KR102581296B1

KR102581296B1 - 막 지질 코팅된 나노입자 및 사용 방법

Info

Publication number: KR102581296B1
Application number: KR1020197034265A
Authority: KR
Inventors: 에디 요콘 청
Original assignee: 코스타 쎄라퓨틱스 인크.
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-21
Publication date: 2023-09-22
Also published as: US11413252B2; CN110621306A; KR20190137906A; EP3612169A4; EP3612169A1; JP7329839B2; US20200060979A1; WO2018195526A1; JP2020519241A

Abstract

바이러스를 포함하는 내부 코어; 및 세포로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 포함하는 나노입자, 및 그의 제조방법이 개시되어 있다. 상기 바이러스는 종양용해성 바이러스이고, 상기 세포막은, 예를 들어, 적혈구로부터 유래된다.

Description

막 지질 코팅된 나노입자 및 사용 방법

교차 참조

본 출원은 2017년 4월 21일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/488,685호의 이점을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로 원용된다.

종양용해성 바이러스(oncolytic virus, OV)는 암세포를 우선적으로 감염시키고 죽이는 바이러스이다. 이러한 바이러스는 성장하여 암세포의 용해(종양용해)를 유발하거나 다른 메커니즘을 작동시켜 암-면역억제성 미세환경을 방해하고 인체의 면역 반응을 촉발시켜 암세포를 제거한다. 최근 성공적인 임상 데이터와 약물 허가로 인해 종양용해성 바이로테라피(virotherapy)에 대한 대중의 관심이 높아졌다. 종양용해성 바이로테라피의 사용은 기타 약물, 면역 관문 억제제(immune check point inhibitor) 및 T-세포 치료법과 조합되어 암 환자에 대한 결과를 향상시킬 수 있다.

OV의 전달 경로는 종양내(i.t.) 주입, 정맥내(i.v.) 전달, 및 복강내 전달을 포함하고, 이 중에서 종양내 주입이 가장 많이 사용된다.

발명의 요약

본 발명에 따르면, 본 발명은 바이러스 등을 포함하는 내부 코어와 세포로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 비-염 수용액 중에서 합치는 단계; 상기 용액에 초음파처리를 적용하여, 상기 외부 표면으로 코팅된 상기 내부 코어를 포함하는 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 바이러스를 포함하는 내부 코어; 및 세포로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 포함하는 나노입자를 제공한다.

인용된 참조

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 마치 각각의 간행물, 특허 또는 특허출원이 하나 하나 구체적이고 개별적으로 참조로서 포함된 정도로 본원에서 참조로서 원용된다.

본 발명의 새로운 특징은 첨부된 청구범위에 상세하게 설명한다. 본 발명의 특징과 장점은, 본 발명의 원리를 이용하는 예시적인 실시양태들을 설명하고 있는 하기 상세한 설명과 하기 첨부된 도면을 참고하면 더욱 잘 이해할 수 있다:
도 1은 4분, 6분, 8분이란 각각의 다양한 초음파처리 시간을 적용하여 제조된 다양한 샘플 배치(batch)와 처리하지 않는 바이러스('미처리 바이러스')를 바이러스 검출 분석한 것의 예시적인 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 나노입자 제조 방법 중에 다양한 용액에서 RBC 막을 바이러스 코어와 합쳐서 제조한 다양한 샘플 배치를 바이러스 검출 분석한 것의 예시적인 결과를 나타낸다. 4개의 샘플 배치(식염수 용액, 수크로스, 덱스트로스, 및 라이신-덱스트로스 용액 각각에서 RBC 막을 바이러스 저장액과 합침)와 한 개의 대조군 배치(미처리 바이러스)가 있다.
도 3은 미처리 바이러스와 코팅된 바이러스의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 4는 동적 광산란으로 측정한 미처리 바이러스와 코팅된 바이러스의 크기를 나타낸다.
도 5는 바이러스가 코팅되어 결과적으로 450 nm에서 매우 낮은 흡광도를 나타내는 경우와 훨씬 높은 흡광도를 나타내는 미처리 바이러스 중 하나를 비교하는, 예시적인 바이러스 검출 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 코팅된 바이러스 나노입자가 코팅 제거과정을 거친 후 미처리 바이러스가 된 것을 코팅된 바이러스와 비교하는 팔로우 업(follow up) 바이러스 검출 분석을 제공한다.

