CN114395531A - 一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用，属于药物传递领域，本发明利用大剂量紫外辐射促使真核细胞脱核，以密度梯度离心收集去核体，以超声使之微囊泡化，所制备的微囊泡可用于负载多种水溶性及脂溶性生物活性物质或药物，含不同成分或药物的微囊泡可应用于组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗等方面，本发明具有制备过程简单、易于标准化、原料来源丰富、成本低廉等优点；所制备的负载生物活性成分或药物的微囊泡应用范围广泛，本发明可用于生物活性成分或者药物的体内外传递，具有广阔的应用前景。

Description

一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物传递领域，更具体地说，涉及一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用。
背景技术
生物活性物质以及各类药物特别是RNA类药物的体内递送及控释是目前药物研究的重要领域之一。常用的递送载体包括脂质体、细胞外泌体以及来自细胞的凋亡小泡。
本项发明基于我们首次观察到的现象：大剂量的紫外辐射可促使真核细胞主动脱核。本方法简单高效，可促使绝大多数活细胞出现脱核，从而获得大量的去核体及去核囊泡，用于下游多种生物活性物质和各类药物的载药。在采用基因编辑手段灭活真核细胞中主要组织相容性复合物I(MHCI)的活性的基础上，利用本发明可大量制备无免疫原性的即用型通用去核囊泡用于载药。
与此相比，脂质体虽然已应用于某些药物的给药过程，但脂质体膜成分较为单一，在体内不如去核微囊泡稳定，且易引起机体的排斥反应。而外泌体是某些细胞分泌出的纳米级大小的囊泡，内含丰富的生物活性物质，但细胞类型及其功能状态会显著影响外泌体内的成分，稳定性欠佳。来自于凋亡小体的药物载体则存在含有供体细胞遗传物质的弊端，且凋亡小体亦存在较强免疫原性的问题。
1967年Cater首先观察到细胞松弛素B(CB)能诱导体外培养的小鼠细胞发生脱核现象。经Prescott改进后，结合CB和超速离心可大量制备胞质体和核体。CB是细胞骨架中肌动蛋白聚合的抑制剂，能特异性破坏微丝的组装，从而使细胞核无法牢固地固定在细胞内，再结合超速离心，利用胞质体和核体不同的沉降系数，通过机械地方法将细胞核从细胞质内硬拽出来。由此可见，CB诱导的脱核并不是主动脱核。我们通过实验也观察到，单纯CB处理后，细胞核仍停留在细胞内，并无任何去核体产生。此方案所制备的胞质体存在脆性较高的弱点，且胞质体内会残存大量的CB，严重限制了其作为药物载体的应用价值。目前尚未发现该方案在药物传递方面应用研究的报道。
发明内容
1.要解决的技术问题
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用，它可以实现，成本低、周期短、方法简便、易于操作等优点，所制备的去核囊泡可用于负载多种生物活性物质及水溶性和脂溶性药物。
2.技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用，包括；
步骤一：紫外辐射促使真核细胞主动脱核；
步骤二：Percoll法分离纯化去核体；
步骤三：超声一步法制备含细胞外分泌活性成分或药物的去核微囊泡；
步骤四：超滤法分离纯化载药微囊泡。
进一步的，所述步骤一中的脱核程序包括：
S1：制备单细胞悬液，培养真核细胞至对数生长期，以磷酸缓冲液清洗三遍后，胰酶消化3-5分钟获得单细胞悬液；
S2：离心，将S1中获得的单细胞悬液以无血清培养液清洗后离心，重复3遍后将细胞沉淀重悬于无血清培养液中；
S3：脱核，在离心完成后立即进行紫外辐射，随后继续培养4-6h，细胞将出现自发脱核现象，并形成大量的去核体。
进一步的，所述S3中紫外辐射剂量为1-100×105μJoules/cm2，波长为200-380nm。
进一步的，所述步骤二中分离纯化程序包括：
A1：以灭菌PBS稀释无菌Percoll液体至40％，获得密度为1.056g/ml的Percoll分离液；
