CN110151701A - 杂化囊泡的制备方法及其制备得到的杂化囊泡、药物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杂化囊泡的制备方法及其制备得到的杂化囊泡、药物和应用，涉及生物技术领域。该杂化囊泡的制备方法包括将含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至脂质体和细胞来源囊泡杂化。该制备方法制备得到的杂化囊泡兼具生物相容性和稳定性，并且粒径分布均一，同时操作简单，杂化效率高，并且制备的过程中无杂质残留。

Description

杂化囊泡的制备方法及其制备得到的杂化囊泡、药物和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种杂化囊泡的制备方法及其制备得到的杂化囊泡、药物和应用。

背景技术

近年来小分子药物和生物大分子递送载体的开发和研究受到了广泛关注。这类递送载体可保护小分子药物、生物大分子如蛋白质或核酸的活性，以及避免某些蛋白酶或核酸酶的降解作用。某些递送载体还具有免疫佐剂的功能，可增强抗原诱发的免疫反应。

各种细胞来源囊泡因其来源于机体而具有非常好的生物相容性，此外，嵌入囊泡膜的功能性蛋白也有利于其在靶向递送领域的应用，为了将细胞来源囊泡用作递送载体，常常需要对囊泡膜或内水相进行修饰。

比如，为了克服外泌体有限的胶体稳定性和较短的血浆半衰期，可将亲水性聚合物PEG插入外泌体膜以增加其胶体稳定性并延长其血浆半衰期(Kim,M.S.,et al(2018).Nanomedicine：nanotechnology，biology，and medicine，14(1)：195-204.)。此外，特定的膜蛋白可以预先通过亲本细胞的遗传修饰掺入外泌体膜中(Takahashi,Y.,et al(2013).JBiotechnol 165(2)：77-84.)。然而，这些外泌体修饰方法都比较繁琐且效率较低。

还有一类细胞来源囊泡修饰方法是利用化学或物理方法诱导脂质体与细胞来源囊泡发生膜融合，从而将脂质体特定膜组分或内水相引入细胞来源囊泡膜或内水相。比如有研究利用化合物PEG诱导脂质体与外泌体发生膜融合，从而实现对外泌体膜的修饰(Piffoux,M.,et al.(2018).ACS Nano12(7):6830-6842)。还有研究利用物理方法如冻融诱导膜融合，从而将脂质体特定组分聚乙二醇磷脂插入外泌体膜，构建杂化外泌体(T.Sato,Y.,et al(2016).6：21933)。这类通过诱导脂质体与细胞来源囊泡发生膜融合的方法不仅可用于修饰囊泡膜，还能将脂质体内水相插入囊泡内水相，从而将功能分子载入囊泡膜。这种修饰方法同时实现囊泡膜的修饰和内水相的包载。化学诱导膜融合的方法需要在脂质体和外泌体的混合物中添加化学物质如PEG、Ca2⁺或Cu2⁺等，因此在膜融合诱导完毕需要采取额外的步骤除去(Piffoux,M.,et al.(2018).ACS Nano 12(7):6830-6842)。而冻融法诱导膜融合则常引起杂化囊泡的粒径变大、分布变宽的缺点(T.Sato,Y.,et al(2016).6：21933)，这不利于杂化囊泡作为递送载体的体内药动学特性(Pattni,B.S.,etal.(2015).Chemical Reviews 115(19):10938-10966.)，此外冻融法通常耗时6～8h以上，效率偏低。

综上现有技术方案的缺点有：(1)化学法诱导脂质体与外泌体膜或其它细胞囊泡融合需要添加外来化学物质如Ca²⁺或聚乙二醇，在诱导融合完成后需要采取额外步骤除去这些化学物质，且耗时较长。(2)冻融法诱导脂质体与外泌体膜或其它细胞囊泡融合的方法存在冻融法耗时较长，达通常达6～8h，且冻融制备的杂化外泌体或杂化细胞囊泡粒径分布很宽。(3)孵育法将功能分子载入外泌体或其它细胞囊泡耗时长，效率偏低。因此，一种改进的脂质体和细胞来源囊泡杂化的方法是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种杂化囊泡的制备方法，该制备方法具有脂质体和细胞来源囊泡杂化效率高、无杂质残留和杂化后得到的杂化囊泡粒径分布均一的优点。

