CN114869856B - 一种共载药细胞微颗粒制剂及其制备方法 - Google Patents

一种共载药细胞微颗粒制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物靶向载体技术领域，公开了一种共载药细胞微颗粒制剂及其制备方法，该共载药细胞微颗粒制剂，包括源自肿瘤细胞分泌的微颗粒和一同包载在微颗粒内的光敏剂及肿瘤相关成纤维细胞去激活剂。本发明通过对制剂的细节组成、结构进行改进，以源自肿瘤细胞分泌的微颗粒为载体，在其中同时包载光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂，得到的共载药细胞微颗粒制剂，一方面改造肿瘤基质微环境，增强光敏剂在肿瘤富集，提升光热治疗对肿瘤细胞的直接杀伤效果，另一方面还可增强光热治疗导致的肿瘤免疫原性死亡，促进CD8+T细胞浸润，并减少肿瘤相关成纤维细胞导致的抗原依赖性活化诱导的CD8+T细胞死亡，改善肿瘤免疫微环境。

Description

一种共载药细胞微颗粒制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于药物靶向载体技术领域，更具体地，涉及一种共载药细胞微颗粒制剂及其制备方法，得到的细胞微颗粒共载药制剂是在源自肿瘤细胞分泌的微颗粒上同时包载有光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂这2种成分，尤其适用于抗肿瘤应用。
背景技术
尽管癌症研究取得了巨大的成果，但癌症仍然是导致死亡的主要原因之一，需要进一步探索更有效的肿瘤治疗策略。光热治疗(PTT)是近几年得到广泛发展的肿瘤治疗手段，在激光照射下通过光敏剂将光能转换为热能，可提供一种时空热效应来消融光照射区域内的肿瘤组织，从而达到特殊的治疗效果，而且治疗过程中对正常组织无损伤。然而肿瘤组织中致密的基质微环境导致光敏剂难以更多到达肿瘤组织，导致光热治疗效果欠佳，难以完全消灭癌细胞。同时，研究发现光热治疗后残留肿瘤组织会进一步导致肿瘤复发与转移。此外，肿瘤组织热消融过程中释放大量的炎症因子，比如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等，诱导的炎症反应会进一步导致肿瘤再生。考虑到单纯光热治疗的局限性，引入其他肿瘤治疗手段有利于完全抑制肿瘤发生发展。光热治疗会导致肿瘤细胞免疫原性死亡(ICD)，释放损伤相关分子模式(DAMPs)可以激活免疫系统，特别是先诱导DC细胞成熟，成熟的DC细胞迁移至淋巴结处，将抗原交叉呈递给
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T细胞，诱导CD8+T细胞产生。产生的CD8+T细胞需要浸润到肿瘤深部才能发挥有效的肿瘤杀伤效果，但是致密的肿瘤细胞外基质导致CD8+T细胞不能充分浸润到肿瘤深部发挥效果。
肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中最丰富的基质成分，通过分泌多种基质成分、细胞因子、趋化因子和蛋白酶等，在肿瘤的发生发展、治疗耐受、肿瘤免疫逃逸以及复发转移中发挥重要作用。肿瘤相关成纤维细胞通过分泌胶原蛋白、纤连蛋白等基质成分形成致密的细胞外基质，从而形成药物及杀伤性CD8+T细胞在肿瘤部位浸润的物理屏障。另外，肿瘤相关成纤维细胞分泌的细胞因子及趋化因子TGF-β、CCL2、IL-6等会降低肿瘤组织CD8+T细胞响应性，增加免疫抑制细胞的招募。去激活肿瘤相关成纤维细胞，可以重塑肿瘤细胞外基质从而增加肿瘤特异性T细胞在肿瘤部位的浸润，整体提高肿瘤组织中浸润的CD8+T细胞数量及活性，有效控制肿瘤生长。
光热治疗联合肿瘤相关成纤维细胞去激活，有利于改善肿瘤基质微环境，增加光敏剂在肿瘤组织中的分布，提高光热直接杀伤效果的同时可增加CD8+T细胞在肿瘤组织中的数量及浸润，抑制肿瘤生长。单纯光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂缺乏肿瘤靶向特异性，纳米材料因其独特的理化特性和靶向修饰性等，在靶向药物输送方面具有明显优势。由于人工合成的纳米药物载体可能具有的生物相容性差等问题，利用细胞来源的囊泡用作药物载体引起广泛关注。
现有技术已知，细胞在相关信号的刺激下出现细胞膜下的骨架变化，导致细胞膜在局部向外膨出，包裹细胞内容物，并以囊泡形式释放到细胞外，产生粒径在100-1000nm的微颗粒(Microparticles，MPs)。相对于人工合成的纳米载体，这种天然生物来源的囊泡具有低免疫原性、优良的体内循环稳定性及高靶向性等特点。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种共载药细胞微颗粒制剂及其制备方法，其中通过对制剂的细节组成、结构进行改进，以源自肿瘤细胞分泌的微颗粒为载体，在其中同时包载光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂，得到的共载药细胞微颗粒制剂，一方面改造肿瘤基质微环境，增强光敏剂在肿瘤富集，提升光热治疗对肿瘤细胞的直接杀伤效果，诱导更强的肿瘤免疫原性死亡，另一方面可去激活肿瘤相关成纤维细胞，改善肿瘤免疫微环境，促进CD8+T细胞肿瘤组织招募与浸润。更为重要的是，本发明发现利用细胞微颗粒共递送光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂可减少肿瘤相关成纤维细胞摄取光热治疗产生的肿瘤抗原后引起的CD8+T细胞死亡，显著增强肿瘤特异性CD8+T细胞抗肿瘤免疫反应，高效抑制光热治疗后的肿瘤复发转移。与现有技术相比，本发明能够有效解决光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂在肿瘤组织不能有效富集和渗透、光热治疗效果受限、抗肿瘤免疫激活水平不足等问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种共载药细胞微颗粒制剂，其特征在于，包括源自肿瘤细胞分泌的微颗粒和一同包载在所述微颗粒内的光敏剂及肿瘤相关成纤维细胞去激活剂。
作为本发明的进一步优选，所述肿瘤细胞具体为源自急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌或皮肤癌中的肿瘤细胞。