A2：使用A1中的Percoll分离液铺于离心管底部，并将步骤S3中所获取的含去核体和核体的培养液平铺于Percoll液上方，注意勿破坏两者之间的界面；
A3：以800-2000g的离心力离心10-30分钟，吸取上层液体，获得纯化的去核体，以细胞计数板对去核体悬液进行计数，计算浓度，稀释至所需浓度，以备载药。
进一步的，所述步骤三中制备载细胞外分泌活性成分微囊泡的方法包括：
B1：利用基因工程手段促使细胞分泌生物活性成分；
B2：收集培养上清，低速离心过滤去除细胞碎片，利用A1-A3的方法获取去核体，将去核体重悬于培养上清中，以10-900W的超声能量一步完成去核体的微囊泡化和外分泌活性成分的负载；
B3：以超滤法纯化负载外分泌活性成分的微囊泡。
进一步的，所述生物活性成分包括分泌型生长因子、炎症因子、抑炎因子及其他可分泌的因子。
进一步的，所述步骤三中制备载药物的微囊泡的方法包括：
C1：将水溶性的生物活性物质或者药物溶于等渗液中，按照所需配比，加入一定量A3中获取的去核体悬液，混匀，在冰水浴下，以10-900W的功率进行超声处理，每次超声持续2-5秒，间隔10秒，进行多次循环，最后收集液体以备纯化；
C2：将脂溶性药物混匀于少量大豆油中，随后将混合液滴加入一定量A3中获取的去核体悬液，混匀，在冰水浴下，以10-900W的功率进行超声处理，每次超声持续2-5秒，间隔10秒，进行多次循环，最后收集液体以备纯化。
进一步的，所述C1中的等渗液为生理盐水、磷酸缓冲液以及其他适用的液体。
进一步的，所述步骤四中超滤法分离纯化载药微囊泡的方法是将C1或者C2超声处理后的混悬液，加入100KDa的超滤管中，4000g离心30分钟，并用PBS清洗三次，收集浓缩液，进行包封率测定。
一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法应用，包括使用权利要求1-9任意一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法所制得的微囊泡在组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗方面的应用。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明利用大剂量紫外辐射促使真核细胞脱核，以密度梯度离心收集去核体，以超声使之微囊泡化，所制备的微囊泡可用于负载多种水溶性及脂溶性生物活性物质或药物，含不同成分或药物的微囊泡可应用于组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗等方面，本发明具有制备过程简单、易于标准化、原料来源丰富、成本低廉等优点；所制备的负载生物活性成分或药物的微囊泡应用范围广泛，本发明可用于生物活性成分或者药物的体内外传递，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的去核体及去核微囊泡显微照片；
其中，A为去核过程中的β2-MGnull 293T细胞，箭头所指为去核体；
B显示带绿色荧光的β2-MGnull 293T细胞所形成的去核体也带有绿色荧光，箭头所指为去核体；
C为Percoll纯化的去核体；D为超声后超滤所得的去核微囊泡；E为Dil染色的去核微囊泡；
F为β2-MGnull 293T来源的去核微囊泡对T淋巴细胞的刺激效应；
图2为载阿霉素去核微囊泡对肝癌细胞HuH-7的杀伤效应；
其中，A为倒置相差照片；
B为PI染色后流式细胞术检测的代表性结果；
C为流式检测结果
图3为载siVDR去核微囊泡对胃癌细胞的杀伤效应；
其中，A为VD去核微囊泡对裸鼠皮下移植瘤的抑制效应；
B为siVDR去核微囊泡对体外培养胃癌细胞中VDR mRNA的干扰效应；
C为siVDR去核微囊泡降低了胃癌细胞中VDR的蛋白水平。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-3，一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用，包括；
步骤一：紫外辐射促使真核细胞主动脱核；
步骤二：Percoll法分离纯化去核体；
步骤三：超声一步法制备含细胞外分泌活性成分或药物的去核微囊泡；
