, NG2를 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는 세포.
본 개시의 고증식성 세포는, SLC1A2가 양성인 세포를 포함할 수도 있다. 구체적으로는, 고증식성 세포는, 상기의 유전자의 적어도 하나가 양성이고, 또한, SLC1A2가 양성인 세포를 포함할 수도 있다.
본 개시의 고증식성 세포가, 적어도 GFAP가 양성의 세포를 포함하는 경우, 바람직하게는, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨 후의 GFAP 유전자의 발현량이, 당해 저해제와 비접촉으로 배양된 외배엽성 세포에서의 GFAP 유전자의 발현량의 1.0배 이상 4.0배 미만이다.
본 개시의 고증식성 세포는, GFAP, NG2, 및 S100B로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 양성이고, 또한, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로부터 선택되는 적어도 하나가 음성인 세포를 포함할 수 있다. 즉, 이 태양에 있어서, 상기 (I) ~ (VII)의 세포는, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로부터 선택되는 적어도 하나가 음성이다.
고증식성 세포의 단리에는, 특정의 세포를 단리하는 공지의 수단을 적용할 수 있고, 예를 들어, 전술한 마커 유전자에 유래하는 단백질의 발현에 기초하는 형광 활성화 세포 분류(Fluorescence-activated cell sorting；FACS)법, 및, 다이나비즈(Dynabeads) 등을 이용한 자기 세포 분리법을 이용할 수 있다. 얻어지는 고증식성 세포의 증식능이 높기 때문에, 장기 배양을 행하는 것에 의하여 고증식성 세포의 비율이 극히 높은 세포 집단을 얻는 것으로, 고증식성 세포를 실질적으로 단리하는 것이어도 무방하다.
<2> 외배엽성 전구 세포 및 그 제조 방법
본 개시에 관련되는 제조 방법에 의하여 얻어지는 고증식성 세포에는, 출발 재료인 원료가 되는 외배엽성 세포보다도 미성숙인 분화 단계의 특징을 나타내는 세포가 포함되어 있어도 무방하다. 이와 같은 미성숙 단계의 외배엽성 세포, 즉 외배엽성 전구 세포는, 저해제를 포함하지 않는 배지를 이용하는 이외는 당해 세포의 배양 조건과 동일한 배양 조건에서 배양한 대조가 되는 외배엽성 세포와 비교하여 세포 증식 활성이 높고, 보다 단시간에 증식하는 성질, 보다 장기간에 걸쳐 증식하는 성질, 또는 이것들 쌍방을 만족하는 성질을 구비할 수 있다. 이 고증식성을 나타내는 외배엽성 전구 세포를, 본 명세서에서는 고증식성 전구 세포라고 칭하는 경우가 있다. 본 명세서에 있어서의 「고증식성 세포」에는, 고증식성 전구 세포를 포함하는 일이 있다. 이것에 의하여, 미성숙 단계의 외배엽성 세포를 보다 장기에 걸쳐 성육시켜, 예를 들어, 외배엽성 전구 세포가 생성하는 세포 분비물을, 대조가 되는 외배엽성 세포와 비교하여, 보다 단시간에 대량으로 얻을 수 있는 등의 이점을 가진다.
본 개시의 다른 측면은, 외배엽성 전구 세포의 제조 방법에 관하여, 상기 외배엽성 전구 세포는, 고증식성 세포이고, 당해 제조 방법은,
(i) 원료가 되는 외배엽성 세포를 준비하는 것,
(ii) 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하는 배지 중에서, 당해 저해제를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포에 접촉시켜, 28일 초과의 기간에 걸쳐 배양하는 것, 및,
(iii) 상기 접촉 후, 상기 저해제를 포함하는 배지 중에서 추가 배양을 행하고, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포보다도 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 포함하는 배양물을 얻는 것
을 포함한다. 본 개시의 외배엽성 전구 세포의 제조 방법은, 상기 배양물로부터, 상기 고증식성 세포를 단리하는 것을 더 포함하여도 무방하다.
본 개시의 외배엽성 전구 세포의 제조 방법에 있어서의, 원료가 되는 외배엽성 세포, 및, 저분자 시그널 전달 경로 저해제로서는, 예를 들어, 본 개시의 고증식성 세포의 제조 방법에 관하여 기재한, 원료가 되는 외배엽성 세포, 및, 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 각각 사용할 수 있다.
고증식성 전구 세포의 단리에는, 특정의 세포를 단리하는 공지의 수단을 적용할 수 있고, 예를 들어, 전구 세포에 특유의 전술한 마커 유전자에 유래하는 단백질의 발현에 기초하는 형광 활성화 세포 분류(Fluorescence-activated cell sorting；FACS)법, 및, 다이나비즈(Dynabeads) 등을 이용한 자기 세포 분리법을 이용할 수 있다. 얻어지는 고증식성 전구 세포의 증식능이 높기 때문에, 장기 배양을 행하는 것에 의하여 고증식성 전구 세포의 비율이 극히 높은 세포 집단을 얻는 것으로, 고증식성 전구 세포를 실질적으로 단리하는 것이어도 무방하다.
본 개시에 관련되는 제조 방법에 의하여 얻어지는 고증식성 세포에서는, 출발 재료인 원료가 되는 외배엽성 세포가, 최종 분화 단계로 도달한 아스트로사이트를 포함하는 경우, 얻어진 고증식성 세포에는, 아스트로사이트보다도 미성숙인 분화 단계의 특징을 나타내는 세포가 포함되어 있어도 무방하다. 이와 같은 미성숙 단계의 외배엽성 세포는, 높여진 증식능을 가지는 것에 더하여, 한층 더, 이하의 (a) 또는 (b)의 특성을 가질 수 있다：
(a) 아스트로사이트와 비교하여, GFAP 및 S100B의 조합, GFAP 및 SLC1A2의 조합, S100B 및 SLC1A2의 조합, GFAP 및 NG2의 조합, NG2 및 SLC1A2의 조합, 또는 NG2 및 S100B의 조합의 발현량이 증가하고 있다.
(b) 아스트로사이트와 비교하여, GFAP, S100B 및 NG2의 조합, GFAP, SLC1A2 및 NG2의 조합, S100B, SLC1A2 및 NG2의 조합, 또는 GFAP, S100B, SLC1A2 및 NG2의 조합의 발현량이 증가하고 있다.
본 개시의 한층 더 다른 측면은, 본 개시에 관련되는 외배엽성 전구 세포 및 그 용도에 관한 것이다.
상기 제조 방법에 의하여 얻어진 외배엽성 전구 세포는, 예를 들어, 신경 장해 치료제의 평가 방법에 사용할 수 있다. 구체적으로는, 신경 장해 치료제의 후보 약제를, 상기 외배엽성 전구 세포와 접촉시키는 것에 의하여, 신경 장해 치료제의 후보 약제의 유용성을 평가할 수 있다. 따라서, 본 개시는, 신경 장해 치료제의 후보 약제를, 상기 외배엽성 전구 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 신경 장해 치료제의 평가 방법에도 관한 것이다. 나아가서는, 전술의 외배엽성 전구 세포를 사용하는 것을 포함하는, 신경 질환 모델의 평가 방법에도 관한 것이다.
본 개시는 한층 더, 본 개시에 관련되는 제조 방법에 의하여 얻어진 외배엽성 전구 세포를, 성숙 조건하에 제공하여 외배엽성 전구 세포의 분화를 유도하고, 외배엽성 성숙 세포를 얻는 것을 포함하는, 외배엽성 성숙 세포의 제조 방법에도 관한 것이다.
여기서 「성숙 조건하」란, 기지의 분화 유도 인자를 이용한 배양 조건을 의미한다. 분화 유도 인자로서는, 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자-2(Fibroblast growth factor-2；FGF-2)； 백혈병 저해 인자(Leukemia inhibitory factor；LIF) 또는 모양체 신경 영양 인자(Ciliary neurotrophic factor；CNTF) 등의 IL-6 패밀리 사이토카인； BMP2 또는 BMP4 등의 Bone morphogenetic protein(BMP) 패밀리 사이토카인, Notch 패밀리 단백질； Wnt 유전자 패밀리 단백질； 소닉ㆍ헤지호그 단백질； 및 레티노산을 들 수 있다. 나아가 성숙 세포의 증식 또는 유지에 필요한 인자로서, 예를 들어, 신경 성장 인자(Nerve growth factor；NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor；BDNF), Neurotrophin-3(NT-3), Neurotrophin-4/5(NT-4/5), 및 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor；PDGF)를 들 수 있다.
분화 유도 인자를 이용한 배양 조건으로서는, 분화 유도 인자에 의한 분화 유도 방법에 있어서 적용되는 기지의 분화 유도 조건을 적용할 수 있고, 당해 분화 유도 조건은, 이용하는 분화 유도 인자의 종류에 의하여 적의 선택할 수 있다.
<3> 저해제의 용도
전술의 제조 방법에서 사용되는 저해제는, 외배엽성 세포의 증식능을 유지 또는 촉진시키기 위하여 이용할 수 있다. 따라서, 본 개시의 가일층의 측면은, 저분자 시그널 전달 경로 저해제, 예를 들어 TGFβ 수용체 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 외배엽성 세포의 증식성 조정제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시는, 전술의 제조 방법에 의하여 얻어지는 고증식성 세포, 또는 외배엽성 세포의 증식능을 유지 또는 촉진시키기 위하여 사용되는, 증식성 조정제에도 관한 것이다. 여기서, 본 명세서에 있어서, 용어 「증식성 조정」이란, 세포의 증식 유지 및 증식 촉진 중 적어도 일방(一方)을 달성하는 것을 의미할 수 있다. 용어 「증식 유지」 및 「증식 촉진」에 관하여는, 세포가 배양 기간에 걸쳐 세포수가 유지 또는 증가하고 있는 한, 특별히 구별되지 않는다. 세포의 증식성 조정을 위한 증식성 조정제의 사용 농도로서는, 전술한 제조 방법에 있어서의 사용 농도에 관하여 기술한 농도를 그대로 적용할 수 있다.
나아가 본 개시는, 전술의 제조 방법에 의하여 얻어지는 고증식성 세포 또는 외배엽성 세포의 배양 방법으로서, 저분자 시그널 전달 경로 저해제, 예를 들어 TGFβ 수용체 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 저해제의 존재하에서, 상기 세포 집단 또는 상기 세포를 계대 배양하는 것을 포함하는, 배양 방법에 관한 것이다. 여기서, 「배양 방법」에는, 고증식성 세포 또는 외배엽성 세포의 증식성 조정 방법이 포함되는 것으로 한다. 본 배양 방법에 이용하는 경우의 저해제의 사용 농도로서는, 전술한 제조 방법에 있어서의 사용 농도에 관하여 기술한 농도를 그대로 적용할 수 있다.
