JP6664382B2 - 全血から成体幹細胞を増殖させる方法 - Google Patents

Description

ここで説明する実施形態は、全血から成体幹細胞を増殖させる方法に関し、特に成体哺乳類の末梢血だけからでなく、全血から成体幹細胞を増殖させる方法に関する。そして、特に人間医学または獣医学において、外部および内部損傷、損傷（腱、靭帯、軟骨）、骨折の治療処置と、また、慢性および／または急性炎症病態、神経学的病理および精神変性病理、心臓病態、腫瘍状の病態、自己免疫疾患、眼病および遺伝的原因の病態の治療的および／または予防的処置との、医学分野における対応する応用に関する。

以降の明細書で、そして、文献においても知られているように、「増殖」という語は、細胞分裂によってか、または本願に記載されクレームされる特定の場合のような、「脱分化（dedifferentiation）」または「プログラム解除(deprogramming)」により細胞の数を増加させるプロセス、つまりは後述するように、適切な試験管内での生体外処理（in vitro処理）の後に血液中に存在する細胞を幹細胞に転換させるプロセスのことを意味する。

近年、治療における幹細胞の使用は広範囲に亘って受け入れられているが、血液から得られる幹細胞を除くと、得られた治療結果は期待をはるかに下回る。

事実、相対的な結果（時折り副作用）に関して、幹細胞を得るための多くの公知方法は、時間を要し、面倒であり、高価であることが分かってきている。

幹細胞には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と成体幹細胞とがあり、前者は８日目の胚盤胞に由来し、他方、成体幹細胞は末梢血、アンビリカルコード（へその緒）などの、主に骨髄や脂質または筋組織から得られる。

幹細胞の定義は常に変化しており、胚性幹細胞と成体幹細胞、 造血幹細胞（ＨＳＣ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の両方（Ｋｕｗａｎａ Ｍら、２００３年）、これらすべての幹細胞に対して、さまざまな遺伝子マーカーが同定されている。それらのいくつかは多くの細胞型に共通である。（Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ Ｍら、２００６年、Ｋａｎｇ Ｗ．Ｊ．ら、２００６年、Ｚｈａｏ Ｙ．ら、２００３年、Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ Ｍ．ら、１９７６年）

多能性幹細胞（ＰＳＣ）、すなわち胚性幹細胞と成体幹細胞とを区別するために、細胞内のいくつかの転写因子の表示が考慮される（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）。

胚性幹細胞は、多能性を備える上に、必要な質的条件を備えかつ定量化も可能である点で実験に適する。そのため、初期の段階では胚性幹細胞の研究が進んだ。しかしながら、倫理的問題および、とりわけ腫瘍化による禁忌の問題により、胚性幹細胞は研究の本流から外れるようになった。従って、今日では成体幹細胞が好まれる。他人（同種異系）の成体幹細胞は「自己」とは認められないので、重篤な拒絶反応という問題が極めて頻繁に生じる。これは特にへその緒からの幹細胞に影響し、そして、その幹細胞はもっぱら同種異系の幹細胞として使用される。

ウイルスを介して多能性因子を胚性幹細胞から成体幹細胞へ移すプロセスを使用して誘発される多能性幹細胞には、胚性幹細胞を用いて処理されるものと同様の禁忌があり、コストも極めて高いので、処理に適さない幹細胞とされる。

ヒトにおいては、今のところ、「除去療法」または「白血球搬出法」と呼ばれるプロセスを介して得られる末梢血からの幹細胞の使用が、受け入れられている。化学療法または放射線療法の直後に、幹細胞が血液から抽出され、収集され、そして、何らかの白血病性病態を患う患者に接種される。この幹細胞は造血幹細胞である。したがって、この幹細胞は血液の病態にのみ作用する。

除去療法（６〜８時間持続する）では、腕や頸部または胸部の静脈から血液を採取し、幹細胞を取り除く機械を通過させる。このように採取後の血液は患者に戻されるが、一方で、集められた幹細胞は液体窒素で冷凍保存される（Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ Ｍら、２００６年、Ｋａｎｇ Ｗ．Ｊ．ら、２００６年）。この療法は、痛みを伴うだけでなく、患者にとっても大いにストレスを感じるものである。上記は、骨髄から血液への幹細胞の流出を誘発するために、成長因子の生体内接種を行い、そして、循環する幹細胞の正しい識別および／または精製は行わない。

この幹細胞を用いる療法が今日では、法律を厳守し、血液のみの病態を処置するための治療法として認められている。

異なる病態を処置するために今日市場に投入されている幹細胞は、主に、骨髄および脂肪から得られる間葉成体幹細胞である。しかしながらこれらは、以下のようなデメリットを有する。
まず、細胞を集めるために侵襲的な方法を必要とする。骨髄幹細胞を採取するためには骨を穿孔するか、脂肪から幹細胞を採取するために手術を行わなければならない。さらに、間葉由来のため特定の組織としか作用（相互反応）させることができない。しかも、治療に必要な量を得るために培養すると、他の細胞型に分化し始め、常に異なる細胞膜受容体を示す。従って、臨床試験のために不可欠な特徴を備えず、定量化もできない。

他の公知の方法は、Ｚｈａｏ Ｙ．らによる、記事「Ａ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｂｓｅｔ ａｃｔｓ ａｓ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」と、国際公開第２００４／０４３９９０号とに記載されている。
これは単球に由来する幹細胞を準備する方法である。この方法は末梢血から単球を単離して、分裂促進的成分に接触させ、細胞を増殖させるのに適切な条件の末梢血から、単球をその後培養するステップを含む。

この方法（単球を単離するステップと、培地での増殖ステップを初めに必要とする）で相当数の幹細胞を得るためには、非常に長い時間がかかる（約１５〜２０日）。そして、この方法では多能性幹細胞を得ることができない。

