CN104958324A - 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 - Google Patents
一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104958324A CN104958324A CN201510289636.7A CN201510289636A CN104958324A CN 104958324 A CN104958324 A CN 104958324A CN 201510289636 A CN201510289636 A CN 201510289636A CN 104958324 A CN104958324 A CN 104958324A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- oncolytic virus
- microparticle
- preparation
- oncolytic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 title claims abstract description 98
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 119
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 81
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 85
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 30
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 10
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 74
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 64
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 35
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 9
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 9
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 9
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 9
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 3
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 3
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 3
- 101710098398 Probable alanine aminotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 3
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 3
- 230000003263 anti-adenoviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012474 bioautography Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
- A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/761—Adenovirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5089—Processes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20251—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明提供一种溶瘤病毒制剂及其制备方法。所述溶瘤病毒制剂包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的溶瘤病毒,该溶瘤病毒制剂利用细胞自身来源的细胞囊泡将溶瘤病毒包裹其中,使溶瘤病毒逃避机体免疫系统的攻击,并能靶向达到肿瘤治疗部位,提高杀瘤效应。
Description
技术领域
本发明涉及一种溶瘤病毒制剂及其制备方法,尤其涉及一种溶瘤病毒制剂及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤作为一种严重威胁人类生命健康的疾病,近年来寻找有效、毒副作用小的治疗方法已成为医学研究的重中之重。依据以毒攻毒的原理,利用病毒来杀灭肿瘤细胞,是肿瘤治疗的一种理想策略,然而这一策略却面临两方面问题,即如何使病毒选择性地到达肿瘤部位,以及如何使病毒逃过机体免疫系统的攻击。
病毒DNA或RNA与蛋白质及其它生物分子一起组装形成病毒颗粒,后者如能够感染肿瘤细胞,并在肿瘤细胞中大量复制,产生新的病毒颗粒,最终导致肿瘤细胞裂解,此即所谓的溶瘤病毒,即具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒。然而,溶瘤病毒作为异己成分,一旦进入机体便会受到机体的免疫排斥,特别是抗病毒抗体的产生,通过对病毒的清除,从而限制溶瘤病毒的抗瘤作用。另外,游离的溶瘤病毒容易进入正常组织,不但削弱了病毒对肿瘤细胞的有效杀伤效果,而且会对正常组织造成损伤,引发毒副作用。
发明内容
本发明提供了一种溶瘤病毒制剂,溶瘤病毒作为治疗有效组分由凋亡的肿瘤细胞获得的细胞囊泡所包裹,可以作为一种靶向生物制剂用于肿瘤疾病的治疗,有效提升溶瘤病毒的杀瘤效应,及降低对机体的毒副作用。
