CN110200940B - 基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针。将金纳米粒子用双亲性大分子包被，再将血清蛋白包被上去形成疏水空腔，加入药物分子，形成负载有药物分子的金纳米粒子；将负载有药物分子的金纳米粒子、尿液外泌体混悬液加入电转缓冲液，充分混匀，得到样品，放入电穿孔仪中，进行电穿孔，得到基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针。与现有技术相比，本发明所得纳米探针平均直径约30‑150nm，粒径分布均匀。本发明制备方法简单、快捷能够满足多种疾病诊断治疗的需要，例如肿瘤的体内外成像与治疗，另外由于尿液来源丰富，尿液外泌体的临床应用可行性强，前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物与医药新剂型、制剂技术领域，尤其是涉及一种基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针及其制备方法与应用。
背景技术
外泌体(Exosomes)由细胞内的多泡体(multi-vesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为30～130nm。细胞源性膜性囊泡广泛存在于细胞培养液上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的蛋白质、脂类、核酸等，在疾病的病理学过程中充当细胞间信息传递载体，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。基于外泌体天然的运载属性和良好的生物安全性，外泌体被认为是极具前景的药物和蛋白递送载体，与人工合成的脂质体相比，外泌体优势突出：优越的稳定性、肿瘤靶向性强、毒性低。目前将外泌体改造为载体已经是近年来相关研究领域的热点问题，然而外泌体的产量和纯度问题仍然没有很好的解决，虽然目前有差速离心法，聚乙二醇(PEG)沉淀法，超滤离心法，密度梯度离心法，免疫磁珠捕获法，但是没有哪一种方法能同时解决纯度和产量的问题。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针及其制备方法与应用。
本发明以临床级高纯度高产率尿液外泌体、负载药物分子的超小金纳米颗粒(AuNPs)，制成多功能纳米探针，该探针具有对疾病(包括肿瘤)成像治疗的作用，优越的生物相容性，该探针的制备方法简单易行，产率高，质量稳定。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针，尿液外泌体中载有金纳米粒子，所述金纳米粒子中负载有药物分子。
所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针为平均直径30-150nm的纳米粒子。
优选地，所述金纳米粒子(Au NPs)平均粒径为4nm。
所述药物分子包括二氢卟酚、阿霉素、IR780、小RNA等。
基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)负载有药物分子的金纳米粒子的制备：
将金纳米粒子用双亲性大分子包被，透射电镜观察大小均一，分散性好，接着借助范德华力(包括疏水作用、电荷作用、氢键)再将血清蛋白包被上去形成疏水空腔，加入药物分子，形成负载有药物分子的金纳米粒子；负载有药物分子的金纳米粒子尺寸均一、分散性好，水溶性好；
(2)基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备：
将负载有药物分子的金纳米粒子、尿液外泌体混悬液加入电转缓冲液，加入电击杯中，并充分混匀，得到样品，按电穿孔仪要求及电穿孔器皿规格加入相应体积的上述样品，放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行电穿孔，得到基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针。
所述双亲性大分子选自聚丙烯酸甲酯(PMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PAA)等。
所述血清蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)。
步骤(1)中，加入血清蛋白以后，室温下快速搅拌10-12h。
步骤(1)中，加入药物分子以后，37℃恒温震荡箱中避光共孵育12h，离心洗涤得到负载有药物分子的金纳米粒子。
所述尿液外泌体通过以下方法制备得到：
(21)采用4℃条件下磷酸盐缓冲液对尿液进行稀释；
(22)将步骤(21)制得的稀释液在4℃条件下以3,00-15,000rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
(23)将步骤(22)得到的上清液在4℃条件下以8,000-20,000rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
(24)用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤(23)中得到的上清液，继续用60-220k的超滤管以2000-8000rpm的速度离心10～60min，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液，减少接下来的超速离心的工作量及成本；
(25)将步骤(24)得到的浓缩上清液以4℃条件下60,000g-200,000g的转速离心60-90min，离心结束后，弃上清，留住沉淀；
(26)将步骤(25)得到的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后即可得到大量高纯度的尿液外泌体，损失率极低；