また、単球から幹細胞を準備する構想では、国際公開第２００５／０４６５７０号と、国際公開２００７／１３１２００号と、国際公開第０３／０８３０９２号とが公知である。
しかしながら、１つの細胞分画（すなわち単球）だけを単離するために適切な血液の予備精製と、所望の幹細胞を得るための次の増殖も行わなければならないので、受容可能な量の幹細胞を獲得するためには、上記文献に記載の方法は、更に１５〜４０日の期間を要し、非常に長い期間が必要となる。

本出願人の名で出願され、その特許の全体が参照の目的の為に本願に組み込まれる、国際公開第２００８／０３４３７０号もまた公知であり、そして、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）を用いた、血液からの成体幹細胞のための増殖方法に関する。
この公知の方法は、血液採取後、ＭＣＳＦ（濃度：８ｎＭ〜１５ｎＭ）を用いた生体外処理によって成体血液幹細胞を成長させる方法、好ましくはフィコール勾配による分画精製方法を提供する。この方法によれば、３５ｎＭ〜５５ｎＭの濃度のＭＣＳＦで、生体外処理で末梢血から精製された幹細胞を成長させることも可能となる。

この方法の有効性は、幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ９０／３４、ＣＤ３４、ＣＤ１１７が存在し、これらを用いて幹細胞を認識できることによって、また、分裂や増殖に際して幹細胞が「自己」認識因子を失わないという事実によって、保証される。患者に幹細胞を投与するときは、幹細胞は、奇形腫の拒絶、感染または発生のような副作用を起こさず、「生体内で」分化して、多能性幹細胞のように作用することができる。

分裂または増殖で成長した細胞が、患部や静脈内に注入されると、治療を受ける生体のニーズや病態に応じた、マクロファージ、リンパ球、上皮、内皮、神経および肝細胞のすべての形態学的と化学的特性を、「生体内」で獲得するということを著者は見いだした。これは、適切な成長因子および／または化学的刺激による技術水準の公知方法（Ｇｕｌａｔｉ Ｒ．ら,２００３年、Ｋａｔｚ Ｒ．Ｌ．ら、２００２年、Ｏｋａｚａｋｉ Ｔ．ら、２００５年）にあるような「生体外」ではない。
この方法は、幹細胞を収集する前に使用される他の方法と比べ、侵襲的でなく、つまり痛みもなく、経済的である（この点で、除去療法とは異なる）。

最後に、容易にこれらの細胞を獲得し、そして、例えば液体窒素で凍らせ、長い間保存できることで、多くの病態（さまざまな種類の損傷、代謝性疾患、神経学的病理、急性および慢性炎症病態）の治療において、自己移植に適する公知の方法を用いて得られる細胞を産生する。

本出願人の名で出願され、参照することにより本願に組み込まれる、国際公開第２００９／１１５５２２号もまた公知でもあり、そして、多能性幹細胞の産生のために、血液（好ましくは末梢血）を収集するためのキットに関する。そして、抗凝固物質およびＭＣＳＦ物質を含める、採取される血液を含むことが可能な容器を備える。キットは、国際公開第２００８／０３４３７０号に記載の方法の構想で、用いることができる。

しかしながら、国際公開第２００８／０３４３７０号に記載の方法を実施すると、幹細胞が受けるさまざまな作業および処理ステップ（例えば赤血球の除去、血液の他の成分に対する幹細胞の精製、造血幹細胞および間葉系幹細胞と比較してより多くの多能性幹細胞を得ること、培養、他の細胞型への分化）により、結果として得られる成体幹細胞にストレスを加えることができることを出願人は見いだした。幹細胞を生きた状態に保つことができる反面、有効性は低くなりエネルギーと情報の潜在能力が抑えられる。

獣医学分野においては、特に脂肪および骨髄からの幹細胞を凝縮させそして成長因子を得るために、幹細胞を生じさせるためのさまざまな技術と装置がある。

しかしながら、幹細胞における第１の障壁は、収集するのが困難ということである。
上述のように、骨髄から幹細胞を得るためには、骨を穿孔し背骨を貫通させなくてはならない。そして、脂肪から幹細胞を得るためには、縫合を必要とする外科手術が必要とされる。

物流面での複雑さもある。サンプルを送り、幹細胞を受け取り、その幹細胞全てを生きたままの状態で安定して保管する必要がある。

他の障壁は必要とされる手動操作の数である。そして、ここまで使用されるすべての成体幹細胞のための準備時間および経費である。

不十分な臨床結果と、これらの問題点により、幹細胞は獣医学臨床業務からほぼ完全に姿を消した。そして、実験的な目的のために、ほんの少数の獣医師のみが幹細胞の使用を続ける。

国際公開第２００８／０３４３７０号に記載され、さまざまな科学出版物で報告される細胞調製では、多能性特徴を確認し、獲得した幹細胞を定性および定量化することが可能である。
サンプリングが単純で（２、３ミリリットルの血液）、また、細胞を増殖する必要がないので、これまで用いてきた技術よりずっと容易である。

しかしながら、ヒトの臨床試験で幹細胞を使用するために、そして、研究室へのサンプルの急送と、続くＭＣＳＦを用いたプログラム解除と、治療処置が行われる仕組みへの復帰とに関係する障壁を克服するために、このシステムを改善することもできる。
他の制限により、考えられる同種異系の接種（安全性がまだ証明されていない）に対して、より高い安全性が見込まれる、国際公開第２００８／０３４３７０号に記載の方法を用いた、血液から得られる幹細胞の完全な精製を行うことができる。
事実、赤血球を除去するために用いられる精製と処理、細胞がソーターを通過することによって（必要条件）、獲得した幹細胞に相当なストレスが生じ、幹細胞の治癒的能力は部分的に失われる。
従って、有効な幹細胞を得て、更に良好な結果を獲得するためには、血液の処理を最小限にすることが強く求められる。

