CN112870165A - 一种提高囊泡载药量的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高囊泡载药量的方法和应用，所述方法包括：将肿瘤细胞悬浮于含化疗药物和保护剂的培养液中，并按照超声功率19.5～26W，单次超声时长2～3s，超声间隔时间2～4s，总超声时长60～80s，频率30Hz的程序进行超声处理，然后使肿瘤细胞凋亡，提取并收集其产生的囊泡；其中所述保护剂为质量浓度2％丙三醇和/或2％山梨醇。本发明针对现有的囊泡载药量过低的问题，利用低功率超声波刺激细胞，通过优化超声波多项参数并加入保护剂，使其发挥协同作用，显著增加了载药囊泡的载药量，进而提高了其体内外的肿瘤杀伤效果。并且该方法简单快速易操作，成本低，适合大规模生产使用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种提高囊泡载药量的方法和应用。
背景技术
细胞骨架是真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，细胞在受到外源性或内源性刺激之后会引起细胞骨架发生重排，导致细胞膜局部受力不均匀。受力异常的胞质会向胞外膨胀，进而随机包裹部分细胞内容物后以囊泡的形式释放到细胞外部。这种直径约为0.1-1μm的特殊亚细胞结构称为“细胞囊泡”。
专利CN102302784B公开了一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法，具体为以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡作为肿瘤化疗药物制剂的载体，包裹化疗药物作为靶向药，更利于药物到达肿瘤治疗部位，在降低化疗药物对正常细胞的毒副作用的同时，提高了化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果。其中载药囊泡的抗肿瘤效果与其化疗药物的载药量呈正相关关系，然而目前囊泡的载药量与其来源的细胞吞药量有关，其主要依赖于细胞膜的吞噬作用，然而基于主动吞噬作用会导致细胞的载药量过低。因此如何提高囊泡的载药量进而提高载药囊泡的抗肿瘤效果，是具有重要意义的。
发明内容
本发明针对现有技术中载药囊泡基于主动吞噬作用进行载药，导致载药量过低的缺陷，提供一种提高囊泡载药量的方法和应用，利用低功率超声波刺激含化疗药物的细胞悬液，使细胞膜间隙变大，通透性变高，从而提高细胞中化疗药物的含量，同时细胞悬液中还添加有保护剂，不仅可避免超声波对细胞的破坏，还可进一步提高囊泡的载药量，即通过超声波和保护剂的协同作用，显著提高了载药囊泡的载药量，进而显著提高了其体内和体外的抗肿瘤效果。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种提高囊泡载药量的方法，所述方法包括：将肿瘤细胞悬浮于含化疗药物和保护剂的培养液中，并按照超声功率19.5～26W，单次超声时长2～3s，超声间隔时间2～4s，总超声时长60～80s，频率30Hz的程序进行超声处理，然后使肿瘤细胞凋亡，提取并收集其产生的囊泡；其中所述保护剂为质量浓度2％丙三醇和/或质量浓度2％山梨醇。
本发明利用低频超声波刺激细胞，并优化超声波的多项参数，以增加细胞对于化疗药物的吞噬量，并加入保护剂质量浓度2％丙三醇和/或2％山梨醇，该保护剂不仅可避免超声波对细胞的破坏，还可进一步增加载药量，即通过超声波和保护剂的协同作用，显著提高了载药囊泡的载药量。
进一步的，所述超声处理的程序为：超声功率19.5W，单次超声时长3s，超声间隔时间4s，总超声时长60s，频率30Hz。在该超声处理的程序下，载药囊泡的载药量以及体内外肿瘤杀伤效果均显著最优。
进一步的，所述保护剂为质量浓度2％山梨醇。相比于2％丙三醇，2％山梨醇对于细胞的保护作用以及载药效果相对更好。
进一步的，所述方法中，利用紫外线照射或高渗溶液诱导，使肿瘤细胞凋亡。可采用本领域的多种常规技术手段，促使肿瘤细胞凋亡，并释放装载有化疗药物的细胞囊泡。
进一步的，所述化疗药物选自甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他滨或10-羟基喜树碱。化疗药物可选自本领域的多种常规化疗药物。
进一步的，所述化疗药物为甲氨蝶呤。
进一步的，所述肿瘤细胞为H22小鼠肝癌细胞。
进一步的，所述囊泡的提取方法为：收集凋亡后的肿瘤细胞悬液，3000rpm离心后取上清，14000g离心后再取上清，4000g离心后弃上清，用PBS溶液润洗沉淀，再用PBS溶液重悬沉淀即得所述囊泡悬液。
本发明还提供了一种载药囊泡，其是采用上述方法制备而成的。
本发明还提供了上述载药囊泡在制备肿瘤化疗药物制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明针对现有的囊泡载药主要依赖于细胞膜的主动吞噬作用导致载药量过低的技术问题，提供了一种提高囊泡载药量的方法，即利用低功率超声波刺激含化疗药物的细胞悬液，使细胞膜间隙变大，通透性变高，并通过优化超声波的多项参数显著增加肿瘤细胞对于化疗药物的吞噬量，进一步的，还在细胞悬液中加入有质量浓度2％丙三醇和/或2％山梨醇的保护剂，不仅可保护细胞免受破坏还可增加细胞载药量。即通过对超声波参数的特殊选取，并与保护剂产生协同增效作用，显著增加了载药囊泡的载药量，提高了其体内外的肿瘤杀伤效果。并且该方法简单快速易操作，成本低，适合大规模生产使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例3中不同组囊泡的体外肿瘤杀伤效果验证；
图2为本发明实施例3中不同组囊泡的体内肿瘤杀伤效果验证。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1保护剂的筛选