本发明的第二目的在于提供一种采用上述制备方法制备得到的杂化囊泡，该杂化囊泡兼具生物相容性和稳定性，粒径分布均一。

本发明的第三目的在于提供一种药物，该药物中包含上述杂化囊泡。

本发明的第四目的在于提供一种上述杂化囊泡的制备方法，或上述杂化囊泡的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种杂化囊泡的制备方法，该制备方法包括将含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至脂质体和细胞来源囊泡杂化；

所述杂化包括：脂质体的膜和细胞来源囊泡的膜融合成杂化囊泡的膜，和脂质体的内水相和细胞来源囊泡的内水相融合成杂化囊泡的内水相。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了由上述杂化囊泡的制备方法制备得到的杂化囊泡。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了包含上述杂化囊泡的药物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述杂化囊泡的制备方法，或上述杂化囊泡的应用，所述应用包括如下(x1)～(x3)中的至少一种：

(x1)用于包载药物活性成分，所述药物活性成分包括：抗生素类药物、用于治疗肿瘤的药物活性成分，用于免疫治疗的药物活性成分，用于基因治疗的药物活性成分和免疫佐剂中的一种或者多种；

(x2)用于制备药物，所述药物包括用于肿瘤治疗的药物，用于免疫治疗的药物或用于基因治疗的药物；

(x3)治疗性肿瘤疫苗或在自免性疾病诱导免疫耐受的生物制剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用挤出法制备杂化囊泡，该方法通过将脂质体和细胞来源囊泡在压力驱动下穿过核孔膜，使二者的膜发生局部破裂和重组，并伴随发生膜融合和内水相混合，从而实现脂质体膜中的组分和内水相的组分融合至细胞来源囊泡中。同时，脂质体和细胞来源囊泡穿过核孔膜限制了脂质体和细胞来源囊泡融合后形成的杂化囊泡的粒径，以使挤出法得到的杂化囊泡的粒径分布更均一。

本发明提供的杂化囊泡的制备方法克服了现有细胞来源囊泡修饰技术的不足和缺陷，比如效率低、需添加其它化学物质或囊泡粒径范围变宽等。本发明提供的制备方法无需添加其它化学物质，避免杂质残留；本发明提供的制备方法杂化效率高，只需将脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至脂质体和细胞来源囊泡杂化，操作简单，制备时间短。

本发明提供的杂化囊泡在细胞来源囊泡的膜中引入了脂质体膜组分，得到的杂化囊泡的膜相较于细胞来源囊泡的膜更稳定，同时该杂化囊泡含有细胞来源囊泡的膜组分，生物相容性较脂质体更佳，因此本申请提供的杂化囊泡是一种兼具生物相容性和稳定性的囊泡；并且该杂化囊泡采用挤出法制备得到，杂化囊泡的粒径分布更均一。

基于上述发明构思，本发明还提供了包含上述杂化囊泡的药物，以及上述杂化囊泡的制备方法，或上述杂化囊泡的应用，该药物和应用具有上述杂化囊泡的制备方法和杂化囊泡的所有有益效果，再次不再赘述。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的杂化囊泡的示意图；

图2为本发明实施例1提供的荧光标记脂质体的粒径分布；

图3为本发明实施例2提供的外泌体的粒径分布；

图4为本发明实施例2提供的外泌体的透射电镜鉴定图；

图5为本发明实施例3提供的杂化外泌体的粒径分析图；

图6为本发明实施例3提供的杂化外泌体的透射电镜图；

图7为本发明实施例3提供的杂化外泌体的共聚焦显微镜图；

图8为本发明实施例4提供的脂质稀释率标准曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种杂化囊泡的制备方法，该杂化囊泡主要由脂质体和细胞来源囊泡杂化而成，本发明所述的杂化，指的是至少两种不同来源的囊泡结构发生重组并融合成一种兼具两种囊泡成分的新囊泡，所述新囊泡成分包括但不限于组成囊泡的膜的组分，囊泡的内水相和修饰囊泡的表面的修饰物等。脂质体是由脂质双分子层所形成的人工双层膜封闭结构，当两性分子分散于水相时，分子的疏水尾部聚集在一起，亲水头部暴露在水相，形成封闭结构。细胞来源囊泡是一种由细胞膜或胞内膜组成的封闭囊泡结构，细胞来源囊泡可以包括细胞分泌出的囊泡，包括但不限于为外泌体、膜微粒或微囊泡等；也可以是细胞的胞内含有的，并经过分离处理分离得到的囊泡；还可以是以细胞为原料，制备得到的膜组分来自于细胞的囊泡。