현재, 대부분의 종양용해성 바이러스 치료법은 특정 부분의 국소 주입(예컨대, 종양내)에 제한되어 있고, 1회 주입으로 충분히 치료 효과를 달성할 수 있을지는 여전히 연구중이다. 또한, 몇몇 OV는 급성의 일시적인 독성 프로파일을 갖는 것으로 나타났고, 따라서 이러한 바이러스를 주입하면 종양 세포보다도 그 바이러스에 대해 경쟁적인 면역 반응이 유도될 수 있다. 또한, OV 정맥내 전달은 OV가 혈류로부터 신속하게 없어지므로 빈번한 투약 또는 고용량 투약이 요구되고, 그 결과 치료 비용이 높아지고 잠재적 안전성 이슈를 가져 온다고 하는 문제가 있다. 따라서, 투여될 수 있는 OV를 포함하는 조성물을 제공하고, 궁극적으로 표적 세포까지 치료제가 전달될 수 있도록 긴 기간 동안 순환 상태를 유지할 필요가 있다.

나노입자 상에 스텔스 잔기(stealth moiety)를 달성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하는 것은 당해 기술분야에 알려져 있다. 그러나, 항-PEG 면역 반응이 촉발될 수 있고 따라서 이러한 접근에는 문제가 있다. 양쪽이온성 물질[예를 들어, 폴리(카복시베타인) 및 폴리(설포베타인)]의 사용과 같은 대안적인 접근법이 제안되어 왔다.

근래에, 막 지질 및 관련 막 단백질 모두를 포함한 천연 적혈구막을 사용한 코팅에 의해 기능성 나노입자를 제공하기 위한 톱-다운 생체모방 접근법(top-down biomimetic approach)이 실현되었고, 따라서 장시간 순환형 적재물 전달이 이루어졌다(C-M. J. Hu et al., "Erythrocyte membrane-camouflaged polymeric nanoparticles as a biomimetic delivery platform," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, July 5; 108(27): 10980-10985 참조). 특히, 혈액 세포(예를 들어, 적혈구(RBC), 백혈구(WBC), 또는 혈소판)로부터 유래된 막지질은 종양용해성 바이러스가 아닌 다양한 물질 등을 코팅하는 데 있어서 특별한 관심대상이다.

RBC 코팅된 종양용해성 바이러스를 갖는 나노입자를 제조하려는 다양한 시도가 있었으나 공지된 방법에 따라서는 성공적이지 못했다. 종양용해성 바이러스 등이 RBC 막으로 코팅된 적은 처음이다. 본 발명의 실시에 따라, 놀랍게도 본원에 개시된 본 발명 나노입자를 제조하기 위해서는 특정 조건이 사용되어야 한다는 사실을 발견하였다.

본원에서 언급되는 용어 "종양용해성 바이러스"는 비제한적인 예로서 헤르페스바이러스; 백시니아 바이러스; 레오바이러스; 아데노바이러스; 홍역 바이러스, 파보바이러스 또는 이들의 조합을 포함한다.

바이러스가 자살 유전자, 즉 별도로 투여된 무독성 전구 약물(pro-drug)을 강력한 세포독소로 대사시킬 수 있는 암호화 효소(이는 널리 퍼져서 이웃하는 세포들을 죽인다)의 전달을 위한 벡터로서 사용될 수 있다는 점은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 치료제는 또한 그러한 벡터, 자살 유전자 또는 암호화 효소를 포함한다.

본 발명에 따라, 바이러스(치료제)를 포함하는 내부 코어와 세포로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 비-염 수용액 중에서 합치는 단계; 상기 용액에 초음파처리를 적용하여, 상기 외부 표면으로 코팅된 상기 내부 코어를 포함하는 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 나노입자를 제조하는 방법이 놀랍게도 발견되었다. 식염수 및 PBS 용액과 같은 염 용액이 내부 코어의 세포막 코팅 과정에 필요한 공지 방법과 대조적으로, 종양용해성 바이러스와 같은 바이러스 코팅에는 비-염 수용액(예컨대, 당(sugar) 함유 용액) 등 (예컨대, 수용액에서 당과 유사한 성질을 갖는 구성성분)이 필요하다. 처음으로, 바이러스를 포함하는 내부 코어 및 세포로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 포함하는 나노입자가 본 발명의 실시에 따라 제조되었다. 놀랍게도, 바이러스 등의 코어를 포함하는 나노입자를 제조하는 방법에 5 내지 15%, 7 내지 14%, 9 내지 11%의 비-염 수용액(예컨대, 당 함유 용액)이 사용되어야 한다는 것이 밝혀졌다. 몇 가지 실시양태에서, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% 또는 15%의 비-염 수용액(예컨대, 당 함유 용액)이 바이러스 등의 코어를 포함하는 나노입자의 제조방법에 필요하다.

몇몇 실시양태에서, 바이러스를 포함하는 내부 코어; 및 세포로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 포함하는 나노입자가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 종양용해성 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 상기 종양용해성 바이러스는 헤르페스바이러스; 백시니아 바이러스; 레오바이러스; 아데노바이러스; 홍역 바이러스, 파보바이러스 또는 이들의 조합이다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 아데노바이러스이다.

몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 혈액 세포, 지방 세포, 줄기 세포, 내피 세포, 엑소좀, 분비 소포 또는 시냅스 소포이다. 특정 실시양태에서, 상기 혈액 세포는 적혈구, 백혈구, 또는 혈소판이다. 특정 실시양태에서, 상기 혈액 세포는 적혈구이다.

몇몇 실시양태에서, 바이러스를 포함하는 내부 코어와 세포로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 비-염 수용액 중에서 합치는 단계; 상기 용액에 초음파처리를 적용하여, 상기 외부 표면으로 코팅된 상기 내부 코어를 포함하는 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 나노입자를 제조하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 비-염 수용액은 당 등(예컨대, 수용액에서 당과 유사한 성질을 갖는 구성성분)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 비-염 수용액은 당 용액이다. 특정 실시양태에서, 상기 당 용액은 수크로스 또는 덱스트로스 함유 용액이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 바이러스는 종양용해성 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 상기 종양용해성 바이러스는 헤르페스바이러스; 백시니아 바이러스; 레오바이러스; 아데노바이러스; 홍역 바이러스, 파보바이러스 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 혈액 세포, 지방 세포, 줄기 세포, 내피 세포, 엑소좀, 분비 소포 또는 시냅스 소포이다. 특정 실시양태에서, 상기 혈액 세포는 적혈구, 백혈구, 또는 혈소판이다. 특정 실시양태에서, 상기 혈액 세포는 적혈구이다.

본 발명은 종양용해성 바이러스와 같은 치료제를 전달하기 위한, 세포막 유래된 나노입자를 제공한다. 상기 치료제는 필수적으로 종양용해성 바이러스와 같은 치료제를 세포막 지질로 코팅하여 감추어진다.

몇몇 실시양태에서, 종양용해성 바이러스와 같은 치료제를 대상체(예를 들어, 환자)의 혈류 안의 순환계와 맞는 지질로 코팅한다. 이렇게 하여 치료제가 EPR(enhanced permeability and retention: 증진된 투과 및 유지) 효과를 통해 종양 혈관계까지 전달될 수 있고, 여기서 특정 분자들은 정상 조직에서보다 종양 조직에서 더 많이 축적되는 경향이 있다. 이러한 EPR 효과는 통상적으로 나노입자와 리포솜의 암 조직까지의 전달을 설명하는 데 이용된다. 많은 예들 중 하나는 금 나노입자를 사용하는 열 절제(thermal ablation) 관련 연구이다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 나노입자는 종양의 혈관계 근처에 축적될 것이고, 치료제(예를 들어, OV)가 암세포와 접촉하게 될 것이다. 이어서, OV는 암세포를 감염시키게 되고 결과적으로 세포가 용해, 사멸 또는 제거된다.

몇몇 실시양태에서, 본원에서는 종양용해성 바이러스 등을 포함하는 내부 코어; 및 혈액 세포(예를 들어, 적혈구(RBC 또는 erythrocyte), 백혈구, 또는 혈소판), 지방 세포, 줄기 세포, 내피 세포 등과 같은 세포로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 포함하는 나노입자가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 세포막은 적혈구와 같은 혈액 세포로부터 유래된다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 나노입자를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 혈액 세포는 전혈로부터 또는 혈액 공급자로부터 입수한 처리된 적혈구로부터 정제될 수 있다. RBC는 사람 혈액에 풍부하고 개인 공여자로부터 채혈이 용이하기 때문에 막 소스로서 특히 유용하다. RBC는 내부 단백질이 고갈되어, 막 구성성분들이 본질적으로 무손상 상태로 남아 있는 적혈구 고스트(ghost) (또는 RBC 고스트) 형태로 제공될 수 있다. RBC 고스트를 사용하면 또한 코팅 과정 중에 방해가 될 수 있는 RBC 세포 단백질의 존재량이 감소된다. 몇몇 실시양태에서, RBC는 O형(-) 혈액 세포(즉, "보편공여자")이다. 이러한 막 소스를 나노입자의 제조시 사용하여 치료제(예를 들어, 0V)를 수 많은 대상체에게 전달할 수 있다. 특정 실시양태에서, 개별화된(personalized) 나노입자 배치를 위해, 동일한 환자로부터 유래된 세포막을 사용할 수 있다.