1.细胞对超声波的耐受性
为避免超声波功率过高对细胞的伤害，首先检测小鼠肝癌细胞H22细胞对不同功率和超声间隔时间的耐受性，具体为：
取一定量的H22细胞，悬浮于无菌的PBS缓冲液中，计数后制备成1x 107个/mL的细胞悬液。平均分成11份，每份1mL，按照不同的超声程序对各细胞悬液进行刺激处理，处理完毕后进行细胞计数，并以不进行超声处理的细胞作为对照组Control，结果如表1所示(其中本实施例所使用的超声波仪器总功率为650W，超声功率比为相较总功率的比，如超声功率比1％为6.5W，以此类推)。
表1 H22细胞对超声波的耐受性
根据表1的测定结果，其中对照组Control样品由于未进行超声处理，因此细胞数量无变化，同时样品5号、7号、8号、9号和10号经超声处理后，细胞被破坏的较少。
2、保护剂的筛选
基于表1的结果，进一步筛选不同试剂对于细胞超声的保护作用，具体为：分别使用质量浓度为0.5％或2％的β环糊精、丙三醇、聚乙二醇、蔗糖、葡聚糖和山梨醇作为保护剂，并进行相同的超声处理，以比较不同的保护剂对于细胞的超声保护作用的差异，Control组中不添加有保护剂，其检测方法与上述相同，在超声处理前后分别进行细胞计数，结果如表2所示。
表2不同保护剂的保护作用
根据表2的检测结果，不同的保护剂，其对于细胞的保护作用是存在差异的，而其中质量浓度2％丙三醇以及2％山梨醇对于细胞避免超声波的破坏具有相对较好的保护作用。
进一步的，对比保护剂2％丙三醇和2％山梨醇存在的情况下，相同超声波处理后，利用液相色谱法检测各细胞载药量的差异，具体为：
取一定数量的H22细胞，悬于无菌的PBS缓冲液中(在PBS缓冲液的制备过程中已分别添加了质量浓度2％山梨醇或2％丙三醇)，计数后制备成1x107个/mL的细胞悬液。平均分成6份，每份1mL，每份细胞悬液分别加入100μL化疗药物，具体为50mg/mL的甲氨蝶呤溶液。按照下列超声程序处理后，细胞悬液静置孵育30min，取各细胞悬液300μL，加入三倍体积的乙腈：氯仿(体积比1:2)溶液，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为检测样品进行检测。本实施例使用的高效液相色谱仪型号为ThermoUltiMate 3000，色谱柱型号规格为：Thermo AcclaimTM 120，C18 5μm 4.6*250mm；泵流速为1.0mL/min，柱温为30℃，流动相为：0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈9:1(pH 6.60)，进样体积为40μL，检测波长为304nm，单针运行时间为10min。每种保护剂样品三个重复，Control组不添加有保护剂且不进行超声波处理，Sample1组进行超声波处理但不添加有保护剂，各样品的超声程序、细胞计数结果以及HPLC检测分析结果如表3所示。
表3不同保护剂的对载药量的影响
根据表3的测定结果，其中相比于不进行超声波处理的Control组，超声处理后的细胞样品(Sample1组)的HPLC检测峰面积有所提高，即含药量有所增加，而添加有保护剂2％丙三醇或2％山梨醇的样品，细胞的含药量进一步增加了。并且添加有2％山梨醇的细胞样品的含药量高于添加了2％丙三醇的细胞样品，因此用质量浓度2％山梨醇作为保护剂进行后续实验。
实施例2超声程序的优化
基于实施例1的结果，对超声程序进一步进行优化，并且所有样品中均添加有质量浓度2％山梨醇作为保护剂。
1、首先对超声程序中的单次超声时长和超声间隔时间进行优化，其中各样品的超声程序以及超声前后的细胞计数量如表4所示：
表4单次超声时长和超声间隔时间优化
根据表4的检测结果，在1号、3号、7号样品的超声条件下，细胞完整度良好。
2、进一步的，对总超声时长和超声频率进行优化，其中各样品的超声程序以及超声前后的细胞计数量如表5所示。
表5总超声时长和超声频率优化
根据表5的检测结果，其中当3号和4号样品的细胞经超声处理后，细胞数量显著降低，即总超声时长应低于80s。进一步，根据5号、6号和7号样品的检测结果可知，当超声频率为30Hz时，细胞的完整度仍较好。
3、基于上述结果，设计几种不同的超声程序，对比各程序处理后，细胞的载药量差异，检测方法同实施例1的表3(即化疗药物为100μL 50mg/mL的甲氨蝶呤溶液)，其中各样品的超声程序、超声前后的细胞计数结果以及HPLC检测分析结果如表6所示。
表6不同超声程序对细胞含药量的影响
根据表6的检测结果，其中2号样品经超声处理后，其细胞数量以及细胞含药量最高。
4、进一步的，根据表6的结果，检测其中Control、1号、2号、3号样品经不同的超声程序处理后，提取得到的细胞囊泡的载药量。具体检测方法为：
取H22细胞用无血清1640培养基稀释成1x 107个/mL的悬液，每份样品20mL，共准备四份。分别按照表6的程序进行超声处理。静置10min后按专利CN102302784B的方法进行紫外线照射处理60min，使H22细胞发生凋亡，过夜培养后提取囊泡。提取步骤具体为：收集细胞悬液于50mL离心管，3000rpm离心6min，转移上清至50mL高速离心管，14000g离心2min，转移上清至另一50mL高速离心管，14000g离心60min后弃上清，用适量PBS缓冲液润洗沉淀然后去除润洗液，再用1mL PBS缓冲液重悬沉淀，混匀后即得所述囊泡悬液。取0.1mL囊泡悬液稀释后利用马尔文计数，另取0.2mL囊泡悬液加入三倍体积的乙腈：氯仿(体积比1:2)溶液，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为检测样品，用高效液相色谱仪检测并分析囊泡的载药量，检测方法同实施例1。各样品的超声程序、马尔文计数结果以及HPLC检测分析结果如表7所示。
