CN114107205A - 一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用 - Google Patents
一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114107205A CN114107205A CN202111429684.3A CN202111429684A CN114107205A CN 114107205 A CN114107205 A CN 114107205A CN 202111429684 A CN202111429684 A CN 202111429684A CN 114107205 A CN114107205 A CN 114107205A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- exosomes
- cell
- cells
- sound
- supernatant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 105
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 54
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 16
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 15
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 13
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 8
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 25
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 6
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 3
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 101000613251 Homo sapiens Tumor susceptibility gene 101 protein Proteins 0.000 description 2
- 102100040879 Tumor susceptibility gene 101 protein Human genes 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011529 cardiovascular cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：装载声敏剂：对细胞装载声敏剂，得到装有声敏剂的细胞；超声波辐照：待细胞将声敏剂吸收或转化后进行低频超声波辐照；收集细胞上清液：收集步骤(2)中经低频超声波辐照后的细胞的上清液；外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中得到的细胞上清液经超速离心法去除死亡细胞和调亡小体，再进行提取与纯化，得到外泌体。本发明还公开了刺激细胞快速分泌外泌体的方法制备得到的物质，在制备细胞调节基因表达、免疫治疗药物中的应用。本发明采用声敏剂联合超声波产生声动力作用的方法，作用于细胞，促使细胞产生和释放更多的外泌体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及到一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用。
背景技术
外泌体是由细胞释放到细胞外液中的直径约为40-160nm的生物活性囊泡，可高效地传递生物活性物质参与细胞代谢、组织修复、免疫调控等关键过程，在缓解炎症、心血管疾病、肿瘤等治疗领域具有巨大的应用潜力。外泌体治疗具有独特优势：无复制功能故无成瘤风险；高递送效率且有过滤杀菌作用；体积小易通过体内循环到达损伤部位；更低的免疫源性和良好的生物相容性；可保护其携带的微小核糖核酸(miRNA)免受RNA酶降解,使其可以相对较长时间稳定的表达并行使调控作用，从而抑制血管形成达到控制疾病进展或组织修复的目的。
目前临床尚无有效促进外泌体分泌的药物和方法。最新的3D培养技术可优化外泌体产量及功能，但无法在人体上实施，其临床应用前景渺茫。缺氧预处理是最常用的促进外泌体分泌的手段，然而，当体内氧饱和度降低到一定水平时会导致细胞发生应激反应，干扰细胞的正常功能，无法维持良好细胞状态。药物刺激预处理也存在药物不适配患者的病情，甚至增加不良反应的弊端。因此，开发可获得更高质量的临床适用性外泌体的新方法是当务之急，具有深远、重要的意义。
专利201910567977.4公开了一种低强度脉冲超声刺激促进细胞外泌体分泌的方法，该发明是通过低强度脉冲超声刺激促进细胞外泌体分泌，解决传统依靠细胞分泌外泌体产量低的问题。该专利只公开了如何提高细胞分泌的外泌体量，并没有公开如何使细胞在短时间内产生并释放外泌体。
现有技术中，没有文献公开过如何使细胞在短时间内产生并释放大量外泌体，本发明公开了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用，通过声敏剂与超声波协同产生的声动力作用使细胞在短时间内产生并释放外泌体，并且得到的外泌体中包含了更多具有治疗动脉粥样硬化斑块作用的微小核糖核酸，从而稳定动脉粥样硬化斑块。
发明内容
本发明的目的是提供一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用，用于解决现有技术中如何使细胞在短时间内产生并释放外泌体的技术问题。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：
步骤(1)装载声敏剂：对细胞装载声敏剂，得到装有声敏剂的细胞；
步骤(2)超声波辐照：待细胞将声敏剂吸收或转化后进行低频超声波辐照；
步骤(3)收集细胞上清液：收集步骤(2)中经低频超声波辐照后的细胞的上清液；
步骤(4)外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中得到的细胞上清液经超速离心法去除死亡细胞和调亡小体，再进行提取与纯化，得到外泌体。
本发明优选的方案之一，步骤(1)中声敏剂为具有声敏性的药物或者具有声敏性的药物的前体药物。
本发明优选的方案之一，步骤(1)中细胞为原代培养巨噬细胞，声敏剂为华卟啉钠。
本发明优选的方案之一，步骤(1)具体为：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.75μM-0.85μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育5.5h-6.5h。