将脂质体和细胞来源囊泡杂化后得到的杂化囊泡，其膜中含有脂质体的膜组分和细胞来源囊泡的膜组分，膜组分指的是构成膜的组分。脂质体和细胞来源囊泡在杂化过程中脂质体的膜和细胞来源囊泡的膜发生了融合和重组，使杂化囊泡的膜中既含有细胞来源的膜组分，也含有构成脂质体膜的组分，即将构成脂质体的膜组分引入到细胞来源囊泡的膜中，构成了杂化囊泡。在杂化囊泡引入了脂质体膜组分，使得到的杂化囊泡的膜相较于细胞来源囊泡的膜更稳定，该杂化囊泡含有细胞来源囊泡的膜组分，生物相容性较脂质体更佳，因此本申请提供的杂化囊泡是一种兼具生物相容性和稳定性的囊泡。除了脂质体和细胞来源囊泡的膜之间发生杂化，脂质体的内水相和细胞来源囊泡的内水相也发生了杂化，即杂化囊泡的内水相包括脂质体的内水相组分和细胞来源囊泡的内水相组分，如图1所示。

本发明提供的杂化囊泡的制备方法，包括将含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至脂质体和细胞来源囊泡杂化。核孔膜是一种新型的筛孔型过滤膜，主要利用重离子或裂变碎片在绝缘物质薄膜上打孔然后化学刻蚀扩孔而成。所述反复挤出指的是将前一次挤出的产物作为下一次挤出的原料来进行挤出。将脂质体和细胞来源囊泡在压力驱动下穿过核孔膜，能使二者的膜发生局部破裂和重组，并伴随发生膜融合和内水相混合，从而实现脂质体膜中的组分和内水相的组分融合至细胞来源囊泡中。同时，脂质体和细胞来源囊泡穿过核孔膜限制了脂质体和细胞来源囊泡融合后形成的杂化囊泡的粒径，以使挤出法得到的杂化囊泡的粒径分布更均一。在一些优选的实施方式中，将含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至少25次，可使二者杂化；更优选反复挤出至少25～200次，例如可以为但不限于为25次、50次、75次、100次、120次、150次、160次、180次或200次，可达到较好的挤出效果。

本发明采用挤出法制备杂化囊泡，可以得到粒径分布均一的杂化囊泡。本发明提供的杂化囊泡的制备方法克服了现有细胞来源囊泡修饰技术的不足和缺陷，比如效率低、需添加其它化学物质或囊泡粒径范围变宽等。本发明提供的制备方法无需添加其它化学物质，避免杂质残留；本发明提供的制备方法杂化效率高，只需将脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至脂质体和细胞来源囊泡杂化，操作简单，制备时间短。

作为本发明提供的制备方法的制备原料之一的脂质体，其膜可以由本领域可接受的单体经常规方法制备得到，其中脂质体的膜组分可由包括但不限于为由磷脂、糖脂、胆固醇中的一种或者多种组成，其中磷脂具体的例如可以为但不限于为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇中的一种或者多种，其中优选磷酯酰丝氨酸，因为含有磷酯酰丝氨酸的杂化囊泡更容易被细胞吞噬，从而使杂化囊泡内的物质更容易递送至细胞内。可以理解的是，所述脂质体可以采用本领域可接受的常规方法制备得到，例如可以为但不限于为薄膜分散法、超声分散法、复乳法、乙醇注入法、反相蒸发法、超临界法或微流控喷射法。