<4> 세포 분비물 및 그 제조 방법
본 개시의 한층 더 다른 측면은, 본 개시에 관련되는 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물을 포함하는 배양물을 얻는 것, 및, 상기 세포 분비물을, 상기 배양물로부터 분리하는 것을 포함하는, 세포 분비물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 제조 방법은, 필요에 따라 임의의 공정을 더 포함하여도 무방하다. 본 개시에 관련되는 고증식성 세포는, 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포이기 때문에, 저해제를 포함하지 않는 배지를 이용하는 이외는 당해 고증식성 세포의 배양 조건과 동일한 배양 조건에서 배양한 대조가 되는 세포와 비교하여, 보다 단시간에 증식하고, 보다 장기간에 걸쳐 증식하고, 또는 보다 단시간에 증식하는 것과 함께 장기간에 걸쳐 증식한다. 따라서, 본 세포 분비물의 제조 방법에서는, 고증식성 세포가 분비하는 세포 분비물을, 대조가 되는 세포와 비교하여, 보다 단시간에 대량으로 얻을 수 있다.
세포 분비물은, 「세크레톰」이라고도 칭하여지고, 세포로부터 분비되는 물질이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 엑소좀, 마이크로베시클, 아포토시스 소포 등의 세포 외 소포； 사이토카인, 호르몬, 항체 등의 기능성 단백질 등을 들 수 있다. 일 태양에서는, 세포 분비물은, 세포 외 소포여도 무방하고, 그 중에서도, 엑소좀이어도 무방하다.
본 개시에 관련되는 세포 분비물의 제조 방법에 있어서 준비되는 배양물은, 상기 중 어느 하나의 태양에 의하여 얻어진 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물을 포함한다. 세포 분비물을 포함하는 배양물은, 본 개시에 관련되는 고증식성 세포의 제조 방법을 실시하여 제조한 것이어도 무방하고, 본 개시에 관련되는 고증식성 세포를 입수하여 배양하는 것으로 얻은 것이어도 무방하고, 본 개시에 관련되는 제조 방법을 실시하는 것으로 얻어진 배양물을 별도 입수한 것이어도 무방하고, 본 개시에 관련되는 고증식성 세포의 배양물을 별도 입수한 것이어도 무방하다. 본 명세서에 있어서 「배양물」이란, 세포를 배양하는 것에 의하여 얻어지는 배양 세포와 배양 상청(순화 배지(conditioned medium))과의 조합을 의미한다.
본 개시에 관련되는 세포 분비물의 제조 방법은, 상기 세포 분비물을, 상기 배양물로부터 분리하는 것을 포함한다. 배양물로부터의 세포 분비물의 분리 방법에는, 예를 들어, 상청의 제거 및 원심 분리 등의 공지의 분리 방법을 사용할 수 있다. 배양물로부터 분리된 세포 분비물은, 세포 분비물을 함유하는 조성물의 형태로 얻어도 무방하다. 세포 분비물이 세포 분비물을 함유하는 조성물, 즉 세포 분비물 함유 조성물인 경우, 세포 분비물 함유 조성물은, 세포 분비물 및 수성 매체를 포함할 수 있다. 수성 매체로서는, 세포 분비물의 종류 등에 따라 선택되는 공지의 수성 매체이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 배양 상청, 물, 완충액(예를 들어, 인산 완충액, 굿 완충액), 생리 식염수 및 배지를 들 수 있다.
세포 분비물의 제조 방법은, 나아가, 분리된 세포 분비물을 정제 또는 단리하는 것을 포함할 수 있다. 세포 분비물의 정제 방법 또는 단리 방법으로서는, 세포 분비물의 종류에 따라 공지의 방법을, 특별히 제한없이 적용할 수 있다.
세포 분비물의 단리 또는 정제 방법으로서는, 예를 들어, 여과 및 농축을 들 수 있다. 예를 들어, 사이즈 또는 분자량 컷오프값을 가지는 막을 이용하여 여과를 행하여, 세포 분비물을 단리 또는 정제할 수 있다. 다른 방법으로서, 예를 들어, 탄젠셜 플로우 필터레이션 또는 한외 여과를 이용하여, 세포 분비물을 여과 또는 농축하여도 무방하다. 세포 분비물은, 세포 분비물을 함유하는 조성물의 형태, 또는 단리 혹은 정제 후에 얻어지는 단리 세포 분비물의 형태로, 사용할 수 있다. 세포 분비물은, 조성물 혹은 단리 세포 분비물의 형태인 채로, 또는 분무 건조, 동결 건조 처리 등의 공지의 처리에 제공하는 것에 의하여, 보관, 냉장 보존 또는 냉동 보존할 수 있다.
본 개시에 관련되는 세포 분비물은, 구체적으로는, 단백질 및/또는 miRNA를 포함하는 세포 분비물로서, 단백질은, 도 4a 및 도 4b에 도시하는 것으로부터 선택되고, miRNA는, 도 5 ~ 10에 도시하는 것으로부터 선택된다. 도 4a 및 도 4b에 있어서, 각 단백질명에 이어지는 괄호 내의 기재는, UniProtKB/Swiss-Prot(https://www.uniprot.org/)에 있어서의 액세션 번호를 의미한다. 도 5 ~ 도 10에 있어서, 각 miRNA명에 이어지는 괄호 안의 기재는, miRBase(Release 21)(https://www.mirbase.org/)에 있어서의 액세션 번호를 의미한다. 세포 분비물은, 이것들의 단백질로부터 선택되는 적어도 하나, 또는 이것들의 miRNA로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것이면 되고, 이것들의 단백질로부터 선택되는 적어도 하나와, 이것들의 miRNA로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것이어도 무방하다.
일 실시 형태에 있어서 세포 분비물은, 단백질로서,
ㆍ PA군： 빈쿨린(P18206), 인테그린 β-1, CD29(P05556), 피루브산 키나아제 M1/2(P14618), 및 에프린 타입-A 수용체 2(P29317)의 조합을 적어도 포함하는 것이어도 무방하고,
ㆍ PB군： 빈쿨린(P18206), 인테그린 β-1, CD29(P05556), 피루브산 키나아제 M1/2(P14618), 및 에프린 타입-A 수용체 2(P29317)의 조합과, 아미노펩티다아제 N(P15144), 아넥신 A2(P07355), 아넥신 A6(P08133), 미오페린(Q9NZM1), 및 5′-뉴클레오티다아제, CD73(P21589)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 적어도 포함하는 것이어도 무방하고,
ㆍ PC군： 빈쿨린(P18206), 인테그린 β-1, CD29(P05556), 피루브산 키나아제 M1/2(P14618), 및 에프린 타입-A 수용체 2(P29317)의 조합과, 아미노펩티다아제 N(P15144), 아넥신 A2(P07355), 아넥신 A6(P08133), 미오페린(Q9NZM1), 및 5′-뉴클레오티다아제, CD73(P21589)의 조합과, 모에신(P26038), 인테그린 α-2, CD49b(P17301), 인테그린 α-3, CD49c(P26006), 2′,3′-환상(環狀) 뉴클레오티드 3′-포스포디에스테라아제(P09543), F액틴 캡핑 단백질 β 서브유닛(P79136), 뉴로필린 1(O14786) 및 테나신 C(P24821)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것이어도 무방하고, 혹은,
ㆍ PD군： 도 4a 및 도 4b에 기재된 모든 단백질을 포함하는 것이어도 무방하다.
일 실시 형태에 있어서 세포 분비물은, miRNA로서,
ㆍ RA군： hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-155-5p(MIMAT0000646), hsa-miR-379-5p(MIMAT0000733), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-21-5p(MIMAT0000076), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-409-3p(MIMAT0001639), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), 및 hsa-let-7f-5p(MIMAT0000067)의 조합을 적어도 포함하는 것이어도 무방하고,
ㆍ RB군： hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-155-5p(MIMAT0000646), hsa-miR-379-5p(MIMAT0000733), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-21-5p(MIMAT0000076), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-409-3p(MIMAT0001639), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), 및 hsa-let-7f-5p(MIMAT0000067)의 조합과, hsa-miR-151a-3p(MIMAT0000757), hsa-miR-93-5p(MIMAT0000093), hsa-miR-29a-3p(MIMAT0000086), hsa-miR-9-5p(MIMAT0000441), hsa-miR-25-3p(MIMAT0000081), hsa-miR-92a-3p(MIMAT0000092), hsa-miR-34a-5p(MIMAT0000255), hsa-miR-26a-5p(MIMAT0000082), hsa-miR-26b-5p(MIMAT0000083), hsa-miR-29a-3p(MIMAT0000086), hsa-miR-9-5p(MIMAT0000441), hsa-miR-155-5p(MIMAT0000646), hsa-miR-92a-3p(MIMAT0000092), hsa-miR-103a-3p(MIMAT0000101), 및 hsa-miR-26a-5p(MIMAT0000082)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 적어도 포함하는 것이어도 무방하고,
ㆍ RC군： hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-155-5p(MIMAT0000646), hsa-miR-379-5p(MIMAT0000733), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-21-5p(MIMAT0000076), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-409-3p(MIMAT0001639), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), 및 hsa-let-7f-5p(MIMAT0000067)의 조합과, hsa-miR-151a-3p(MIMAT0000757), hsa-miR-93-5p(MIMAT0000093), hsa-miR-29a-3p(MIMAT0000086), hsa-miR-9-5p(MIMAT0000441), hsa-miR-25-3p(MIMAT0000081), hsa-miR-92a-3p(MIMAT0000092), hsa-miR-34a-5p(MIMAT0000255), hsa-miR-26a-5p(MIMAT0000082), hsa-miR-26b-5p(MIMAT0000083), hsa-miR-29a-3p(MIMAT0000086), hsa-miR-9-5p(MIMAT0000441), hsa-miR-155-5p(MIMAT0000646), hsa-miR-92a-3p(MIMAT0000092), hsa-miR-103a-3p(MIMAT0000101), 및 hsa-miR-26a-5p(MIMAT0000082)의 조합과, hsa-miR-128-3p(MIMAT0000424), hsa-miR-222-3p(MIMAT0000279), hsa-miR-31-5p(MIMAT0000089), hsa-miR-381-3p(MIMAT0000736), hsa-miR-128-3p(MIMAT0000424), hsa-miR-24-3p(MIMAT0000080), hsa-miR-26b-5p(MIMAT0000083), hsa-miR-24-3p(MIMAT0000080), hsa-miR-30a-3p(MIMAT0000088), hsa-miR-31-5p(MIMAT0000089), hsa-miR-128-3p(MIMAT0000424), hsa-miR-23a-3p(MIMAT0000078), hsa-miR-24-3p(MIMAT0000080), hsa-let-7d-5p(MIMAT0000065), 및 hsa-miR-654-3p(MIMAT0004814)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 적어도 포함하는 것이어도 무방하고, 혹은,
ㆍ RD군： 도 5 ~ 도 10에 기재된 모든 miRNA를 포함하는 것이어도 무방하다.