本发明优选的方案之一，低频超声波辐照的超声参数为：超声频率0.5MHz-1.5MHz，超声强度0.01W/cm2-0.5W/cm2，占空比5％-15％，辐照时间2min-8min。
本发明优选的方案之一，步骤(2)中得到的经低频超声波辐照后的细胞的上清液需静置1.8h-2.2h后再收集其上清液。
本发明优选的方案之一，步骤(3)具体为：使用移液管吸取细胞上清，转移至无菌无RNA酶的离心管中。
本发明优选的方案之一，步骤(4)具体为：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心15min-30min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心25min-35min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心50min-70min，取离心后的沉淀溶于PBS缓冲液中，在离心力100000g下离心50min-70min，获得的沉淀为外泌体。
本发明优选的方案之一，步骤(4)具体为：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心15min-30min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心25min-35min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心50min-70min，取离心后的沉淀重悬于PBS缓冲液中。
本发明还公开了刺激细胞快速分泌外泌体的方法制备得到的物质，在细胞调节基因表达、免疫治疗中的应用。
综上所述，本发明的有益效果为：
1、本发明采用声敏剂联合超声波产生声动力作用的方法，作用于细胞，促使细胞产生和释放更多的外泌体，同时得到的外泌体中包含了更多具有生物活性及治疗作用的miRNAs，从而起到稳定动脉粥样硬化斑块、减轻炎症的作用。
2、体内外结果表明，本发明采用声敏剂联合超声波产生声动力作用的方法具有在短时间内产生和释放大量外泌体的效应，且低频超声波辐射安全可控性强，对正常局部组织及细胞影响极其小，不会干扰细胞正常的功能，具有广阔的临床应用前景。
3、本发明具体涉及一种基于SDT介导的外泌体疗法，为减轻炎症、肿瘤、心血管等治疗领域开辟了新的途径。
附图说明
图1为本发明一个实施例与对比例的外泌体的电镜代表图；
图2为本发明一个实施例与对比例的外泌体的粒径分布图；
图3为本发明一个实施例与对比例的外泌体的生物标志物表达情况图；
图4为本发明一个实施例与对比例的外泌体内含物的差异miRNA图；
图5为本发明一个实施例与对比例的外泌体部分miRNA差异表达热图；
图6为本发明一个实施例与对比例的外泌体与动脉粥样硬化斑块关系图；
图7为本发明一个实施例与对比例的外泌体被内皮细胞摄取图。
具体实施方式
实施例1
本发明提供了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：
步骤(1)装载声敏剂：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.8μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育6h；
步骤(2)超声波辐照：对步骤(1)中完成声敏剂装载的巨噬细胞进行低频超声波辐照，超声参数为：超声频率1MHz，超声强度0.1W/cm2，占空比10％，辐照时间5min；
步骤(3)收集细胞上清液：超声波辐照完成2h后进行细胞上清液的收集，使用配备有低吸附吸头的移液器吸取细胞上清液，转移至无菌无RNA酶的50mL离心管中；
步骤(4)外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心20min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心30min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心60min，取离心后的沉淀溶于PBS缓冲液中，在离心力100000g下离心60min，获得的沉淀为外泌体。
实施例2
本发明提供了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：
步骤(1)装载声敏剂：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.75μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育5.5h；
步骤(2)超声波辐照：对步骤(1)中完成声敏剂装载的巨噬细胞进行低频超声波辐照，超声参数为：超声频率1.5MHz，超声强度0.5W/cm2，占空比5％，辐照时间2min；
步骤(3)收集细胞上清液：超声波辐照完成1.8h后进行细胞上清液的收集，使用配备有低吸附吸头的移液器吸取细胞上清液，转移至无菌无RNA酶的50mL离心管中；
步骤(4)外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心20min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心30min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心60min，取离心后的沉淀重悬于PBS缓冲液中。
实施例3
本发明提供了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：
步骤(1)装载声敏剂：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.85μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育6.5h；
步骤(2)超声波辐照：对步骤(1)中完成声敏剂装载的巨噬细胞进行低频超声波辐照，超声参数为：超声频率0.5MHz，超声强度0.01W/cm2，占空比15％，辐照时间8min；
步骤(3)收集细胞上清液：超声波辐照完成2.2h后进行细胞上清液的收集，使用配备有低吸附吸头的移液器吸取细胞上清液，转移至无菌无RNA酶的50mL离心管中；
步骤(4)外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心15min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心35min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心70min，取离心后的沉淀溶于PBS缓冲液中，在离心力100000g下离心50min，获得的沉淀为外泌体。
实施例4
本发明提供了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：