本发明提供了一种溶瘤病毒制剂的制备方法,实现了将作为治疗有效成分的溶瘤病毒包裹到源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡中,并成功收集了细胞囊泡包裹溶瘤病毒后形成微颗粒,即本发明的溶瘤病毒制剂。
本发明提供了一种溶瘤病毒制剂,是一种以溶瘤病毒感染肿瘤细胞并使之凋亡而产生的细胞囊泡为载体,包裹溶瘤病毒而形成的制剂。
本发明提供的溶瘤病毒制剂由细胞囊泡包裹溶瘤病毒而形成,其作为一种靶向生物制剂,更利于溶瘤病毒达到肿瘤治疗部位,提高杀瘤效应,同时利用肿瘤细胞自身来源的细胞囊泡将溶瘤病毒包裹其中,使溶瘤病毒逃避机体免疫系统的攻击。
作为本领域的基础知识,细胞在受到凋亡信号或者刺激信号刺激时,局部细胞膜结构发生改变,向外膨起并包裹细胞内容物形成囊泡结构而被释放到细胞外,其直径界于100-1000纳米(nm),即本发明所述的“细胞囊泡(microparticles)”。另外,细胞在凋亡时,还可以释放直径在1-3微米(μm)的凋亡小体(apoptotic body),以及直径在30-100纳米的外排体(exosome)。凋亡小体或外排体与细胞囊泡,存在显著差别,不包括在本发明内。正由于肿瘤细胞在凋亡过程中会产生凋亡小体、外排体等,本发明的方案需要以特定的步骤和条件才能获得细胞囊泡包裹溶瘤病毒后形成的所述溶瘤病毒制剂。
本案申请人曾公开了一种利用来自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡包裹化疗药物提供能够实现靶向给药的药物制剂,具体看参见CN102302784A。本发明方案与囊泡包裹化疗药物有不同的设计和应用特点。化疗药物在进入肿瘤细胞后,通过物理空间包裹的原理,被凋亡肿瘤细胞释放的细胞囊泡所包裹形成装载化疗药物的微颗粒制剂。本发明方案中,溶瘤病毒进入肿瘤细胞后,借助肿瘤细胞内的氨基酸、核苷酸、脂类分子等原料物质,进行大量的生物合成,在此过程中,病毒处于活性状态,具有活动复制的能力,可以与肿瘤细胞的细胞骨架或者细胞膜进行相互作用,最终导致肿瘤细胞释放小泡,形成其中包裹溶瘤病毒的细胞颗粒,也可称微颗粒。与包裹化疗药物不同的是,溶瘤病毒与肿瘤细胞的数量需要达到合适的比例才利于得到能发挥治疗功效的微颗粒制剂,即,溶瘤病毒过少会达不到复制的效果,溶瘤病毒过多则会导致肿瘤细胞死亡,进而导致释放的细胞囊泡量急剧减少。除此之外,化疗药物作为小分子物质,其粒径通常小于1nm,而病毒的直径可处于50-200nm之间,细胞囊泡的直径则介于100-1000nm之间,因而细胞囊泡在释放的过程中能否包裹病毒并不能通过其能够包裹化疗药物而简单推出,并且只有当病毒在肿瘤细胞内复制到一定数量的时候,才会让细胞囊泡包裹病毒的几率增大和数量增多。故而细胞囊泡包裹病毒与细胞囊泡包裹化疗药物相比,需要考虑病毒的生物复制和病毒的粒径大小的因素。
本发明提供的方案中,为了得到细胞囊泡对溶瘤病毒有效包裹的微颗粒,制备体系中溶瘤病毒与肿瘤细胞的比例最好介于1:1至20:1之间。进一步的,所述比例可以是10:1。
本发明提供的一种溶瘤病毒制剂的制备方法,包括使溶瘤病毒与肿瘤细胞以1:1至20:1比例混合以感染肿瘤细胞,在37℃和5%氧含量条件下,培养被感染的肿瘤细胞并使之凋亡,在48-72小时时间内,收集凋亡肿瘤细胞释放的微颗粒,所述微颗粒即为细胞囊泡包裹溶瘤病毒后形成的所述溶瘤病毒制剂。在本申请的方案中,溶瘤病毒与肿瘤细胞的比例指的是数量比。
本发明方案所使用的溶瘤病毒可以为商购获得的任何溶瘤病毒。例如,所述溶瘤病毒为溶瘤腺病毒。腺病毒为感染人的常见病毒,其免疫原性强,能够被机体的免疫系统快速清除,并且腺病毒不整合到基因组DNA分子中,不导致基因组DNA突变,因此使用此种病毒具有非常好的安全性。
进一步的,所述肿瘤细胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌或前列腺癌等。
本发明的方案中,对于微颗粒的收集可使用超速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。在具体实施方案中,可以通过离心机,在低温条件下(4℃左右),以1000-50000g的离心力,收集微颗粒。例如,可以在不大于5000g的离心力去除肿瘤细胞及其碎片,以10000g-50000g的离心力收集获得的沉淀即为所述微颗粒。更进一步的,可以在不大于5000g的离心力下去除肿瘤细胞及其碎片,在10000g的离心力下收集获得的沉淀即为所述微颗粒。
本发明提供的一种溶瘤病毒制剂,包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的溶瘤病毒,所述溶瘤病毒制剂根据所述任一方法制成。
本发明提供的所述溶瘤病毒制剂由于采用了上述来自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡作为包裹溶瘤病毒的载体,成为一种微颗粒。相较于游离的溶瘤病毒,包裹在细胞囊泡内的溶瘤病毒不能被免疫系统所识别,从而能够安全、有效到达肿瘤部位。一般的游离溶瘤病毒是通过细胞膜上特殊受体分子的介导而进入细胞内,但一些肿瘤细胞本身不表达该受体或者主动下调该受体表达,则可以逃避溶瘤病毒的入侵。而在本申请的方案中,由于采用的来源于肿瘤细胞的细胞囊泡极其容易与肿瘤细胞的细胞膜融合,反而介导了其包裹的溶瘤病毒进入肿瘤细胞。
在本发明的方案中,由所述细胞囊泡包裹所述溶瘤病毒所形成的溶瘤病毒制剂的粒度为100~1000纳米。
可以看出,本发明所采用的包裹溶瘤病毒的细胞囊泡因为尺寸远大于正常组织毛细血管的通透性(5-10nm),而不能穿过正常毛细血管而进入正常组织,避免了现有技术中由于直接注射游离溶瘤病毒而对机体其他正常组织的毒副作用。
可以理解,本发明提供了一种获得靶向溶瘤病毒制剂的新的思路和方案,该靶向溶瘤病毒制剂可以针对不同类型的临床恶性肿瘤,例如:卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等,用于包裹溶瘤病毒的细胞囊泡(载体)则最好是来自与患者罹患的肿瘤同种类型的肿瘤细胞或者能让溶瘤病毒进行复制的其它类型细胞。
本发明所述的溶瘤病毒感染肿瘤细胞并使肿瘤细胞凋亡,可以按照本领域技术人员公知的判断标准,例如观察肿瘤细胞缩小、变暗,即可认为其已经凋亡。