다른 플랫폼, 예를 들어 PEG 코팅 나노입자와 비교할 때, RBC 막 유래된 나노입자는 면역글로블린 수퍼패밀리에서 CD47, CD59(MAC-억제 단백질, 보체 세포 용해를 피함), CD55(DAF), CD35(CR1) 및 기타 요소와 같은 많은 표면 마커를 포함하여 자기 자신을 바디 클리어런스(body clearance)로부터 보호한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 코팅을 위해 사용한 세포막은 비-지질 구성성분, 예컨대 세포 표면 마커, MHC 분자 및 당단백질을 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포막은 PEG와 같은 친수성 구성성분을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 "세포막"이란 용어는 세포 또는 새로 생기는 바이러스 입자 안에서 또는 그 주변에서 구조체를 감싸거나 분리하는 생체막으로서, 선택적 장벽으로 작용하는 것을 말한다. 세포막은 선택적으로 이온과 유기 분자에 투과성이고 세포 안에 그리고 세포 밖으로 물질의 움직임을 조절한다. 세포막은 인지질 단층 또는 이중층, 및 선택적으로 관련된 단백질 및 탄수화물을 포함한다. 본원에 사용할 때, 세포막은 세포 또는 세포 소기관의 자연적으로 발생하는 생체막으로부터 입수한 막, 또는 그로부터 유래된 것을 말한다.

본원에서 사용할 때, 용어 "자연적으로 발생하는"이란 자연에 존재하는 것을 말한다.

본원에서 사용할 때, 용어 "그로부터 유래된"이란 천연 막의 임의의 후속적인 변형으로서, 예컨대 세포막의 단리, 막의 부분 또는 단편 생성, 세포 또는 세포 소기관으로부터 취한 막으로부터 또는 그 막으로, 지질, 단백질 또는 탄수화물과 같은 특정 구성성분을 제거 및/또는 첨가하는 것을 말한다. 막은 임의의 적절한 방법으로 자연적으로 발생하는 막으로부터 도출될 수 있다. 예를 들어, 막은 세포로부터 제조되거나 세포로부터 단리될 수 있고 그 제조된 또는 단리된 막은 다른 물질 또는 재료와 합쳐져서 파생된 막을 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 세포는 재조합 조작되어 "천연이 아닌" 또는 "천연" 물질을 생성하고 이러한 물질은 생체 내 막 안으로 혼입되고, 상기 세포로부터 세포 또는 바이러스막이 제조되거나 단리되어 파생된 막을 형성한다.

세포막은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포는 미세유동화기(microfluidizer; MF), 또는 물과 같은 저삼투압 용액을 사용한 후 식염수 또는 PBS로 한외여과(ultrafiltration) 또는 투석여과(diafiltration)을 사용하여 파괴될 수 있다. 어떤 경우에는, 더 높은 이온 세기를 갖는 용액이 돼지 간으로부터 혈액을 빼내기에 유용하며, 따라서 PBS 또는 NaCl 용액은 여과 과정을 통해 세포내 덩어리(mass)를 빼낼 수 있다. 혈액응고방지제, 예컨대 EDTA가 예를 들어 불순물을 제거하기 위한 투석여과 동안 사용될 수 있다. 어떤 실시양태에서는, 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration; TFF) 장치 또는 원심분리를 사용하여 막을 정제할 수 있다. 정제된 막 구성성분을 예를 들어 BCA 단백질 테스트에 의해 세포 단백질의 존재에 대해 시험할 수 있다. 바람직하게는, 대부분의 비-막 구성성분(non-membrane components)는 코팅 전에 제거된다.

많은 노력에도 불구하고, 미국 특허 출원 공개 US2013/0337066호에서의 절차와 같이 공지된 방법에 따르면, 종양용해성 바이러스와 같은 바이러스 또는 CRISPR, 즉 바이러스로부터 DNA 서열은 세포막(예를 들어, RBC 막)에 의해 코팅되거나 캡슐화될 수 없다고 밝혀져 있었다. 놀랍게도 세포막(예를 들어, RBC 고스트)은 특정 조건에서만 바이러스 등을 코팅하는 것으로 밝혀졌다. 본원에 개시된 나노입자를 제조하기 위한 방법은 (2) 수크로스 용액과 같은 비-염 용액에서 (1) RBC 고스트와 OV의 혼합물의 초음파처리를 필요로 한다.

본 발명의 실시에 따르면, 코팅에 적합한 바이러스는 종양용해성 바이러스 뿐만 아니라 암세포를 감염시킬 수 있는 기타 바이러스를 포함한다. 바이러스는 외피보유 형태(enveloped form) 또는 비-외피보유 형태(nonenveloped form)를 취할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스 벡터가 선호되는데 암세포를 감염시키고 복제할 수 있기 때문이다(복제 능력).

특정 약제학적 의학 용어

본원에 사용된 제제, 조성물 또는 성분과 관련하여 "허용가능한"이란 용어는 치료될 대상체의 일반 건강에 미치는 지속적인 악영향이 없음을 의미한다.

본원에서 사용된 "담체"란 용어는 화합물의 세포 또는 조직 안으로의 혼입을 촉진시키는, 비교적 무독성의 화학적 화합물 또는 제제를 말한다.

본원에서 사용된 "병용투여" 등의 용어는 선택된 치료제들을 한 명의 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 치료제들을 동일한 또는 상이한 투여 경로로 투여하거나, 또는 동시에 또는 서로 다른 때에 투여하는 것을 포함하고자 하는 것이다.