步骤(1)装载声敏剂：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.8μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育5.7h；
步骤(2)超声波辐照：对步骤(1)中完成声敏剂装载的巨噬细胞进行低频超声波辐照，超声参数为：超声频率1.2MHz，超声强度0.3W/cm2，占空比7％，辐照时间4min；
步骤(3)收集细胞上清液：超声波辐照完成2.1h后进行细胞上清液的收集，使用配备有低吸附吸头的移液器吸取细胞上清液，转移至无菌无RNA酶的50mL离心管中；
步骤(4)外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心25min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心25min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心50min，取离心后的沉淀溶于PBS缓冲液中，在离心力100000g下离心70min，获得的沉淀为外泌体。
实验检测：将没有经声动力作用的巨噬细胞分泌的外泌体作为对比例。
实验1：外泌体的电镜代表图
将实施例与对比例分别置于透射电子显微镜下进行检测，检测结果如图1所示，其中标尺为100nm，Control为对比例，SDT为实施例。
从图1中可看出：在同一大小区域中，实施例中的外泌体数量显著大于对比例中外泌体的数量。因此，将声动力作用于细胞上能显著提高细胞分泌外泌体的数量。
实验2：外泌体粒径分布
将实施例与对比例分别置于MalvernZetasizerNanoZS90纳米粒径电位分析仪下进行检测，检测得到实施例组与对比例组外泌体的粒径大小，如图2所示，其中Control为对比例，SDT为实施例。
从图2中可看出：对比例组所获得囊泡的粒径处于60nm-90nm区间，实施例组所获得囊泡的粒径处于90nm-110nm区间，两组所获得的囊泡大小均符合外泌体大小。因为外泌体是由细胞释放到细胞外液中的直径约为40nm-160nm的生物活性囊泡，这个结果证明我们分离的囊泡是符合外泌体大小的，从粒径大小方面证实我们提取的是外泌体。
实验3：外泌体生物标志物的表达情况
将实施例与对比例通过WesternBlot方法检测外泌体标志性蛋白CD63、TSG101，检测结果如图3中A所示，其中Con为对比例，SDT为实施例。
从图3中A可看出：对比例组和实施例组中均能检测到CD63和TSG101。因此，对比例组和实施例组的外泌体均表达外泌体标志性蛋白CD63及TSG101。
将实施例与对比例通过Micro BCA蛋白检测试剂盒检测各组蛋白浓度，检测结果如图3中B所示，其中C-Exos为对比例，S-Exos为实施例。
从图3中B中可看出：实施例组的蛋白浓度显著高于对比例组的蛋白浓度。因此，与对比例组相比，实施例组分泌了更多的外泌体。
实验4：检测具有生物活性的miRNAs
通过外泌体miRNA测序检测实施例组与对比例组外泌体中的差异miRNA，对Illumina HiSeq TM2500测序鉴定出来的miRNA进行表达量计算、miRNA表达聚类和样品间差异表达miRNA分析，检测结果如图4和图5所示。
从图4中可看出：通过差异倍数(|log2(Fold Change)|>1)和显著水平(Pvalue<0.05)两个水平挑选两组间的差异表达miRNA，共发现188个miRNA表达有差异，其中99个表达上调，89个表达下调。
部分miRNA差异表达热图如图5所示。
实验5：外泌体治疗稳定和缩小动脉粥样硬化斑块
雄性8周龄ApoE-/-小鼠高脂饮食饲喂12周建立进展期斑块模型后，通过尾静脉输入对比例组外泌体、实施例组外泌体及加入外泌体抑制剂GW4869后所提取的实施例组外泌体，结果如图6中A中所示，其中C+Exo为对比例组，S+Exo为实施例组，S+Exo+GW4869为加入外泌体抑制剂GW4869的实施例组外泌体组。
每周治疗一次，共治疗3次，第4周进行组织取材。取小鼠主动脉根部组织进行制作冰冻切片，通过油红O染色结果发现，输注实施例组外泌体组小鼠主动脉进展期斑块面积明显缩小—如图6中B所示；斑块脂质含量明显降低如图6中C所示，而加入外泌体抑制剂GW4869后所提取的实施例组外泌体并没有上述作用。这一结果说明实施例组外泌体具有缩小和稳定动脉粥样硬化斑块的作用。
实验6：外泌体被内皮细胞摄取
分别将PKH67标记好的对比例组和实施例组中的外泌体与血管内皮细胞共同培养一定的时间后，通过共聚焦显微镜观察，观察结果如图7所示，其中Control为对比例组，SDT为实施例组。
从图7中可看出：实施例组的外泌体可被血管内皮细胞摄取。
综上所述，本发明采用声敏剂联合超声波产生声动力作用的方法，作用于细胞，促使细胞产生和释放更多的外泌体，并且得到的外泌体具有缩小和稳定动脉粥样硬化斑块的作用，同时得到的外泌体也能被血管内皮细胞摄取。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1.一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)装载声敏剂：对细胞装载声敏剂，得到装有声敏剂的细胞；
步骤(2)超声波辐照：待细胞将声敏剂吸收或转化后进行低频超声波辐照；
步骤(3)收集细胞上清液：收集步骤(2)中经低频超声波辐照后的细胞的上清液；
步骤(4)外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中得到的细胞上清液经超速离心法去除死亡细胞和调亡小体，再进行提取与纯化，得到外泌体。
2.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中声敏剂为具有声敏性的药物或者具有声敏性的药物的前体药物。
3.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中细胞为原代培养巨噬细胞，声敏剂为华卟啉钠。
4.如权利要求3所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.75μM-0.85μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育5.5h-6.5h。
5.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述低频超声波辐照的超声参数为：超声频率0.5MHz-1.5MHz，超声强度0.01W/cm2-0.5W/cm2，占空比5％-15％，辐照时间2min-8min。
6.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(2)中得到的经低频超声波辐照后的细胞的上清液需静置1.8h-2.2h后再收集其上清液。
7.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：使用移液管吸取细胞上清，转移至无菌无RNA酶的离心管中。