在本发明提供的方案中,在使溶瘤病毒感染肿瘤细胞之前还包括对所述肿瘤细胞进行培养。上述细胞的培养方法可采用本领域常规的培养方法进行培养。
本领域技术人员可以按照常规方法制成溶瘤病毒制剂,尤其是注射制剂,例如,将收集到的微颗粒用生理盐水悬浮后制成注射液。
本发明的所述溶瘤病毒制剂可以为单位制剂。所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂,如一单位(针)针剂等。患者一次施用所需的药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂量的乘积得到。例如,在制备药物的过程中,一般认为成人体重为50-70kg,所以最初可以通过实验动物与人的单位体重剂量之间的等效剂量换算关系来确定用药量。例如,可以根据FDA、SFDA等药品管理机构提出的指导意见,也可参考(黄继汉等,“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”,《中国临床药理学与治疗学》,2004Sep;9(9):1069-1072)来确定。在本发明的实施方式中,可以使用按照人和小鼠的体表面积折算系数0.0026来换算人和小鼠的剂量。
更进一步的,根据申请人针对小鼠的实验,针对人的溶瘤病毒制剂的单位制剂中可以包括1×107-1×108个所述微颗粒。
本发明还提供了一种治疗或预防肿瘤的方法,包括对患有肿瘤的个体或具有肿瘤发生趋势的个体施用所述溶瘤病毒制剂的过程。
本发明的技术方案具有以下技术效果:
1、本发明提供的制备方法能获得细胞囊泡包裹溶瘤病毒后形成的微颗粒即为所述溶瘤病毒制剂,而非外排体、凋亡小体;通过调节使用溶瘤病毒的剂量,能够使得95%以上的细胞囊泡均包裹溶瘤病毒,从而高效获得本申请的所述溶瘤病毒制剂。
2、将来自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡作为本发明的溶瘤病毒的载体,避免了溶瘤病毒进入机体时免疫系统的攻击,并且更利于溶瘤病毒达到肿瘤治疗部位,提高杀瘤效应。
3、在本申请的方案中,由于采用来源于肿瘤细胞的细胞囊泡作为载体,其包裹的溶瘤病毒能容易的进入肿瘤细胞。
4、本发明所采用的包裹溶瘤病毒的微颗粒因为尺寸远大于正常组织毛细血管的通透性(5-10nm),而不能穿过正常毛细血管而进入正常组织,避免了由于直接注射游离溶瘤病毒而对机体其他正常组织的毒副作用。
5、肿瘤细胞具有无限增殖的特性,培养方法成熟,根据本发明记载的方案可从肿瘤细胞获得大量的细胞囊泡用于制备所述溶瘤病毒制剂,成本小,操作简单。
附图说明
图1a为体外培养的A549人肺肿瘤细胞经溶瘤腺病毒处理后释放出微颗粒的电镜图。
图1b为溶瘤腺病毒诱导人肺癌细胞凋亡产生的微颗粒的粒径分析图。图1b中y轴表示待测微颗粒样本中颗粒的数量密度,红色曲线线峰所对应的x轴数值代表样本中大部分微颗粒所处的直径范围。
图2a显示了体外培养的肿瘤细胞经溶瘤腺病毒处理后产生的微颗粒中含有溶瘤腺病毒的DNA。
图2b显示了肿瘤细胞经溶瘤腺病毒处理后产生的微颗粒包裹了溶瘤腺病毒。
图3显示包裹有溶瘤腺病毒的微颗粒对多种人肿瘤细胞类型进行杀伤的作用图。图中:a、b、c、d分别代表A2780人卵巢癌细胞系、MCF-7人乳腺癌细胞系、A549人肺癌细胞系、SNU1人胃癌细胞系;g、h、i、j分别代表Caco2人结肠癌细胞系、HepG2人肝癌细胞系、ASCP-1人胰腺癌细胞系、LINCap人前列腺癌细胞系。
图4a和图4b显示了各组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和肌酐(CRE)含量,显示了包裹溶瘤腺病毒的微颗粒对机体没有产生明显的毒副作用。
图5a显示了经磷酸盐缓冲溶液(PBS),细胞囊泡(MP)、溶瘤腺病毒(OA)、包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒(OA-MP)处理后荷A549肿瘤小鼠第5天和第21天的肿瘤体积;图5b显示了经PBS,MP、OA、OA-MP处理荷A549肿瘤小鼠后不同时间点检测的肿瘤体积;图5c显示了经PBS,MP、OA、OA-MP处理荷A549肿瘤小鼠后荷瘤小鼠的存活率;图5d显示了经PBS,MP、OA、OA-MP处理小鼠后裸鼠A2780肿瘤的生长。
具体实施方式
为了证实肿瘤细胞来源的细胞囊泡能够包裹溶瘤腺病毒,有效杀伤肿瘤细胞,并且在体内不产生明显的毒副作用,下面结合附图和实施例进一步说明本发明。
下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、溶瘤腺病毒及实验动物:
A2780人卵巢癌细胞系、MCF-7人乳腺癌细胞系、A549人肺癌细胞系、SNU1人胃癌细胞系、Caco2人结肠癌细胞系、HepG2人肝癌细胞系、ASCP-1人胰腺癌细胞系、LINCap人前列腺癌细胞系,均可从美国ATCC中心或中国典型物保藏中心CCTCC购买。
溶瘤腺病毒可购自上海三维生物技术有限公司,名称为重组人5型腺病毒(H101)。体重18克左右雌性裸鼠200只,购自中国医学科学院协和医学院实验动物中心。
实施例1:使用溶瘤腺病毒诱导人肺癌细胞凋亡产生微颗粒
1、实验步骤
在DMEM细胞培养液中培养A549人肺癌细胞,使细胞数量达到1×107;在培养液中加入1×108溶瘤腺病毒以感染人肺癌细胞;在37℃和5%氧含量条件下,培养被感染的肿瘤细胞,在施用溶瘤腺病毒后的第48小时,当肿瘤细胞出现缩小、变暗,将人肺癌细胞培养液的上清以1000g、5000g的离心力依次离心10分钟,去除细胞及碎片,取离心后的上清再进一步以10000g的离心力离心2小时,收集沉淀即获得源自凋亡A549人肺癌细胞的细胞囊泡包裹溶瘤腺病毒后形成的微颗粒。
2、实验结果
将上述所制备的微颗粒使用1ml的0.9%(g/ml)的生理盐水进行重悬后涂片,在电子显微镜下观察微颗粒(见图1a)。同时,对微颗粒粒径进行纳米粒度电位仪检测,得到粒径分布结果(见图1b),微颗粒样本中绝大部分的颗粒直径分布在100~1000nm范围内。
实施例2:溶瘤腺病毒诱导人肺癌细胞凋亡产生的细胞囊泡包裹了溶瘤腺病毒DNA。
1、实验步骤
培养A549人肺癌细胞,使细胞数量达到1×107;培养液中加入1×108溶瘤腺病毒颗粒;在施用溶瘤腺病毒后的第48小时,当肿瘤细胞出现缩小、变暗,将人肺癌细胞培养液的上清按照实施例1的步骤收集A549人肺癌细胞凋亡所产生的微颗粒(由源自凋亡A549人肺癌细胞的细胞囊泡包裹溶瘤腺病毒后形成)。
