JP7329839B2 - 膜脂質被覆されたナノ粒子および使用方法 - Google Patents
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Description
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも各々の個別の刊行物、特許または特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示されるかのような同じ程度、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用されるような、製剤、組成物、または成分に関する用語「許容可能な」とは、処置されている被験体の一般的な健康状態に対して持続的な有害効果がないことを意味する。
細胞膜調製(例えば、RBCゴースト調製)は、当該技術分野で知られている。ここで、本発明のナノ粒子調製のための例示的な細胞膜を提供するための、細胞膜を調製する非限定的な例であるRBC細胞膜は以下の通りである。
1.パックされた赤血球バッグを-80℃の冷蔵庫に入れ、一晩凍結させる。翌朝4℃の冷蔵庫でパックされた赤血球を解凍させる。
2.0.5mM EDTA 360mLを培地ボトルに注ぎ、冷蔵庫で一晩保存する。
3.pRBCから40mLの血液を培地ボトルに加え、振とうさせてよく混合する。冷蔵庫で30分間穏やかに混合する。
4.400mLのWFI水をTFF(Millipore社製のLabscale TFF System)プロセスリザーバーに入れ、リザーバーを閉じる。TFFシステムを起動し、流量ノブをレベル4に回す。このシステムを5分間再循環させ、すべての水を浸透ラインに押し込み、フィルター(Millipore社製の Pellicon 2 mini TFF filter、PXDVPPC50)を事前に湿らせる。システムを一時停止する。
5.ステップ3の混合物をTFFプロセスリザーバーに注ぐ。
6.この混合物を100mLに濃縮する。
7.400mL PBSを用いて透析濾過する。PBSをリザーバーにゆっくりと注ぎ、リザーバー内の溶液を100±50mLに保つ。
8.200mL 0.5mM EDTAにて透析濾過する。EDTA溶液をリザーバーにゆっくりと注ぎ、リザーバー内の溶液を100±50mLに保つ。
9.40mLまで最後の濃縮を行う。圧力を監視し、ポンプ速度を下げて圧力を40psi未満に保つ。
10.脂質を50mLコニカルチューブに送り出し、さらに分析するために-80℃の冷凍庫に保存し、細胞膜の調製および/またはプロセスを確認する。
この手順は、プローブ超音波処理を使用した、1mLの被覆したウイルス(10^10VP/mL)の実験室規模のプロセスについて説明している。このプロセスで使用される賦形剤の細胞膜(例えば、赤血球膜)は、原材料として0.1mLのパックされた赤血球と等価である。以下は、既知の方法に従ってウイルスコアを含むナノ粒子の調製を試みる詳細な説明である。
1.1.5mL微量遠心チューブに800uLの生理食塩水を加える。
2.200μLのRBC膜(1.5mg/mL)をこのチューブに加え、よく混合する。これにより、0.3mg/mL膜のプロセス混合物が作成される。
3.プローブ超音波発生装置の電源を入れ、70%エタノールでプローブを拭き、プローブのみをバイオフードに移動させる。
4.超音波破砕機の出力をレベル2に調整する(出力~3W)。
5.プロセス温度を4℃未満に保つために、冷水のアイスボックスを準備する。
6.10uLのアデノウイルス貯蔵溶液(Vector biolabs、Lot#20170922)をプロセス混合物に追加する。
7.チューブをアイスボックスに入れる。プローブをチューブに浸す。プローブが底に触れないようにする。
8.1秒の超音波処理および各超音波処理の間隔を1秒にして、混合物を手動で超音波処理する。このステップを4、6、および8分間維持して、3つのサンプルバッチを作成する。
9.裸のウイルスの場合は、ステップ1~8に従うが、2.で分子グレード水に溶液を変更する。
10.ベンダーの手順(Virusys Corporation、AK290-2)に従って、各バッチのサンドイッチELISAデータを取得する。
使用した装置および材料は、RBC膜とウイルス貯蔵溶液との混合物のためにPBS溶液を使用したことを除いて、実施例2と同じである。次に、以下に詳述するように、混合物を高せん断ホモジナイザープロセスにかけた。