作为本发明的进一步优选，所述光敏剂包括花菁染料类光敏剂和卟啉化合物类光敏剂中的至少一种；
优选的，所述花菁染料类光敏剂包括吲哚菁绿ICG、IR825、IR780、Cypate中的至少一种；所述卟啉化合物类光敏剂包括Ce6。
作为本发明的进一步优选，所述肿瘤相关成纤维细胞去激活剂包括全反式维甲酸(ATRA)、维生素D3类似物中的至少一种；
优选的，所述维生素D3类似物包括卡泊三醇(Calcipotriol,Cal)。
作为本发明的进一步优选，所述共载药细胞微颗粒制剂的粒径为100～1000nm。
按照本发明的另一方面，本发明提供了上述共载药细胞微颗粒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:使用紫外线照射、温度调节、气压调节、饥饿中的至少一种方式处理肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生更多的微颗粒；
S2：将光敏剂及肿瘤相关成纤维细胞去激活剂加入到所述肿瘤细胞中共孵育；
S3：离心收集细胞所分泌释放的载药微颗粒，即可得到同时包载有光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂的共载药细胞微颗粒制剂。
作为本发明的进一步优选，所述步骤S2中，所述共孵育的时间为6～48h，优选为12～24h。
作为本发明的进一步优选，所述步骤S3中，所述离心具体是在4℃～15℃的低温条件下，以400～20000g的离心力收集载药微颗粒。
作为本发明的进一步优选，所述步骤S1中：
当处理方式为紫外照射时，紫外照射的时间为10min-2h；
当处理方式为温度调节时，温度调节处理的时间为2h-8h；
当处理方式为气压调节时，具体是在2-5个大气压的环境下进行处理2h-8h；
当处理方式为饥饿处理时，饥饿处理的时间为12-48h。
按照本发明的又一方面，本发明提供了上述共载药细胞微颗粒制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明中的共载药细胞微颗粒制剂，是在源自肿瘤细胞分泌的微颗粒中同时包载有光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂，利用光敏剂、肿瘤相关成纤维细胞去激活剂与源自肿瘤细胞分泌的微颗粒的整体作用，使得该共载药细胞微颗粒制剂能高效靶向递送药物，改善肿瘤基质微环境，促进光敏剂在肿瘤组织高度富集及深部渗透，提高光热治疗对肿瘤细胞的直接杀伤效果；同时，可增强光热治疗导致的肿瘤免疫原性死亡，增加CD8+T细胞在肿瘤组织中的数量及浸润，减少肿瘤相关成纤维细胞摄取光热治疗产生的肿瘤抗原后引起的CD8+T细胞死亡，改善肿瘤免疫微环境，显著抑制光热治疗导致的肿瘤复发及转移。
现有技术已有研究证实，细胞来源的微颗粒载药体系具有低免疫原性、优良的体内循环稳定性及高靶向性等特点。但是，实体瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞分泌多种基质成分，在肿瘤细胞周围形成致密的细胞外基质，不利于药物向肿瘤内部渗透。细胞载药微颗粒中包载肿瘤相关成纤维细胞去激活剂可以去激活肿瘤相关成纤维细胞，降解肿瘤细胞外基质，促进细胞载药微颗粒在肿瘤组织的富集和渗透，增强光热治疗效果，改善肿瘤微环境，提高抗肿瘤效果。
与肿瘤相关成纤维细胞去激活剂去激活肿瘤相关成纤维细胞后，降解胞外基质、增加药物摄取、CD8+T细胞浸润这些已知的常规作用机理不同，本发明首次发现光热治疗和去激活肿瘤相关成纤维细胞联合后，可减少肿瘤相关成纤维细胞摄取肿瘤抗原后导致的CD8+T细胞死亡，进而更好的预防肿瘤复发与转移。共载药细胞微颗粒制剂中包载的肿瘤相关成纤维细胞去激活剂去激活肿瘤相关成纤维细胞后，可通过削弱肿瘤相关成纤维细胞的抗原呈递能力、减少FasL及PD-L2表达等，抑制肿瘤相关成纤维细胞摄取光热治疗产生的肿瘤抗原后产生的肿瘤特异性杀伤T细胞死亡。本发明具体能够取得如下有益效果：
(1)共载药微颗粒可同时实现光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂分别针对肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞的靶向递送；
(2)共载药细胞微颗粒中包载的肿瘤相关成纤维细胞去激活剂可以去激活肿瘤相关成纤维细胞，降解肿瘤组织胞外基质，促进细胞载药微颗粒在肿瘤组织的富集和渗透；
(3)肿瘤组织中富集的共载药细胞微颗粒中包载的光敏剂在激光照射下，增强光热直接杀伤肿瘤组织的同时诱导更强的肿瘤细胞免疫原性死亡，产生更多CD8+T细胞，激活更有效的抗肿瘤免疫反应；
(4)共载药细胞微颗粒中包载的肿瘤相关成纤维细胞去激活剂可以去激活肿瘤相关成纤维细胞，改善肿瘤微环境，一方面促进光热治疗诱导产生的CD8+T细胞招募，另一方面降解肿瘤细胞外基质，促进招募的CD8+T细胞更多的浸润到肿瘤组织中，更有效地杀伤肿瘤细胞；
(5)共载药细胞微颗粒制剂中包载的肿瘤相关成纤维细胞去激活剂去激活肿瘤相关成纤维细胞后，可通过削弱肿瘤相关成纤维细胞的抗原呈递能力、减少FasL及PD-L2表达等，抑制肿瘤相关成纤维细胞摄取光热治疗产生的肿瘤抗原后产生的肿瘤特异性杀伤T细胞死亡，更好的抑制光热治疗后的肿瘤复发转移；
(6)此外，本发明中的细胞载药微颗粒制剂为纳米尺寸，粒径可优选为100～1000nm，更有利于细胞载药微颗粒制剂在肿瘤部位富集，对正常组织不会产生任何损伤，避免使用外源性材料作为载体而对机体产生的毒害作用。另外，本发明制备方法，通过对肿瘤细胞进行紫外线照射、温度调节、气压调节、饥饿处理，优选的处理条件可使细胞微颗粒达到更佳合适的释放量。
附图说明
图1为共载ICG/Cal细胞微颗粒粒径，Zeta电位及TEM图；其中，图1中的(A)对应粒径，图1中的(B)对应Zeta电位，图1中的(C)对应TEM图。图1中的(C)中示出的标尺均代表200nm。
图2为共载ICG/Cal细胞微颗粒对H22小鼠肝癌细胞的光热杀伤效果，以及共载ICG/Cal细胞微颗粒光热杀伤H22肿瘤细胞后CRT表达；其中，图2中的(A)对应光热杀伤效果，图2中的(B)对应CRT表达。
图3为共载ICG/Cal细胞微颗粒对4T1小鼠乳腺癌细胞的光热杀伤效果，以及共载ICG/Cal细胞微颗粒光热杀伤4T1小鼠乳腺癌细胞后CRT表达；其中，图3中的(A)对应光热杀伤效果，图3中的(B)对应CRT表达。