一方面将微颗粒进行蛋白酶K处理,破膜裂解,分离DNA分子,同时对溶瘤腺病毒进行处理,分离、制备其含有的DNA分子。
另一方面,对上述获得的微颗粒使用PKH67(显示绿色)进行染色,同时对微颗粒中腺病毒使用PE荧光标记的抗腺病毒抗体(显示红色)进行染色,在共聚焦荧光显微镜下观察。
作为参照,对由上述A549人肺癌细胞获得的细胞囊泡使用PKH67(显示绿色)进行染色,同时对细胞囊泡使用PE荧光标记的抗腺病毒抗体(显示红色)进行染色,在共聚焦荧光显微镜下观察。
上述细胞囊泡的制备方法为:培养肿瘤细胞,使用紫外线照射30分钟,在紫外线照射后的48小时,当肿瘤细胞出现明显变小、暗淡状态,对小鼠肝癌细胞的培养液的上清进行逐步离心,即以500g、1000g、5000g的离心力依次离心10分钟,之后以14000g的离心力离心1分钟,以除去细胞及碎片,取离心后的上清进一步以14000g的离心力离心1小时,收集沉淀即为细胞囊泡。
2、实验结果
对上述分别所制备的DNA进行电泳,得到电泳结果见图2a,图2a中OA代表溶瘤腺病毒DNA,OA-MP代表包裹溶瘤腺病毒的微颗粒的DNA,DNA分子量标准条带(marker)见最左侧泳道。已知溶瘤腺病毒基因组大小约为23kb,而从微颗粒样本含有的DNA电泳条带与已知的溶瘤腺病毒基因组大小一致。同时,荧光显微镜观察结果见图2b,使用PKH67染色,MP组(细胞囊泡组)和OA-MP组(微颗粒组)都显示绿色;使用PE荧光标记的抗腺病毒抗体染色,MP组不显示红色,OA-MP组显示红色;两组染料染色图片重合后的图片,可以看出在OA-MP组,绿色和红色共定位,表明本发明的微颗粒中包裹了溶瘤腺病毒。
实施例3
在DMEM细胞培养液中培养A549人肺癌细胞,使细胞数量达到1×107;在培养液中加入1×107溶瘤腺病毒以感染人肺癌细胞;在37℃和5%氧含量条件下,培养被感染的肿瘤细胞,在施用溶瘤腺病毒后的第48小时,当肿瘤细胞出现缩小、变暗,将人肺癌细胞培养液的上清以1000g、5000g的离心力依次离心10分钟,去除细胞及碎片,取离心后的上清再进一步以10000g的离心力离心2小时,收集沉淀即获得源自凋亡A549人肺癌细胞的细胞囊泡包裹溶瘤腺病毒后形成的微颗粒。
将上述所制备的微颗粒使用1ml的0.9%(g/ml)的生理盐水进行重悬后涂片,在电子显微镜下观察微颗粒,以及对微颗粒粒径进行纳米粒度电位仪检测,结果同实施例1。采用荧光染色,结果也表明本实施例的微颗粒中包裹了溶瘤腺病毒。
实施例4
在DMEM细胞培养液中培养A549人肺癌细胞,使细胞数量达到1×107;在培养液中加入2×108溶瘤腺病毒以感染人肺癌细胞;在37℃和5%氧含量条件下,培养被感染的肿瘤细胞,在施用溶瘤腺病毒后的第48小时,当肿瘤细胞出现缩小、变暗,将人肺癌细胞培养液的上清以1000g、5000g的离心力依次离心10分钟,去除细胞及碎片,取离心后的上清再进一步以10000g的离心力离心2小时,收集沉淀即获得源自凋亡A549人肺癌细胞的细胞囊泡包裹溶瘤腺病毒后形成的微颗粒。
将上述所制备的微颗粒使用1ml的0.9%(g/ml)的生理盐水进行重悬后涂片,在电子显微镜下观察微颗粒,以及对微颗粒粒径进行纳米粒度电位仪检测,结果同实施例1。采用荧光染色,结果也表明本实施例的微颗粒中包裹了溶瘤腺病毒。
实施例5:包裹溶瘤腺病毒的微颗粒制剂在对肿瘤细胞的杀伤作用。
1、实验步骤
将制备的包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒分别与不同类型人肿瘤细胞系进行培养,包括A2780人卵巢癌细胞系、MCF-7人乳腺癌细胞系、A549人肺癌细胞系、SNU1人胃癌细胞系、Caco2人结肠癌细胞系、HepG2人肝癌细胞系、ASCP-1人胰腺癌细胞系、LINCap人前列腺癌细胞系等,作为包裹溶瘤腺病毒的微颗粒处理组。48小时后,观察细胞的死亡情况。采用生理盐水处理肿瘤细胞的组作为对照组,仅采用细胞囊泡处理肿瘤细胞的组作为仅施用细胞囊泡组。
包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒的制备:按照实施例1所述方法获得来自以上各种肿瘤细胞的微颗粒。利用实施例3-4方法获得来自以上各种肿瘤细胞的微颗粒也具有以下类似的肿瘤杀伤效果。
细胞囊泡的制备:培养肿瘤细胞,使用紫外线照射30分钟,在紫外线照射后的48小时,当肿瘤细胞出现明显变小、暗淡状态,对小鼠肝癌细胞的培养液的上清进行逐步离心,即以500g、1000g、5000g的离心力依次离心10分钟,之后以14000g的离心力离心1分钟,以除去细胞及碎片,取离心后的上清进一步以14000g的离心力离心1小时,收集沉淀即为细胞囊泡。
2、实验结果
肿瘤细胞经过上述处理,48小时后,在倒置相差显微镜下观察各组细胞:对照组和仅施用细胞囊泡组(MP)组细胞呈现贴壁生长状态;而包裹溶瘤腺病毒的微颗粒处理组(OA-MP)细胞则脱离贴壁,呈现死亡状态(见图3),表明包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒对肿瘤细胞具有杀伤作用。
实施例6:包裹溶瘤腺病毒的微颗粒对机体不产生毒副作用
1、实验步骤
将磷酸盐缓冲溶液(PBS)、细胞囊泡(MP)、溶瘤腺病毒(OA)、包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒(OA-MP)尾静脉注射小鼠,一天一次共5次,第6天处死小鼠,检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和肌酐(CRE)含量。本实施例中使用的微颗粒、细胞囊泡同实施例2。使用实施例3-4的微颗粒也不对机体产生毒副作用。
2、实验结果
由图4a和图4b可以看出,相比于注射PBS或单纯细胞囊泡对照组小鼠,注射细胞囊泡包裹溶瘤腺病毒形成的微颗粒的实验组小鼠,谷丙转氨酶和肌酐含量没有明显变化。
实施例7:包裹溶瘤腺病毒的微颗粒抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠的存活时间
1、实验步骤