在一些优选的实施方式中，所述脂质体的膜组分经修饰物修饰；在脂质体的膜组分上添加修饰物可以使脂质体附加额外的功能，或提高杂化囊泡的性能，所述修饰物包括大不限于荧光标记、同位素标记和药物修饰剂中的至少一种。可选地，在脂质体上修饰荧光标记，一方面可以观察脂质体和细胞来源囊泡的融合度，另一方面还可以用于示踪杂化囊泡的在机体中或体外实验时在细胞中的位置；可选地，在脂质体上修饰同位素标记也可以起到示踪作用。可选地，在脂质体膜组分上修饰药物修饰剂以提高杂化囊泡的物理和化学性能，药物修饰剂指的是用于偶联到药物上，以改善药物某些物理和化学性质的物质，例如降低药物的毒副作用、提高药物的溶解性以及延长药物的半衰期等，所述药物修饰剂包括但不限于小分子有机酸或水溶性高分子，具体的例如可以为但不限于为丁二酸、戊二酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、聚甲基丙烯酸的共聚物以及聚谷氨酸等。在一些优选的实施方式中，所述药物修饰剂包括聚乙二醇类修饰剂，所述聚乙二醇类修饰剂包括各分子量的聚乙二醇以及经甲苯磺酸酯、氨基、羧基、醛基或巯基修饰的聚乙二醇的衍生物。经聚乙二醇修饰的膜组分可延长脂质体膜组分的半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。

在一些优选的实施方式中，所述脂质体的膜组分包括聚乙二醇磷脂，即经聚乙二醇修饰的磷脂，聚乙二醇磷脂可以提高磷脂与细胞膜的融合效率，进而提高脂质体和细胞来源囊泡的融合效率，和杂化后杂化囊泡和细胞的融合效率，并且聚乙二醇化磷脂体外稳定性好。在一些优选的实施方式中，所述膜组分包括荧光标记的磷酯酰丝氨酸，磷酯酰丝氨酸能促使细胞对其进行吞噬，使用荧光标记磷酯酰丝氨酸能检测脂质体和细胞来源囊泡的融合度。

在一些可选的实施方式中，在脂质体的内水相中包裹活性物质，以使杂化后将活性物质引入杂化囊泡的内水相中。所述活性物质包括用于治疗和/或辅助治疗的药物活性成分；优选地，所述药物活性成分包括抗生素类药物、用于治疗肿瘤的药物活性成分，用于免疫治疗的药物活性成分，用于基因治疗的药物活性成分和免疫佐剂中的一种或者多种。可以理解的是，本发明对药物活性成分的形式以及来源不做限制，所述药物活性成分例如可以为但不限于为蛋白质、多肽、氨基酸、脂类、糖类、糖蛋白、DNA、mRNA、siRNA、miRNA或lncRNA等具有生物活性的天然的生物大分子或小分子，以及各种具有治疗作用的化合物类药物，天然物质的提取物，或者各种活性成分联合或者经过修饰的具有治疗作用的物质，以及用于辅助治疗或者用于增强或者改善这些药物活性成分的物质、比如用于示踪的标记物，用于携带药物活性物质的纳米载体、用于携带DNA或表达siRNA或miRNA的质粒等。

作为本发明提供的制备方法的另一制备原料，细胞来源囊泡可以来源于任何可产生囊泡的细胞，所述可产生既可以指细胞天然产生的可分泌至细胞外的囊泡，或胞内的不可分泌至细胞外的囊泡；也可以指以细胞为原料通过人工方法制备得到的囊泡。所述细胞来源囊泡中的细胞可以来源于各种组织中的细胞、人或动物的干细胞或者商业化的细胞系；其中所述各种组织具体的例如可以为但不限于为上皮组织、结缔组织、神经组织或肌肉组织；所述细胞也可以来源于肿瘤组织或者肿瘤患者外周血来源的循环肿瘤细胞，商品化的肿瘤细胞株以及恶性血液病患者血液中的细胞；当所述细胞来源囊泡为可以被细胞分泌出的囊泡，所述细胞来源囊泡还可以分离自细胞培养基以及人或者动物的体液，例如血液、淋巴液、唾液、乳汁或者尿液等。细胞来源囊泡的膜的组成成分来源于细胞，包括但不限于为组成细胞膜的磷脂、膜蛋白和糖脂等成分。可以理解的是，所述细胞来源囊泡种的内水相中通常还包含一些细胞内的成分，包括但不限于为蛋白质、多肽、氨基酸、脂类、糖类、糖蛋白、DNA、mRNA、siRNA、miRNA或lncRNA以及细胞代谢的各种代谢或次级代谢产物。