步骤四：超滤法分离纯化载药微囊泡。
优选的，步骤一中的脱核程序包括：
S1：制备单细胞悬液，培养真核细胞至对数生长期，以磷酸缓冲液清洗三遍后，胰酶消化3-5分钟获得单细胞悬液；
S2：离心，将S1中获得的单细胞悬液以无血清培养液清洗后离心，重复3遍后将细胞沉淀重悬于无血清培养液中；
S3：脱核，在离心完成后立即进行紫外辐射，随后继续培养4-6h，细胞将出现自发脱核现象，并形成大量的去核体。
优选的，S3中紫外辐射剂量为1-100×105μJoules/cm2，波长为200-380nm。
优选的，步骤二中分离纯化程序包括：
A1：以灭菌PBS稀释无菌Percoll液体至40％，获得密度为1.056g/ml的Percoll分离液；
A2：使用A1中的Percoll分离液铺于离心管底部，并将步骤S3中所获取的含去核体和核体的培养液平铺于Percoll液上方，注意勿破坏两者之间的界面；
A3：以800-2000g的离心力离心10-30分钟，吸取上层液体，获得纯化的去核体，以细胞计数板对去核体悬液进行计数，计算浓度，稀释至所需浓度，以备载药。
优选的，步骤三中制备载细胞外分泌活性成分微囊泡的方法包括：
B1：利用基因工程手段促使细胞分泌生物活性成分；
B2：收集培养上清，低速离心过滤去除细胞碎片，利用A1-A3的方法获取去核体，将去核体重悬于培养上清中，以10-900W的超声能量一步完成去核体的微囊泡化和外分泌活性成分的负载；
B3：以超滤法分离纯化负载外分泌活性成分的微囊泡。
优选的，生物活性成分包括分泌型生长因子、炎症因子、抑炎因子及其他可分泌的因子。
优选的，步骤三中制备载药物的微囊泡的方法包括：
C1：将水溶性的生物活性物质或者药物溶于等渗液中，按照所需配比，加入一定量A3中获取的去核体悬液，混匀，在冰水浴下，以10-900W的功率进行超声处理，每次超声持续2-5秒，间隔10秒，进行多次循环，最后收集液体以备纯化；
C2：将脂溶性药物混匀于少量大豆油中，随后将混合液滴加入一定量A3中获取的去核体悬液，混匀，在冰水浴下，以10-900W的功率进行超声处理，每次超声持续2-5秒，间隔10秒，进行多次循环，最后收集液体以备纯化。
优选的，C1中的等渗液为生理盐水、磷酸缓冲液以及其他适用的液体。
优选的，步骤四中超滤法分离纯化载药微囊泡的方法是将C1或者C2超声处理后的混悬液，加入100KDa的超滤管中，4000g离心30分钟，并用PBS清洗三次，收集浓缩液，进行包封率测定。
一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法应用，包括使用权利要求1-9任意一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法所制得的微囊泡在组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗方面的应用。
以下结合具体实施例进一步说明本发明：
实施例1：
β2-MGnull 293T去核微囊泡的制备及应用。由于组织相容性复合物I(MHCI)发挥功能须依赖于β2微球蛋白(β2-MG)，将细胞中β2-MG基因敲除或破坏可灭活MHCI的功能，从而显著降低细胞的免疫原性。
体外合成靶向β2-MG基因的sgRNA，序列为sgB2MFor：CACCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCG和sgB2MRev：AAACCGGAGCGAGACATCTCGGCCC；两条链退火后通过T7连接酶将其连接到BbsI酶切纯化的PX459质粒上。连接产物用于转化感受态大肠杆菌Stbl3菌株。划板挑选单集落，摇菌后提取质粒，通过PCR及Sanger测序鉴定所含质粒是否含有sgB2Me1序列，将测序通过的质粒命名为PX459-sgB2M。以电转的方法将PX459-sgB2M导入状态良好的已带绿色荧光蛋白(GFP)的293T细胞株中，并进行单克隆培养。依赖测序筛选出B2M基因敲除的293T克隆进行扩增，并通过逆转录荧光定量PCR就流式细胞术确认敲除效果，将其命名为β2-MGnull 293T细胞。