图4为共载Ce6/Cal细胞微颗粒对H22小鼠肝癌细胞的光热杀伤效果，以及共载Ce6/Cal细胞微颗粒光热杀伤H22小鼠肝癌细胞后CRT表达；其中，图4中的(A)对应光热杀伤效果，图4中的(B)对应CRT表达。
图5为共载ICG/Cal细胞微颗粒去激活肿瘤相关成纤维细胞的western blotting结果以及免疫荧光结果；其中，图5中的(A)对应western blotting结果，图5中的(B)对应免疫荧光结果。图5中的(B)其右下角示出的标尺代表100μm。
图6为共载ICG/ATRAl细胞微颗粒去激活肿瘤相关成纤维细胞的westernblotting结果以及胶原蛋白含量；其中，图6中的(A)对应western blotting结果，图6中的(B)对应胶原蛋白含量。
图7为共载ICG/Cal细胞微颗粒去激活的肿瘤相关成纤维细胞与相对应的光热治疗后的H22肿瘤细胞上清共培养，经处理的肿瘤相关成纤维细胞再与CD8+T细胞共培养，肿瘤相关成纤维细胞上FAS-L表达及PD-L2表达，CD8+T cell的凋亡结果；其中，图7中的(A)对应FAS-L表达，图7中的(B)对应PD-L2表达，图7中的(C)对应CD8+T cell的凋亡结果。
图8为共载ICG/Cal细胞微颗粒在荷瘤小鼠不同组织中的分布。图中任意一组柱状标记，自左至右均依次对应对照组1、对照组2、对照组3和实验组。
图9为共载ICG/ATRA细胞微颗粒在荷瘤小鼠不同组织中的分布。图中任意一组柱状标记，自左至右均依次对应对照组1、对照组2、对照组3和实验组。
图10为共载ICG/Cal细胞微颗粒通过尾静脉给药H22肝癌皮下瘤小鼠，经激光照射后小鼠的肿瘤部位升温曲线、肿瘤生长曲线、肿瘤组织的重量，以及小鼠生存期；其中，图10中的(A)对应肿瘤部位升温曲线，图10中的(B)对应肿瘤生长曲线，图10中的(C)对应肿瘤组织的重量，图10中的(D)对应生存期。
图11为共载ICG/Cal细胞微颗粒通过尾静脉给药H22肝癌皮下瘤小鼠后，小鼠肿瘤组织中CAF的比例以及a-SMA、Fibronectin、collagen-I表达；其中，图11中的(A)对应CAF比例，图11中的(B)对应a-SMA、Fibronectin、collagen-I表达。图11中的(B)其右下角示出的标尺代表100μm。
图12为共载ICG/Cal细胞微颗粒通过尾静脉给药H22肝癌皮下瘤小鼠后，经激光照射后小鼠肿瘤组织中CAF上MHC-I表达、Fas-L表达、PD-L2表达、CD8+T细胞的数目、激活的CD8+T细胞的数目、PMN-MDSC的比例以及Treg的比例；其中，图12中的(A)对应MHC-I表达，图12中的(B)对应Fas-L表达，图12中的(C)对应PD-L2表达，图12中的(D)对应CD8+T细胞的数目，图12中的(E)对应激活的CD8+T细胞的数目，图12中的(F)对应PMN-MDSC的比例，图12中的(G)对应Treg的比例，图12中的(H)对应免疫荧光标记CD8+T细胞在肿瘤组织中的分布代表图，图12中的(I)对应免疫荧光标记CD8+T细胞在肿瘤组织中的分布定量结果。图12中的(H)所示出的标尺代表100μm。
图13为共载ICG/Cal细胞微颗粒通过尾静脉给药4T1乳腺癌转移小鼠后，经激光照射后小鼠的体内活体成像和小鼠肺部结节数目；其中，图13中的(A)对应体内活体成像，图13中的(B)对应小鼠肺部结节数目。
图14为共包载的细胞载药微颗粒通过尾静脉给药H22肝癌皮下瘤小鼠后，经激光照射后小鼠的血清生化指标ALT、AST、CK及BUN水平；其中，图14中的(A)对应ALT，图14中的(B)对应AST，图14中的(C)对应CK，图14中的(D)对应BUN。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物及实验动物：
H22小鼠肝癌细胞、4T1小鼠乳腺癌细胞，均可从美国ATCC公司或中国典型物保藏中心CCTCC购买。
BALB/c小鼠，购自武汉大学医学实验动物中心，体重18-20克；
吲哚菁绿(ICG)及二氢卟吩E6(Ce6)购自百灵威科技有限公司，全反式维甲酸(ATRA)及卡泊三醇(Cal)购自Sigma(上海)贸易有限公司。
实施例1：共载ICG/Cal细胞微颗粒的制备及表征
1、实验材料和试剂
H22小鼠肝癌细胞、吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)，紫外线装置为常规细胞超净工作台所有。
2、实验步骤
1)H22小鼠肝癌细胞用紫外线照射1h，向细胞中加入100μg ml-1ICG和4μg ml- 1Cal，置于37℃培养箱中。
2)共孵育12h后，对凋亡肿瘤细胞进行分离。取上清进行逐步离心，以200g，600g的转速各离心10min后，以14000g的离心力离心1min，以除去细胞及碎片，取离心后的上清进一步以20000g的离心力离心1h，得到来自H22小鼠肝癌细胞凋亡所产生共包载的细胞载药微颗粒(Cal/ICG@MPs)，作为实验组。类似的处理方式，经紫外线照射的H22小鼠肝癌细胞上清收集到的微颗粒(MPs)，作为对照组1；向经紫外线照射的H22小鼠肝癌细胞中只添加ICG的细胞上清收集到的微颗粒(ICG@MPs)，作为对照组2；向经紫外线照射的H22小鼠肝癌细胞中只添加Cal的细胞上清收集到的微颗粒(Cal@MPs)，作为对照组3。
3)将得到的微颗粒溶解于PBS中，使用纳米粒度及zeta电位仪检测其粒径以及zeta电位分布。具体设定条件为：温度为25℃，平衡时间为120s。同时，使用TEM观察样品形貌。
3、实验结果
实验结果表明，得到的微颗粒的平均粒径分布为350nm-450nm(如图1中的(A)所示；当然，根据实际需求，可以通过调整离心条件，得到相应目标粒径大小的微颗粒)，zeta电位为-11mV左右(如图1中的(B)所示)。TEM结果显示微颗粒形貌为球形或椭圆形(如图1中的(C)所示)。
实施例2：共载ICG/Cal细胞微颗粒对H22小鼠肝癌细胞的光热杀伤效果
1、实验材料及试剂
H22小鼠肝癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)及流式抗体商购获得。
2、实验步骤
1)共载ICG/Cal细胞微颗粒收集同实施例1。