다른 일 실시 형태에 있어서 세포 분비물은, 단백질로서, 상술한 PA군, PB군, PC군 또는 PD군의 단백질군과, miRNA로서, 상술한 RA군, RB군, RC군 또는 RD군의 miRNA군을 포함하는 것이어도 무방하다. 이것에 의하여, 일 실시 형태에 관련되는 세포 분비물은, 이것들의 단백질 및 miRNA에 기인한 기지의 작용을 가지는 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
일 태양에 있어서, 세포 외 소포는, 지질 이중층을 포함하는 소포이다. 세포 외 소포의 직경은, 예를 들어, 50nm ~ 5μm, 또는 50nm ~ 1000nm이다. 세포 외 소포의 하나인 엑소좀의 직경은, 예를 들어 50nm ~ 200nm이다. 엑소좀은, 단백질, 핵산, 당질, 지질 등의 다양한 생리 활성 물질을 포함하는 것으로부터, 질환의 치료 및 진단법, 의약품, 화장품 등으로의 이용이 기대된다.
엑소좀은, 접착 세포로부터 배양물 중, 특히, 배양 상청 중에 분비된다. 또한, 엑소좀은, 비접착 세포가 세포 현탁액 중에 존재하는 경우, 비접착 세포로부터 배양 상청 중 또는 세포 현탁액 중에 분비된다. 접착 세포 또는 비접착 세포에 유래하는 엑소좀으로서는, 외배엽성 접착 세포 또는 외배엽성 비접착 세포로부터 얻을 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 저널ㆍ오브ㆍ콘트롤드ㆍ릴리즈 323권, 225페이지 ~ 239페이지(2020년)에 기재되어 있는 엑소좀을 들 수 있다.
엑소좀은, 분자량, 크기, 형상, 조성 또는 생물 활성에 기초하여 단리할 수 있다. 구체적으로는, 초원심 분리에 의한 침강물의 분취, 밀도 구배 초원심에 의한 분획의 분취, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용한 분취, 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, CIMmultusTM EV(BIA separations제))를 이용한 분취, 단백질(예를 들어, MagCaptureTM 엑소좀 아이솔레이션 키트 PS(후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤))을 이용한 포착에 의한 분취, 항체를 이용한 포착에 의한 분취, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리머를 이용한 침전물의 분취 등에 의하여 단리할 수 있다. 이것들의 방법은, 하나 또는 복수를 조합하여 실시할 수 있다.
엑소좀의 성질은, 세포 분비물로서의 엑소좀의 제조 방법에 있어서, 엑소좀의 활성을 추적하기 위하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀의 활성은, 정적 광산란, 동적 광산란, 자외 가시 검출기, 형광 검출기 또는 시차 굴절률 검출기를 사용하여 확인할 수 있다.
순도 좋게 엑소좀을 얻는 관점으로부터, 엑소좀의 단리 또는 정제에 있어서, 통상, 얻어진 고증식성 세포가 포함되는 배양용 배지를, 회수용 배지로 교환하여, 추가 배양을 행할 수 있다. 회수용 배지는, 구체적으로는, 배양 상청 회수용 배지이다. 추가 배양은, 배양용 배지에 의한 배양 후에 행하는 회수용 배지에 의한 단시간의 배양을 의미한다. 추가 배양의 기간은, 예를 들어 6시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 36시간 이상, 48시간 이상, 또는 60시간 이상으로 할 수 있고, 예를 들어, 96시간 이하, 또는 72시간 이하로 할 수 있다. 추가 배양을 하는 것에 의하여, 고증식성 세포와는 다른 기원에 유래하는 엑소좀이고 배양용 배지에 포함될 수 있는 엑소좀의 혼입률을 낮춰, 목적으로 하는 고증식성 세포에 유래하는 엑소좀의 순도를 올릴 수 있다.
회수용 배지로서는, 예를 들어, 혈청 무첨가의 배지 및 엑소좀 제거 처리가 끝난 배지를 들 수 있다. 시판의 엑소좀 제거 처리가 끝난 배지로서는, 예를 들어, FBS exosome-depleted, OneShot format(Gibco(등록 상표), Thermo Fisher Scientific)를 들 수 있다.
회수용 배지를 이용하였을 경우에는, 추가 배양 후에, 원심 분리를 실시하여, 엑소좀 함유 조성물로서 배양 상청을 분취하고, 필요에 따라, 분취된 배양 상청을 상술한 엑소좀의 단리 또는 정제 방법에 제공하는 것에 의하여, 엑소좀을 얻을 수 있다.
<5> 고증식성 세포 및 세포 분비물의 용도
일 실시 형태에 관련되는 고증식성 세포로부터 분리된 세포 분비물, 예를 들어, 상기와 같이 하여 분리 또는 정제된 엑소좀은, 다양한 세포종에 대한 다양한 작용, 예를 들어, 신경 돌기 신장 억제 작용, 신경 돌기 신장 작용, 신경 돌기 네트워크 형성 작용, 신경 세포사 예방 작용 및 신경 세포 증식 촉진 작용을 가지는 것이 예상된다. 이것들의 기능에 기초하여 말초 신경 세포 또는 중추 신경 세포에 관계하는 장해에 대한 예방 또는 치료용의 의약 조성물로서의 유용성이 기대된다.
예를 들어, 고증식성 세포로부터 분리된 세포 분비물의 신경 돌기 신장 억제 작용은, 말초 신경 세포의 분화에 관하여, 보다 미분화된 세포로부터 말초 신경 세포, 특히 교감 신경 세포로의 분화를 억제할 수 있다. 이 때문에, 본 개시에 관련되는 세포 분비물을 말초 신경 세포에 대하여 이용하는 것에 의하여, 말초 신경계, 특히 교감 신경계를 억제하는 것을 기대할 수 있다. 또한 예를 들어, 고증식성 세포로부터 분리된 세포 분비물을 중추 신경 세포에 대하여 이용하는 것에 의하여, 그 신경 돌기 신장 작용, 신경 돌기 네트워크 형성 작용, 신경 세포사 예방 작용 및 신경 세포 증식 촉진 작용 등에 기초하여, 중추 신경계를 활성화하는 것을 기대할 수 있다.
따라서, 고증식성 세포로부터 분리된 치료 또는 예방으로서의 유효량의 세포 분비물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물, 및, 본 의약 조성물을 대상으로 투여하는 것을 포함하는 치료 또는 예방 방법도 본 개시의 범위에 포함된다. 본 명세서에 있어서 「치료」라는 문언에는, 장해의 근치뿐만 아니라, 완화 및 관해(寬解) 등, 장해의 증상의 개선도 포함된다.
치료 또는 예방 대상의 장해로서는, 말초 신경 세포 또는 중추 신경 세포에 관계하는 장해이면 되고, 예를 들어, 암, 동통, 알츠하이머병, 파킨슨병, 우울증, 통합 실조증 및 치매증으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 말초 신경 세포, 특히, 교감 신경 세포에 관계하는 장해로서는, 예를 들어, 교감 신경 세포에 관계하는 암, 동통 등을 들 수 있다. 중추 신경 세포에 관계하는 장해는, 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 우울증, 통합 실조증 및 치매증으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
약학적으로 허용 가능한 담체로서는, 특히 제한은 없고, 당해 분야에서 공지의 것이 사용되고, 예를 들어 생리 식염수 등을 들 수 있다. 나아가, 상기 작용에 관련하여, 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물, 구체적으로는 엑소좀을 신경 세포, 예를 들어 교감 신경 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 교감 신경계의 억제 방법, 신경 돌기의 신장 억제 방법 등도 본 개시의 범위에 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「~」를 이용하여 나타내진 수치 범위는, 「~」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다. 본 명세서에 단계적으로 기재되어 있는 수치 범위에 있어서, 어느 단계의 수치 범위의 상한값 또는 하한값은, 다른 단계의 수치 범위의 상한값 또는 하한값과 임의로 조합할 수 있다.
본 개시는, 이하의 일본국 특허 출원에 기초하는 것이고, 당해 일본국 특허 출원에 의한 우선권의 이익을 향수(享受)하는 것이다. 또한, 이하의 일본국 특허 출원의 전체의 내용이 참조에 의하여 본 개시에 편입된다：
「고증식성 세포의 제조 방법, 고증식성 세포 및 그 용도」라는 제목으로 2021년 7월 29일에 제출된 일본국 특허출원 제2021-124172호.
본 개시에 기재된 모든 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격은, 참조에 의하여 그 전체가 본 개시에 편입된다.
실시예
실시예 1： 저해제 첨가 배지에 의한 인간 아스트로사이트의 장기 배양
이하에 나타내는 재료 및 시약, 배양용 제품을 이용하여, 인간 아스트로사이트의 장기 배양을 행하였다.