(27)将步骤(26)中得到的洗涤后的尿液外泌体用0.22μm-0.66μm的无菌滤头滤菌处理，即可得到临床级高纯度高产率尿液外泌体，冻存于-80℃备用。
步骤(21)中，所述尿液为健康志愿者晨起空腹中段尿。
所述尿液外泌体的提取是采用差速离心和超滤离心相结合，并增加稀释和浓缩步骤，获取的高纯度和高产率尿液外泌体。
步骤(2)中，负载有药物分子的金纳米粒子、尿液外泌体、电转缓冲液的加入比例关系为：5-20μg尿液外泌体、20-80μL负载有药物分子的金纳米粒子和100-200μL电转缓冲液混合。
步骤(2)中，电穿孔的条件为：电压20-1200V，电容100-1200μF，放电时间1-30ms，放电次数：1-30times。
步骤(2)中，电穿孔结束后，为了促进电穿孔后外泌体磷脂双分子层的修复，将得到的混合液37℃温箱中放置30min-120min，优选60-120min，等待外泌体膜修复后以8,0000-14,0000g，梯度离心，以去除游离的负载有药物分子的金纳米粒子，获取多功能纳米探针。
本发明还对获得的多功能纳米探针进行表征，利用纳米颗粒跟踪分析检测(Nano-sight Tracking Analysis,NTA)或动态光反射分析(DLS)测定其粒径大小及分布范围，并在电子透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)下观察其大小及形貌特征，蛋白质印迹法(western blot)检测尿液外泌体膜表面特征性蛋白表达，电穿孔标记外泌体对其主要的标记蛋白没有很大的影响，间接说明这种装载方式是安全的。
当所述药物分子为二氢卟酚(Ce6)时，所形成的多功能纳米探针称之为Exo-PMA/Au-BSA@Ce6。所述尿液外泌体内部载有可用于光动力学治疗的Ce6，为了提高Ce6的稳定性以及其进入尿液外泌体的量，以超小金纳米颗粒作为载体，同时Ce6是一种光敏剂，Ce6标记的尿液外泌体可作为成像跟踪，研究药学代谢动力学。通过超小Au NPs作为载体将Ce6通过电转方式带入uri-exos中形成可以用来成像治疗的纳米探针，该探针在体液中有天然的稳定性，并可以延长药物在体内的循环时间，减少毒副作用。该载体能穿透生物屏障，进入普通药物难以起效的的部位，改善治疗效果。该方法简便易行，产物的稳定性好，制备方法对囊泡本身所携带的生物分子无显著影响，保证后续应用的安全性。
本发明提供了一种能大量获得高纯度尿液外泌体(urine-exosomes,uri-exos)的方法，另外，相比较体外细胞培养获得的外泌体，由于尿液来源丰富，无创易得，节省财力物力，生物安全性高，自体尿液来源外泌体免疫原性低，非常适合作为载体的外泌体来源，为临床转化提供可能。
Ce6是一种常用的光动力学药物，在激光照射下能产生大量的单线态氧，从而诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死。游离的Ce6都表现为疏水性，在溶液中很容易聚集且易被单核巨噬细胞系统吞噬，肿瘤部位的浓度较低，影响肿瘤成像和治疗效果，而以超小Au NPs为载体装载的Ce6通过电穿孔方式进入外泌体形成的纳米探针可以提高Ce6分散性和稳定性，减少其毒性，超小粒径的Au NPs易于合成，比表面积大，能包载大量Ce6，包载率高，同时由于Ce6带有荧光，借助Au NPs进入外泌体后可以标记外泌体，而外泌体的标记与活体成像是外泌体作为疾病治疗载体安全性及研究其体内分布、代谢动力学的重要手段，为该载体的可视化治疗奠定基础。而且对于肿瘤，尤其是深部的肿瘤来说，需要借助于影像学检查发现病灶，评估病情进展，而与治疗相伴随的动态成像就显得尤为重要。因此，本发明提供的能同时进行肿瘤成像治疗的外泌体多功能探针有利于促进诊疗的一体化。
附图说明
图1 uri-exos的透射电镜图；
图2外泌体的NTA；
图3二氢卟吩结构图；
图4负载Ce6的金颗粒电镜图；
图5基于外泌体的纳米探针电镜图；
图6外泌体的western blot结果。
具体实施方式
一种基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法：
首先，通过以下方法制备得到尿液外泌体：
(21)采用4℃条件下磷酸盐缓冲液对尿液进行稀释；
(22)将步骤(21)制得的稀释液在4℃条件下以3,00-15,000rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
(23)将步骤(22)得到的上清液在4℃条件下以8,000-20,000rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
(24)用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤(23)中得到的上清液，继续用60-220k的超滤管以2000-8000rpm的速度离心10～60min，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液，减少接下来的超速离心的工作量及成本；
(25)将步骤(24)得到的浓缩上清液以4℃条件下60,000g-200,000g的转速离心60-90min，离心结束后，弃上清，留住沉淀；
(26)将步骤(25)得到的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后即可得到大量高纯度的尿液外泌体，损失率极低；
(27)将步骤(26)中得到的洗涤后的尿液外泌体用0.22μm-0.66μm的无菌滤头滤菌处理，即可得到临床级高纯度高产率尿液外泌体，冻存于-80℃备用。
步骤(21)中，所述尿液为健康志愿者晨起空腹中段尿。
所述尿液外泌体的提取是采用差速离心和超滤离心相结合，并增加稀释和浓缩步骤，获取的高纯度和高产率尿液外泌体。
制得的高纯度高产率尿液外泌体的透射电镜图片如图1所示，外泌体的NTA如图2所示。
然后制备负载有Ce6的金纳米粒子：