国際公開第２００８／０３４３７０号を含む、公知の方法を用いて得られた幹細胞のすべての治療における他の制限は、専門の研究室を必要とするということである。

国際公開第２００８／０３６３７４号も公知であり、予め免疫抑制されていない患者の幹細胞の移植のための方法および組成物が記載される。

以下の科学論文も、公知である。
Ｓｐａａｓ Ｊ．Ｈ．，Ｇａｍｂａｃｕｒｔａ Ａ．，Ｐｏｌｅｔｔｉｎｉ Ｍ．，Ｂｒｏｅｃｋｘ Ｓ．らによる、「Purification and expansion of stem cells from equine peripheral blood, with clinical applications」第８０巻、ｎｏ．２、ページ１２９〜１３５（インターネットＵＲＬ：http://hdl.handle.net/1854/LU-1215157）
Ｇ．Ｅ．Ｇａｒｂｅｒらによる、「The use of ozone-treated blood in the therapy of HIV infection and immune disease: a pilot study of safety and efficacy」 AIDS、１９９１年１月１日、ページ９８１〜９８４（インターネットＵＲＬ：http://graphics.tx.ovid.com/ovftpdfs/FPDDNCFBHADJCP00/fs047/ovft/live/gv039/00002030/00002030-199108000-00009.pdf）
Ｌａｒｉｎｉらによる、「Effects of ozone on isolated peripheral blood mononuclear cells」Toxicology in vitro、Elsevier Science、GB、第１９巻、ｎｏ．１、２００５年２月１日、ページ５５〜６１

国際公開第２００４／０４３９９０号 国際公開第２００５／０４６５７０号 国際公開２００７／１３１２００号 国際公開第０３／０８３０９２号 国際公開第２００８／０３４３７０号 国際公開第２００９／１１５５２２号 国際公開第２００８／０３６３７４号

Ｓｐａａｓ Ｊ．Ｈ．，Ｇａｍｂａｃｕｒｔａ Ａ．，Ｐｏｌｅｔｔｉｎｉ Ｍ．，Ｂｒｏｅｃｋｘ Ｓ．らによる、「Purification and expansion of stem cells from equine peripheral blood, with clinical applications」第８０巻、ｎｏ．２、ページ１２９〜１３５（インターネットＵＲＬ：http://hdl.handle.net/1854/LU-1215157） Ｇ．Ｅ．Ｇａｒｂｅｒらによる、「The use of ozone-treated blood in the therapy of HIV infection and immune disease: a pilot study of safety and efficacy」 AIDS、１９９１年１月１日、ページ９８１〜９８４（インターネットＵＲＬ：http://graphics.tx.ovid.com/ovftpdfs/FPDDNCFBHADJCP00/fs047/ovft/live/gv039/00002030/00002030-199108000-00009.pdf） Ｌａｒｉｎｉらによる、「Effects of ozone on isolated peripheral blood mononuclear cells」Toxicology in vitro、Elsevier Science、GB、第１９巻、ｎｏ．１、２００５年２月１日、ページ５５〜６１

従って、技術水準のデメリットの少なくとも１つを克服することができる、全血から成体幹細胞を増殖させる方法を完成させる必要がある。

技術水準の欠点を克服して、これらの目的とその他の目的および利点を得るために、出願人は、本発明を考案して、テストして、実施した。

別段の記載がある場合を除き、以降に使用されるすべての専門的用語および科学用語は、当該発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。ここで記載されるのと類似又は同等の方法および材料を本発明の実践および検証において用いることができる場合であっても、方法および材料は例証として後述する。不一致が生じた場合、その定義を含み、本出願を優先する。
材料、方法および実施例は、単に図示する目的であり、限定するものと理解されない。

本発明は独立クレームに記載され、特徴づけられる。その一方で、従属クレームには本発明の他の特性、または主たる発明概念に対する変形例が記載される。

上記の目的に従い、技術水準の範囲を克服して、その欠陥を除去する、全血中で成体血液幹細胞を増殖させる方法は、
前記全血が、１〜５５ｎＭの濃度のマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）を用いて、４〜９６時間生体外で処理される第１の処理と、
全血が、生体外で酸素とオゾンの混合物によりオゾン処理される第２の処理と、を含む。

本発明により、血液試料から多能性成体幹細胞を獲得することができる。

考えられる実施形態によれば、第１の処理前に第２の処理を行う方法を提供する。具体的には、予め第２の処理された全血に第１の処理を行うことができる。

他の考えられる実施形態によれば、第１の処理の間に第２の処理を行う方法を提供する。具体的には、第２の処理間の全血に第１の処理を行うことができる。

他の考えられる実施形態によれば、第１の処理後に第２の処理を行う方法を提供する。具体的には、第２の処理前の全血に第１の処理を行うことができる。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によれば、オゾン処理により、Ｏ_２−Ｏ_３の混合物を血液試料に供給する方法を提供する。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によれば、血液：Ｏ_２−Ｏ_３混合物を化学量論比１：１とする方法を提供する。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によれば、約１μｇ／ｌ以上の量の血液試料のＯ_２−Ｏ_３混合物を提供する方法を提供する。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によると、全血中の混合物の量を約１μｇ／ｍｌ〜約４２μｇ／ｍｌの範囲で選択することができる方法を提供する。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によれば、抗凝固物質を全血に加える方法を提供する。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によれば、少なくとも前記ＭＣＳＦを含んだ容器に、採取された前記全血を収容する方法を提供する。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によれば、第１の処理および、前記第２の処理がなされる、前記全血の量が、０．２ｍｌ〜１００ｍｌ、特に０．５ｍｌ〜５０ｍｌ、特に１ｍｌ〜２５ｍｌ、さらに特に２ｍｌ〜１０ｍｌ、特に２ｍｌ〜８ｍｌ、特に３ｍｌ〜８ｍｌ、特に３ｍｌ〜５ｍｌである方法を提供する。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によれば、ＭＣＳＦの濃度が約１ｎＭ〜約５５ｎＭの範囲である方法を提供する。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、考えられる実施形態によれば、方法により、４時間〜９６時間の、ＭＣＳＦを用いた生体外処理による、成長およびプログラム解除時間を設ける。