<재료>
ㆍ Normal Human Astrocytes(NHA)(CC-2565, Lonza)
<사용 시약 및 배양용 제품>
ㆍ 배양용 배지： AGM Astrocyte Growth Medium Bullet Kit(CC-3186, Lonza)(AGM의 조성: 기초 배지, FBS(3%(v/v)), L-글루타민, 아스코르브산, hEGF, 인슐린, 항생 물질),
ㆍ 저해제 Y： CultureSure(등록 상표) Y-27632(034-24024, 후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤), 최종 농도：10μM,
ㆍ 저해제 A： CultureSure(등록 상표) A-83-01(035-24113, 후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤), 최종 농도：0.5μM,
ㆍ 세포 박리제： Accutase(AT104, ICT),
ㆍ 세포용 완충액： 인산 완충염 수용액(둘베코； 칼슘 및 마그네슘 불포함)(BNDSBN200, KAC),
ㆍ 세포 동결용 배지： CELLBANKER 1(CB011 TaKaRa(니혼 젠야쿠 고교 가부시키가이샤(日本全藥工業株式會社))),
ㆍ 세포 배양용 디시 60mm(150462, Thermo Fisher Scientific),
ㆍ 세포 배양용 디시 100mm(150466, Thermo Fisher Scientific),
ㆍ 세포 배양용 디시 150mm(150468, Thermo Fisher Scientific),
ㆍ Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System(S2GPU02RE, Merck Millipore),
ㆍ 배양 상청 회수용 저해제 비함유 배지： DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)(C11995500CP, Gibco(등록 상표), Thermo Fisher Scientific) 및 N-2 Supplement(100×)(17502-048, Gibco(등록 상표), Thermo Fisher Scientific)
<장기 배양의 수순(手順)>
장기 배양은 하기의 수순에 따라 행하였다. 인간 아스트로사이트 세포(NHA)의 동결 튜브를 37℃의 워터 배스로 융해하였다. 그 다음에, 융해 후의 세포를 합계 10mL가 되도록 배양용 배지로 옮기고, 180×g, 3분간, 실온에서 원심 분리에 제공한 후, 배지를 제거하였다. 세포를 저해제 Y만 첨가군(이하, NHA-Y군), 저해제 A만 첨가군(이하, NHA-A군), 저해제 Y＋저해제 A 첨가군(이하, NHA-YA군), 무첨가군(Normal군)의 4군으로 나누어, 재차, 배양용 배지에 현탁하고, 6웰 플레이트(세포 배양용 멀티 디시 6 well(140675, Thermo Fisher Scientific. 이하, 생략)로 4.2×103세포/cm2의 파종 밀도로 파종하였다. 다음날, 배지를, 표 2에 기재대로 각 군에 대하여 각 저해제 함유(또는 비함유) 배양용 배지(각 저해제의 농도는, 상술대로)로 교환하고, 배양을 계속시켰다. 배양 기간 중, 현미경에 의한 세포의 관찰과 사진 촬영을 행하였다.
배지 교환은, 1일 또는 2일 간격으로 하고, 각각 저해제 함유(또는 비함유)의 신선한 배양용 배지로 교환하였다. 80 ~ 90% 컨플루언트로 도달한 부근에서 세포 박리제를 이용하여 세포를 벗기고, 각 저해제 함유(또는 비함유) 배양용 배지에 현탁하여, 6웰 플레이트에 4.2×103세포/cm2의 파종 밀도로 계대하였다. 계대를 섞으면서 41일간, 각 저해제 함유(또는 비함유) 배양용 배지에서 배양을 행하였다.
각 군의 세포의 계대 횟수와 최종 계대일까지의 일수를 하기 표 1에, 배양 일수와 총 세포수와의 관계를 표 2에, 각각 나타낸다.
표 1에 나타내지는 대로, Normal군에서는, 저해제 접촉 후 22일간 경과 후에 증식이 정지하였지만, NHA-YA군에서는, 최대 저해 시 접촉 후 37일간, 세포의 증식이 계속한 것을 알았다. 나아가, 표 2로부터 알 수 있는 대로, 증식에 의하여 얻어진 세포수에 관하여도, NHA-YA군의 세포수는, Normal군의 세포수의 약 400배였다. 모든 실험군에 있어서, 최종 계대일 이후, 배지 교환하면서 배양 개시 후 41일째까지 계속 관찰하였다. 배양 개시 후 41일째의 세포 형태(100배로 확대)를 도 1에 나타낸다. 덧붙여, 도 1에 있어서 「P」는 계대수를 나타내고, 예를 들어 「Y-P5」란, 5계대 세포이고, 저해제 Y를 포함하는 배지를 이용하여 배양된 세포군인 것을 의미한다.
실시예 2： 배양 상청 중의 엑소좀의 회수 및 확인
<인간 아스트로사이트 세포의 배양 상청의 회수>
이하의 수순을 따라, YA 함유 배양용 배지 또는 저해제 비함유 배지를 이용하여 인간 아스트로사이트 세포를 배양하였을 때의 배양 상청을 각각 회수하였다.
(1) YA 함유 배양용 배지에서의 인간 아스트로사이트 세포의 배양에 있어서의 배양 상청 회수
동결하여 둔 인간 아스트로사이트 세포를, 실시예 1과 마찬가지로, 융해하여 한 번 배지에서 워시 후, 세포를 배양용 배지에 재차 현탁하고, 60mm 세포 배양용 디시에, 3.5×103세포/cm2의 파종 밀도로 파종하였다. 다음날, YA 함유 배양용 배지에서 배지 교환하고, 배양을 계속시켰다. 80 ~ 90% 컨플루언트로 도달한 부근에서 세포 박리제를 이용하여 세포를 벗기고, YA 함유 배양용 배지에 현탁하여 100mm 세포 배양용 디시로 3.5×103세포/cm2의 파종 밀도로 계대하였다. YA 함유 배양용 배지에서 배양된 세포군을, 실시예 1과 마찬가지로, NHA-YA군이라고 칭한다.
NHA-YA군에 관하여, 5회 계대하고, 합계 60일 YA 함유 배양용 배지에서 배양하여 상당한 세포수를 확보할 수 있었기 때문에, 150mm 세포 배양용 디시로 8×103세포/cm2의 파종 밀도로 파종하였다. 이 때 파종한 세포수는 1디시당 1.16×106 세포이고, 디시를 6매(枚) 사용하였기 때문에, 파종 총 세포 총수는 6.96×106 세포였다.
다음날, 배지를 YA 함유 배양용 배지로부터 회수용 배지로, 20ml/150mm 디시의 용량으로 교환하고, 추가 배양을 개시하였다. 덧붙여, 회수용 배지로서, YA 함유 배양용 배지로부터 FBS만을 제외한 배지를 이용하였다. 추가 배양 개시의 2일 후에, 디시로부터 추가 배양의 배양 상청을 회수하여 튜브로 옮기고, 2,000×g, 10분간, 4℃에서 원심 분리한 후, 0.22μm 필터 시스템으로 여과하고, 4℃에서 보존하였다. 배양 상청 회수 후의 디시 상(上)에 남은 세포를, 세포 박리제를 이용하여 벗기고, 세포수를 카운트한 바, NHA-YA군으로서 얻어진 총 세포수는 5.10×106 세포이고, 파종 총 세포 총수에 대한 잔존율은 73.3%였다.
(2) 저해제 비함유 배양용 배지(대조) 중에서의 인간 아스트로사이트 세포의 배양에 있어서의 배양 상청 회수
동결하여 둔 인간 아스트로사이트 세포를, 실시예 1과 마찬가지로, 융해하여 한 번 배지에서 워시 후, 세포를 배양용 배지에 재차 현탁하고, 60mm 세포 배양용 디시에 3.5×103세포/cm2의 파종 밀도로 파종하였다. 저해제를 포함하지 않는 배양용 배지에서 배양된 세포군을, 실시예 1과 마찬가지로, Normal군이라고 칭한다.
Normal군에 관하여, 2회 계대하고, 합계 26일간 저해제를 포함하지 않는 배양용 배지에서 배양하고, 150mm 세포 배양용 디시로 8×103세포/cm2의 파종 밀도로 파종하였다. 이 때 파종한 세포수는 1디시당 1.16×106 세포이고, 디시를 2매 사용하였기 때문에, 파종 총 세포 총수는 2.32×106 세포였다.
다음날, 배지를 배양용 배지로부터, DMEM에 N-2 Supplement를 가한 회수용 배지로, 20ml/150mm 디시의 용량으로 교환하여 추가 배양을 개시하였다. 추가 배양 개시의 2일간 후에, 디시로부터 추가 배양의 배양 상청을 회수하여 튜브로 옮기고, 2,000×g, 10분간, 4℃에서 원심 분리한 후, 0.22μm 필터 시스템으로 여과하고, 4℃에서 보존하였다. 배양 상청 회수 후의 디시 상에 남은 세포를, 세포 박리제를 이용하여 벗기고, 세포수를 카운트한 바, Normal군으로서 얻어진 총 세포수는 8.25×105 세포이고, 파종 총 세포 총수에 대한 잔존율은 35.6%였다. 상청을 2000×g, 10분간, 4℃에서 원심한 후, 0.22μm 필터 시스템으로 여과하고, 4℃에서 보존하였다. 회수용 배지로 교환하는 전후의 세포 형태를 도 2에 도시한다.
<배양 상청 중의 세포수, 입자수 및 입경 분포의 측정>
상기에서 회수된 Normal군 및 NHA-YA군 각각의 추가 배양의 배양 상청을, 세포용 완충액(사용 전에 0.22μm 필터로 여과한 것)으로 5배 희석한 후, NanoSight LM10(Malvern Panalytical)에 의하여, 입자수와 입경 분포를 확인하였다. 블랭크로서, 세포용 완충액 중의 입자수도 측정하고, 각 배양 상청의 측정값으로부터 세포용 완충액 중의 입자수를 감산하는 것에 의하여, 배양 상청 중의 입자수를 계산하였다. 입자수와 입경 분포의 확인은 각각 2회 행하였다. 회수된 추가 배양의 배양 상청에 포함되는 입자의 입자수와 입자 사이즈의 일례를 표 3에, 입경 분포를 도 3a 및 도 3b에 각각 도시한다. 또한 도 3a 및 도 3b에 있어서, 입자수(106개/mL)를 세로축에 나타내고, 입자 사이즈(nm)를 가로축에 나타낸다.
표 3 및 도 3b로부터 분명한 바와 같이, NHA-YA군의 배양 상청 중에는, 입경 100nm ~ 200nm에 복수의 피크를 확인할 수 있고, 엑소좀이 포함되어 있는 것을 알았다. 또한, NHA-YA군의 배양 상청 중에 포함되는 엑소좀의 양은, Normal군과 비교하여 많은 것도 확인할 수 있었다. 그 후, 탄젠셜 플로우 필터레이션, 한외 여과 등의 정제 방법에 의하여, 후술하는 바와 같이, 입경 100nm ~ 200nm의 피크의 입자를 단리 또는 정제할 수 있었다.
실시예 3-1： 정량 PCR에 의한 외배엽성 세포 마커의 확인 (1)
실시예 1의 배양에 출발 재료로서 이용한 아스트로사이트의 세포군과, 얻어진 외배엽성 세포 집단에 관하여, 이하의 외배엽성 세포 마커 유전자에 관하여 발현량을 검토하였다. 이하에 기재한 NCBI의 데이터베이스인 RefSeq의 accession 번호로 등록되어 있는 배열을 기초로 검출용 프라이머를 제작하였다.