1.LM10高せん断ホモジナイザー(Microfluidics)の冷却ボックスに冷水を注ぐ。圧縮空気を機械に接続し、空気圧を約120psiに調整する。
2.100mLの脱イオン水でリザーバーを満たし、処理圧力を10Kpsiに設定する。システムを脱イオン水で2回、PBSで2回洗浄する。
3.14mLのPBSと1mLの細胞脂質(1.5mg/mL)および50uLアデノウイルス(10^12vp/mL、Vector Biolabs社製)を混合し、混合物をリザーバーに注ぐ。
4.機械を始動し、高せん断ストロークを5回繰り返す。
5.製品コンテナからサンプルを収集する。
既知の方法と科学的原理に基づいて、RBCゴーストを調製するためにこれらの溶液が使用されたため、RBCの生理食塩水またはPBS溶液の膜での被覆またはカプセル化のプロセスが必要とされる。既知の手順とは異なり、「非伝統的な」手順を検討するために、いくつかの無塩溶液が使用された。
1.1.5mLの微量遠心チューブに800uLの様々な溶液(例えば、生理食塩水、スクロース、デキストロース、リジンデキストロース)を加える。
2.200μLのRBC膜(1.5mg / mL)をチューブに加え、よく混合する。これにより、0.3mg/mL膜を伴うプロセス混合物が作成される。
3.プローブ超音波発生装置の電源を入れ、70%エタノールでプローブを拭き、プローブのみをバイオフードに移動させる。
4.超音波破砕機の出力をレベル2に調整する(出力~3W)。
5.プロセス温度を4℃未満に保つために、冷水のアイスボックスを準備する。
6.10uLのアデノウイルス貯蔵溶液(Vector biolabs、Lot#20170922)をプロセス混合物に追加する。
7.チューブをアイスボックスに入れる。プローブをチューブに浸す。プローブが底に触れないようにする。
8.1秒の超音波処理および各超音波処理の間隔を1秒にして、混合物を手動で超音波処理する。このステップを4分間維持して、様々なバッチを作製する。
9.調製したバッチの確認および比較のために、ベンダーの手順(Virusys Corporation、AK290-2)に従って、サンドイッチELISAデータを取得する。
ウイルス貯蔵溶液とRBC膜の混合物に無塩溶液を使用して予想外に見つかった結果を確認するため、ウイルスコアを含むナノ粒子を調製するために以下に示す例示的な本発明の手順が使用された。
1.1.5mL微量遠心チューブに800uLの11%スクロース溶液を加える。
2.200μLのRBC膜(1.5mg/mL)をチューブに加え、よく混合する。これにより、0.3mg/mL膜を伴うプロセス混合物ができる。
3.プローブ超音波発生装置の電源を入れ、70%エタノールでプローブを拭き、プローブのみをバイオフードに移動させる。
4.超音波破砕機の出力をレベル2に調整する(出力~3W)。
5.プロセス温度を4℃未満に保つために、冷水のアイスボックスを準備する。
6.2.5μLの例示的な腫瘍溶解性ウイルス(例えば、アデノウイルス貯蔵溶液(Vector biolabs、Lot#20170721.2))を処理混合物に加え、混合物の約9%のスクロース溶液を結果としてもたらす。5%から15%の糖溶液が同様の条件で機能することが当業者によって予想される。
7.チューブをアイスボックスに入れる。プローブをチューブに浸す。プローブが底に触れないようにする。
8.1秒の超音波処理および各超音波処理の間隔を1秒にして、混合物を手動で超音波処理する。このステップを4分間維持して、ウイルスのコアを含むナノ粒子を調製する。
9.裸のウイルスの場合には、手順1~9に従うが、2.で溶液を分子グレード水に変更する。
Claims (4)
- 細胞膜を含む外部表面で被覆された単一のウイルスを含む内部コアを有するナノ粒子であって、ここで、細胞膜は、血球に由来し、細胞の内部タンパク質は枯渇されている、ナノ粒子。
- 前記ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記腫瘍溶解性ウイルスがヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、またはそれらの組み合わせである、請求項2に記載のナノ粒子。
- 前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項1に記載のナノ粒子。
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