さらにまた、ここで記載される他の実施形態は、血液からの成体幹細胞を増殖させる方法に関する。そして、ＭＣＳＦを用いた血液試料の生体外処理による、採取された血液試料の成体血液幹細胞の成長およびプログラム解除のみで構成される。

ここで記載される実施形態も、本発明による方法により入手できる成体幹細胞を含む血液試料に関する。

考えられる実施形態によれば、血液試料は、治療処置および／または病変の予防のために設けられる。

考えられる実施形態によれば、外部および内部損傷、損傷（腱、靭帯、軟骨）、骨折の治療と、慢性および／または急性炎症病態、神経学的病理および精神変性病理、心臓病態、腫瘍状の病態、自己免疫疾患、眼病および遺伝子の病態の治療または予防とを含む、治療処置用に血液試料を設ける。

考えられる実施形態によれば、ＭＣＳＦおよびオゾン処理される血液試料の、静脈、動脈または局所投与（例えば皮下組織、筋肉内または組織内）を含む処置用に、血液試料を設ける。

他の考えられる実施形態によれば、ＭＣＳＦで処理される血液試料の静脈、動脈または局所投与（例えば皮下組織、筋肉内または組織内）、および患者の全身的なオゾン処理とを提供する治療のために血液試料を設ける。

ここで説明する実施形態は、本発明による方法を用いて入手可能な成体幹細胞を含む、血液試料を含む容器を少なくとも含むキットに関する。

本開示内容の、これらの、そしてまた他の態様、特徴および利点は、以下の明細書と、図面と、添付の請求の範囲とを参照してよりよく理解される。本明細書に組み込まれ、その一部をなす図面は、本発明のいくつかの実施形態を示し、明細書と共に本開示内容の原理を記載することを目的とする。

可能な場合は、本明細書に記載されるさまざまな態様および特徴は個々に適用することができる。これらの個々の態様（例えば添付の従属クレームに記載される態様および特徴）は、分割出願の対象となり得る。

特許プロセスの間にすでに公知であると発見されるいかなる態様または特徴も、クレームされず、ディスクレームの対象であるものと理解される。

ウマの脚部の写真である ウマの脚部の超音波画像である ウマの脚部の超音波画像である ウマの脚部の超音波画像である ウマの脚部の超音波画像である ウマの脚部の超音波画像である ウマの脚部の超音波画像である ウマの脚部の超音波画像である 競技に参加する馬の写真である 競技に参加する馬の写真である 競技に参加する馬の写真である 心不全を伴う病態の治療結果を比較するための、収縮作用の有意なパラメータを含む表である 心不全を伴う病態の治療結果を比較するための、収縮作用の有意なパラメータを含む表である 患畜の心エコー検査画像である 患畜の心エコー検査画像である 患畜の心エコー検査画像である 患畜の心エコー検査画像である

我々は、これより本発明のさまざまな実施形態を詳細に言及する。
各実施例は、本発明の例証として与えられ、限定するものとして理解されない。
例えば、１つの実施例の一部である限りは、示されるか記載される特徴は、他の実施形態を生じるために、他の実施形態に、または、それに関連して採用されることができる。
本発明がすべてのこの種の変更および変形例を含むものと理解される。

これらの実施形態を説明する前に、我々はまた、以下の明細書にて添付の図面を用いて説明するが、本明細書が、利用において構成要素の構造および配置の細部により制限されないことを明らかにしなければならない。
本明細書は、他の実施形態を提供することができ、そして、さまざまな他の方法で獲得または実行されることができる。
我々は、ここで用いる文体および用語が説明のためだけであり、制限するものとみなされないと明らかにしなければならない。

「ａｂｏｕｔ」「ｇｅｎｅｒａｌｌｙ」「ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ」と言った用語は、絶対的ではなく、しかし技術水準において報告されていない用語または値を修正する役割と理解される。
この種の用語は特定の状況で定義され、そして、特定の分野におけるこの種の用語の一般的な受け入れに従う修正する用語によって定義される。それらは、少なくとも予想される実験誤差の程度と、テクニカルエラーと、値を測定するために採用される一定の技術のための器差とを考慮する。特に明記しない限り、そうでなければ文脈で示唆しない限り、本明細書での単数形は複数形も含むと理解される。

特に明記しない限り、ここで説明されるすべての範囲は、２つ値間の範囲を説明するものを含み、両極の端を含むと理解される。

本明細書はまた、特に明記しない限り、記載される２つ以上の範囲を兼ね備えるかまたは重なりから生じる範囲を含む。

本明細書はまた、特に明記しない限り、異なる位置で取られる２つ以上の値の組合せから生じ得る範囲を含む。

別段の記載がある場合を除き、以降に用いるすべての専門的および科学用語は、当該発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

ここで記載されるのと類似又は同等の方法および材料を本発明の実践および検証において用いることができる場合であっても、方法および材料は例証として後述する。
不一致が生じた場合、その定義を含み、本出願を優先する。材料、方法および実施例は、単に図示する目的であり、限定するものと理解されない。

ここで説明する実施形態は血液から成体幹細胞を増殖させる方法に関し、
マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）を用いた血液試料の生体外処理による、患者から採取された血液試料の成体血液幹細胞の成長およびプログラム解除を行うステップと、
血液試料のオゾン処理を行うステップと、を提供する。

具体的には、血液は、全血（特に末梢血）であることができる。

従って、本発明により、採取される血液試料から多能性成体幹細胞を獲得できるようにする。

事実、国際公開第２００８／０３４３７０号および国際公開第２００９／１１５５２２号に記載のように、得られた幹細胞は、幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ９０／３４、ＣＤ３４、ＣＤ１１７を有し、それらはまた、多能性特徴（Ｓｏｘ２，Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ）に強く関係するいくつかの細胞内の転写因子を表し、そして、分裂または増殖の際に、自身の「自己」認識因子を失わない。幹細胞による副作用（例えば拒絶、感染、奇形腫の発生）は生じない。一旦患者に投与されると、「生体内で」自身を区別するので、多能性幹細胞のように作用することが可能である。