ㆍ Notch1(vX1도 포함한다)(NM_017617)
ㆍ Nestin(NM_006617)
ㆍ SOX2(SRY-box transcription factor 2)(NM_003106)
ㆍ S100B(S100 calcium binding protein B)(NM_006272)
ㆍ NG2(Chondroitin sulfate proteoglycan 4)(NM_001897)
ㆍ GFAP(Glial fibrillary acidic protein)(v1. v4, vX1, vX3)(NM_002055)
<cDNA의 합성>
이하의 샘플로부터 상법(常法)에 따라 RNA를 추출하고, 당해 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. RNA 시료의 조제 및 반응 조건의 설정은, 제품 첨부의 프로토콜에 따랐다.
샘플：
ㆍ Normal Human Astrocytes(NHA)(구입한 초대 세포를 기면(起眠)하여 증식시키고 동결한 것을, 다시 기면하고 4일간 배양한 것. 계대 없음.),
ㆍ NHA-YA(구입한 초대 세포를 기면하여 증식시키고 동결한 것을, 다시 기면하고 YA를 포함하는 배지에서 28일간 배양한 후 동결한 것을, 또다시 기면하고 YA를 포함하는 배지에서 14일간 배양한 것.
14일간의 배양 기간 중, 1회 계대하였다.)
시약： High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor(어플라이드ㆍ바이오시스템즈),
기기： SimpliAmp Thermal Cycler(어플라이드ㆍ바이오시스템즈)
<정량 PCR>
제작한 검출용 프라이머를 하기 표 4에 나타낸다. 이것들 프라이머를 이용하여, 정량 PCR에 의하여 외배엽성 세포 마커 유전자의 발현을 검토하였다. RNA 시료의 조제 및 반응 조건의 설정은, 제품 첨부의 프로토콜에 따랐다.
시약： Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(인비트로젠),
기기： StepOnePlus Real-Time PCR System(어플라이드ㆍ바이오시스템즈)
정량 PCR에 의한, 신경 상피 세포의 마커인 Notch1, Nestin, SOX2의 각 마커 및 방사상 글리아 세포의 마커인 Nestin의 각 마커의 발현 확인 결과, 및, 아스트로사이트의 마커인 GFAP 및 S100B 및 올리고덴드로사이트 전구체 세포의 마커인 NG2의 발현 확인 결과를, 각각, 표 5 및 표 6에 나타낸다.
표 5 및 표 6에서는, NHA-YA에서의 각 마커 유전자의 발현량(컨트롤 유전자에 대한 발현량)을, NHA에서의 각 발현량을 「1」로 하였을 때의 상대값으로서 나타내었다. 표 5는, 컨트롤 유전자로서 ACTB 유전자를 이용하였을 경우의 각 마커의 발현량을, 표 6은, 컨트롤 유전자로서 GAPDH 유전자를 이용하였을 경우의 각 마커의 발현량을 나타낸다.
표 5 및 표 6에 나타내지는 바와 같이, 얻어진 세포 집단(NHA-YA)에 있어서는, 원료로서 이용한 아스트로사이트(NHA)와 비교하여, 아스트로사이트의 마커인 GFAP 및 S100B와 올리고덴드로사이트 전구체 세포의 마커인 NG2와의 쌍방에 있어서, 보다 높은 발현이 인정되었다.
이것들의 결과로부터, 얻어진 세포 집단(NHA-YA)은, 성숙 세포인 아스트로사이트의 특징과 전구 세포인 올리고덴드로사이트 전구 세포의 특징을 겸비하고, 아스트로사이트보다도 높은 증식능을 가지는 세포인 것을 알았다. 이 NHA-YA는, 아스트로사이트보다도 단시간에 보다 많이 증식할 수 있다. 또한, 단시간에 보다 많은 엑소좀을 얻으려면, NHA-YA를 이용하는 것이 유리한 것을 알 수 있다.
실시예 3-2： 정량 PCR에 의한 외배엽성 세포 마커의 확인 (2)
실시예 1의 배양에 출발 재료로서 이용한 아스트로사이트의 세포군과, 얻어진 외배엽성 세포 집단에 관하여, 실시예 3-1과 마찬가지로 하여, 이하의 외배엽성 세포 마커 유전자의 발현량을 정량 PCR에 의하여 측정하였다. 각 마커 유전자의 검출용 프라이머는, 이하에 기재한 NCBI의 데이터베이스인 RefSeq의 accession 번호로 등록되어 있는 배열을 기초로 제작하였다.
ㆍ SLC1A2(solute carrier family 1 member 2)(v1, v2, v3, vX1 ~ vX7도 포함한다)(NM_004171)
ㆍ SLC1A3(solute carrier family 1 member 3)(v1 ~ v5, vX1, vX2, vX3)(NM_004172)
ㆍ OLIG2(oligodendrocyte transcription factor 2)(NM_005806)
ㆍ PAX6(paired box 6)(v1 ~ v48)(NM_000280)
ㆍ ALDH1L1(aldehyde dehydrogenase 1 family member L1)(v1, v2, v3, vX1, vX2, vX3)(NM_001270364)
ㆍ Musashi1(musashi RNA binding protein 1；MSI1)(v1, vX1 ~ vX10)(NM_002442)
제작한 검출용 프라이머를 하기 표 7에 나타낸다. 이것들 프라이머를 이용하여, 정량 PCR에 의하여 외배엽성 세포 마커 유전자의 발현을 검토하였다. RNA 시료의 조제 및 반응 조건의 설정은, 제품 첨부의 프로토콜에 따랐다. 덧붙여, 정량 PCR의 측정 기기로서는, Musashi1에 관하여는, SimpliAmp Thermal Cycler(어플라이드ㆍ바이오시스템즈) 또는 CFX96 Touch Real-time PCR Detection system(바이오래드(Bio-Rad Laboratories, Inc.))를 사용하고, 그 외의 마커 유전자에 관하여는, 실시예 3-1에서 사용한 것과 같은 측정 기기를 사용하였다.
결과를 표 8 및 표 9에 나타낸다. 표 8 및 표 9에서는, NHA-YA에서의 각 마커 유전자의 발현량(컨트롤 유전자에 대한 발현량)을, NHA에서의 각 발현량을 「1」로 하였을 때의 상대값으로서 나타내었다. 표 8은, 컨트롤 유전자로서 ACTB 유전자를 이용하였을 경우의 각 마커의 발현량을, 표 9는, 컨트롤 유전자로서 GAPDH 유전자를 이용하였을 경우의 각 마커의 발현량을 나타낸다.
실시예 4： NHA-YA 유래 엑소좀의 프로테옴 해석
<NHA-YA 유래 엑소좀의 회수>
NHA를 함유하는 세포 배양액이 보관된 동결 튜브를 37℃의 워터 배스로 융해하였다. 그 다음에, 용해 후의 세포를 합계 10mL가 되도록 YA 함유 배양용 배지로 옮기고, 180×g, 3분간, 25℃에서 원심 분리에 제공한 후, 배지를 제거하였다. 얻어진 NHA를 YA 함유 배양용 배지에 현탁시키고, 6웰 플레이트로 4.2×103세포/cm2의 파종 밀도로 계대하였다. 2회의 계대를 섞으면서 11일간, YA 함유 배양용 배지에서 배양을 행하였다.
그 후, 배지를 YA 함유 배양용 배지로부터 회수용 배지로, 20mL/150mm 디시의 용량으로 교환하고, 추가 배양을 37℃에서 72시간 행하였다. 회수용 배지로서, YA 함유 배양용 배지 중의 FBS 대신에 엑소좀이 제거된 FBS［3%(v/v)］를 함유하는 배지를 사용하였다. 추가 배양은 1.16×105 세포/150mm 디시의 파종 밀도로 행하였다. 추가 배양 후, 디시로부터 추가 배양의 배양 상청을 회수하여 튜브로 옮기고, 2,000×g, 10분간, 4℃에서 원심 분리한 후, 0.22μm 필터 시스템으로 여과하고, 엑소좀 함유 용액을 조제하였다.
<엑소좀의 프로테옴 해석 1>
상기에서 얻은 엑소좀 함유 용액을 트리클로로아세트산으로 침전 처리하고, 그 다음에, 5mM 디티오트레이톨의 Tris 완충액 용액을 가하고, 35℃, 2시간의 환원 처리를 행하였다. 환원 후의 샘플에, 14mM 요오드아세트아미드의 Tris 완충액 용액을 가하고, 차광 조건하, 25℃, 30분간 반응을 행하였다. 그 다음에, 트립신 처리를 37℃에서, 20시간 행하고, 엑소좀을 분해하였다. 얻어진 엑소좀의 분해물을 양이온 교환 칼럼에서 용매 치환한 후, 탈염 및 농축하고, LC-MS/MS 분석에 제공하였다. HPLC 장치에는 EASY-nLC 1200 System(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)을, 칼럼에는, EASY-Spray column, 15cm×75μmID, 3μm particles, 100Å pore size(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)를 사용하였다. LC-MS/MS 분석에 의하여 얻어진 스펙트럼의 프로덕트 이온 측정 데이터를 기초로, MASCOT server(https://www.matrixscience.com/help.html)를 이용하여 데이터베이스 검색을 행하였다. 계속하여, 얻어진 결과를 이하의 2개의 데이터베이스에 대조하여, 엑소좀 획분과 배지 성분을 합쳐 합계 1798종류의 단백질 단편을 검출하였다.
ㆍ 인간 유래 단백질： SwissProt(배열수 20376)
ㆍ 소 유래 단백질： UniProtKB(배열수 47043)
엑소좀 획분의 SwissProt 상에서 검출된 총 1285개의 마커 단백질로부터 Quantitative Value(검출된 스펙트럼 수. 보정 있음.)가 5 이상의 것을 선출하고, 520개의 마커 단백질을 추출하였다. 추출한 520개의 단백질 중에서, 특징적인 단백질을 선출하고, 선출한 단백질이 배지 중의 성분은 아닌 것을 확인하는 것과 함께, 소 유래 단백질이었을 경우에는, 인간 유래 단백질에서의 동정(同定) 확률을 검토하고, 동정 확률이 높은 것을 선출하였다. 이하에, 특징적인 단백질의 선출 스텝에 관하여 서술한다.
a： 대뇌에 특징적인 단백질의 선출 스텝
(a1) 상기에서 추출한 520개의 단백질을 Tissue Enrich(https://tissueenrich.gdcb.iastate.edu)로 검색하였다. 여기서, Human Protein Atlas의 데이터 세트, 및 조직 특이적 유전자의 모두를 검색 대상으로 하였다；
(a2) 대뇌에 특이적인 유전자를 22개 선출하였다；
(a3) 상기 (a2)에서 선출한 22개의 유전자 중, 배지 샘플에서 검출되지 않았던 유전자를 12개 선출하였다；
(a4) 상기 (a3)에서 선출한 12개의 유전자 중, 인간 단백질일 가능성이 높은 유전자를 8개 선출하였다；
(a5) 상기 (a4)에서 선출한 8개의 유전자 중, 질환과의 관련이 높은 유전자를 5개 선출하였다.