1×106A549人肺癌细胞皮下接种裸鼠。5天后,细胞囊泡(MP)、溶瘤腺病毒(OA)、包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒(OA-MP)直接注射入肿瘤接种部位,3天注射一次,共5次,观察皮下肿瘤生长情况。每次注射的细胞囊泡、微颗粒的数量相同为2×106,腺病毒的量为2×106。
5×106A549人肺癌细胞腹腔接种裸鼠。3天后,PBS溶液、单独溶瘤腺病毒(OA)、单独细胞囊泡(MP)、包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒(OA-MP)分别直接给予腹腔注射,3天注射一次,共5次,观察小鼠存活时间。每次注射的细胞囊泡、微颗粒的数量相同为3×106,腺病毒的量为3×106。
5×106A2780人卵巢癌细胞腹腔接种裸鼠。3天后,细胞囊泡(MP)、溶瘤腺病毒(OA)、包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒(OA-MP)分别给予腹腔注射,2天注射一次,共7次,观察小鼠腹腔肿瘤生长情况。每次注射的细胞囊泡、微颗粒的数量相同为3×106,腺病毒的量为3×106。
本实施例中制备微颗粒、细胞囊泡的方法同实施例2。使用实施例3-4的制备方法也能获得以下类似的效果。
2、实验结果
裸鼠皮下接种A549肿瘤细胞,第5天开始长出肿瘤结节,但经过包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒治疗后,其肿瘤生长明显受抑制,肿瘤体积显著小于其它对照组别(图5a显示了第5天和第21天的肿瘤体积大小、图5b显示了不同时间点检测肿瘤体积大小),即相比于仅施用溶瘤腺病毒的组,以及单独施用细胞囊泡的组,包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒组能够显著抑制裸鼠皮下A549肿瘤的生长。
裸鼠腹腔接种A549肿瘤细胞后,包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒治疗显著延长荷瘤小鼠的生存期,与单独溶瘤腺病毒组相比,p<0.05(图5c显示了经磷酸盐缓冲溶液(PBS),细胞囊泡(MP)、溶瘤腺病毒(OA)、包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒(OA-MP)处理小鼠后荷瘤小鼠的存活率),即相比于仅施用溶瘤腺病毒的组,以及单独施用细胞囊泡的组,包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒组能够明显延长荷瘤小鼠的生存期。
裸鼠腹腔接种A2780肿瘤细胞后,分别给予磷酸盐缓冲溶液(PBS)、单独细胞囊泡(MP)、单独溶瘤腺病毒(OA)、包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒(OA-MP)等不同治疗,30天后,对肿瘤大小和重量进行检测,结果如图5d所示,即相比于仅施用溶瘤腺病毒的组,以及单独施用细胞囊泡的组,包裹了溶瘤腺病毒的微颗粒组治疗能够显著抑制卵巢癌肿瘤的生长。并且与单独溶瘤腺病毒组相比,p<0.05(见图5d)。
Claims (10)
1.一种溶瘤病毒制剂的制备方法,包括使溶瘤病毒与肿瘤细胞以1:1至20:1比例混合以感染肿瘤细胞,在37℃和5%氧含量条件下,培养被感染的肿瘤细胞并使之凋亡,在48-72小时的时间内,收集凋亡肿瘤细胞释放的微颗粒,所述微颗粒即为细胞囊泡包裹溶瘤病毒后形成的所述溶瘤病毒制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法,所述肿瘤细胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌或前列腺癌。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其中,所述收集凋亡肿瘤细胞所释放的微颗粒的方法为通过离心机,以1000-50000g的离心力,收集微颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其中,所述收集凋亡肿瘤细胞所释放的微颗粒的方法为通过离心机,以不大于5000g的离心力去除肿瘤细胞及其碎片,以10000g-50000g的离心力收集所述微颗粒。
5.一种溶瘤病毒制剂,包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的溶瘤病毒,所述溶瘤病毒制剂根据权利要求1-4任一项所述方法制成。
6.根据权利要求5所述的溶瘤病毒制剂,由所述细胞囊泡包裹所述溶瘤病毒所形成的溶瘤病毒制剂的粒度为100~1000纳米。
7.根据权利要求5所述的溶瘤病毒制剂,所述肿瘤细胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌或前列腺癌。
8.根据权利要求5所述的溶瘤病毒制剂,所述溶瘤病毒制剂包括注射制剂。
9.根据权利要求5或8所述的溶瘤病毒制剂,所述溶瘤病毒制剂为单位制剂。
10.根据权利要求9所述的溶瘤病毒制剂,所述单位制剂中含有1×107到1×108所述微颗粒。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510289636.7A CN104958324A (zh) | 2015-05-29 | 2015-05-29 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
PCT/CN2016/077927 WO2016192451A1 (zh) | 2015-05-29 | 2016-03-30 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
EP16802374.5A EP3305310B1 (en) | 2015-05-29 | 2016-03-30 | Oncolytic virus formulation and preparation method thereof |
JP2018513707A JP6577139B2 (ja) | 2015-05-29 | 2016-03-30 | 腫瘍溶解性ウイルス製剤及びその調製方法 |