将平均粒径为4nm的金纳米粒子用双亲性大分子聚丙烯酸甲酯(PMA)包被，透射电镜观察大小均一，分散性好，接着借助范德华力(包括疏水作用、电荷作用、氢键)再将牛血清白蛋白(BSA)包被上去形成疏水空腔，室温下快速搅拌10-12h，加入Ce6，Ce6的结构式如图3所示，37℃恒温震荡箱中避光共孵育12h，离心洗涤负载有Ce6的金纳米粒子；负载Ce6超小Au NPs(4nm)的图片如图4所示，负载有药物分子的金纳米粒子尺寸均一、分散性好，水溶性好。
再进行基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备：
将5-20μg尿液外泌体、20-80μL负载有药物分子的金纳米粒子和100-200μL电转缓冲液混合，加入电击杯中，并充分混匀，得到样品，按电穿孔仪要求及电穿孔器皿规格加入相应体积的上述样品，放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行电穿孔，电穿孔的条件为：电压20-1200V，电容100-1200μF，放电时间1-30ms，放电次数：1-30times，电穿孔结束后，为了促进电穿孔后外泌体磷脂双分子层的修复，将得到的混合液37℃温箱中放置30min-120min，优选60-120min，等待外泌体膜修复后以8,0000-14,0000g，梯度离心，以去除游离的负载有药物分子的金纳米粒子，获取多功能纳米探针，如图5所示。
还对获得的多功能纳米探针进行表征，利用纳米颗粒跟踪分析检测(Nano-sightTracking Analysis,NTA)或动态光反射分析(DLS)测定其粒径大小及分布范围，并在电子透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)下观察其大小及形貌特征，蛋白质印迹法(western blot)检测尿液外泌体膜表面特征性蛋白表达，结果如图6所示，说明电穿孔标记外泌体对其主要的标记蛋白没有很大的影响，间接说明这种装载方式是安全的。
上述制备方法中，药物分子还可以是阿霉素、IR780、小RNA等。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
将制备好的负载Ce6的Au NPs、exosomes混悬液加入电转缓冲液，充分混匀，得到样品，按电穿孔仪要求及电穿孔器皿规格将5μg uri-exos、负载Ce6的40μL Au NPs和100μL电转缓冲液混合加入电击杯中并混匀放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；电穿孔条件为：电压50V，电容100μF，放电时间1ms，放电次数：1次。电穿孔结束后，得到的混合液37℃温箱中放置30min，等待exosomes膜修复后以8,0000g，梯度离心获取多功能纳米探针。
实施例2
将制备好的负载Ce6的Au NPs、exosomes混悬液加入电转缓冲液，充分混匀，得到样品，按电穿孔仪要求及电穿孔器皿规格将10μg uri-exos、负载Ce6的50μL Au NPs和110μL电转缓冲液混合加入电击杯中并混匀放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；电穿孔条件为：电压80V，电容150μF，放电时间2ms，放电次数：1次。电穿孔结束后，得到的混合液37℃温箱中放置45min，等待exosomes膜修复后以9,0000g，梯度离心获取多功能纳米探针。
实施例3
将制备好的负载Ce6的Au NPs、exosomes混悬液加入电转缓冲液，充分混匀，得到样品，按电穿孔仪要求及电穿孔器皿规格将15μg uri-exos、负载Ce6的60μLAu NPs和120μL电转缓冲液混合加入电击杯中并混匀放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；电穿孔条件为：电压100V，电容200μF，放电时间2ms，放电次数：2次。电穿孔结束后，得到的混合液37℃温箱中放置40min，等待exosomes膜修复后以10,0000g，梯度离心获取多功能纳米探针。
实施例4
将制备好的负载Ce6的Au NPs、exosomes混悬液加入电转缓冲液，充分混匀，得到样品，按电穿孔仪要求及电穿孔器皿规格将20μg uri-exos、负载Ce6的70μL Au NPs和200μL电转缓冲液混合加入电击杯中并混匀放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；电穿孔条件为：电压200V，电容150μF，放电时间3ms，放电次数：1次。电穿孔结束后，得到的混合液37℃温箱中放置75min，等待exosomes膜修复后以11,0000g，梯度离心获取多功能纳米探针。
实施例5
将制备好的负载Ce6的Au NPs、exosomes混悬液加入电转缓冲液，充分混匀，得到样品，按电穿孔仪要求及电穿孔器皿规格将40μg uri-exos、负载Ce6的100μL Au NPs和200μL电转缓冲液混合加入电击杯中并混匀放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；电穿孔条件为：电压150V，电容400μF，放电时间4ms，放电次数：1次。电穿孔结束后，得到的混合液37℃温箱中放置30min，等待exosomes膜修复后以12,0000g，梯度离心获取多功能纳米探针。
实施例6