2)向1*104H22小鼠肝癌细胞中分别加入含有(4μg/mL，ICG量；60ng/mL，Cal量)游离ICG、Cal/ICG(即同时具有游离Cal与游离ICG)、ICG@MPs、Cal/ICG@MPs的无血清培养基，37℃、5％CO2下孵育4h，收集细胞，PBS清洗3次，250g离心3min。使用808nm激光(1W/cm2，5分钟)处理H22小鼠肝癌细胞。37℃、5％CO2条件下孵育4h后每孔加入10μL CCK8溶液孵育4h，使用318C酶标仪检测每孔在450nm处吸光度，检测肿瘤细胞死亡结果。向H22小鼠肝癌细胞中加入CaL/ICG@MPs并进行激光处理作为实验组，H22小鼠肝癌细胞未经处理的作为对照组1，未加入材料只进行激光处理的作为对照组2，加入含有(4μg/mL，ICG量)游离ICG并进行激光处理的作为对照组3，加入含有(4μg/mL，ICG量；60ng/mL，Cal量)游离Cal/ICG并进行激光处理的作为对照组4，加入含有(4μg/mL，ICG量)ICG@MPs并进行激光处理的作为对照组5。
3)向3*105H22小鼠肝癌细胞中分别加入含有(4μg/mL，ICG量；60ng/mL，Cal量)游离ICG、Cal/ICG、ICG@MPs、Cal/ICG@MPs的无血清培养基，37℃、5％CO2下孵育4h，收集细胞，PBS清洗3次，250g离心3min。使用808nm激光(1W/cm2，5分钟)处理H22小鼠肝癌细胞。37℃、5％CO2条件下孵育4h后，向细胞中加入CRT流式抗体，4℃、避光孵育30min。离心收集细胞，用400μL PBS重悬，使用CytoFLEX S流式细胞仪检测各组细胞膜表面的CRT表达结果。
3、实验结果
由图2中的(A)可知，加入ICG@MPs、Cal/ICG@MPs并进行激光处理对H22小鼠肝癌细胞的杀伤效果明显优于游离ICG、Cal/ICG组。同时损伤相关分子模式(DAMPs)例如CRT结果可知(如图2中的(B)所示)，加入ICG@MPs、Cal/ICG@MPs并进行激光处理致使H22小鼠肝癌细胞产生免疫原性死亡效果最佳。以上结果表明，光敏剂ICG包载在细胞微颗粒中可以增强光热诱导的肝癌肿瘤细胞免疫原性死亡。
实施例3：共载ICG/Cal细胞微颗粒对4T1小鼠乳腺癌细胞的光热杀伤效果
1、实验材料及试剂
4T1小鼠乳腺癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)及流式抗体商购获得。
2、实验步骤
1)共载ICG/Cal细胞微颗粒收集同实施例1，其中肿瘤细胞微颗粒来源于4T1小鼠乳腺癌细胞。
2)4T1小鼠乳腺癌细胞光热处理及CRT检测方法同实施例2。向4T1小鼠乳腺癌细胞中加入Cal/ICG@MPs并进行激光处理作为实验组，4T1小鼠乳腺癌细胞未经处理的作为对照组1，未加入材料只进行激光处理的作为对照组2，加入含有(4μg/mL，ICG量)游离ICG并进行激光处理的作为对照组3，加入含有(4μg/mL，ICG量；60ng/mL，Cal量)游离Cal/ICG并进行激光处理的作为对照组4，加入含有(4μg/mL，ICG量)ICG@MPs并进行激光处理的作为对照组5。
3、实验结果
由图3中的(A)可知，加入ICG@MPs、Cal/ICG@MPs并进行激光处理对4T1小鼠乳腺癌细胞的杀伤效果明显优于游离ICG、Cal/ICG组。同时损伤相关分子模式(DAMPs)例如CRT结果可知(如图3中的(B)所示)，加入ICG@MPs、Cal/ICG@MPs并进行激光处理致使4T1小鼠乳腺癌细胞产生免疫原性死亡效果最佳。以上结果表明，光敏剂ICG包载在细胞微颗粒中可以增强光热诱导的乳腺癌肿瘤细胞免疫原性死亡。
实施例4：共载Ce6/Cal细胞微颗粒对H22小鼠肝癌细胞的光热杀伤效果
1、实验材料及试剂
H22小鼠肝癌细胞，Ce6、卡泊三醇(Cal)及流式抗体商购获得。
2、实验步骤
1)共载Ce6/Cal细胞微颗粒收集同实施例1，其中Ce6孵育浓度为100μg/mL。
2)H22小鼠肝癌细胞光热处理及CRT检测方法同实施例2。向H22小鼠肝癌细胞中加入Cal/Ce6@MPs并进行激光处理作为实验组，H22小鼠肝癌细胞未经处理的作为对照组1，未加入材料只进行激光处理的作为对照组2，加入含有(4μg/mL，Ce6量)游离Ce6并进行激光处理的作为对照组3，加入含有(4μg/mL，Ce6量；60ng/mL，Cal量)游离Cal/Ce6并进行激光处理的作为对照组4，加入含有(4μg/mL，Ce6量)Ce6@MPs并进行激光处理的作为对照组5。
3、实验结果
由图4中的(A)可知，加入Ce6@MPs、Cal/Ce6@MPs并进行激光处理对H22小鼠肝癌细胞的杀伤效果明显优于游离Ce6、Cal/Ce6组。同时损伤相关分子模式(DAMPs)例如CRT结果可知(如图4中的(B)所示)，加入Ce6@MPs、Cal/Ce6@MPs并进行激光处理致使H22小鼠肝癌细胞产生免疫原性死亡效果最佳。以上结果表明，光敏剂Ce6包载在细胞微颗粒中可以增强光热诱导的肝癌肿瘤细胞免疫原性死亡。
实施例5：共载ICG/Cal细胞微颗粒对肿瘤相关成纤维细胞的去激活作用
1、实验材料及试剂
吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)、流式抗体、TGF-β商购获得，BALB/C乳鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)共载药细胞微颗粒收集同实施例1。
2)使用直接组织块法收集原代纤维细胞。无菌条件下，用刀片将BALB/C乳鼠的背部皮肤取下，切成小块的组织块(0.5～1.0mm3)，然后接种在细胞培养瓶底部，加入含15％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的新鲜培养基，置于37℃、5％CO2下培养48h后，更换培养基(每48h更换一次)。1～3天后，原代纤维细胞从组织块中生长出来。
3)收集生长出来的原代纤维细胞，向其中加入40ng/mL TGF-β刺激诱导24h得到肌成纤维细胞。
4)将3×105个肌成纤维细胞培养在细胞培养板中，12h后去掉培养基，分别加入含有(4μg/mL，ICG量；60ng/mL，Cal量)游离ICG、Cal、Cal/ICG、ICG@MPs、Cal@MPs、Cal/ICG@MPs的含2％胎牛血清的培养基。培养48h后，各组细胞提取细胞蛋白，Western blotting检测肌成纤维细胞特征蛋白的表达。同时，收集各组肌成纤维细胞进行免疫荧光染色，通过共聚焦显微镜直观检测肌成纤维细胞特征蛋白的表达。向肌成纤维细胞中加入Cal/ICG@MPs作为实验组，肿瘤相关成纤维细胞未做处理作为对照组1，加入含有(4μg/mL，ICG量)游离ICG作为对照组2，加入含有(60ng/mL，Cal量)游离Cal作为对照组3，加入含有(4μg/mL，ICG量；60ng/mL，Cal量)游离Cal/ICG作为对照组4，加入含有(4μg/mL，ICG量)ICG@MPs作为对照组5，加入含有(60ng/mL，Cal量)Cal@MPs作为对照组6。