表現「ＭＣＳＦを用いた血液試料の生体外処理による、患者から採取した血液試料の成体血液幹細胞の成長およびプログラム解除」とは、血液の白血球の細胞のプログラムを解くことによって、血液試料に元々存在する成体幹細胞の成長を獲得するために、患者から採取されそして特定量の成体幹細胞を含んでいる血液試料を、生体外でＭＣＳＦを用いて処理することを意味する。

さらにまた、表現「オゾン処理」とは、血液試料に又は血液試料中への、オゾンを用いた血液試料の処理（オゾンの付加、吐出、投与または混合、または、酸素とオゾンの混合）を意味する。

オゾン（シンボルＯ_３）は、三原子分子と、分子量：４８とを有する、酸素の同素形である。通常の状態では、オゾンは刺激臭を伴い、青色の気体として現れ、強い酸化力を有する。オゾンは、多数の有機合成において、消毒薬、脱臭剤、殺菌剤、滅菌器または酸化剤として作用することができる。

考えられる実施形態によれば、血液試料のオゾン処理は、ＭＣＳＦ処理の前に行うことができる。

考えられる実施形態によれば、血液試料のオゾン処理は、ＭＣＳＦ処理と同時に行うことができる。

考えられる実施形態によれば、血液試料のオゾン処理は、ＭＣＳＦ処理の後に行うことができる。

考えられる実施形態によれば、血液試料に抗凝固物質を加えることができる。考えられる抗凝固物質の例としては、ヘパリン、ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムがある。

いくつかの実施形態において、上記の方法による多能性幹細胞の産生のために、本発明による方法では、血液を収集するためにキットを使用することができる。そして、少なくとも、採取される血液試料（ＭＣＳＦ物質と、設けるなら、おそらく引用の抗凝固物質を含む）を含むことが可能な試験管のような容器を備える。

このタイプのキットで、本明細書による上記の方法を用いて、急速に幹細胞の成長および産生を開始するために、全血（好ましくは末梢血）を収集することが可能であり、したがって産生を大幅に早めることができる。

ここで説明する実施形態によると、記載される方法（血液試料のＭＣＳＦおよびオゾン処理を用いた成長およびプログラム解除）に従って収集および処理した血液試料の量は、例えば０．２ｍｌ〜１００ｍｌ、特に０．５ｍｌ〜５０ｍｌ、特に１ｍｌ〜２５ｍｌ、さらに、特に２ｍｌ〜１０ｍｌ、特に２ｍｌ〜８ｍｌ、特に３ｍｌ〜８ｍｌ、さらに、特に３ｍｌ〜５ｍｌに含まれる、２、３ｍｌだけである。

他の変形例によると、収集され、ＭＣＳＦを用いた成長およびプログラム解除を受ける血液試料の量は、数百ｍｌ（例えば１００〜１０００ｍｌ、特に２００ｍｌ〜６００ｍｌ、特に４００ｍｌ〜６００ｍｌ、例えば５００ｍｌ）である。患者（の体内）に循環させるために、血液試料を静脈または動脈内に注入することができ、注入を受けた患者はその後、全身的なオゾン治療を受けることができる。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能でありえる、いくつかの実施形態によると、いずれの種類の考えられる抗凝固物質および、いずれの濃度のＭＣＳＦ（例えば約１ｎＭ〜約５５ｎＭ）ででも、全血およびオゾンを入れることができるならどのような種類の容器も用いることができる上述の方法を提供することができる。
下位の範囲における可能な例としては、２ｎＭ〜５０ｎＭまたは５ｎＭ〜４５ｎＭである。
下位の範囲の他の例としては、２ｎＭ〜２０ｎＭ、または８ｎＭ〜１５ｎＭ、または８〜１０ｎＭ、または１０ｎＭ〜１２ｎＭ、または１２ｎＭ〜３５ｎＭ、または１５ｎＭ〜３０ｎＭ、または２０ｎＭ〜２５ｎＭまたは３５ｎＭ〜５５ｎＭまたは４０ｎＭ〜５０ｎＭ、またはこれらすべての範囲または下位の範囲の組合せであり、そして言及され、明確にここで示されない範囲または下位の範囲に存在するすべての整数または分数も含む。

ここで記載されるすべての実施形態と組み合わせ可能である、いくつかの実施形態によると、オゾン処理により、Ｏ_２−Ｏ_３の混合物を血液試料に供給する。

考えられる実施形態では、出願人は、Ｏ_２−Ｏ_３混合物に対する血液の比率は、好ましくは１：１の化学量論比であることができると発見した。

考えられる実施形態において、血液試料のＯ_２−Ｏ_３混合物の量は、約１μｇ／ｌ以上でありえ、特に、約１μｇ／ｍｌ〜約４２μｇ／ｍｌから選択され、特に約５μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌから選択され、さらに、特に約１０μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌから選択され得る。

ここに記載されるいくつかの実施形態によると、血液を、好ましくは室温で、条件を特定の時間後（好ましくは４時間〜９６時間、特に４時間〜７２時間、更には特に４時間〜４８時間）にしておき、プログラム解除から得られる幹細胞の成分で得られる全血を、全身的に（静脈または動脈内に）または局所的に、患部組織かその近くに、全て再接種することができる。

考えられる実施では、ＭＣＳＦを用いた生体外処理による、成長およびプログラム解除時間は、１２時間〜９６時間、特に１２時間〜７２時間、特に１２時間〜３６時間であり得る。

考えられる実施では、ＭＣＳＦを用いた生体外処理による、成長およびプログラム解除時間は、２４時間〜９６時間、特に２４時間〜７２時間、特に２４時間〜３６時間であり得る。

考えられる実施では、ＭＣＳＦを用いた生体外処理による、成長およびプログラム解除時間は、４８時間〜９６時間、特に４８時間〜７２時間、特に４８時間〜６０時間であり得る。

ＭＣＳＦを用いた生体外処理により成長およびプログラム解除を受ける血液試料のオゾン処理が、成体幹細胞の増殖およびプログラム解除のプロセスを刺激し、その結果、数時間後に、有意な数の役立つ成体幹細胞が確認できると、出願人は仮説を立てた。