可以理解的是，所述细胞来源囊泡可以采用本领域可接受的常规方法从含有细胞来源囊泡的体系中分理出细胞来源囊泡，本领域可接受的常规方法例如可以为但不限于为超速离心法、密度梯度离心法、沉淀法、分子排阻法、场流分级法、微流控法、非接触法和免疫吸附法中的一种或几种的联用。

在一些可选的实施方式中，所述含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系中，使用基于核孔膜的挤出装置反复挤出25～200次，挤出时间共15～60min，得到所述杂化囊泡。所述基于核孔膜的压力挤出装置指的是能够使脂质体和细胞来源囊泡的混合体系在外力的驱动下，从核孔膜中挤出的装置。可选地，反复挤出例如可以为但不限于为25次、50次、75次、100次、120次、150次、160次、180次或200次；可选地，挤出时间例如可以为但不限于为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。例如可以为但不限于为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。

通过调整各参数之间的配合，可以进一步优化脂质体和细胞囊泡的杂化效率，在一些优选的实施方式中，所述含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系中，使用脂质体挤出仪反复挤出50～150次，挤出时间共20～40min，得到所述杂化囊泡。在一些更优选的实施方式中，所述含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系中，使用脂质体挤出仪反复挤出80～120次，挤出时间共25～35min，得到所述杂化囊泡。

在一些优选的实施方式中，所述基于核孔膜的挤出装置包括脂质体挤出仪，脂质体挤出仪通过动力端产生一定的压力，使待挤出的体系通过核孔膜实现挤出的效果。

在一些可选的实施方式中，所述制备方法还包括在将含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系挤出前，先对脂质体、细胞来源的囊泡和脂质体和细胞来源囊泡的混合体系中的至少一种进行前处理，所述前处理包括超声和或冻融，以控制脂质体或细胞来源的囊泡的粒径，使其粒径较为均一或降低粒径，所述超声和或冻融可以联用也可择一使用，只要能达到改善脂质体和/或细胞来源囊泡的粒径即可。

由于挤出时细胞来源囊泡和脂质体发生破裂，二者的内水相中的一些组分，例如细胞来源囊泡内的蛋白、多肽、脂类或者核酸，以及脂质体中的药物活性成分或生物活性分子，会从细胞来源囊泡和脂质体的封闭结构内流出成为游离组分与杂化囊泡混合在一起，因此在一些优选的实施方式中，所述制备方法还包括在挤出完毕得到杂化囊泡后分离游离组分，以去除这些游离组分，去除游离组分方法可以采用离心的方法或超滤的方法，也可以将二者联用。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的杂化囊泡。该杂化囊泡在细胞来源囊泡的膜中引入了脂质体膜组分，得到的杂化囊泡的膜相较于细胞来源囊泡的膜更稳定，同时该杂化囊泡含有细胞来源囊泡的膜组分，生物相容性较脂质体更佳，因此本申请提供的杂化囊泡是一种兼具生物相容性和稳定性的囊泡；并且该杂化囊泡采用挤出法制备得到，杂化囊泡的粒径分布更均一。

本发明还提供了包含上述杂化囊泡的药物，本发明所述的药物可以只以上述杂化囊泡作为活性成分，由于上述杂化囊泡包含细胞来源囊泡，细胞来源囊泡中可含有活性物质，因此该杂化囊泡可作为具有治疗活性的成分包含于药物中；可选地，也可以包含上述杂化囊泡和其他用于治疗、辅助治疗或者药学上可接受的辅料等其他成分。可以理解的是，其他成分可以和杂化囊泡通过化学键连接，形成杂环囊泡的衍生物；也可以和所述杂化囊泡作为药物的组合物形式同时施用；也可以部分成分和所述杂化囊泡通过化学键连接，同时部分成分以药物组合物形式和所述杂化囊泡同时施用。

本发明提供的药物根据其中含有的药物活性成分包括但不限于抗生素类药物、用于治疗肿瘤的药物活性成分，用于免疫治疗的药物活性成分，用于基因治疗的药物活性成分和免疫佐剂中的一种或者多种。在一些优选的实施方式中，所述药物以所述杂化囊泡作为载体，携带所述药物的活性活性成分，以提高药物和靶点的结合，调控其释放速率或增强其靶向性能，以上述杂化囊泡作为药物载体，具有生物相容性好，载体结构稳定和粒径分布均一的优点，优化了药物的体内药物动力学特性。