8.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心15min-30min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心25min-35min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心50min-70min，取离心后的沉淀溶于PBS缓冲液中，在离心力100000g下离心50min-70min，获得的沉淀为外泌体。
9.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心15min-30min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心25min-35min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心50min-70min，取离心后的沉淀重悬于PBS缓冲液中。
10.如权利要求1-9中任一项所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法制备得到的物质，在制备细胞调节基因表达、免疫治疗药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111429684.3A CN114107205B (zh) | 2021-11-29 | 2021-11-29 | 一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111429684.3A CN114107205B (zh) | 2021-11-29 | 2021-11-29 | 一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114107205A true CN114107205A (zh) | 2022-03-01 |
| CN114107205B CN114107205B (zh) | 2023-08-22 |
Family
ID=80370993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111429684.3A Active CN114107205B (zh) | 2021-11-29 | 2021-11-29 | 一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114107205B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115109750A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-09-27 | 山西农业大学 | 一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用 |
| CN116716288A (zh) * | 2023-04-28 | 2023-09-08 | 四川大学 | 一种声波振动提高外泌体产量的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170296626A1 (en) * | 2014-09-05 | 2017-10-19 | Exerkine Corporation | Exosome isolation |
| CN109554341A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-04-02 | 深圳先进技术研究院 | 无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用 |
| CN110777142A (zh) * | 2019-06-27 | 2020-02-11 | 上海交通大学 | 一种低强度脉冲超声刺激促进细胞外泌体分泌的方法 |
| CN113061579A (zh) * | 2019-12-12 | 2021-07-02 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种外泌体及其制备方法及应用 |
-
2021
- 2021-11-29 CN CN202111429684.3A patent/CN114107205B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170296626A1 (en) * | 2014-09-05 | 2017-10-19 | Exerkine Corporation | Exosome isolation |
| CN109554341A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-04-02 | 深圳先进技术研究院 | 无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用 |
| CN110777142A (zh) * | 2019-06-27 | 2020-02-11 | 上海交通大学 | 一种低强度脉冲超声刺激促进细胞外泌体分泌的方法 |
| CN113061579A (zh) * | 2019-12-12 | 2021-07-02 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种外泌体及其制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HAHM J等: "Strategies to Enhance Extracellular Vesicle Production.", 《TISSUE ENGINEERING AND REGENERATIVE MEDICINE》, vol. 18, no. 4, pages 515 * |
| ZHENG D等: "The Role of Exosomes and Exosomal MicroRNA in Cardiovascular Disease", FRONTIERS IN CELL AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY, vol. 8, pages 1 - 15 * |
| 李惠莉等: "外泌体lncRNA在心血管疾病中的研究进展", 华中科技大学学报, vol. 51, no. 6, pages 853 - 857 * |
| 林默楠等: "不同种类声敏剂联合超声的抗肿瘤效果及作用机制研究进展", 《医学研究生学报》, vol. 33, no. 10, pages 1108 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115109750A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-09-27 | 山西农业大学 | 一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用 |