"희석제"란 용어는 전달 전에 관심 대상의 화합물을 희석시키기 위해 사용된 화학적 화합물을 말한다. 희석제는 또한 화합물을 안정화하기 위해 사용될 수 있는데, 이들은 더욱 안정한 환경을 제공할 수 있기 때문이다. 비제한적으로, 인산염 완충 식염수를 비롯한 완충 용액에 용해된 염(또한 pH 조절 또는 유지 기능을 제공할 수 있다)이 당해 기술분야에서 희석제로서 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "효과량" 또는 "치료 유효량"이란 용어는 치료될 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시키기에 충분한, 투여될 치료제 또는 화합물의 양을 말한다. 그 결과는 질병의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화이거나 또는 생체 시스템의 임의의 기타 바람직한 변화일 수 있다. 예를 들어, 치료용으로 "효과량"이란 질병 증상을 임상적으로 상당히 감소시키기 위해 요구되는, 본원에 개시된 화합물을 포함하는 조성물의 양이다. 임의의 개별적인 경우에 적절한 "효과"량은 용량 증가 연구와 같은 기술을 사용하여 결정할 수 있다.

본원에 사용된 "향상시키다" 또는 "향상시키는"이란 용어는 의도하는 효과의 효능이나 지속기간을 증가시키거나 연장시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 향상시키는 것과 관련하여, "향상시키는"이란 용어는 시스템에 미치는 다른 치료제의 효과를 효능 면에서나 지속기간 면에서 증가시키거나 연장시키는 능력을 말한다. 본원에서 사용된 "향상-효과량"이란 의도하는 시스템에서 또 다른 치료제의 효과를 향상시키기에 적당한 양을 말한다.

용어 "약제학적 조성물"이란 나노입자(즉, 본원에 개시된 나노입자)와 다른 화학적 구성성분, 예컨대 붕해제, 결합제, 윤활제, 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 및/또는 부형제의 혼합물을 말한다. 상기 약제학적 조성물은 그 화합물이 기관으로 투여되는 것을 촉진한다. 화합물을 투여하는 다수의 기술이 당해 기술분야에 존재하고, 비제한적으로 다음을 포함한다: 정맥내 투여, 경구 투여, 에어로졸 투여, 비경구 투여, 안 투여, 폐 투여, 및 국소 투여.

"대상체" 또는 "환자"라는 용어는 포유동물을 포함한다. 포유동물로는 비제한적으로 다음의 어떠한 포유동물류 구성원도 가능하다: 사람, 사람이 아닌, 침팬지, 및 기타 유인원 및 원숭이 종과 같은 영장류; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 가축; 토끼, 개 및 고양이와 같은 사육동물; 설치류, 예컨대 래트, 마우스 및 기니피그 등을 포함한 실험용 동물. 한 가지 실시양태에서, 포유동물은 사람이다.

본원에서 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질병 또는 질환 중 하나 이상의 증상을 완화하거나, 약화시키거나 개선하는 것, 추가적인 증상을 예방하는 것, 질병 또는 질환을 억제하는 것, 예를 들어 질병 또는 질환의 진행을 멈추는 것, 질병 또는 질환을 경감시키는 것, 질병 또는 질환의 퇴행을 야기하는 것, 질병 또는 질환으로 야기된 상태를 경감시키는 것, 또는 질병 또는 질환의 증상을 예방적으로 및/또는 치료적으로 멈추는 것을 포함한다.

본원에 개시된 다양한 실시양태 또는 선택사항은 모두 임의의 어떠한 변형으로도 결합될 수 있다. 다음 실시예는 본 발명을 설명할 목적일 뿐 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.

실시예

실시예 1: 세포막 제조를 위한 예시적인 제법

세포막 제법(예를 들어, RBC 고스트 제법)은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명의 나노입자 제조를 위한 예시적인 세포막을 제공하기 위해, 세포막, 즉 RBC 세포막을 제조하는 비-제한적인 실시예는 다음과 같다.

장비 및 재료 요건

절차:

1. 농축 적혈구 백을 -80℃ 냉장고에 넣고 밤새 냉동한다. 농축 적혈구를 다음 날 아침 4℃ 냉장고에서 해동한다.

2. 360 mL의 0.5 mM EDTA를 메디아병(media bottle)에 부어 넣고 밤새 냉장고에 보관한다.

3. pRBC로부터 40 mL 혈액을 메디아병에 가하고, 잘 섞어서 혼합한다. 냉장고 안에서 30분 동안 살살 혼합한다.

4. 400 mL 주사용 멸균수를 TFF(밀리포어 랩스케일 TFF 시스템) 공정 저장용기에 넣고 저장용기를 닫는다. TFF 시스템을 시작하고, 유속 조절 손잡이를 레벨 4까지 돌린다. 시스템을 5분 동안 다시 순환시키고 침투 라인(permeate line)을 통해 모든 물을 눌러서 필터를 미리 적신다(밀리포어 펠리콘 2 미니 TFF 필터, PXDVPPC50). 시스템을 중지한다.