出願人は、幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ９０／３４、ＣＤ３４およびＣＤ１１７の識別により、約４〜９６時間のＭＣＳＦを用いた生体外処理の時間が、結果として幹細胞の成長を安定させることができると発見した。これは、最適条件であると考えられている。

出願人はまた、濃度が約１ｎＭ〜約５５ｎＭであるＭＣＳＦで、細胞が多能性成体幹細胞の表現型を維持すると発見した。５５ｎＭを超える（例えば７０ｎＭ）濃度のＭＣＳＦを用いた場合、２４時間後はすでに、細胞は多能性成体幹細胞の表現型をもはや維持しないと観察された。

ここで記載される方法の実施形態では、ＭＣＳＦが含まれており、成体幹細胞の増殖させる容器だけでなく、上記のように獲得された幹細胞を含む第２の容器（例えば静脈であるか動脈内の使用の場合）および、おそらく局所使用のための第３の容器（異なるサイズ）を使用することもできる。前記容器で産生され保存される幹細胞は、すぐに使用可能であるか、または、必要に応じて後で使用するために、例えば液体窒素で保存することができる。

ＭＣＳＦ（参照される容器のいずれか一つに含まれる）を用いた増殖およびプログラム解除の前か間か、後、幹細胞を含む血液試料に、本明細書によるオゾン処理を行うことができる。

考えられる実施形態によれば、抗凝固物質とＭＣＳＦが入っている試験管に、患者から採取した直後の血液を入れることができる。抗凝固物質は凝固の開始を止めることができ、一方で、ＭＣＳＦも同時に存在するので、急速に増殖プロセスを開始させ、患者を治療する開始時間の最短化を保証するようにする。さらにまた試料は、本明細書に従ってオゾン処理される。

他の考えられる実施形態によれば、保存プロセス（幹細胞を作り出す能力は変化しない）を受ける血液の凝固を止めるために、患者から採取される血液に、抗凝固物質を加えることができる。保存され上記通りに幹細胞の増殖処理を受ける部分から、必要に応じて、血液を採取する。すなわち、ＭＣＳＦ物質をそこに加え、必要な量の幹細胞を素早く獲得する。さらにまたこの場合も、試料は本明細書に従ってオゾン処理される。

本発明による方法により、技術水準のデメリットを克服することができ、そして、多数の利点を伴う。

例えば、本発明は全血を準備し処理することを可能にする。そして、治療を極力簡素化し、研究室で複数の種類の細胞処理を行うことは不要となる。
事実、本発明によれば、例えば赤血球を除去し、または血液の他の成分すべてに対して幹細胞を精製し、幹細胞（造血および間葉）のその他２つの成分と比較しより多くの多能性幹細胞を獲得し、または他の細胞型にそれらを増殖させるか分化させるための処理を行うことは不要となる。
これらの付加的処理は通常は獲得した幹細胞にとってストレスとなりうる。そして、情報とエネルギーの潜在能力は抑えられるが、幹細胞を生きている状態に保つことができる。これに反して、本発明は、血液試料に対して更に作業や処理を行うことは不要となる。その結果、ストレスが加えられることなく、そして、血液では再生過程を助ける他の要素の存在による恩恵を受けることができるので、全血に存在する成体幹細胞は自身の特性をより良い状態で維持する。

国際公開第２００８／０３４３７０号に記載のような、良好な結果を用いてプログラム解除により血液から得られる幹細胞で予め処理される、例えば心筋の退化といった治療不能な病態では、上記のような付加的な操作や処理がなく、このように、精製（次の増殖）を含む付加的な作業段階なしに、ＭＣＳＦを用いた成長およびプログラム解除だけから、または、ＭＣＳＦおよびオゾン処理を用いた成長およびプログラム解除から、全血においてプログラム解除された幹細胞によって、圧倒的に更なる確実な改善が見られることを出願人は見いだした。

ここで記載される方法による幹細胞の準備では、複雑な研究室での準備が不要となる。そして、病院、クリニックまたは医師が好ましくは最小限量のＭＣＳＦで、簡易検査管を用いて、幹細胞を準備できるようにする。つまりは、ＭＣＳＦを用いて、血液試料が２、３ｍｌ入った一つの試験管を使用して、重篤な病態（例えば心発作の後遺症またはパーキンソン病）さえ治療し改善することができる。
従って、考えられる実施形態によれば、これらの結果は、ＭＣＳＦを用いた血液試料の生体外処理によって、血液試料の成体血液幹細胞を成長させ、プログラムを解除するだけで、血液から成体幹細胞を増殖させる方法を構成することもできるという事実を裏付けるものである。

さらにまた、いくつかの実施形態において、血液試料に対するオゾンの添加または寄与（血液試料のオゾン処理で生じる）は、成体幹細胞のプログラム解除、そして、得られた幹細胞の質および、その情報とエネルギー蓄量に触媒作用を示すことができ、その結果、損傷組織の細胞再生に確実に影響し、製品が無菌であると更に保証をする。事実、上述のように、オゾンは、消毒薬または殺菌剤として機能することができる。

実験的症例
出願人は、本明細書による成長階段から得られるプログラム解除された幹細胞を用いて行われた治療におけるオゾンの触媒作用を証明するいくつかの生体内実験に続いて、ＭＣＳＦによる処理およびオゾンによる処理、すなわち、ＭＣＳＦを用いた増殖および「プログラム解除」に、「オゾン」または「酸素とオゾンの混合物」を追加するアイデアを思いついた。