表7不同超声程序对细胞囊泡载药量的影响
根据表7的检测结果，相比于不经超声处理的Control组，经超声波处理后的细胞样品，其可提取得到的囊泡数量显著增多，并且载药量也均显著提高，其中2号样品中单位囊泡所载的药物浓度最高。
实施例3体内外肿瘤杀伤效果
根据实施例2的优化结果，其中表7所示的3个样品的囊泡载药量相对较高，因此进一步验证这3个样品的体内外肿瘤杀伤效果。
1、体外小鼠肝癌细胞H22杀伤实验
准备适量浓度的H22细胞，用1640完全培养基稀释至5×104个/0.5mL，接种于24孔板，每孔0.5mL，共12组。按照实施例2的表7，制备4组囊泡悬液(包括Control、1号、2号、3号样品)，每组囊泡悬液分别取0.1mL加入至上述孔板，每组囊泡三个重复。摇匀后于培养箱共培养24h。培养结束后，将孔板中的悬液分别收集到流式管中，用500μL PBS缓冲液洗涤，洗涤悬液也加入相应流式管，300g离心6min。弃去上清，分别依次加入100μL AnnexinVbinding buffer，1.5μL Annexin V-FITC和1.2μL PI染料，混匀后室温孵育15min。每管分别加入200μL Annexin V binding buffer，混匀后用流式细胞仪检测H22细胞的凋亡率，检测结果如图1所示。
根据图1的检测结果，其中相比于Control组，1号、2号、3号样品由于载药量提高，因此其对于肿瘤细胞的体外杀伤效果也有所提高，并且其中2号样品中囊泡的体外肿瘤杀伤效果显著最优，这与表7的载药量检测结果一致。
2、H22肝癌小鼠生存期试验
准备30只BALB/c小鼠平均分成5组，每组6只，第0天腹腔接种H22细胞，按2×105个细胞/只进行接种。从第2天按照实施例2表7的方法制备4组不同的载药囊泡并开始腹腔注射，连续给药5天，同时设置一组注射PBS缓冲液的空白组，统计5组小鼠的生存期，结果如图2所示。
根据图2的检测结果，结果表明载药囊泡治疗H22肝癌小鼠的效果与其载药量有关，相比于Control组，1号、2号、3号样品由于载药量提高，因此其延长了患癌小鼠的生存期，即抗肿瘤效果有所提高，并且其中2号样品中载药囊泡的体内抗肿瘤效果显著最优。
综合上述结果，按照本发明所述的方法，将肿瘤细胞悬浮于含化疗药物和保护剂(质量浓度2％丙三醇和/或2％山梨醇)的培养液中，并按照超声功率19.5～26W，单次超声时长2～3s，超声间隔时间2～4s，总超声时长60～80s，频率30Hz的程序进行超声处理后，可显著提高提取得到的囊泡载药量，进而可显著提高囊泡的体内外杀伤效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种提高囊泡载药量的方法，其特征在于，所述方法包括：将肿瘤细胞悬浮于含化疗药物和保护剂的培养液中，并按照超声功率19.5～26W，单次超声时长2～3s，超声间隔时间2～4s，总超声时长60～80s，频率30Hz的程序进行超声处理，然后使肿瘤细胞凋亡，提取并收集其产生的囊泡；
其中所述保护剂为质量浓度2％丙三醇和/或质量浓度2％山梨醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声处理的程序为：超声功率19.5W，单次超声时长3s，超声间隔时间4s，总超声时长60s，频率30Hz。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护剂为质量浓度2％山梨醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，利用紫外线照射或高渗溶液诱导，使肿瘤细胞凋亡。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化疗药物选自甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他滨或10-羟基喜树碱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊泡的提取方法为：收集凋亡后的肿瘤细胞悬液，3000rpm离心后取上清，14000g离心后再取上清，4000g离心后弃上清，用PBS溶液润洗沉淀，再用PBS溶液重悬沉淀即得所述囊泡悬液。
7.一种载药囊泡，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的方法制备而成。
8.如权利要求7所述的载药囊泡在制备肿瘤化疗药物制剂中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114395531A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-04-26 | 镇江市中西医结合医院（镇江市第二人民医院） | 一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用 |
| CN117987365A (zh) * | 2023-12-27 | 2024-05-07 | 常州市第一人民医院 | 一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法及其应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100178305A1 (en) * | 2008-12-15 | 2010-07-15 | University Of Utah Research Foundation | Ultrasonic nanotherapy of solid tumors with block copolymers stabilized perfluorocarbon nanodroplets |