3、实验结果
由Western blotting结果显示(如图5中的A所示)，游离ICG及ICG@MPs对肌成纤维细胞的激活状态没有影响，游离Cal、Cal/ICG可以下调肌成纤维细胞的a-SMA及Fibronectin表达，但是Cal@MPs、Cal/ICG@MPs下调肌成纤维细胞的a-SMA及Fibronectin表达最为明显。免疫荧光结果，如图5中的(B)所示，同western blotting结果。以上结果表明，肿瘤相关成纤维细胞去激活剂Cal包载在细胞微颗粒中可以增强对肌成纤维细胞的去激活作用。
实施例6：共载ICG/ATRA细胞微颗粒对肿瘤相关成纤维细胞的去激活作用
1、实验材料及试剂
吲哚菁绿(ICG)、全反式视黄酸(ATRA)、流式抗体、TGF-β、胶原检测试剂盒商购获得，BALB/C乳鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)共载药细胞微颗粒收集同实施例1，其中ATRA孵育浓度为80μg/mL。
2)肌成纤维细胞的提取方法同实施例5。
3)将3×105个肌成纤维细胞培养在细胞培养板中，12h后去掉培养基，分别加入含有(4μg/mL，ICG量；1.2μg/mL，ATRA量)游离ATRA、ATRA/ICG(即，游离ATRA与游离ICG)、ATRA@MPs、ATRA/ICG@MPs的含2％胎牛血清的培养基。培养48h后，各组一半细胞用于提取细胞蛋白，Western blotting检测肌成纤维细胞特征蛋白的表达。另一半细胞使用胶原检测试剂盒检测肌成纤维细胞中的胶原蛋白含量。其中向肌成纤维细胞中加入Cal/ATRA@MPs作为实验组，肌成纤维细胞未做处理作为对照组1，加入含有(1.2μg/mL，ATRA量)游离ATRA作为对照组2，加入含有(4μg/mL，ICG量；1.2μg/mL，ATRA量)游离ICG/ATRA作为对照组3，加入含有(1.2μg/mL，ATRA量)ATRA@MPs作为对照组4。
3、实验结果
由Western blotting结果显示(如图6中的(A)所示)，游离ATRA、ATRA/ICG可以下调肌成纤维细胞的a-SMA，但是ATRA@MPs、ATRA/ICG@MPs下调肌成纤维细胞的a-SMA表达最为明显。胶原蛋白含量，如图6中的(B)所示，同western blotting结果。以上结果表明，肿瘤相关成纤维细胞去激活剂ATRA包载在细胞微颗粒中可以增强对肌成纤维细胞的去激活作用。
实施例7：共载ICG/Cal细胞微颗粒去激活肌成纤维细胞对T细胞的影响
1、实验材料及试剂
H22小鼠肝癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)、流式抗体、TGF-β、IL-2、CD3/CD28抗体商购获得，BALB/C乳鼠及BALB/C小鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)共载药细胞微颗粒收集同实施例1。
2)肌成纤维细胞的提取同实施例5。
3)取BALB/C小鼠的脾脏碾碎，过1次40μm筛网，经裂红、PBS清洗后得到单细胞悬液。脾细胞用CD3/CD28抗体刺激2天后，使用Miltenyi Biotec CD8a磁分选试剂盒分选CD8+T细胞，之后用含有20ng/mL IL-2的培养基继续培养5天。
4)H22小鼠肝癌细胞进行光热处理，同实施例2。激光处理12h后，收集肿瘤细胞上清待用。
5)肌成纤维细胞加入各组材料进行去激活处理，同实施例5。
6)收集的肿瘤细胞上清加入到去激活处理的肌成纤维细胞中，共培养24h后，去掉上清，PBS清洗3遍。将提取得到的CD8+T细胞与上述处理的肌成纤维细胞进行共培养，48h后分别收集CD8+T细胞和肌成纤维细胞进行检测。检测肌成纤维细胞的FASL和PD-L2的表达，使用凋亡检测试剂盒检测CD8+T细胞的凋亡结果。将加入Cal/ICG@MPs并进行激光处理的肿瘤细胞上清加入到经Cal/ICG@MPs预处理的肌成纤维细胞中的实验组，加入未经处理的肿瘤细胞上清到肌成纤维细胞中的作为对照组1，加入单纯经激光处理的肿瘤细胞上清到肌成纤维细胞中的作为对照组2，将加入ICG并进行激光处理的肿瘤细胞上清加入到经ICG预处理的肌成纤维细胞的作为对照组3，将加入Cal/ICG并进行激光处理的肿瘤细胞上清加入到经Cal/ICG预处理的肌成纤维细胞中的作为对照组4，将加入ICG@MPs并进行激光处理的肿瘤细胞上清加入到经ICG@MPs预处理的肌成纤维细胞中的作为对照组5。
3、实验结果
结合图2中的(A)、(B)与图7中的(A)、(B)结果可知，虽然ICG@MPs与Cal/ICG@MPs两组经激光处理的肿瘤细胞的免疫原性死亡效果一致，但是加入经处理的肿瘤细胞上清到肌成纤维细胞中共培养之后ICG@MPs组的肌成纤维细胞上的FasL、PD-L2表达强于Cal/ICG@MPs组。由图7中的(C)结果可知，肌成纤维细胞与经处理的肿瘤细胞上清共培养之后ICG@MPs组对CD8+T细胞的杀伤作用强于Cal/ICG@MPs。以上结果表明，在肿瘤抗原存在的条件下，Cal/ICG@MPs去激活的肌成纤维细胞的抗原交叉呈递能力减弱，FasL及PD-L2表达下调，从而减弱了对CD8+T细胞的抗原依赖性的活化诱导死亡。
实施例8共载ICG/Cal细胞微颗粒在荷瘤小鼠不同组织中的分布
1、实验材料和试剂
H22小鼠肝癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)商购获得，BALB/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)共载药细胞微颗粒收集同实施例1。
2)小鼠肝癌H22皮下瘤模型的建立：在BALB/c小鼠背部右下侧近右下肢处皮下接种肝癌H22+myofibroblasts细胞悬液100μL(细胞数为H22：2×106，myofibroblasts：2×106)，建立小鼠肝癌H22皮下瘤模型。