5. 단계 3으로부터의 혼합물을 TFF 공정 저장용기 안에 부어 넣는다.

6. 혼합물을 100 mL까지 농축시킨다.

7. 400 mL PBS로 투석여과한다. 용액을 PBS에서 서서히 저장용기로 부어 넣고 저장용기에서 100 ± 50 mL로 유지한다.

8. 200 mL 0.5 mM EDTA로 투석여과한다. EDTA 용액을 저장용기 안으로 서서히 부어 넣고 용액을 저장용기 안에서 100 ± 50 mL로 유지한다.

9. 40 mL까지 최종 농축한다. 압력을 모니터링하고, 펌프 속도를 낮추어 압력을 < 40 psi로 유지한다.

10. 지질을 50 mL 원뿔 튜브 안으로 쏟아 내고 -80℃ 냉장고에서 추가의 분석을 위해 저장하여 세포막의 제조 및/또는 과정들을 확인한다.

실시예 2: 공지된 방법에 따라 바이러스 코어를 포함하는 나노입자를 상이한 초음파처리 시간 연구를 사용하여 제조하기 위한 시도의 실패

이 절차는 탐침 초음파처리를 사용하는 1 mL 코팅된 바이러스(10^10 VP/mL)에 대한 실험실 규모 공정을 설명한다. 본 방법에 사용된 부형제 세포막(예를 들어, 적혈구막)은 원료 물질로서 0.1 mL의 농축 적혈구와 등가이다. 다음은 공지된 방법에 따라 바이러스 코어를 포함하는 나노입자의 제조를 시도한 것을 상세히 설명한다.

미국 특허 출원 공개 US2013/0337066호에 기재된 공지된 방법에 따라 바이러스의 코어를 포함하는 나노입자를 제조하려는 처음 몇 가지 시도가 성공적이지 않았기 때문에, 대표적인 바이러스(사람 5형 아데노바이러스)의 코어를 포함하는 나노입자를 제조할 수 있다는 희망으로, 서로 다른 초음파처리 시간(4분, 6분, 및 8분)을 적용하여 에너지 조건을 알아보기로 결정하였다.

장비 및 재료: 다음은 1 mL 코팅된 바이러스를 합성하기 위해 사용된 장비 및 재료의 간략한 설명이다:

탐침 소니케이터(probe sonicator): 큐소니카(Qsonica) XL2000

원료 목록:

절차

1. 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에 식염수 800 μL를 가한다.

2. 200 μL의 RBC 막(1.5 mg/mL)을 상기 튜브 안에 가하고 잘 혼합한다. 이렇게 0.3 mg/mL 막의 공정 혼합물이 만들어진다.

3. 탐침 소니케이터의 전원을 키고 70% 에탄올로 상기 탐침을 닦아내고 탐침만 바이오후드(biohood) 안으로 옮긴다.

4. 소니케이터의 전원을 레벨 2까지 조절한다(출력 ~3W)

5. 차가운 물이 담긴 아이스박스를 준비하여 공정 온도를 < 4℃로 유지한다.

6. 10 μL 아데노바이러스 저장액(벡터 바이오랩스, Lot# 20170922)을 상기 공정 혼합물에 가한다.

7. 튜브를 아이스박스 안에 놓는다. 탐침을 튜브 안에 담근다. 탐침이 바닥에 닿지 않도록 한다.

8. 혼합물에 1초 초음파처리와 각각의 초음파처리 사이에 1초의 간격을 두는 방식으로 초음파처리를 수동으로 해준다. 이러한 단계를 4, 6 및 8분 유지하여 세 개의 샘플 배치를 만든다.

9. 미처리 바이러스의 경우, 단계 1 내지 8을 따르되, 다만 단계 2의 용액을 분자 등급수(molecular grade water)로 바꾼다.

10. 각 배치의 샌드위치 ELISA 데이타를 수득하기 위해 판매처의 절차(Virusys Corporation, AK290-2)에 따른다.

코팅된 바이러스 나노입자는 바이러스 검출 분석에 의해 확인되어야 했다. 상기 분석은 샘플로부터 항원을 포착하기 위해 단클론성 항-아데노바이러스 항체를 사용하는 이중 항체 (샌드위치) ELISA이다. 샘플 배양 후, 바이오티닐화 검출 항체를 부가하고 이러한 단계 후 HRP-스트렙타비딘을 부가한다. 헥손 항원의 존재는 HRP 기질을 부가한 후 정지 시약(stop reagent)을 부가하면 가시화 된다. 웰(well) 안에서 색상의 전개가 샘플에서 아데노바이러스 헥손 항원의 존재를 나타낸다. 정량화할 목적으로, 바이러시스(Virusys)는 별도의 검정 키트(AK291, Adenovirus Antigen Calibration Kit)를 제공하고 있으며, 이를 본 생성물과 함께 사용하여 정량화 측정을 위한 표준 곡선을 작성할 수 있다.