全身的なオゾン処理
１５歳のウマは右の前脚の表面屈筋腱の慢性近位病変のため競争から離脱した。そして、慢性近位病変のため、１８ヵ月間足を引きずっていた（図１参照）。遠い昔は一般的な方法であったので、６ヵ月前、「焼烙」による治療がウマに行われた。（図２参照）。「焼烙」には、肯定的な治療効果は何もなく、実際のところ、瘢痕（硬化症）を引き起こした。
ウマは、全身状態が不良であり、そして、焼烙によって、年老いたウマでは治療するのが困難である敏感な部分に近位病変が生じた（図３参照）。
毎６週ごとに３回、ＭＣＳＦを用いたプログラム解除から得られる増殖幹細胞の局所注入を行ったが、それでも何の改善も見られない瘢痕が焼烙により生じてしまった。すなわち、超音波でも、跛行においても少しも改善がなかった。
この種の増殖幹細胞の注入の５ヵ月後に、ウマは運動させられたが、損傷は悪化し始めた（図４および５参照）。

従って、焼烙による腱硬化症のこの症例では、ＭＣＳＦを用いた増殖により得られた血液からのプログラム解除された幹細胞の局所および全身的な接種による効果は、示された頻度で行われた３回の接種の後、見られなかった。

３回目の接種後１５日目に、１２０ｃｃのＯ_２−Ｏ_３（１０μｇ／ｍｌ）で富化した半リットルの血液の自家輸血によって、オゾンによる全身的治療を行った。

驚くべきことに、病変が消失し、そして、超音波による検査によってウマの足はもはや不自由でないことが確認された（図６参照）。すなわち、全身的にオゾンを導入することによって、すなわち、実験により、患者の血液に酸素を与えるためにオゾン富化した自己由来の血液を有する輸血によって、わずか１０−１５日で、オゾンの触媒効果が認められた。
傷ついた表面屈筋腱の部材の幹細胞を活性化させるＭＣＳＦを介して増殖された、血液から獲得された幹細胞の接種により、以前から報告されていた病理学的組織は、再生過程上のオゾンの触媒作用によって治癒した。

オゾン療法の３か月後に、心エコー検査分析により、損傷が治癒していることが確認された（図７および８参照）。

確かな長期持続効果については、実際の治癒の証拠に、ウマは１５日間運動させられ、そして、競技に送られた。
１８歳までウマは１ヵ月に平均６つの競技に参加し、１メートル６０センチまでのジャンプを行う競技生活を定期的に続けたので、超音波によって示される回復は本当だった。
事実、ウマは再発もなく、更に３年間も競技を続けた。そして、１６歳（図９参照）、１７歳（図１０参照）、そして、１８歳（図１１参照）までジャンプイベントに参加した。

ＭＣＳＦを用いた増殖およびプログラム解除によって成体の血液から獲得される幹細胞上のオゾンの触媒作用は、上記の実験によって生体内で検出された。

この症例の後、血液から採取され、ＭＣＳＦを用いて増殖およびプログラム解除される幹細胞による処置を受ける多くの患者への触媒剤として、オゾン療法を導入した。

血液から得られる幹細胞に対する生体内効果については、ＭＣＳＦを用いた処理の前、後、または、その間、生体外も同様に、すなわち、試験管の血液も同じ触媒効果を仮定すると認める。

生体外オゾン処理
得られた結果に続き、プログラム解除プロセスに触媒作用を追加し、ＭＣＳＦを用いた成長およびプログラム解除によって得られた幹細胞に、より多くのエネルギー情報の可能性を与えようと、出願人は、血液およびＭＣＳＦを含む容器にオゾンを直接導入するという、新しく革新的なアイデアを着想した。

出願人は、生体内外両方の、血液におけるオゾンの効果を研究した（上記参照）。

血液中に気泡が発生する時には、Ｏ_２−Ｏ_３の混合物は数秒で細胞膜のリン脂質層の脂肪酸と反応する。

二重結合を有する不飽和脂肪酸とオゾンＯ_３とのこの反応結果として、リン脂質鎖は壊され、過酸化物の形で赤血球に深く入りこみ、細胞膜は越えないが、赤血球内部での反応に影響する。
しかし、過酸化物は高い細胞毒性力を有するため、赤血球は直ちに反応し、そして、グルタチオン系による解毒メカニズムを活性化する。このように消費されるグルタチオンは、解糖バイパス、すなわち、ペントースリン酸経路で再生される。

それゆえに、ヘモグロビン（Ｈｂ）はメトヘモグロビンへの酸化から守られている。そして、ＨｂＯ_２の機能を保ち、酸素Ｏ_２の透過を許容する。

赤血球の機能に関して、２，３―ジホスホグリセリン酸（２，３―ＤＰＧ）が果たす特別な役割も考慮しなければならない。２，３―ＤＰＧは赤血球に存在し、そして、その機能は酸素へのヘモグロビンの親和性を調整することである。オゾンに関して、具体的には、酸素放出作用は、末梢部で赤血球により生じる。

他の興味深い作用は、インターフェロンの誘導によって生じるオゾンの免疫賦活効果である。免疫適格細胞の中で、マクロファージによって活性化され、細胞間メッセンジャーとして作用し細胞の中のコミュニケーションを容易にする、特定の物質（インターロイキン、成長因子など）を生じるので、Ｔ４リンパ球またはヘルパー細胞には重要な役割がある。

インターロイキンによって活性化された後に、マクロファージは、免疫適格細胞の活性を測定するための基準として役立つ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を生じる。

従って、オゾンは、白血球の細胞に直接作用し、そして、赤血球で生じる反応を介して間接的に作用する。そして、血液の細胞株の機能において、それゆえに白血球の細胞においても、ＭＣＳＦによって活性化されるプログラム解除プロセスにおいて触媒としての役割を果たす。

血液とＯ_２−Ｏ_３混合物の比に関して、出願人は、この値が好ましくは１：１の化学量論比であるとわかった。

さらにまた、出願人は、血液試料のＯ_２−Ｏ_３混合物の量は、約１μｇ／ｌ以上、特に約１μｇ／ｍｌ〜約４２μｇ／ｍｌから選択され、特に約５μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌから選択され、さらに、特に約１μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌから選択され得ると発見した。
１つの実施例によると、約１２μｇ／ｍｌのＯ_２−Ｏ_３混合物を提供することができる。
他の実施例によると、約１５μｇ／ｍｌのＯ_２−Ｏ_３混合物を提供することができる。
他の実施例によると、約１８μｇ／ｍｌのＯ_２−Ｏ_３混合物を提供することができる。