상기 스텝 (a1) ~ (a5)에 의하여 선출된 5개의 유전자가 코드하는 단백질을 도 4에 적는다.
B： 막 단백질, 세포외 영역 등에 특징적인 단백질의 선출 스텝
(b1) 상기에서 추출한 520개의 단백질 중, Scaffold Proteome viewer의 GO에서 「membrane」에 묶여 있는 단백질로서 409개의 단백질을 선출하였다；
(b2) 상기에서 추출한 520개의 단백질 중, Scaffold Proteome viewer의 GO에서 「extracellular region」에 묶여 있는 단백질로서 443개의 단백질을 선출하였다；
(b3) 상기에서 추출한 520개의 단백질 중, Scaffold Proteome viewer의 GO에서 「membrane」와 「extracellular region」 중 어느 쪽에도 묶여 있지 않은 단백질로서 15개의 단백질을 선출하였다；
(b4) 상기 스텝 (b1), (b2) 및 (b3)에서 추출한 단백질 중, 배지 샘플에 포함되어 있지 않은 단백질로서 35개의 단백질을 선출하였다. 선출한 35개 중, 14개에 관하여는, 하기의 스텝 (c1) ~ (c3)에 의하여 선출된 단백질과 중복한다.
상기 스텝 (b1) ~ (b4)에 의하여 선출된 35개의 단백질을 도 4에 적는다.
<엑소좀의 프로테옴 해석 2>
상기 선출 스텝 a 및 선출 스텝 b와는 다른 선출 스텝 c에서 특징적인 단백질을 선출하였다.
c： 특징적인 단백질의 선출 스텝
(c1) SwissProt_Homo sapiens와 UniProtKB_Bos taurus를 합친, 총 1562개의 배열로부터 엑소좀 획분의 Quantitative Value가 20 이상의 것을 103개 선출하였다；
(c2) 상기 (c1)에서 선출한 103개의 배열 중에서, 배지 샘플에서의 Quantitative Value가 10 이하의 것을 65개 선출하였다；
(c3) 상기 스텝 (c2)에서 선출한 65개의 배열에 관하여, 논문 검색 사이트 PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)에 의하여 중추 신경 질환과 관련하는 것, 또는 뇌, 신경 세포의 증식, 발생, 분화, 형태 형성, 이동, 대사 등에 관여하고 있는 것이 추정되는 것을 20개 선출하였다. 선출한 20개 중, 14개에 관하여는, 상기 스텝 (b1) ~ (b4)에 의하여 선출된 단백질과 중복한다.
상기 스텝 (c1) ~ (c3)에 의하여 선출된 20개의 단백질을 도 4에 적는다.
상기 선출 스텝 a ~ c에 의하여, 합계 46개의 단백질을 선출할 수 있었다(도 4 참조).
실시예 5： NHA-YA 유래 엑소좀의 miRNA 해석
<NHA-YA 유래 엑소좀의 회수>
NHA를 함유하는 세포 배양액이 보관된 동결 튜브를 37℃의 워터 배스로 융해하였다. 그 다음에, 용해 후의 세포를 합계 10mL가 되도록 YA 함유 배양용 배지로 옮기고, 180×g, 3분간, 25℃에서 원심 분리에 제공한 후, 배지를 제거하였다. 얻어진 NHA를 YA 함유 배양용 배지에 현탁시키고, 6웰 플레이트로 4.2×103세포/cm2의 파종 밀도로 계대하였다. 4회의 계대를 섞으면서 47일간, YA 함유 배양용 배지에서 배양을 행하였다.
그 후, 배지를 YA 함유 배양용 배지로부터 회수용 배지로, 20mL/150mm 디시의 용량으로 교환하고, 추가 배양을 37℃에서 48시간 행하였다. 회수용 배지로서, 실시예 4에서 이용한 회수용 배지를 사용하였다. 추가 배양은 1.16×106 세포/150mm 디시의 파종 밀도로 행하였다. 추가 배양 후, 디시로부터 추가 배양의 배양 상청을 회수하여 튜브로 옮기고, 2,000×g, 10분간, 4℃에서 원심 분리한 후, 0.22μm 필터 시스템으로 여과하고, 엑소좀 함유 용액을 조제하였다.
<NHA-YA 유래 엑소좀으로부터의 RNA의 추출>
상기에서 얻어진 엑소좀 함유 용액 205mL를, 초원심기 Optima XE-90(Beckman Coulter)을 이용하여, 250,000×g, 70분간, 4℃에서 원심 분리에 제공한 후, 상청을 제거하고, 엑소좀 획분을 얻었다. 그 다음에, miRNeasy Mini Kit(217004, Qiagen)를 이용하여, 얻어진 엑소좀 획분으로부터 RNA를 추출하였다. 그 결과, 엑소좀 획분 230μL로부터 토털 RNA 41.8ng를 회수하였다.
<RNA 해석>
상기에서 얻어진 RNA를 Agilent RNA 6000 pico kit(Agilent Technologies) 및 Agilent small RNA kit(Agilent Technologies)를 사용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer에 의하여 퀄리티 체크를 행하였다. 퀄리티 체크 후, 디렉셔널(Stranded)용 RNA 라이브러리 조제 키트, NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina를 이용하여, 상기에서 얻어진 토털 RNA로부터 RNA 라이브러리를 조제하였다. 조제한 RNA 라이브러리를 이용하여 mRNA-Seq 해석을 행하고, 6538개의 mRNA를 검출하였다.
마찬가지로 miRNA 라이브러리 조제 키트, QIAseq miRNA Library Kit(Qiagen), 및 QIAseq miRNA NSG 96 Index IL(Qiagen)를 이용하여, 상기에서 얻어진 토털 RNA로부터 miRNA 라이브러리를 조제하였다. 조제한 miRNA 라이브러리를 이용하여 miRNA-Seq 해석을 행하고, 370개의 miRNA를 검출하였다.
시퀀스 라이브러리의 퀄리티 체크는 High Sensitivity DNA kit(Agilent Technologies)를 사용하고, Agilent 2100 Bioanalyzer에 의하여 행하였다.
NGS는 NextSeq500, Illumina를 이용하여 행하였다(싱글 엔드, 75bp, 평균 리드수 약 1,000만 리드).
시퀀스 후의 데이터는, 리드의 품질 평가(FastQC)를 행한 후, GeneGlobe：Data Analysis Center(QIAGEN)에서 레퍼런스 게놈(Human hg38)에 얼라인먼트(매핑)하고, Trimmed mean of M values(TMM)로 발현량을 정규화하고, 각 miRNA의 어노테이션 정보와 Small RNA 조성의 분류 집계를 포함하는 Excel 형식의 파일을 작성하였다(해석 툴： StrandNGS v4.0, R v3.6.2； 어노테이션 정보：miRBase Release21 준거). 그 후, 데이터 해석으로서 발현 변동 유전자 추출 후, 타깃 유전자 예측으로부터의 GO 해석, 및 Pathway 해석을 실시하였다.
<기능적 마커 miRNA의 선출>
1. 파킨슨병 마커로서의 miRNA
이하의 문헌을 참조하여, 파킨슨병의 인간 뇌조직에서 발현이 저하되고 있는 miRNA를 42개 선출하였다. 당해 miRNA를 함유하는 엑소좀을 파킨슨병 환자의 세포에 투여하는 것에 의하여, 파킨슨병 환자에 있어서, 외인성에 당해 miRNA의 기능이 보완되고, 파킨슨병의 치료 효과가 기대된다.
문헌： MicroRNAs in Parkinson′s disease and emerging therapeutic targets. Neural Regeneration Research, 12(12), pp.1945-1959 (2017)
그 다음에, 이 중에서, NHA-YA 유래의 엑소좀 miRNA로서 검출되는 miRNA를 16개 선출하였다. 선출한 16개의 miRNA를 도 5에 도시한다.
2. 알츠하이머병 마커로서의 miRNA
IMOTA(https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/)를 이용하여, 알츠하이머병의 병태에 관련하는 단백질, 특히 알츠하이머병 치료약의 약리 작용에 기여하는 복수의 단백질과 관련하는 것이 알려진 하기의 단백질과 관련지어지는 miRNA를 선발하였다.
2-1. 알츠하이머병 마커로서의 miRNA (1)
IMOTA를 이용하여, 대뇌 피질에 있어서 아밀로이드 전구체 단백질(APP：Amyloid Precursor Protein)과 관련지어지는 miRNA를 70개 선출하였다. APP는, 알츠하이머병 발증의 원인 중 하나로 들 수 있는 노인반, 즉, 아밀로이드 β 단백의 침착물의 주요 구성 성분이다.
그 다음에, 이 중에서, NHA-YA 유래의 엑소좀 miRNA로서 검출되는 miRNA를 23개 선출하였다. 선출한 23개의 miRNA를 도 6에 도시한다.
2-2. 알츠하이머병 마커로서의 miRNA (2)
IMOTA를 이용하여, 대뇌 피질에 있어서 BACE1(β-site APP cleaving enzyme)과 관련지어지는 miRNA를 42개 선출하였다. 알츠하이머병 발증 시 BACE1은 APP의 N말단 부분을 절단하는 것에 의하여, 비정상인 아밀로이드 β 단백을 산생(産生)한다.
그 다음에, 이 중에서, NHA-YA 유래의 엑소좀 miRNA로서 검출되는 miRNA를 20개 선출하였다. 선출한 20개의 miRNA를 도 7에 도시한다.
2-3. 알츠하이머병 마커로서의 miRNA (3)
IMOTA (https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/)를 이용하여, 대뇌 피질에 있어서 NMDA 수용체(N-methyl-D-aspartate receptor)와 관련지어지는 miRNA를 66개 선출하였다. 알츠하이머병 발증 시, 뇌 내에 비정상인 단백질이 축적하는 것으로, 신경을 흥분시키는 물질이 과잉으로 방출된다. 이 흥분 물질에 의하여 NMDA 수용체가 과잉으로 활성화되는 것으로, 신경 전달이나 기억이 장해된다.