3)当小鼠肝癌H22皮下瘤长到体积为300～400mm3时，随机将荷瘤小鼠(18-22g)分为四组，每组3只。将所制备Cal/ICG@MPs(5mg/kg，ICG量；75μg/kg，Cal量)以200μL的剂量分别经尾静脉注射3只BALB/c小鼠作为实验组；对3只BALB/c小鼠注射相同剂量的游离ICG，作为对照组1；对3只BALB/c小鼠注射相同剂量的游离Cal/ICG，作为对照组2；对3只BALB/c小鼠注射相同剂量的ICG@MPs，作为对照组3。
4)尾静脉给药48h后，按照对应组再次给药，给药方式同步骤2。
5)再次尾静脉注射72h后各组处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，对各组织进行小动物活体成像，对各组织中ICG荧光强度进行定量。
3、实验结果
由图8所示，相比于游离ICG、Cal/ICG，ICG@MPs及Cal/ICG@MPs在肿瘤组织中的蓄积更多，并且Cal/ICG@MPs的蓄积量明显多于ICG@MPs。表明细胞载药微颗粒可以增加光敏剂在肿瘤部位的富集，同时包载的Cal可以进一步促进细胞载药微颗粒在肿瘤部位的蓄积。
实施例9共载ICG/ATRA细胞微颗粒在荷瘤小鼠不同组织中的分布
1、实验材料和试剂
H22小鼠肝癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、全反式视黄酸(ATRA)商购获得，BALB/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)共载药细胞微颗粒收集同实施例4。
2)小鼠肝癌H22皮下瘤模型的建立及给药方式同实施例8。其中将所制备ATRA/ICG@MPs(5mg/kg，ICG量；1.5mg/kg，ATRA量)以200μL的剂量分别经尾静脉注射3只BALB/c小鼠作为实验组；对3只BALB/c小鼠注射相同剂量的游离ICG，作为对照组1；对3只BALB/c小鼠注射相同剂量的游离ATRA/ICG，作为对照组2；对3只BALB/c小鼠注射相同剂量的ICG@MPs，作为对照组3。
3)再次尾静脉注射72h后各组处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，对各组织进行小动物活体成像，对各组织中ICG荧光强度进行定量。
3、实验结果
由图9所示，相比于游离ICG、ATRA/ICG，ICG@MPs及ATRA/ICG@MPs在肿瘤组织中的蓄积更多，并且ATRA/ICG@MPs的蓄积量明显多于ICG@MPs。表明细胞载药微颗粒可以增加光敏剂在肿瘤部位的富集，同时包载的ATRA可以进一步促进细胞载药微颗粒在肿瘤部位的蓄积。
实施例10：共载ICG/Cal细胞微颗粒对小鼠肝癌皮下瘤模型的抑制效果
1、实验材料及试剂
H22小鼠肝癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)商购获得，BALB/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)共载药细胞微颗粒收集同实施例1。
2)肌成纤维细胞的提取同实施例5。
3)小鼠肝癌H22皮下瘤模型的构建同实施例8。
4)当小鼠肝癌H22皮下瘤长到体积为300mm3时，随机将荷瘤小鼠(18-22g)分为六组，每组14只。尾静脉注射PBS、ICG、Cal/ICG、ICG@MPs、Cal/ICG@MPs(8mg/kg，ICG量；120μg/kg，Cal量)，每隔两天给药一次，总共2次，第二次给药2h后，对小鼠肿瘤部位进行808nm激光处理(1.5W/cm2，10min)，记录升温曲线。随后，每天固定时间测量肿瘤大小。治疗结束之后，每组随机抽取8只进行生存期试验。治疗12天后，将每组其余6只小鼠进行引颈处死，取出肿瘤组织，清洗、擦净后称重并拍照。Cal/ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为实验组，PBS处理的BALB/c小鼠作为对照组1，PBS并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组2，ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组3，Cal/ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组4，ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组5。
3、实验结果
如图10中的(A)肿瘤部位升温曲线所示，经激光处理后，Cal/ICG@MPs组肿瘤部位的升温最为明显。如图10中的(B)肿瘤生长曲线所示，经激光处理后，ICG@MPs及Cal/ICG@MPs在初期可显著抑制肿瘤生长，其抑瘤效果优于ICG和Cal/ICG两组。但从第26天开始，ICG@MPs处理的BALB/c小鼠的肿瘤明显开始复发，Cal/ICG@MPs处理的BALB/c小鼠的肿瘤没有明显复发。给药结束后，取出的肿瘤组织的称重结果也表明(如图10中的(C)所示)，Cal/ICG@MPs经激光处理明显抑制肿瘤生长。生存期结果也显示(如图10中的(D)所示)，Cal/ICG@MPs经激光处理明显延长荷瘤小鼠生存期，显著优于其他对照组。
实施例11：共载ICG/Cal细胞微颗粒对小鼠肝癌皮下瘤基质微环境的改善
1、实验材料及试剂
H22小鼠肝癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)、抗体商购获得，BALB/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)共载药细胞微颗粒收集同实施例1。
2)肌成纤维细胞的提取同实施例5。
3)小鼠肝癌H22皮下瘤模型的构建同实施例8。
4)当小鼠肝癌H22皮下瘤长到体积为300mm3时，随机将荷瘤小鼠(18-22g)分为六组，每组6只。尾静脉注射PBS、Cal/ICG、ICG@MPs、Cal@MPs、Cal/ICG@MPs(8mg/kg，ICG量；120μg/kg，Cal量)，每隔两天给药一次，总共2次。给药12天后，引颈处死小鼠，取出肿瘤组织。Cal/ICG@MPs处理的BALB/c小鼠作为实验组，PBS处理的BALB/c小鼠作为对照组1，Cal/ICG处理的BALB/c小鼠作为对照组2，ICG@MPs处理的BALB/c小鼠作为对照组3，Cal@MPs处理的BALB/c小鼠作为对照组4。
5)每组取部分肿瘤组织剪成2mm3左右的小块，使用0.8mg/mL胶原酶在37℃下消化40min后，过1次200目不锈钢筛网和2次200目尼龙网，经红细胞裂解液裂红、PBS清洗后得到单细胞悬液。取1×106个细胞加入荧光染料标记的抗体，4℃、避光孵育30min。离心收集细胞，用500μL PBS重悬，使用CytoFLEX S流式细胞仪检测各组中的CAF比例。
6)取出的肿瘤组织做免疫荧光切片，检测各组肿瘤组织中的α-SMA、Fibronectin、Collagen-I表达。
3、实验结果
由图11中的(A)和(B)结果可知，Cal@MPs及Cal/ICG@MPs可显著降低CAF比例，减少肿瘤组织中α-SMA表达的CAF数量，减少Fibronectin和Collagen-I的表达，其效果明显优于游离Cal/ICG。以上结果表明，Cal/ICG@MPs在体内能有效地去激活肿瘤相关成纤维细胞。
实施例12：共载ICG/Cal细胞微颗粒对小鼠肝癌皮下瘤免疫微环境的改善
1、实验材料及试剂
H22小鼠肝癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)、流式抗体商购获得，BALB/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)按照实施例10对小鼠肝癌皮下瘤模型进行给药治疗。
2)给药治疗结束后，引颈处死小鼠，取出肿瘤组织，洗净并按实施例11分离得到肿瘤组织的单细胞悬液。取1×106个细胞加入荧光染料标记的抗体，4℃、避光孵育30min。离心收集细胞，用500μL PBS重悬，使用CytoFLEX S流式细胞仪检测肿瘤组织中CAF上的MHC-I、FasL、PD-L2表达，CD8+T细胞及激活的CD8+T细胞的数目、PMN-MDSCs和Tregs的比例。CD45+CD3+CD8+为CD8+T细胞，CD45+CD3+CD8+CD69+为激活的CD8+T细胞，CD11b+Ly6G+Ly6-为粒细胞样髓源抑制性细胞(PMN-MDSC)，CD3+CD4+CD25+Foxp3+为调节性T细胞(Treg)。Cal/ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为实验组，PBS处理的BALB/c小鼠作为对照组1，PBS并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组2，ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组3，Cal/ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组4，ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组5。
3)取出的肿瘤组织做免疫荧光切片，检测各组肿瘤组织中的CD8+T细胞在肿瘤组织中分布。Cal/ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为实验组，PBS并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组2，ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组3，Cal/ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组4，ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组5。
3、实验结果
如图12中的(A)、(B)和(C)所示，经激光处理后，Cal/ICG@MPs相比ICG@MPs显著下调CAF上的MHC-I、FasL、PD-L2表达。如图12中的(D)、(E)、(F)和(G)所示，经激光处理后，ICG@MPs肿瘤组织中CD8+T细胞及激活CD8+T细胞明显减少，Cal/ICG@MPs逆转了ICG@MPs组的不利效果，明显增加肿瘤组织中的CD8+T细胞及激活CD8+T细胞数目，同时明显下调肿瘤组织中的PMN-MDSC和Treg比例。如图12中的(H)和图12中的(I)所示，经激光处理后，Cal/ICG@MPs组中CD8+T细胞在肿瘤组织深部浸润明显增加。以上结果表明Cal/ICG@MPs在体内能明显抑制肿瘤相关成纤维细胞对CD8+T细胞的抗原依赖性活化诱导死亡，增强肿瘤组织中细胞毒性T细胞的数目及深部浸润，改善肿瘤免疫抑制微环境，增强对肿瘤细胞的杀伤，抑制肿瘤组织的生长，具有良好的肿瘤免疫治疗效果。
实施例13：共载ICG/Cal细胞微颗粒对小鼠乳腺癌转移瘤模型的抑制效果
1、实验材料及试剂
4T1小鼠乳腺癌细胞、4T1-Luc小鼠乳腺癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)D-荧光素钾盐商购获得，BALB/c小鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)收集共包载的细胞载药微颗粒，收集方法同实施例3。
2)小鼠乳腺癌转移瘤模型构建：第1天时，在BALB/C小鼠左侧第四个乳腺脂肪垫原位接种乳腺癌4T1+myofibroblasts细胞悬液50μL(细胞数为4T1：5×105，myofibroblasts：2.5×105)。第10天时，BALB/c小鼠尾静脉注射4T1-Luc细胞悬液100μL(细胞数为4T1：1×105)建立小鼠乳腺癌肺转移瘤模型。
3)当小鼠乳腺癌4T1原位瘤长到体积为100mm3时，随机将荷瘤小鼠分为六组，每组5只。尾静脉注射PBS、ICG、Cal/ICG、ICG@MPs、Cal/ICG@MPs(8mg/kg，ICG量；120μg/kg，Cal量)，每隔两天给药一次，总共2次，第二次给药2h后，对小鼠肿瘤部位进行808nm激光处理(1.5W/cm2，10min)。随后，每隔4天，给荷瘤小鼠腹腔注射D-荧光素钾盐，用小动物成像仪检测肺癌在小鼠肺部转移情况。成像结束后，取出小鼠肺部，对肺部结节进行计数。Cal/ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为实验组，PBS处理的BALB/c小鼠作为对照组1，PBS并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组2，ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组3，Cal/ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组4，ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组5。