| CN102415987A (zh) * | 2010-09-25 | 2012-04-18 | 鲁翠涛 | 实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法 |
| CN104958324A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-10-07 | 黄波 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
| CN110585168A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-12-20 | 南昌大学 | 一种利用细胞表面囊泡作为药物载体的用途 |
| CN111494341A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-07 | 南开大学 | 一种纳米细胞膜载药囊泡及其制备方法与应用 |
| CN111529712A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-08-14 | 集美大学 | 一种细胞外囊泡主动载药方法 |
| CN111617053A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-09-04 | 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 | 一种高渗透压诱导细胞凋亡制备囊泡的方法 |
| CN111693359A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-09-22 | 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 | 一种囊泡数量的检测方法 |
-
2021
- 2021-01-26 CN CN202110106429.9A patent/CN112870165A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100178305A1 (en) * | 2008-12-15 | 2010-07-15 | University Of Utah Research Foundation | Ultrasonic nanotherapy of solid tumors with block copolymers stabilized perfluorocarbon nanodroplets |
| CN102415987A (zh) * | 2010-09-25 | 2012-04-18 | 鲁翠涛 | 实现心血管系统病变部位药物高效递送的方法 |
| CN104958324A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-10-07 | 黄波 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
| CN110585168A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-12-20 | 南昌大学 | 一种利用细胞表面囊泡作为药物载体的用途 |
| CN111693359A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-09-22 | 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 | 一种囊泡数量的检测方法 |
| CN111494341A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-07 | 南开大学 | 一种纳米细胞膜载药囊泡及其制备方法与应用 |
| CN111529712A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-08-14 | 集美大学 | 一种细胞外囊泡主动载药方法 |
| CN111617053A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-09-04 | 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 | 一种高渗透压诱导细胞凋亡制备囊泡的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 伍津津: "《皮肤组织工程学》", 30 June 2009, 人民军医出版社 * |
| 余敬谋等: "《生物药剂学与药物动力学》", 31 August 2019, 华中科技大学出版社 * |
| 王文梅等: "《复发性口腔溃疡中西医结合诊断和治疗》", 30 November 2018, 东南大学出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114395531A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-04-26 | 镇江市中西医结合医院（镇江市第二人民医院） | 一种生物活性物质或药物传递微囊泡的制备方法及其应用 |
| CN117987365A (zh) * | 2023-12-27 | 2024-05-07 | 常州市第一人民医院 | 一种裂亡前列腺癌细胞囊泡的工程化改造方法及其应用 |
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