그 다음에, 이 중에서, NHA-YA 유래의 엑소좀 miRNA로서 검출되는 miRNA를 27개 선출하였다. 선출한 27개의 miRNA를 도 8에 도시한다.
2-4. 알츠하이머병 마커로서의 miRNA (4)
IMOTA (https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/imota/)를 이용하여, 대뇌 피질에 있어서 글리코겐 합성 효소 키나아제가 3-β(GSK-3β：Glycogen synthase kinase-3β)와 관련지어지는 miRNA를 58개 선출하였다. GSK-3β는, 다양한 단백질을 인산화하는 효소로, 복수의 패스웨이 제어를 통하여 세포의 생명 유지나 생리 기능의 조절에 다양한 작용을 하고 있다. 알츠하이머병에 있어서는 뇌 내에서의 아밀로이드 β 단백의 침착이나 신경 세포 중에 타우단백질의 축적을 촉진한다. 그 결과로서 신경 세포의 아포토시스를 유발한다.
그 다음에, 이 중에서, NHA-YA 유래의 엑소좀 miRNA로서 검출되는 miRNA를 24개 선출하였다. 선출한 24개의 miRNA를 도 9에 도시한다.
3. 우울증 마커로서의 miRNA
이하의 문헌을 참조하여, 우울증의 개인에 있어서의 혈장 중에서 발현이 저하되고 있는 miRNA를 24개 선출하였다. 당해 miRNA를 함유하는 엑소좀을 우울증 환자의 세포에 투여하는 것에 의하여, 우울증 환자에 있어서, 외인성에 당해 miRNA의 기능이 보완되고, 우울증의 치료 효과가 기대된다.
문헌： MicroRNAs expressed in depression and their associated pathways：A systematic review and a bioinformatics analysis(Journal of Chemical Neuroanatomy 100 (2019) 101650)
그 다음에, 이 중에서, NHA-YA 유래의 엑소좀 miRNA로서 검출되는 miRNA를 13개 선출하였다. 선출한 13개의 miRNA를 도 10에 도시한다.
실시예 6： NHA-YA 유래 엑소좀에 의한 PC-12 세포의 신경 돌기 신장 억제 시험
NHA-YA 유래 엑소좀에 의한 기능성 평가 시험으로서, 래트 부신 갈색 세포종 유래 세포주, PC-12 세포(RCB0009, RIKEN Bank)에 대한 신경 돌기 신장 억제 시험을 행하였다. 컨트롤로서는, 실시예 1에서 사용한 NHA 세포에 유래하는 엑소좀을 이용하였다.
<시약 및 배양용 제품>
이하의 시약 및 배양용 제품을 사용하였다.
ㆍ 증식용 배지：
조성： 기초 배지, 10%(w/v) FBS, 10%(w/v) HS, 항생 물질,
기초 배지： DMEM, high glucose, pyruvate(11995-073；Gibco),
FBS： Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil(10270-106；Gibco),
HS： Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin(26050-088；Gibco),
항생 물질： Antibiotic-Antimycotic(100X)(15240-062；Gibco)
ㆍ 세포 박리제 1： Accutase(AT104, ICT),
ㆍ 세포 박리제 2： TrypLE Express Enzyme(1X), 페놀 레드 비함유(12604-013, Gibco),
ㆍ 세포용 완충액： 인산 완충염 수용액(둘베코；칼슘 및 마그네슘 불포함)(BNDSBN200, KAC),
ㆍ 어세이용 배지：
조성： 기초 배지, 첨가제, 항생 물질,
기초 배지： Advanced DMEM(12491-015, Gibco),
첨가제： GlutaMAX Supplement(100X)(35050-061, Gibco),
항생 물질： Antibiotic-Antimycotic(100X)(15240-062, Gibco),
ㆍ 양성 컨트롤 시약： 래트 유래 신경 성장 인자(NGF)-β(N2513-.1MG, Sigma-Aldrich),
ㆍ 배양용 배지： AGM Astrocyte Growth Medium Bullet Kit(CC-3186, Lonza)(AGM의 조성： 기초 배지, FBS(3%(v/v)), L-글루타민, 아스코르브산, hEGF, 인슐린, 항생 물질)(실시예 1에서 사용한 것과 같은 것),
ㆍ 저해제 Y： CultureSure(등록 상표) Y-27632(034-24024, 후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤), 최종 농도： 10μM(실시예 1에서 사용한 것과 같은 것),
ㆍ 저해제 A： CultureSure(등록 상표) A-83-01(035-24113, 후지후이루무 와코 준야쿠 가부시키가이샤), 최종 농도： 0.5μM(실시예 1에서 사용한 것과 같은 것),
ㆍ 엑소좀 제거 소 혈청： Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum Qualified One shot(A2720803, Gibco),
ㆍ 0.22μm 필터 시스템： Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System(S2GPU02RE, Merck Millipore),
ㆍ 배양 상청 회수용 배지： AGM Astrocyte Growth Medium Bullet Kit(CC-3186, Lonza) 중의 성분인 소 혈청(FBS) 대신에 3%(w/v)의 엑소좀 제거 소 혈청(A2720803；Gibco)이 첨가된 것,
ㆍ 96웰 플레이트： 콜라겐 I 코트 96웰 플레이트(4860-010, IWAKI),
ㆍ 세포 배양용 플라스크 T-75(430641, Corning),
ㆍ 세포 배양용 디시 100mm： 150466, Thermo Fisher Scientific(실시예 1에서 사용한 것과 같은 것),
ㆍ 세포 배양용 디시 150mm： 150468, Thermo Fisher Scientific(실시예 1에서 사용한 것과 같은 것).
<평가용 샘플의 조제>
하기의 수순에 따라, 이하의 평가용 샘플을 조제하고, 신경 돌기 신장 억제 시험에 사용하였다.
(1) 대조 배지(Control medium(CM))： 배양 상청 회수용 배지를 초원심 분리하여 얻어진 것.
(2) NHA AGM P6： 6회 계대째의 NHA의 배양 상청을 초원심 분리하여 얻어진 것.
(3) NHA-YA P6： 6회 계대째의 NHA-YA의 배양 상청을 초원심 분리하여 얻어진 것.
상기 (2) 및 (3)은, 엑소좀량의 최종 농도가 10μg/mL가 되도록 어세이용 배지에 첨가하여 조제하였다. 또한, 상기 (1) ~ (3)의 각 평가용 샘플의 조제에 있어서 사용한 초원심 분리는, 초원심기(본체：Optima XE-90, 로터：SW41 Ti；BeckmanCoulter)를 사용하여 250,000×g, 70분간, 4℃의 조건에서 행하였다.
<배양 상청 중의 엑소좀의 회수 및 확인>
이하에 나타내는 재료, 시약, 및 배양용 제품을 이용하여, YA 함유 배양용 배지 또는 저해제 비함유 배지를 이용하여 인간 아스트로사이트 세포를 배양하였을 때의 배양 상청을 각각 회수하였다.
1. 재료
NHA로서, 실시예 1에서 사용한 것과 같은 재료를 사용하였다.
2. 인간 아스트로사이트 세포의 배양 상청의 회수
배양 상청의 회수는 이하의 수순을 따라 행하였다. 인간 아스트로사이트 세포(NHA)의 동결 튜브를 37℃의 워터 배스로 융해하였다. 그 다음에, 용해 후의 세포를 합계 10mL가 되도록 배양용 배지로 옮기고, 180×g, 3분간, 실온에서 원심 분리에 제공한 후, 배지를 제거하였다. 세포를 배양용 배지에 현탁하고, T-75 배양용 플라스크(Corning)로 1.25×104세포/cm2의 파종 밀도로 파종하였다. 그 후, 37℃에서 약 12시간 배양을 행하고, 세포를 접착시킨 후, 배지를 「저해제 Y＋저해제 A 첨가군(이하, NHA-YA군)」 및 「무첨가군(NHA군)」 중 어느 하나의 배양용 배지(각 저해제의 농도는, 상술대로)로 교환하고, 배양을 계속시켰다.
배지 교환은, 1일 또는 2일 간격으로 하고, 각각 저해제 함유(또는 비함유)의 신선한 배양용 배지로 교환하였다. 7일간 배양 후, 세포 박리제 1을 이용하여 세포(계대수：1)를 벗기고, 저해제 함유 배양용 배지, 즉 YA 함유 배양용 배지, 및 저해제 비함유 배양용 배지의 각 배지에 현탁하여, 150mm 세포 배양 디시로 3.3×104세포/cm2의 파종 밀도로 계대 배양하였다. 9일간 배양 후, 마찬가지의 방법으로, 150mm 세포 배양 디시로 3.3 ~ 6.6×104세포/cm2의 파종 밀도로 5일간 배양의 계대를 반복하고, 총 5회의 계대 배양을 합계 31일간에 걸쳐 행하였다. 실시예 1과 동일하게 YA 함유 배양용 배지에서 배양된 세포군을 NHA-YA군, 저해제 비함유 배양용 배지에서 배양된 세포군을 Normal군이라고 칭한다.
6계대째로서 150mm 세포 배양 디시 5매에 NHA-YA군을 3.3×104세포/cm2, Normal군을 2.3×104세포/cm2의 파종 밀도로 파종하였다. 파종 총 세포 총수는 NHA-YA군에서 5.0×106 세포, Normal군에서 3.5×106 세포였다.
파종 후, 4일간 배양하고, 유도 후(저해제와의 접촉 후) 35일째에, 40 ~ 60% 컨플루언트로 도달한 것을 확인하고, 배지를 배양용 배지로부터 배양 상청 회수용 배지로 20mL/150mm 디시의 용량으로 교환하고, 추가 배양을 개시하였다. 추가 배양 개시의 48시간 후에, 디시로부터 추가 배양의 배양 상청을 회수하고, 그 후, 회수한 배양 상청을 0.22μm 필터 시스템으로 여과하고, 세포 잔사(殘渣)가 제거된, 엑소좀 함유 배양 상청을 얻었다. 얻어진 여과가 끝난 엑소좀 함유 배양 상청을 4℃에서 보존하였다. 그 다음에, 디시에 남은 세포에 새로운 배양 상청 회수용 배지를 첨가하고, 배양을 48시간 행하고, 마찬가지의 방법에 의하여 여과가 끝난 엑소좀 함유 배양 상청을 얻었다. 마찬가지의 조작을 합계 3회 행하고, 여과가 끝난 엑소좀 함유 배양 상청을 약 300mL 회수하였다. 유도 후 41일째에, 배양 상청을 회수한 후, 디시 상에 남은 세포를, 세포 박리제 1을 이용하여 벗기고, 세포수를 카운트한 바, 얻어진 총 세포수는 NHA-YA군에서 4.42×107 세포, NHA군에서 1.51×107 세포이고, 파종 총 세포 총수에 대한 잔존율은 NHA-YA군에서 94.1%, Normal군에서 84.0%였다.