DK16802374.5T DK3305310T3 (da) | 2015-05-29 | 2016-03-30 | Onkolytisk virusformulering og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
US15/825,065 US10548853B2 (en) | 2015-05-29 | 2017-11-28 | Oncolytic virus formulation and preparation method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510289636.7A CN104958324A (zh) | 2015-05-29 | 2015-05-29 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104958324A true CN104958324A (zh) | 2015-10-07 |
Family
ID=54212530
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510289636.7A Pending CN104958324A (zh) | 2015-05-29 | 2015-05-29 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10548853B2 (zh) |
EP (1) | EP3305310B1 (zh) |
JP (1) | JP6577139B2 (zh) |
CN (1) | CN104958324A (zh) |
DK (1) | DK3305310T3 (zh) |
WO (1) | WO2016192451A1 (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016192451A1 (zh) * | 2015-05-29 | 2016-12-08 | 湖北盛齐安生物科技有限公司 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
CN106591361A (zh) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | 钱文斌 | 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用 |
WO2018130108A1 (zh) * | 2017-01-12 | 2018-07-19 | 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 | 一种口服肿瘤疫苗及其用途 |
CN109288875A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-02-01 | 厦门大学 | 一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
CN110433287A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-11-12 | 南方医科大学 | 用于防治肿瘤的病毒-载体复合物及其制备方法和应用 |
CN112870165A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-06-01 | 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 | 一种提高囊泡载药量的方法和应用 |
CN112941039A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-06-11 | 南京大学 | 一种新型类囊泡溶瘤病毒及其在制备抗肿瘤药物上的应用 |
CN113832111A (zh) * | 2020-06-23 | 2021-12-24 | 南京大学 | 一种类外泌体技术用于制备新型溶瘤病毒的方法 |
CN113832114A (zh) * | 2020-06-23 | 2021-12-24 | 南京大学 | 一种新型溶瘤腺病毒EM/VSV-G Ad5-P及其在制备抗肿瘤药物中的应用 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102581296B1 (ko) * | 2017-04-21 | 2023-09-22 | 코스타 쎄라퓨틱스 인크. | 막 지질 코팅된 나노입자 및 사용 방법 |
US11471420B2 (en) * | 2017-04-21 | 2022-10-18 | Coastar Therapeutics Inc. | Membrane lipid coated nanoparticles and method of use |
CN115478053A (zh) * | 2022-09-15 | 2022-12-16 | 吉林大学 | 神经干细胞源“溶瘤”外泌体及其用途 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999045783A1 (en) * | 1998-03-12 | 1999-09-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Producer cells for replication selective viruses in the treatment of malignancy |
CN102302784A (zh) * | 2011-08-22 | 2012-01-04 | 湖北盛齐安生物科技有限公司 | 一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法 |
CN103260650A (zh) * | 2010-10-20 | 2013-08-21 | 西奈山医学院 | 使用髓源抑制细胞治疗肿瘤的方法和组合物 |