本发明还提供了上述杂化囊泡的制备方法或上述杂化囊泡的应用。所述应用包括作为载体，在一些可选的实施方式中，所述载体用于包载药物的活性成分，所述药物活性成分包括：抗生素类药物、用于治疗肿瘤的药物活性成分，用于免疫治疗的药物活性成分，用于基因治疗的药物活性成分和免疫佐剂中的一种或者多种。在一些可选的实施方式中，所述载体还可以包载具有其他作用的活性成分，例如实验研究中的各种DNA、RNA、表达盒以及质粒等。可以理解的是，作为载体时，对包载的分子种类没有限制，包括但不限于蛋白质、多肽、氨基酸、脂类、糖类、糖蛋白、DNA、mRNA、siRNA、miRNA或lncRNA等具有生物活性的天然的生物大分子或小分子，以及各种有目标作用的化合物或天然物质的提取物等。需要说明的是，作为载体时本发明不限制其包载的物质是由脂质体和细胞来源囊泡杂化时由脂质体中的水相引入的，本发明提供的载体可以是只是由脂质体改性细胞来源囊泡的杂化载体，其包载的活性物质可以由本领域可接受的常规方法进行包载。

在一些可选的实施方式中，所述应用包括可以用于制备药物，当杂化囊泡中包载具有治疗作用的药物活性成分时，其可以作为药物。在制备的药物过程中可选的对杂化囊泡进行常规的修饰或改性，或与其他治疗、辅助治疗或具有其他作用的成分，以及药学领域任选的辅料形成药物组合物。所述药物包括但不限于为所述药物包括用于肿瘤治疗的药物，用于免疫治疗的药物或用于基因治疗的药物。在一些可选的实施方式中，上述杂化囊泡的制备方法或上述杂化囊泡可用于制备包载siRNA，以用于将siRNA转染至细胞中以沉默靶基因。在一些可选的实施方式中，上述杂化囊泡的制备方法或上述杂化囊泡可用于制备包载蛋白质的载体，所述蛋白质可为肿瘤特异性抗原，从而用于诱导抗肿瘤的免疫反应；所述蛋白质也可以为免疫耐受类抗原，从而用于自身免疫疾病的治疗。在一些可选的实施方式中，上述杂化囊泡的制备方法或上述杂化囊泡还可以用于制备包载各种编码功能基因的DNA和/或RNA，以用于基因治疗。在一些可选的实施方式中，杂化囊泡及其制备方法还可以用于制备包载抗原和/或免疫佐剂的载体，从而用于制备治疗性肿瘤疫苗或在自免性疾病诱导免疫耐受的生物制剂。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

荧光标记脂质体的制备，包括如下步骤：

将1,2-二油酰基卵磷脂(瑞士CordenPharma公司)和胆固醇(国药集团化学试剂有限公司)溶解在氯仿/甲醇溶剂(2：1，v/v)(天津市康科德科技有限公司)中，并将N-(7-硝基苄基-2-氧杂-1,3-重氮-4-基)磷脂酰乙醇胺(N-NBD-PE)和N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)磷脂酰乙醇胺(N-Rh-PE)(Thermofisher公司)溶于氯仿。按一定比例将两种溶液混合，氩气流挥干有机试剂并得到脂质薄膜。将薄膜在真空条件下进一步干燥过夜以除去残留的有机溶剂，加入Hepes缓冲液水化，得到多层脂质体悬液。然后将脂质体悬液挤出(脂质体挤出仪LF1，AVESTIN)获得小单层脂质体(SUV)，即NBD-Lip。用动态光散射法检测NBD-Lip的粒径和粒径分布，结果见图2，荧光标记脂质体的平均粒径约在136nm。