3、实验结果
由图13中的(A)可知，Cal/ICG@MPs并激光处理后明显抑制小鼠乳腺癌在肺部的转移情况，从图13中的(B)结果可知，Cal/ICG@MPs并激光处理明显减少小鼠肺部的结节数目。图13中的(A)的以上结果说明，激光治疗条件下，Cal/ICG@MPs明显抑制小鼠乳腺癌转移瘤。
实施例14：共载药细胞微颗粒的生物安全性
1、实验材料及试剂
H22小鼠肝癌细胞，吲哚菁绿(ICG)、卡泊三醇(Cal)、流式抗体商购获得，BALB/C小鼠购自武汉大学医学动物中心。
2、实验步骤
1)按照实施例9对小鼠肝癌皮下瘤模型进行给药治疗。
2)治疗12天后，取荷瘤小鼠静脉血，检测血清中ALT、AST、CK和BUN含量。Cal/ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为实验组，PBS处理的BALB/c小鼠作为对照组1，PBS并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组2，ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组3，Cal/ICG并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组4，ICG@MPs并进行激光处理的BALB/c小鼠作为对照组5。
3、实验结果
由图14表明，相比对照组小鼠，注射Cal/ICG@MPs并进行激光处理的小鼠血清各项指标均无明显变化，说明共包载的细胞载药微颗粒Cal/ICG@MPs对机体基本没有毒副作用。
综上，本发明提供的共载药细胞微颗粒更有利于药物在肿瘤组织高度富集、肿瘤深部穿透，改善肿瘤基质微环境，增强光热治疗效果，减少肿瘤相关成纤维细胞对CD8+T细胞的抗原依赖性的活化诱导死亡，改善肿瘤免疫微环境，有效抑制不完全光热治疗导致的复发及转移。
上述实施例仅为示例，例如，实施例1中的离心条件也可以采用400～20000g的其他离心力条件，该区间内的离心力条件都可以将肿瘤细胞分泌的粒径在100～1000nm的载药微颗粒更有效的富集。而基于本发明作用机制及效果揭示，不难得出，光敏剂、肿瘤相关成纤维细胞去激活剂等均可灵活调整，例如，光敏剂可以采用花菁染料(吲哚菁绿ICG,IR825,IR780,Cypate)及卟啉化合物(Ce6)等多种光敏剂。
另外，关于源自肿瘤细胞分泌的微颗粒，其他未详细说明之外，均可参见现有技术(如中国专利CN108042805B与CN109893515A)。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种共载药细胞微颗粒制剂，其特征在于，包括源自肿瘤细胞分泌的微颗粒和一同包载在所述微颗粒内的光敏剂及肿瘤相关成纤维细胞去激活剂；
其中，所述肿瘤细胞具体为源自急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌或皮肤癌中的肿瘤细胞；
所述光敏剂包括花菁染料类光敏剂和卟啉化合物类光敏剂中的至少一种；
所述肿瘤相关成纤维细胞去激活剂包括全反式维甲酸(ATRA)、维生素D3类似物中的至少一种；
并且，所述共载药细胞微颗粒制剂是由包括以下步骤在内制备方法制备得到的：
S1:使用紫外线照射、温度调节、气压调节、饥饿中的至少一种方式处理肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生更多的微颗粒；
S2：将光敏剂及肿瘤相关成纤维细胞去激活剂加入到所述肿瘤细胞中共孵育；
S3：离心收集细胞所分泌释放的载药微颗粒，即可得到同时包载有光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂的共载药细胞微颗粒制剂。
2.如权利要求1所述共载药细胞微颗粒制剂，其特征在于，所述花菁染料类光敏剂包括吲哚菁绿ICG、IR825、IR780、Cypate中的至少一种；所述卟啉化合物类光敏剂包括Ce6；
所述维生素D3类似物包括卡泊三醇(Calcipotriol,Cal)。
3.如权利要求1所述共载药细胞微颗粒制剂，其特征在于，所述共载药细胞微颗粒制剂的粒径为100～1000nm。
4.如权利要求1－2任意一项所述共载药细胞微颗粒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:使用紫外线照射、温度调节、气压调节、饥饿中的至少一种方式处理肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生更多的微颗粒；
S2：将光敏剂及肿瘤相关成纤维细胞去激活剂加入到所述肿瘤细胞中共孵育；
S3：离心收集细胞所分泌释放的载药微颗粒，即可得到同时包载有光敏剂和肿瘤相关成纤维细胞去激活剂的共载药细胞微颗粒制剂。
5.如权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述共孵育的时间为6～48h。
6.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述共孵育的时间为12～24h。
7.如权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述离心具体是在4℃～15℃的低温条件下，以400～20000g的离心力收集载药微颗粒。
8.如权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤S1中：
当处理方式为紫外照射时，紫外照射的时间为10min-2h；
当处理方式为温度调节时，温度调节处理的时间为2h-8h；
当处理方式为气压调节时，具体是在2-5个大气压的环境下进行处理2h-8h；
当处理方式为饥饿处理时，饥饿处理的时间为12-48h。
9.如权利要求1－2任意一项所述共载药细胞微颗粒制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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