心筋の変性病態の治療処置の実施例

心筋の変性疾患で投与される、オゾン処理された全血をプログラム解除することによって得られる幹細胞の臨床効果を示すために、出願人は実験を行った。

図１２および１３は、心不全を伴う病態の治療結果を比較するための、収縮作用の有意なパラメータを含む以下２つの表である。
国際公開第２００８／０３４３７０号により得られた幹細胞を使用した、１１匹のイヌ。
本発明による方法（成長およびプログラム解除を用いたＭＣＳＦおよび、オゾン処理（全血へのオゾン処理））を用いて得られた幹細胞を使用した、３匹のイヌ。
パラメータを比較することによって、国際公開第２００８／０３４３７０号と比較して、ここに記載される方法を用いると、収縮能が高まり、明らかな改善が見られ、そして具体的には、この改善が短期間（ｃｏｎｔｒｏｌ：４５日）ですでに発生するという事実がわかった。

具体的に出願人は、収縮作用に重篤な低下があり（ＦＳ１５〜２０％）、進行期にある、初期拡張型心筋症（いずれの種類の治療を用いても現在退縮の可能性がない、収縮作用の進行性消失を生じる病態）を患う、３匹の同程度の年齢（６〜７歳）のイヌ（雄のグレートデーン１匹、雄のニューファンドランド１匹、雌のドーベルマン１匹）の処置を行った。
イヌは、オゾン処理した全血からの、増殖した幹細胞（ＭＣＳＦを用いてプログラムを解除）で治療を受け、そして、精製することなく静脈内に、そして心臓域皮下への投与を受けた。
図１４および１６の心エコー検査画像は、処置前の、２匹の異なる患畜（図１３の表：雌のドーベルマン・シャネルおよび雄のニューファンドランド・レオナルド）の様子を示す。上表で、収縮作用のパラメータが示されている：ＤｓＶＳｘ（左心室の収縮末期径）、ＦＳ％およびＦＥ％の極めて悪い値。

これに反して、同じ２匹の患畜の図１５および１７の心エコー検査画像から分かるように、処置後では、収縮作用ＤｓＶＳｘ（左心室の収縮末期径）、ＦＳ％およびＦＥ％のパラメータの線形および容量評価（Ｔｅｉｃｈｏｌｚ及びＳｉｍｐｓｏｎ方法）で測定した収縮能が増加することが明らかとなった。
この効果は、短期的には、すでにはっきりと確認されていた。（ｃｏｎｔｒｏｌ：４５日、国際公開第２００８／０３４３７０号に記載のように、血液から得られる精製されたタイプの幹細胞で予め治療を受ける患畜で、同じ期間で得られた結果）。

ＩＳＡＣＨＳクラスの心不全の、通常の状態と臨床評価とにおける心筋変性疾患により生じる効果に関しても、食欲の回復、大幅な体重増加、および身体能力と１ヵ月後のストレスに対する耐性において相当な改善がみられた。

従って、血液から成体幹細胞を増殖させる方法（本発明によるＭＣＳＦによる成長および、オゾン処理から成る）により、収縮性の退化により不全となった心筋の収縮性を回復させると、出願人は結論づけた。同時に、今日ではこの症例について、最新の治療でも回復の可能性はないであろう。
実際のところ、獣医学分野で、再生医療による他の解決策が試みられたが、異なる起源（骨髄、脂肪）の間葉系幹細胞を心筋自体へ接種しても有意な治療的結果とはならなかった。

筋肉とその神経支配とで相互反応できるように多能性成分を有する、血液から得られる幹細胞のおかげで、結果は、経時的に段階的な改良を有しており、肯定的なものとなった。
しかしながら、オゾン処理後、精製することなく、静注および心臓域皮下に、全血からの成体幹細胞を投与すると（精製された細胞と比較して治療的な結果において改善）、最も驚くべき効果が見つかった。そして、非常に短い時間でより良好な結果を得ることができた。

図１４、１５、１６および１７の心エコー検査画像は、得られた改善がどれほど例外的であったかを示している。

ここまで述べた全血から成体幹細胞を増殖させる方法に対して、本発明の分野及び範囲から逸脱することなく各部の修正及び／又は追加を行うことができることは明らかである。

いくつかの具体例を参照して本発明を説明したが、当業者が全血から成体幹細胞を増殖させる方法、他の多くの同等の実施形態に到達することができ、請求項で説明する特徴を有することにより達成されるすべてが、定められる保護範囲内となることは明白でもある。

Claims (10)

1. 全血中で成体血液幹細胞を増殖させる方法であって、
   前記全血が、１〜５５ｎＭの濃度のＭＣＳＦを用いて、４〜９６時間生体外で処理される第１の処理と、
   前記全血が、生体外で酸素とオゾンの混合物によりオゾン処理される第２の処理と、を備える方法。
2. 前記第１の処理の前に、前記第２の処理を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 前記第１の処理の間に、前記第２の処理を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
4. 前記第１の処理の後に、前記第２の処理を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
5. 前記全血中の前記混合物の量が１μｇ／ｍｌ〜４２μｇ／ｍｌの範囲で選択されることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記全血に抗凝固物質を加えることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項記載の方法。
7. 少なくとも前記ＭＣＳＦを含んだ容器に、採取された前記全血を収容することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項記載の方法。
8. 前記第１の処理および、前記第２の処理がなされる、前記全血の量が０．２ｍｌ〜１００ｍｌ の間であることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項記載の方法。
9. 前記第１の処理および、前記第２の処理がなされる前記全血の量が２ｍｌ〜１０ｍｌの間であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項記載の方法。
10. 前記第１の処理および、前記第２の処理がなされる前記全血の量が３ｍｌ〜５ｍｌであることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項記載の方法。

Images