CN104822626A (zh) * | 2012-09-28 | 2015-08-05 | 加州大学董事会 | 用于超声显像/治疗的可降解二氧化硅纳米壳 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2689707A1 (en) * | 2009-11-16 | 2011-05-16 | Jean-Simon Diallo | Identification of the novel small molecule viral sensitizer vse1 using high-throughput screening |
US10188733B2 (en) * | 2010-10-22 | 2019-01-29 | President And Fellows Of Harvard College | Vaccines comprising bisphosphonate and methods of use thereof |
CA2902650A1 (en) * | 2013-02-28 | 2014-09-04 | Psioxus Therapeutics Limited | A process for the production of adenovirus |
CN104958324A (zh) * | 2015-05-29 | 2015-10-07 | 黄波 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
-
2015
- 2015-05-29 CN CN201510289636.7A patent/CN104958324A/zh active Pending
-
2016
- 2016-03-30 EP EP16802374.5A patent/EP3305310B1/en active Active
- 2016-03-30 DK DK16802374.5T patent/DK3305310T3/da active
- 2016-03-30 JP JP2018513707A patent/JP6577139B2/ja active Active
- 2016-03-30 WO PCT/CN2016/077927 patent/WO2016192451A1/zh active Application Filing
-
2017
- 2017-11-28 US US15/825,065 patent/US10548853B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999045783A1 (en) * | 1998-03-12 | 1999-09-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Producer cells for replication selective viruses in the treatment of malignancy |
CN103260650A (zh) * | 2010-10-20 | 2013-08-21 | 西奈山医学院 | 使用髓源抑制细胞治疗肿瘤的方法和组合物 |
CN102302784A (zh) * | 2011-08-22 | 2012-01-04 | 湖北盛齐安生物科技有限公司 | 一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法 |
CN104822626A (zh) * | 2012-09-28 | 2015-08-05 | 加州大学董事会 | 用于超声显像/治疗的可降解二氧化硅纳米壳 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
徐尊佑等: "细胞荷载溶瘤病毒", 《国际肿瘤学杂志》 * |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10548853B2 (en) | 2015-05-29 | 2020-02-04 | Hubei Soundny Biotechnology Co., Ltd. | Oncolytic virus formulation and preparation method thereof |
WO2016192451A1 (zh) * | 2015-05-29 | 2016-12-08 | 湖北盛齐安生物科技有限公司 | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
CN106591361A (zh) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | 钱文斌 | 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用 |
WO2018130108A1 (zh) * | 2017-01-12 | 2018-07-19 | 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 | 一种口服肿瘤疫苗及其用途 |
CN109288875B (zh) * | 2018-09-04 | 2020-09-01 | 厦门宏谱福生物科技有限公司 | 一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
CN109288875A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-02-01 | 厦门大学 | 一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法 |
CN110433287A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-11-12 | 南方医科大学 | 用于防治肿瘤的病毒-载体复合物及其制备方法和应用 |
CN110433287B (zh) * | 2019-08-15 | 2020-12-08 | 南方医科大学 | 用于防治肿瘤的病毒-载体复合物及其制备方法和应用 |
CN113832111A (zh) * | 2020-06-23 | 2021-12-24 | 南京大学 | 一种类外泌体技术用于制备新型溶瘤病毒的方法 |