以胰酶消化处于对数生长期的β2-MGnull 293T细胞获得单细胞悬液，以无血清DMEM培养液清洗3遍后重悬于培养皿中，十分钟内以9.6×105μJoules/cm2的剂量完成紫外辐射(波长254nm)。将细胞放回培养箱继续培养4-6h，细胞出现脱核，并形成大量的去核体(见附图1A)，且去核体亦带绿色荧光(见附图1B)。以40％的Percoll(密度为1.056g/ml)铺底，将含有去核体和核体的悬液小心铺于其上层，1000g离心30分钟，小心收集上层含纯化去核体的液体。以细胞计数板对去核体悬液进行计数，计算浓度，稀释至1×106/ml，此即为通用的即用型去核体(见附图1C)。以超声处理去核体，并用超滤管纯化，可获得去核微囊泡(见附图1D)。以细胞膜染料Dil对去核微囊泡进行染色，清洗后，在荧光显微镜下拍照，可见去核微囊泡被Dil成功染色(见附图1E)。
以野生型293T制备单细胞悬液，制备去核体及去核微囊泡。按国标YY/T1465.1-2016体外T淋巴细胞转化实验(MTT法)比较β2-MGnull 293T和野生型293T来源的去核微囊泡的免疫原性。结果表明，来源于β2-MGnull 293T的去核微囊泡对T淋巴细胞的刺激效应显著低于ConA和野生型293T来源的去核微囊泡(见附图1F)。
实施例2：
以胰酶将体外培养的对数生长期的HepG2肝癌细胞消化成单细胞悬液，PBS清洗两次后重悬于DMEM培养液中，以9.6×105μJoules/cm2的剂量完成紫外辐射(波长254nm)。于细胞培养箱中继续培养4小时后，培养液中出现大量去核体。以Percoll分离纯化去核体。将阿霉素溶解于去核体悬液中，以80W超声处理，并使用超滤管纯化分离负载阿霉素的去核微囊泡，收集超滤后的液体，紫外分光法测定阿霉素浓度，结合投药量，计算包封率。结果表明，包封率可达90％以上。
体外培养肝癌细胞株HuH-7，将载有阿霉素的去核微囊泡以1×105/ml的终浓度加入HuH7培养液，24小时后PI染色以流式细胞术检测细胞死亡率。结果表明，载阿霉素去核微囊泡在体外能杀死HuH-7肝癌细胞。
实施例3：
以胰酶消化体外培养的AGS胃癌细胞，PBS清洗后重悬于DMEM培养液中，以19.2×105μJoules/cm2的剂量完成紫外辐射(波长254nm)。于细胞培养箱中继续培养6小时后，培养液中出现大量去核体。以Percoll分离纯化去核体。将预混有活性维生素D的大豆油滴加入去核体悬液中，以100W超声处理，并使用超滤管纯化分离负载活性维生素D的去核微囊泡，收集超滤后的液体，紫外分光法于260nm处测定维生素D浓度，结合投药量，计算包封率。结果表明，包封率超过90％。
在裸鼠腋窝中后部皮下种植胃癌细胞HGC-27，一周后皮下肿瘤成形。随后，荷瘤裸鼠随机分为三组，对照组，VD组，VD去核微囊泡组。VD组荷瘤鼠每三日瘤内注射一次DMSO溶解的活性维生素D，剂量为1μM。VD去核微囊泡组荷瘤鼠每三日瘤内注射一次VD去核微囊泡组，对应的VD剂量同样为1μM。27日后处死小鼠，测量瘤体大小。结果表明，VD去核微囊泡能显著抑制皮下移植瘤的生长(见附图3A)。
实施例4：
以胰酶消化体外培养的HGC-27胃癌细胞，PBS清洗后重悬于DMEM培养液中，以19.2×105μJoules/cm2的剂量完成紫外辐射(波长254nm)。于细胞培养箱中继续培养6小时后，培养液中出现大量去核体。以Percoll分离纯化去核体。将靶向维生素D受体(VDR)的siRNA(siVDR)加入去核体悬液中，以50W超声处理，并使用超滤管纯化分离负载siVDR的去核微囊泡。体外培养胃癌细胞株SGC-7901，以终浓度1×105/ml加入siVDR去核微囊泡，作用24小时后以反转录荧光定量PCR检测VDR mRNA的水平，以免疫印迹检测VDR蛋白水平。结果表明，SGC-7901细胞中VDR mRNA和蛋白水平均显著下降(见附图3B和C)。
工作原理：利用大剂量紫外辐射促使真核细胞脱核，以密度梯度离心收集去核体，以超声使之微囊泡化，所制备的微囊泡可用于负载多种水溶性及脂溶性生物活性物质或药物，含不同成分或药物的微囊泡可应用于组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗等方面。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤；
步骤一：紫外辐射促使真核细胞主动脱核；
步骤二：Percoll法分离纯化去核体；
步骤三：超声一步法制备含细胞外分泌活性成分或药物的去核微囊泡；
步骤四：超滤法分离纯化载药微囊泡。
2.根据权利要求1所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的脱核程序包括：
S1：制备单细胞悬液，培养真核细胞至对数生长期，以磷酸缓冲液清洗三遍后，胰酶消化3-5分钟获得单细胞悬液；
S2：离心，将S1中获得的单细胞悬液以无血清培养液清洗后离心，重复3遍后将细胞沉淀重悬于无血清培养液中；
S3：脱核，在离心完成后立即进行紫外辐射，随后继续培养4-6h，细胞将出现自发脱核现象，并形成大量的去核体。
3.根据权利要求2所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述S3中紫外辐射剂量为1-100×105μJoules/cm2，波长范围为200-380nm。
4.根据权利要求2所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤二中分离纯化程序包括：
A1：以灭菌PBS稀释无菌Percoll液体至40％，获得密度为1.056g/ml的Percoll分离液；
A2：使用A1中的Percoll分离液铺于离心管底部，并将步骤S3中所获取的含去核体和核体的培养液平铺于Percoll液上方；
A3：以800-2000g的离心力离心10-30分钟，吸取上层液体，获得纯化的去核体，以细胞计数板对去核体悬液进行计数，计算浓度，稀释至所需浓度，以备载药。
5.根据权利要求4所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤三中制备载细胞外分泌活性成分微囊泡的方法包括：
B1：利用基因工程手段促使细胞分泌生物活性成分；
B2：收集培养上清，低速离心过滤去除细胞碎片，利用A1-A3的方法获取去核体，将去核体重悬于培养上清中，以10-900W的超声能量一步完成去核体的微囊泡化和外分泌活性成分的负载；
B3：以超滤分离纯化负载外分泌活性成分的微囊泡。
6.根据权利要求5所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述生物活性成分包括分泌型生长因子、炎症因子、抑炎因子及其他可分泌的因子。
7.根据权利要求4所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤三中制备载药物的微囊泡的方法包括：
C1：将水溶性的生物活性物质或者药物溶于等渗液中，按照所需配比，加入一定量A3中获取的去核体悬液，混匀，在冰水浴下，以10-900W的功率进行超声处理，每次超声持续2-5秒，间隔10秒，进行多次循环，最后收集液体以备纯化；
C2：将脂溶性药物混匀于少量大豆油中，随后将混合液滴加入一定量A3中获取的去核体悬液，混匀，在冰水浴下，以10-900W的功率进行超声处理，每次超声持续2-5秒，间隔10秒，进行多次循环，最后收集液体以备纯化。
8.根据权利要求7所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述C1中的等渗液为生理盐水、磷酸缓冲液以及其他适用的液体。
9.根据权利要求7所述的一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤四中超滤分离纯化载药微囊泡的方法是将C1或者C2超声处理后的混悬液，加入100KDa的超滤管中，4000g离心30分钟，并用PBS清洗三次，收集浓缩液，进行包封率测定。
10.一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法应用，其特征在于：包括使用权利要求1-9任意一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法所制得的微囊泡在组织损伤修复、免疫调节、感染控制及肿瘤治疗方面的应用。
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