엑소좀 기능 평가 시의 대조 배지(Control medium(CM))로서, 세포를 파종하고 있지 않는 150mm 세포 배양 디시에 배양 상청 회수용 배지를 20mL/150mm 디시의 용량으로 가하고, 세포 배양 시와 완전히 같은 조건에서 배양 상청을 회수하였다.
3. 배양 상청 중의 엑소좀의 농축
상기에서 회수된 NHA-YA군, NHA군, 및 CM의 배양 상청 180mL분을 튜브로 옮기고, 상기 초원심기를 사용하여 250,000×g, 70분간, 4℃에서 원심 분리를 행하였다. 상청을 제거한 후, 얻어진 침강물을 세정하기 위하여, 당해 침전물에 인산 완충염 수용액을 첨가한 후, 250,000×g, 70분간, 4℃에서 원심 분리를 행하였다. 상청을 제거하고, 세정된 침전물을 얻었다. 세정된 침강물은 배양 상청 용적의 대략 1/1000이 되도록 인산 완충염 수용액에서 다시 현탁하였다.
4. 현탁액 중의 입자수, 및 단백량의 측정
상기의 방법에 의하여 농축된 배양 상청 유래의 현탁액을, 사용 전에 0.22μm 필터로 여과한 인산 완충염 수용액으로 100배 희석한 후, 희석액 중의 입자수를 ZetaView X20(Particle Metrix)에 의하여 측정하였다. 측정에서 얻어진 입자수에 희석율, 즉 100을 곱하여 현탁액 중의 총 입자수를 산출하였다. 어세이용 배지 중의 입자수를, 인산 완충염 수용액으로 100배 희석한 후에 측정하고, 얻어진 어세이용 배지 중의 입자수를 각 배양 상청의 측정값으로부터 감산하는 것에 의하여, 배양 상청 중의 입자수를 계산하였다. 또한 아울러, NanoDrop(Thermo Scientific)에 의하여 280nm에서의 흡광도를 측정하고, 현탁액 중의 단백 농도를 측정하였다. 측정에서 얻어진 단백 농도에 현탁액의 액량을 곱하여 현탁액 중의 총 단백량을 산출하였다. 측정 결과를 표 10에 나타낸다. 표 10의 「총 입자수」의 란에 있어서의 「aE＋b」라는 표기는, a×10b를 의미한다. 표 10에 나타내어지는 바와 같이, NHA-YA군에서는 총 단백량이 가장 많이 포함되어 있고, 또한, 입자수도 대조 배지(CM)에 비교하여 현저하게 많은 것을 알았다.
<평가 실험 프로토콜>
상기의 PC-12 세포의 동결 튜브를 37℃의 워터 배스로 융해하였다. 그 다음에, 용해 후의 세포를 합계 10mL가 되도록 증식용 배지로 옮기고, 180×g, 5분간, 실온에서 원심 분리에 제공한 후, 배지를 제거하였다. 계속하여 세포를 증식용 배지에 현탁하고, 세포 배양용 디시 100mm에 대략 5,300세포/cm2의 파종 밀도로 파종하였다. 2일 또는 3일 간격으로 배지를 교환하면서 37℃에서 배양을 행하고, 계대를 섞으면서 세포를 증식시켰다. 얻어진 PC-12 세포를, 세포 박리제 2를 이용하여 벗기고, 어세이용 배지에서 세정한 후, 어세이용 배지에서 3.96×104개/mL의 밀도로 다시 현탁하였다. 현탁한 세포를 96웰 플레이트 중에 1웰당 1.98×103개/50μL 배지, 즉, 6000세포/cm2의 파종 밀도로 파종하고, 약 12시간 세포를 접착시킨 후, 배지를 상기의 각 평가용 샘플로 교환하였다. 그 후, 37℃에서 배양을 행하고, 배양 개시 3일째, 4일째, 및 5일째의 PC-12 세포의 상황을 현미경(BZ-X710, KEYENCE)으로 관찰하고, 관찰 화상을 취득하였다. 당해 화상에 있어서의 신경 돌기의 길이 및 세포수를, 화상 해석 소프트 Fiji(ImageJ2 ver. 2.3.0)의 Multi-point 툴(세포수)과 Straight 툴(신경 돌기 길이)을 사용하여 계측하였다. 통계 처리에는 Microsoft-Excel을 사용하였다.
그 결과, 교감 신경 세포인 PC-12 세포주에 대하여, 엑소좀을 포함하는 상기 (2) 및 (3)에서는, (1)과 비교하여 유의(有意)한 신경 돌기 신장이 관측되지 않고, 신경 돌기의 신장을 억제하고 있는 것이 나타내졌다.
따라서, 본 개시의 엑소좀이, PC-12 세포의 신경 돌기를 신장하는 기능을 구비하고 있지 않고, 오히려, 신경 돌기의 신장을 억제하는 기능을 구비하고 있는 것이 시사되었다. 이것에 의하여, 본 개시의 엑소좀은, 교감 신경계를 억제할 수 있다.

Claims (20)

  1. 고증식성 세포의 제조 방법으로서,
    (i) 원료가 되는 외배엽성 세포를 준비하는 것,
    (ii) 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하는 배지 중에서, 해당 저해제를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포에 접촉시켜 배양하는 것, 및,
    (iii) 상기 접촉 후, 상기 저해제를 포함하는 배지 중에서 추가 배양을 행하고, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포보다도 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 포함하는 배양물을 얻는 것
    을 포함하는, 고증식성 세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고증식성 세포는, 상기 저해제와 접촉시킨 28일 초과의 배양 기간 후의 세포수가, 당해 저해제와 비접촉인 이외는 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 기간에 걸쳐 배양된 외배엽성 세포의 세포수의 1.0배를 넘는 증식능을 가지는, 고증식성 세포의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 원료가 되는 외배엽성 세포가, 중추 신경계의 세포를 포함하는, 고증식성 세포의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 원료가 되는 외배엽성 세포가, 아스트로사이트를 포함하는, 고증식성 세포의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 저해제가, TGFβ 수용체 저해제 및 ROCK 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는, 고증식성 세포의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 TGFβ 수용체 저해제의 농도가, 0.001μM ~ 100μM의 범위 내인, 고증식성 세포의 제조 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 ROCK 저해제의 농도가, 0.001μM ~ 100μM의 범위 내인, 고증식성 세포의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고증식성 세포가, 성숙 세포에 특유의 적어도 하나의 유전자를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하고, 또한, 전구 세포에 특유의 적어도 하나의 유전자를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포와 같거나 그 이상으로 발현하는, 고증식성 세포의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고증식성 세포가, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 음성인, 고증식성 세포의 제조 방법.
  10. 외배엽성 세포의 특징을 구비하고, 저분자 시그널 전달 경로 저해제와 접촉시킨 28일 초과의 배양 기간 후의 세포수가, 해당 저해제와 비접촉인 이외는 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 기간에 걸쳐 배양된 외배엽성 세포의 세포수의 1.0배를 넘는 증식능을 가지는, 고증식성 세포.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 고증식성 세포가, Musashi1, Notch1, Nestin, 및 SOX2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 음성인 세포를 포함하는, 고증식성 세포.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    NG2의 발현량이, 상기 저해제 비접촉의 외배엽성 세포에 있어서의 NG2의 발현량보다도 높은, 고증식성 세포.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법으로부터 얻어지는 고증식성 세포 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물을 포함하는 배양물을 얻는 것, 및, 상기 세포 분비물을, 상기 배양물로부터 분리하는 것을 포함하는, 세포 분비물의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    세포 분비물이, 엑소좀인, 세포 분비물의 제조 방법.
  15. 외배엽성 전구 세포의 제조 방법으로서,
    상기 외배엽성 전구 세포는, 고증식성 세포이고,
    (i) 원료가 되는 외배엽성 세포를 준비하는 것,
    (ii) 저분자 시그널 전달 경로 저해제를 포함하는 배지 중에서, 해당 저해제를 상기 원료가 되는 외배엽성 세포에 접촉시켜, 28일 초과의 기간에 걸쳐 배양하는 것, 및
    (iii) 상기 접촉 후, 상기 저해제를 포함하는 배지 중에서 추가 배양을 행하고, 상기 원료가 되는 외배엽성 세포보다도 세포 증식능이 높여진 고증식성 세포를 포함하는 배양물을 얻는 것
    을 포함하는, 외배엽성 전구 세포의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 배양물로부터, 상기 고증식성 세포를 단리(單離)하는 것을 더 포함하는, 외배엽성 전구 세포의 제조 방법.
  17. 단백질 및/또는 miRNA를 포함하는 세포 분비물로서,
    상기 단백질은, 빈쿨린(P18206), 인테그린 β-1, CD29(P05556), 피루브산 키나아제 M1/2(P14618), 및 에프린 타입-A 수용체 2(P29317)의 조합을 포함하고,
    상기 miRNA는, hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-155-5p(MIMAT0000646), hsa-miR-379-5p(MIMAT0000733), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-382-5p(MIMAT0000737), hsa-miR-21-5p(MIMAT0000076), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), hsa-miR-16-5p(MIMAT0000069), hsa-miR-409-3p(MIMAT0001639), hsa-let-7a-5p(MIMAT0000062), 및 hsa-let-7f-5p(MIMAT0000067)의 조합을 포함하는, 세포 분비물.
  18. 제17항에 있어서,
    엑소좀인, 세포 분비물.
  19. 제1항 혹은 제2항에 기재된 제조 방법에 의하여 얻어진 고증식성 세포 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물과,
    제17항 또는 제18항에 기재된 세포 분비물
    중 어느 하나의 세포 분비물을 포함하는, 말초 신경 세포 또는 중추 신경 세포에 관계하는 장해의 예방 또는 치료에 이용되는 의약 조성물.
  20. 제1항 혹은 제2항에 기재된 제조 방법에 의하여 얻어진 고증식성 세포 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 고증식성 세포로부터 분비된 세포 분비물과,
    제17항 또는 제18항에 기재된 세포 분비물
    중 어느 하나의 세포 분비물을 신경 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 교감 신경계의 억제 방법.
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