实施例2

外泌体的提取，包括如下步骤：

K562细胞用含有10％FBS(Thermofisher公司)和1％抗生素的RPMI1640完全培养基中培养。1-2天后，收集培养基，在300×g条件下离心10分钟除去细胞，然后取上清液在1200×g条件下离心20分钟，以除去死细胞。最后，将上清液在12000×g条件下离心30分钟，去除细胞碎片，所有离心操作均在4℃下进行。然后将上清经0.22μm PES滤膜过滤。将滤液转移至超速离心管中，在4℃、120,000×g条件下离心70分钟，得到外泌体沉淀。最后，将外泌体沉淀用PBS重悬，并再次在相同条件下超离，去除上清中的蛋白质。得到的外泌体沉淀用PBS再次重悬，并用BCA试剂盒测定外泌体悬液的蛋白质浓度，并调整蛋白质浓度为300μg/mL备用。通过透射电子显微镜进行外泌体的鉴定，并利用动态光散射法测量外泌体的粒径和粒径分布，结果见图3和图4，外泌体的平均粒径约在168nm，透射电镜下呈典型的茶托结构，证实所提取得到的囊泡就是外泌体(van Niel,G.,et al.(2018).Nature reviewsMolecular cell biology 19(4):213-228.)。

实施例3

本实施例提供了一种杂化囊泡的制备方法和其制备得到的杂化囊泡，本实施例的杂化囊泡通过将实施例1提供的荧光标记脂质体和实施例2提供的外泌体杂化得到，采用挤出法将荧光标记磷脂插入外泌体膜，制备得到的杂化囊泡为杂化外泌体。

N-(7-硝基苄基-2-氧杂-1,3-重氮-4-基)磷脂酰乙醇胺(N-NBD-PE)和N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)磷脂酰乙醇胺(N-Rh-PE)是一种常用的荧光分子探针对，可用于检测膜融合过程中脂质的混合，这种方法基于如下原理(荧光共振能量转移，FRET)：N-NBD-PE(能量供体)的发射光谱与N-Rh-PE(能量受体)的激发光谱重叠时，供体吸收光子产生的激发态能量非辐射地转移给受体，此过程称为共振能量转移(RET)。特定荧光分子对的能量转移效率取决于两种荧光分子之间距离的6次幂倒数。当膜融合导致脂质混合后，能量供体/能量受体分子对从标记脂质体转移到非标记脂质囊泡，从而被稀释，供体/受体分子的距离加大，此时能量转移效率降低，体现为N-NBD-PE的发射光谱增强而N-Rh-PE的发射光谱减弱。

将外泌体悬液(蛋白质浓度300μg/mL)和NBD/Rh荧光标记脂质体(50μM)混合(1：1，v/v)，然后用脂质体挤出仪挤出100次，耗时约30分钟。在挤出处理之前和完毕，取脂质囊泡悬液进行粒径分析、透射电镜(TEM，FEI Tecnai G2 Spirit BioTwin)观察和激光共聚焦(CLSM，Zeiss LSM710)观察，结果分别见图5、图6和图7所示。对于TEM，取5μL囊泡悬液，用PBS稀释20倍，然后逐滴加至铜网。孵育5分钟后，逐滴加入2％乙酸双氧铀，室温下干燥20分钟，上机用TEM观察，加速电压为80kV。对于CLSM成像，吸取10μL囊泡悬液，用PBS稀释5倍，然后滴加到24×50mm的显微镜盖玻片上，再用24×24mm的盖玻片慢慢盖上，于激光共聚焦下观察N-NBD-PE绿色荧光和N-Rh-PE的红色荧光。如图5和图6所示，杂化外泌体粒径在272nm左右，透射电镜下仍然保持了典型的茶托样结构。从图7可以看出，在CLSM下，相比于荧光标记脂质体：外泌体混合物样品，杂化外泌体样品的NBD绿色荧光增强，而Rh的红色荧光减弱，证实N-NBD-PE和N-Rh-PE分子对经挤出处理后，距离变大，掺入了外泌体膜中，从而成功制备了杂化外泌体。

利用脂质稀释率法定量分析荧光标记脂质体和外泌体膜融合程度。首先制备了不同浓度的荧光标记脂质体(N-NBD-PE和N-Rh-PE摩尔浓度分别为0.650、0.500、0.250、0.185、0.125、0.063％)，分别代表脂质稀释比为0.65、1、2、3、4和5。然后获得每种荧光标记脂质体的EFD值并相对于脂质稀释比进行回归作图，见图8。从标准曲线计算杂化外泌体或杂化囊泡的脂质稀释比。其中EFD＝F543/(F543+F588)，F543和F588分别代表530和588nm处脂质囊泡的荧光强度。回归方程如下，FED＝0.779X+0.1018，R2＝0.9792。经计算杂化外泌体的脂质稀释率平均值为0.72。