그 결과, 초음파처리 시간 4분을 적용하면 바이러스 검출 분석을 기준으로 더 낳은 결과를 제공하는 것으로 보인다(도 1 참조). 그러나, 모든 배치들과 대조군 샘플(즉, 미처리 바이러스 샘플) 사이에 시험 결과를 비교해 보면, 흡광도 차이는 바이러스의 성공적인 코팅을 보장하기에 충분히 크지 않다. 따라서, 다른 조건의 변화가 필요하다.

실시예 3: 공지된 방법에 따라 바이러스 코어를 포함하는 나노입자를 고전단 균일화기를 사용하여 제조하기 위한 시도의 실패

PBS 용액이 RBC 막과 바이러스 저장액의 혼합물에 대해 사용된 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 장비와 재료를 사용하였다. 상기 혼합물을 이어서 이하 상술하는 바와 같이 고전단 균일화기를 통과시켰다.

절차는:

1. 차가운 물을 LM10 고전단 균일화기(Microfluidics)의 냉각 박스 안으로 부어 넣는다. 압축된 공기를 상기 기기에 연결하고 공기압을 약 120psi로 조정한다.

2. 저장용기에 100 mL 탈이온수를 채우고 가공압력을 10K psi로 설정한다. 시스템을 탈이온수로 2회, PBS로 2회 세척한다.

3. 14 mL PBS를 1mL 세포 지질(1.5 mg/mL) 및 50 μL 아데노바이러스(10^12 VP/mL, 벡터 바이오랩스)와 혼합하고 그 혼합물을 저장용기 안으로 부어 넣는다.

4. 기기를 시작하고, 고전단 스트로크를 5회 반복한다.

5. 생성물 컨테이너로부터 샘플을 수집한다.

실험은 성공적이지 않았으며 바이러스 검출 분석을 사용하여도 바이러스가 검출되지 않았다. 바이러스는 장비에서 생성된 높은 전단력에 의해 파괴되었을 것이다. 따라서, 비-바이러스 물질을 포함하는 코어에 RBC 막을 성공적으로 적용하였음에도 불구하고, 본원에 개시된 대표적인 바이러스의 코어를 포함하는 성공적인 나노 입자를 야기하는 조건은 여전히 미지수이다.

실시예 4: 혼합 용액에 다양하게 변화를 주면서 바이러스 코어를 포함하는 나노입자를 제조하기 위한 시도

공지된 방법 및 과학적 원리에 기초하면, RBC 막 코팅 또는 캡슐화 공정에 식염수 또는 PBS 용액이 필요하며, 이는 이들 용액이 RBC 고스트를 제조하는데 사용되었기 때문이다. 알려진 절차와 반대로, 몇 가지 비-염 용액을 사용하여 "비-전통적인" 절차를 탐색하였다.

1. 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에 800 μL의 다양한 용액(예를 들어, 식염수, 수크로스, 덱스트로스, 라이신-덱스트로스)을 가한다.

3. 탐침 소니케이터의 전원을 켜고 70% 에탄올로 상기 탐침을 닦아내고 탐침만 바이오후드 안으로 옮긴다.

4. 소니케이터의 전원을 레벨 2까지 조절한다(출력 ~3W)

6. 10 μL 아데노바이러스 저장액(벡터 바이오랩스, Lot# 20170721.2)을 상기 공정 혼합물에 가한다.

8. 혼합물에 1초 초음파처리와 각각의 초음파처리 사이에 1초의 간격을 두는 방식으로 초음파처리를 수동으로 해준다. 이러한 단계를 4분 유지하여 다양한 배치를 생성한다.

9. 제조된 배치의 확인 및 비교를 위한 샌드위치 ELISA 데이타를 수득하기 위해 판매처의 절차(Virusys Corporation, AK290-2)에 따른다.

미국 특허 출원 공개 US2013/0337066호에 개시된 공지된 절차를 바탕으로, 식염수 또는 PBS가 나노입자를 제조하기 위해 사용되어야 한다. 그러나, 도 2에 명백히 나타낸 바와 같이, 식염수 배치는 ELISA 분석이 코팅되지 않은 바이러스(대조군)와 비교하여 거의 동일한 흡광도를 나타냈기 때문에, 캡슐화된(또는 코팅된) 나노입자의 매우 열등한 결과를 내었다. 반면, 놀랍게도 예기치 않게, 당 함유 용액 배치와 같은 비-염 용액 배치(예를 들어, 수크로스, 덱스트로스, 및 라이신-덱스트로스)는 훨씬 낮은 흡광도를 나타내었는데, 이는 바이러스 코어에 걸쳐 RBC 막의 코팅이 더 많고 양호하다는 것을 나타내는 것이다.