将制备好的负载Ce6的Au NPs、exosomes混悬液加入电转缓冲液，充分混匀，得到样品，按电穿孔仪要求及电穿孔器皿规格将30μg uri-exos、负载Ce6的70μL Au NPs和130μL电转缓冲液混合加入电击杯中并混匀放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；电穿孔条件为：电压350V，电容140μF，放电时间6ms，放电次数：2次。电穿孔结束后，得到的混合液37℃温箱中放置60min，等待exosomes膜修复后以13,0000g，梯度离心获取多功能纳米探针对获得的多功能纳米探针进行表征，利用NTA测定其粒径大小及分布范围，并在TEM下观察其大小及形貌特征，western blot检测exosomes膜表面特征性蛋白表达。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)负载有药物分子的金纳米粒子的制备：
将金纳米粒子用双亲性大分子包被，再将血清蛋白包被上去形成疏水空腔，加入药物分子，形成负载有药物分子的金纳米粒子；
(2)基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备：
将负载有药物分子的金纳米粒子、尿液外泌体混悬液加入电转缓冲液，充分混匀，得到样品，放入电穿孔仪中，进行电穿孔，尿液外泌体中载有金纳米粒子，得到基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针。
2.根据权利要求1所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针为平均直径30-150nm的纳米粒子。
3.根据权利要求1所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，所述药物分子包括二氢卟酚、阿霉素、IR780、小RNA。
4.根据权利要求1所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，所述双亲性大分子选自聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯。
5.根据权利要求1所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，所述血清蛋白包括牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
6.根据权利要求4所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，所述尿液外泌体通过以下方法制备得到：
(21)采用磷酸盐缓冲液对晨起中段尿进行稀释；
(22)将步骤(21)制得的稀释液以3,00-15,000rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
(23)将步骤(22)得到的上清液以8,000-20,000rpm的转速离心，留取上清液，弃沉淀；
(24)用磷酸盐缓冲液稀释步骤(23)中得到的上清液，继续用超滤管以2000-8000rpm的速度离心，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液；
(25)将步骤(24)得到的浓缩上清液60,000g-200,000g的转速离心，离心结束后，弃上清，留住沉淀；
(26)将步骤(25)得到的沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后即可得到大量高纯度的尿液外泌体；
(27)将步骤(26)中得到的洗涤后的尿液外泌体用0.22μm-0.66μm的无菌滤头滤菌处理，即可得到临床级高纯度高产率尿液外泌体。
7.根据权利要求1所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，负载有药物分子的金纳米粒子、尿液外泌体、电转缓冲液的加入比例关系为：5-20μg尿液外泌体、20-80μL负载有药物分子的金纳米粒子和100-200μL电转缓冲液混合。
8.根据权利要求1所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，电穿孔的条件为：电压20-1200V，电容100-1200μF，放电时间1-30ms，放电次数：1-30times。
9.根据权利要求1所述基于尿液外泌体的负载有金纳米粒子和药物分子的多功能探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，电穿孔结束后，将得到的混合液放置，等待外泌体膜修复后以8,0000-14,0000g，梯度离心获取多功能纳米探针。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3292861A1 (en) * | 2016-09-13 | 2018-03-14 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | An in vitro method for obtaining a biohybrid vector |
| CN108114290A (zh) * | 2018-01-03 | 2018-06-05 | 东南大学 | 一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法 |
| CN108543074A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-09-18 | 华中科技大学 | 一种用于肿瘤治疗的外泌体包裹的纳米载药系统及其制备 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 外泌体在疾病实验诊断和临床治疗中的研究进展;蒲双双等;《现代检验医学杂志》;20180715;第33卷(第4期);第160-164页 * |
| 金纳米星负载二氢卟吩e6对肺癌A549 细胞的光动力效应;李晨露等;《中国肿瘤生物治疗杂志》;20180425;第25卷(第4期);第394-400页 * |
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