实施例4

本实施例提供了一种杂化囊泡的制备方法和其制备得到的杂化囊泡，本实施例的杂化囊泡通过将实施例1提供的荧光标记脂质体和实施例2提供的外泌体杂化得到，采用挤出法将荧光标记磷脂插入外泌体膜，制备得到的杂化囊泡为杂化外泌体。

将外泌体悬液(蛋白质浓度300μg/mL)和NBD/Rh荧光标记脂质体(50μM)混合(1：1，v/v)，然后用脂质体挤出仪挤出25次，耗时约8分钟。

利用脂质稀释率法定量分析荧光标记脂质体和外泌体膜融合程度。首先制备了不同浓度的荧光标记脂质体(N-NBD-PE和N-Rh-PE摩尔浓度分别为0.650、0.500、0.250、0.185、0.125、0.063％)，分别代表脂质稀释比为0.65、1、2、3、4和5。然后获得每种荧光标记脂质体的EFD值并相对于脂质稀释比进行回归作图，见图8。从标准曲线计算杂化外泌体或杂化囊泡的脂质稀释比。其中EFD＝F543/(F543+F588)，F543和F588分别代表530和588nm处脂质囊泡的荧光强度。回归方程如下，FED＝0.779X+0.1018，R2＝0.9792。经计算杂化外泌体的脂质稀释率平均值为0.66。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种杂化囊泡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至脂质体和细胞来源囊泡杂化；

所述杂化包括：脂质体的膜和细胞来源囊泡的膜融合成杂化囊泡的膜，和脂质体的内水相和细胞来源囊泡的内水相融合成杂化囊泡的内水相。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至少25次；

优选地，将含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系从核孔膜中反复挤出至少25～200次。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脂质体的膜组分包括磷脂和/或糖脂；

优选地，所述磷脂包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇中的一种或者多种，优选包括磷酯酰丝氨酸；

优选地，所述膜组分经修饰物修饰；

优选地，所述修饰物包括荧光标记、同位素标记和药物修饰剂中的至少一种；

优选地，所述药物修饰剂包括聚乙二醇类修饰剂；

优选地，所述膜组分包括聚乙二醇磷脂；

优选地，所述膜组分包括荧光标记的磷酯酰丝氨酸。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脂质体的内水相中含有活性物质；

优选地，所述活性物质包括用于治疗和/或辅助治疗的药物活性成分；

优选地，所述药物活性成分包括抗生素类药物、用于治疗肿瘤的药物活性成分、用于免疫治疗的药物活性成分、用于基因治疗的药物活性成分和免疫佐剂中的一种或者多种；

优选地，所述活性物质包括蛋白质、多肽和核酸中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系中，使用基于核孔膜的挤出装置反复挤出25～200次，挤出时间共15～60min，得到所述杂化囊泡；

优选地，所述含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系中，使用脂质体挤出仪反复挤出50～150次，挤出时间共20～40min，得到所述杂化囊泡；

更优选地，所述含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系中，使用脂质体挤出仪反复挤出80～120次，挤出时间共25～35min，得到所述杂化囊泡；

优选地，所述基于核孔膜的挤出装置包括脂质体挤出仪。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在挤出前对脂质体、细胞来源囊泡和含有脂质体和细胞来源囊泡的混合体系中的至少一种进行前处理，所述前处理包括超声和/或冻融。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在脂质体和细胞来源囊泡杂化后分离游离组分；

优选地，所述分离游离组分的方法包括离心和/或超滤。

8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的杂化囊泡。

9.药物，其特征在于，所述药物包含权利要求8所述的杂化囊泡。

10.权利要求1-7任一项所述的制备方法，或权利要求8所述的杂化囊泡的应用，所述应用包括如下(x1)～(x3)中的至少一种：

(x1)用于包载药物活性成分，所述药物活性成分包括：抗生素类药物、用于治疗肿瘤的药物活性成分，用于免疫治疗的药物活性成分，用于基因治疗的药物活性成分和免疫佐剂中的一种或者多种；

(x2)用于制备药物，所述药物包括用于肿瘤治疗的药物，用于免疫治疗的药物或用于基因治疗的药物；

(x3)治疗性肿瘤疫苗或在自免性疾病诱导免疫耐受的生物制剂。