실시예 5: 예시적인 조건 하에 RBC-막의 종양용해성 바이러스 코팅

RBC 막과 바이러스 저장액의 혼합물에 대해 비-염 용액을 사용하여 예기치 않게 발견된 결과를 검증하기 위해, 아래 나타낸 예시적인 발명 절차를 사용하여 바이러스 코어를 포함하는 나노입자를 제조하였다.

장비와 재료는 11% 수크로스 용액이 RBC 막과 바이러스 저장액의 혼합물에 대해 사용된 것을 제외하고 실시예 2에 있는 것과 동일하다.

원료 목록:

완충액 및 용액 목록:

절차

1. 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에 800 μL의 11% 수크로스 용액을 가한다.

2. 200 μL의 RBC 막(1.5 mg/mL)을 상기 튜브 안에 가하고 잘 혼합한다. 이렇게 0.3 mg/mL 막으로 공정 혼합물이 만들어진다.

3. 탐침 소니케이터의 전원을 키고 70% 에탄올로 탐침을 닦아내고 탐침만 바이오후드 안으로 옮긴다.

4. 소니케이터의 전원을 레벨 2까지 조절한다(출력 ~3W)

6. 2.5 μL 대표적인 종양용해성 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 저장액(벡터 바이오랩스, Lot# 20170721.2))를 공정 혼합물에 가하고, 상기 혼합물의 약 9%의 수크로스 용액을 생성한다. 당해 기술분야의 숙련인이라면 5% 내지 15% 당 용액이 동일한 조건에서 효과가 있을 것으로 예상할 것이다.

8. 혼합물에 1초 초음파처리와 각각의 초음파처리 사이에 1초의 간격을 두는 방식으로 초음파처리를 수동으로 해준다. 이러한 단계를 4분 유지하여 바이러스의 코어를 포함하는 나노입자를 제조한다.

9. 미처리 바이러스의 경우, 단계 1 내지 9를 따르되, 다만 단계 2의 용액을 분자 등급수로 바꾼다.

생성된 코팅된 나노입자는 투과전자현미경(Transmission electron microscopy; TEM)에 의해 촬영하였다. 도 3은 미처리 바이러스와 RBC 막 코팅된 바이러스 사이에 이미지 비교를 나타낸다. 입자 크기 비교는 도 4에 나타내고, 이는 코팅 층이 약 10 nm임을 암시한다. TEM 이미지는 나노입자 크기가 110 nm 내지 120 nm(약 118 nm)임을 나타낸다.

도 5는 RBC 막 코팅된 바이러스는 검출 항체로부터 보호된 반면에 미처리 바이러스는 뚜렷하게 나타났음을 보여주고; 흡광도 차이는 매우 크며 이는 매우 양호한 RBC 막 코팅 결과임을 나타낸다. 다음, 코팅된 나노입자는 RBC 막을 제거하기 위한 방법을 거치고 이어서 동일한 ELISA 시험을 거쳐서 추가로 코팅 결과를 확인한다.

코팅 제거를 위해, 200 μL의 코팅된 바이러스를 50 μL의 샘플 제조 버퍼(Virusys Corporation, 계면활성제 함유)와 ELISA 진행 전에 혼합한다. 도 6은 RBC 막을 제거한 후 바이러스가 다시 검출되었고, 그것이 사전에 코팅된 바이러스임을 확인해 준다.

본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시 양태는 단지 예로서 제공되는 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 다수의 변형, 변경 및 치환이 이제 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 가능할 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이고 이들 청구범위의 범위 내의 방법 및 구조체, 및 그 등가물이 본 발명에 포함되도록 의도된다.

Claims

종양용해성 바이러스를 포함하는 내부 코어를 포함하고;
적혈구로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면으로 코팅된, 나노입자.
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제1항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 헤르페스바이러스; 백시니아 바이러스; 레오바이러스; 아데노바이러스; 홍역 바이러스, 파보바이러스 또는 이들의 조합인, 나노입자.
제3항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 아데노바이러스인, 나노입자.
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종양용해성 바이러스를 포함하는 내부 코어와 적혈구로부터 유래된 세포막을 포함하는 외부 표면을 당 수용액 중에서 합치는 단계; 상기 혼합물 용액에 초음파처리를 적용하여, 상기 외부 표면으로 코팅된 상기 내부 코어를 포함하는 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 나노입자를 제조하는 방법.
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제8항에 있어서, 상기 당 용액이 수크로스 또는 덱스트로스 함유 용액인, 방법.
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제8항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 헤르페스바이러스; 백시니아 바이러스; 레오바이러스; 아데노바이러스; 홍역 바이러스, 파보바이러스 또는 이들의 조합인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 아데노바이러스인, 방법.
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