| CN116716288A (zh) * | 2023-04-28 | 2023-09-08 | 四川大学 | 一种声波振动提高外泌体产量的方法 |
| CN116716288B (zh) * | 2023-04-28 | 2024-04-26 | 四川大学 | 一种声波振动提高外泌体产量的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114107205B (zh) | 2023-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114107205A (zh) | 一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用 | |
| CN113355290B (zh) | 一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用 | |
| WO2014072468A1 (en) | Compositions for pulmonary delivery | |
| Rehman et al. | Synergy and translation of allogenic bone marrow stem cells after photodynamic treatment of rheumatoid arthritis with tetra sulfonatophenyl porphyrin and TiO 2 nanowhiskers | |
| CN107375234B (zh) | 一种基于体液中细胞源性囊泡的多功能载体及制备方法和应用 | |
| Sun et al. | Ultrasound targeted microbubble destruction assisted exosomal delivery of miR-21 protects the heart from chemotherapy associated cardiotoxicity | |
| CN108671231B (zh) | 一种用于肿瘤光热增效治疗和超声成像的多功能纳米载体及制备方法 | |
| CN110777142A (zh) | 一种低强度脉冲超声刺激促进细胞外泌体分泌的方法 | |
| CN106754723B (zh) | 一种具有抗肿瘤功能的免疫细胞及其应用 | |
| CN115381965B (zh) | 一种γδT细胞功能化的磁性微球、制备方法及其用途 | |
| CN113797229A (zh) | 一种用于抗炎和促组织再生的巨噬细胞来源外泌体制剂及其制备方法和应用 | |
| CN110711249B (zh) | 一种溶酶体膜包覆纳米颗粒的制备方法 | |
| WO2024093149A1 (zh) | 一种微波制备肿瘤细胞微颗粒的方法 | |
| JP6664382B2 (ja) | 全血から成体幹細胞を増殖させる方法 | |
| CN112029705B (zh) | 促内皮细胞产外泌体的方法、外泌体制剂和应用 | |
| CN108619528A (zh) | 一种环糊精-介孔硅多功能纳米载药颗粒 | |
| CN114395531A (zh) | 一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用 | |
| Li et al. | The Potential Therapeutic Role of Mesenchymal Stem Cells-Derived Exosomes in Osteoradionecrosis | |
| CN110882387A (zh) | 一种肿瘤内靶向释放石墨烯阿霉素的方法 | |
| US20220402763A1 (en) | Graphene oxide (go)-based composite nanoparticle drug delivery system and preparation method thereof | |
| CN104922698B (zh) | 人干细胞生长因子注射液及其制备方法 | |
| CN110200940B (zh) | 基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针 | |
| CN113633789B (zh) | 一种集光声成像和包载药物一体化的液态金属纳米探针及其制备方法 | |
| CN114732913B (zh) | 一种利用肿瘤患者自体来源的类器官衍生微泡包载化疗药物的方法及其应用 | |
| CN113058035B (zh) | 替莫唑胺及其活性产物mtic的声动力新应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230420 Address after: 150000 157 health Road, Nangang District, Harbin, Heilongjiang Applicant after: HARBIN MEDICAL University Applicant after: XIANG'AN HOSPITAL OF XIAMEN University Address before: 361000 southeast area of intersection of Xiang'an South Road and Xiang'an East Road, Xiang'an District, Xiamen City, Fujian Province Applicant before: XIANG'AN HOSPITAL OF XIAMEN University |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yang Yang Inventor after: Huang Zhen Inventor after: Sheng Siqi Inventor after: Gao Weiwei Inventor after: Wu Guodong Inventor after: Fan Changqing Inventor after: Wang Jiaxin Inventor after: Cao Changan Inventor after: Zhang Haoliang Inventor after: Tian Ye Inventor after: Guo Shuyuan Inventor after: Tian Zhen Inventor after: Tian Fang Inventor before: Yang Yang Inventor before: Fan Changqing Inventor before: Wang Jiaxin Inventor before: Cao Changan Inventor before: Zhang Haoliang |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information |