CN113832114A (zh) * | 2020-06-23 | 2021-12-24 | 南京大学 | 一种新型溶瘤腺病毒EM/VSV-G Ad5-P及其在制备抗肿瘤药物中的应用 |
CN112870165A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-06-01 | 湖北盛齐安生物科技股份有限公司 | 一种提高囊泡载药量的方法和应用 |
CN112941039A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-06-11 | 南京大学 | 一种新型类囊泡溶瘤病毒及其在制备抗肿瘤药物上的应用 |
WO2022160475A1 (zh) * | 2021-02-01 | 2022-08-04 | 南京大学 | 一种新型类囊泡溶瘤病毒及其在制备抗肿瘤药物上的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20180078508A1 (en) | 2018-03-22 |
JP2018516980A (ja) | 2018-06-28 |
EP3305310A4 (en) | 2019-01-09 |
EP3305310A1 (en) | 2018-04-11 |
JP6577139B2 (ja) | 2019-09-18 |
DK3305310T3 (da) | 2020-11-23 |
WO2016192451A1 (zh) | 2016-12-08 |
EP3305310B1 (en) | 2020-09-02 |
US10548853B2 (en) | 2020-02-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104958324A (zh) | 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法 | |
US9351931B2 (en) | Pharmaceutical preparation for tumor chemotherapy and method for producing the same | |
CN109837306A (zh) | 包载miRNA-204-5p的外泌体及其制备方法和应用 | |
CN108042805A (zh) | 一种肿瘤载药微颗粒制剂及其制备方法 | |
CN108330108A (zh) | 鸭腺病毒3型灭活疫苗ch-gd-12-2014株 | |
CN109620956A (zh) | 一种智能巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统及其制备方法和应用 | |
CN102796709A (zh) | 肝癌特异性基因-病毒及其应用 | |
CN107875124A (zh) | 一种从细胞悬液中提取和纯化包裹药物的细胞囊泡的方法 | |
CN110016465A (zh) | 一种包含b细胞及肿瘤双识别性t细胞的免疫细胞药物 | |
Rupar et al. | Human Papillomavirus and the use of nanoparticles for immunotherapy in HPV-related cancer: A review | |
CN104873560B (zh) | 一种大蓟总黄酮及其制备方法与在制备抗肿瘤或护肝药物中的应用 | |
CN117064931A (zh) | 金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备抗流感病毒药物中的应用 | |
CN106591361A (zh) | 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用 | |
CN105535273A (zh) | 裸花紫珠颗粒在抗肠病毒方面的应用 | |
CN101906423A (zh) | 基于昆虫杆状病毒表达系统的重组人神经生长因子的制备方法 | |
CN108588034A (zh) | 一种变异的兔病毒性出血症病毒及其在制备灭活疫苗中的应用 | |
CN105521482B (zh) | 联合应用HNF1α、HNF4α、FOXA3诱导分化治疗肝细胞癌 | |
CN114668742A (zh) | 仿细菌纳米药物递送系统及其制备方法和应用 | |
CN107050053A (zh) | 一种由川芎醇提物制备的含药血清及其制备方法和应用 | |
CN108753715A (zh) | 一种具有肿瘤治疗功能的免疫细胞及其应用 | |
CN106902098A (zh) | 一种抗肿瘤植入膜及其制备方法 | |
CN107028887A (zh) | 脂质体用于治疗慢性乙型病毒性肝炎的用途 | |
CN106727702A (zh) | 一种由脏毒清制备的含药血清及其制备方法和应用 | |
CN106822862A (zh) | 一种多肽修饰纳米粒子在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用 | |
CN116870190A (zh) | 一种穿透血脑屏障的核酸递送系统及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160628 Address after: 13, building 430032, block C, new world center, 634 Jiefang Avenue, Hankou, Hubei, Wuhan Applicant after: Hubei Soundny Biological Technology Co., Ltd. Address before: 13, building 430032, block C, new world center, 634 Jiefang Avenue, Hankou, Hubei, Wuhan Applicant before: Huang Bo |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151007 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |