JP2006517972A5

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Publication number: JP2006517972A5
Application number: JP2006503562A
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Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2024-02-13

Description

（背景技術）
生物活性物質、例えば治療薬、ワクチン免疫原および栄養物質は純粋な形態で投与できない場合が多いが、生物活性物質の溶解度を増強し、望ましくない副作用を最低限にしながら最適な利益的作用を達成するために適当な形態にそれをパッケージする生体適合性の処方に配合されなければならない。生物活性剤の効率的な送達は身体内における薬剤の短いクリアランス時間、作用部位へのターゲティングが不十分であること、または、生物活性剤そのものの性質、例えば水性媒体中の低い溶解度または疎水性により、遮蔽されてしまう場合が多い。即ち、多くの処方手法、例えば、制御放出処方、乳液およびリポソーム処方が、送達を改善するために開発されている。

リポソームの医薬品送達システムが報告されている。リポソームは捕獲された水性の内容物を含有する完全に閉鎖された球状の脂質２層膜である。脂質２層は疎水性のテール領域および親水性のヘッド領域を有する脂質よりなる２つの脂質単層を含む。膜２層の構造は、共にリポソームの外部および内部において、脂質分子の疎水性で非極性のテールが２層の中心部に配向し、一方、親水性のヘッドが水相に配向しているものである。リポソームの水性の親水性コア領域は溶解した生物活性物質を含有して良い。

１つの特徴において本発明は脂質結合ポリペプチド、疎水性領域を含む内層を有する脂質２層、および、脂質２層の疎水性領域に会合した生物活性剤を含む生物活性剤送達粒子を提供する。生物活性剤送達粒子は一般的には親水性または水性のコアを含まない。

生物活性剤送達粒子は、疎水性領域少なくとも１つを含み脂質２層の疎水性内部に取り込まれるかこれと会合している生物活性剤１つ以上を含む。生物活性剤の疎水性領域は一般的に、例えば脂肪アシル鎖のような、脂質２層の内部の疎水性の表面に会合している。１つの実施形態においては、生物活性剤はアンホテリシンＢ（ＡｍＢ）である。別の実施形態においては生物活性剤はカンプトテシンである。

好ましい実施形態においては、脂質結合ポリペプチドはアポリポタンパク質である。脂質結合ポリペプチド、例えばアポリポタンパク質分子と脂質２層との間の主な相互作用は一般的には両親媒性構造、例えば脂質結合ポリペプチドのα−へリックスの疎水性の面の上の残基と粒子の周界における外部表面上の脂質の脂肪アシル鎖との間の疎水性相互作用である。本発明の粒子は交換可能および／または非交換可能なアポリポタンパク質を包含する。１つの実施形態においては、脂質結合ポリペプチドはアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）である。

一部の実施形態においては、粒子の安定性を向上させるように修飾された脂質結合ポリペプチド分子、例えばアポリポタンパク質を含有する粒子が提供される。１つの実施形態においては、修飾は分子内および／または分子間のジスルフィド結合を形成するためのシステイン残基の導入を包含する。

別の実施形態においては、結合した官能性部分１つ以上、例えばターゲティング部分１つ以上および／または送達粒子に取り込まれる生物活性剤の活性を増強するかそれと相乗的に作用し得る、所望の生物学的活性、例えば抗微生物活性を有する分子１つ以上を有するキメラ脂質結合ポリペプチド分子、例えばキメラアポリポタンパク質分子を含む粒子が提供される。

さらに別の実施形態においては、前述した生物活性剤送達粒子を処方するための方法が提供される。１つの実施形態においては、処方の方法は２層形成脂質および生物活性剤を含む混合物を接触させて脂質ベシクル生物活性剤混合物を形成する工程、および、脂質ベシクル生物活性剤混合物を脂質結合ポリペプチドに接触させる工程を包含する。別の実施形態においては、処方の方法は適切な溶媒中に溶解した生物活性剤を添加するあらかじめ形成された２層含有脂質ベシクルの分散液の形成を包含する。この操作法のための生物活性剤を可溶化するための適切な溶媒は、極性または親水性を有し、生物活性剤を可溶化して本発明の送達粒子に取り込ませることができる溶媒を包含する。適当な溶媒の例は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルホルムアミドであるが、これらに限定されない。ベシクル／生物活性剤混合物には脂質結合ポリペプチドを添加し、その後、インキュベーション、超音波処理またはその両方を行う。１つの実施形態においては、上記した方法の何れかにより送達粒子内に取り込まれる生物活性剤はアンホテリシンＢである。１つの実施形態においては、アンホテリシンＢは、ＤＭＳＯ中に可溶化される。別の実施形態においては、生物活性剤はカンプトテシンである。１つの実施形態においては、カンプトテシンをＤＭＳＯに溶解する。

本発明は上記した方法の何れかに従って調製された生物活性剤送達粒子、および、上記方法の何れかに従って調製された粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を包含する。

（発明の詳細な説明）
本発明は個体に生物活性剤を送達するための組成物および方法を提供する。脂質結合ポリペプチドおよび脂質２層を含む粒子内に取り込まれた生物活性剤の形態の送達ビヒクルが提供される。粒子の内部は脂質分子の疎水性部分、例えば脂質の脂肪アシル鎖を含む脂質２層の疎水性領域を含んでおり、これは２層の脂質親水性表面により包囲された完全に封入された水性の内部を含むリポソームとは対照的である。本発明の粒子の内部の疎水性の性質は例えば２層の脂質分子の間の挿入、または、２層のリーフレット間の疎水性領域内部への封鎖により、疎水性分子の取り込みを可能にする。疎水性領域少なくとも１つを含む生物活性剤は粒子の疎水性の内部に取り込んでよい。本明細書においては、脂質２層の疎水性領域内部への生物活性剤の「取り込み」とは、２層の脂質分子の疎水性領域または疎水性部分、例えば２層を形成する脂質の脂肪アシル鎖の中への可溶化、または、それとの会合、または、脂肪アシル鎖への挿入を指す。

（生物活性剤送達粒子）
本発明は脂質結合ポリペプチド１つ以上、２層形成脂質の１つ以上の種類を含む脂質２層、および、生物活性剤１つ以上を含む「粒子」（本明細書においては「送達粒子」または「生物活性剤送達粒子」とも称する）を提供する。一部の実施形態においては、送達粒子は非２層形成脂質の１つ以上の種類も含む。粒子を含む組成物もまた提供される。１つの実施形態においては、送達粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物が提供される。

一部の実施形態においては、本発明の送達粒子を製造するために有用な脂質結合ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそのフラグメント、天然の変異体、アイソフォーム、類縁体またはキメラ型、天然に存在しない配列を有するタンパク質、または、既知のアポリポタンパク質に合致した脂質結合特性を有する何れかの長さのタンパク質またはペプチドを包含し、そして天然原料から精製するか、組み換え生産するか、または合成により製造してよい。天然に存在するタンパク質の類縁体を使用してよい。脂質結合ポリペプチドは非天然のアミノ酸（例えばＤ−アミノ酸）１つ以上、アミノ酸類縁体、または、ペプチド結合が代謝分解に対してより耐性の構造により置き換えられている、または、個々のアミノ酸が類似の構造により置き換えられているペプチドミメテック構造を包含してよい。

一般的に粒子中のアポリポタンパク質と脂質２層の間の主な相互作用はアポリポタンパク質分子の両親媒性αヘリックスの疎水性表面上の残基と生物活性剤送達粒子の周囲における２層の端部の例えばリン脂質脂肪アシル鎖のような脂質の疎水性表面との間の疎水性相互作用を介したものである。アポリポタンパク質分子の両親媒性αヘリックスは、粒子の周囲の脂質２層の疎水性表面と接触した疎水性表面、および、粒子の外部に面し、粒子が水性媒体中に懸濁した場合には水性の環境と接触する親水性の表面の両方を包含する。一部の実施形態においては、アポリポタンパク質はβ−シートの疎水性残基がディスクの周囲における脂質疎水性表面と相互作用する両親媒性のβ−シート構造を含んでよい。

生物活性剤送達粒子は粒子あたりアポリポタンパク質の１つ以上の種類を約１〜約１０分子含む場合が多い。粒子内でアポリポタンパク質により寄与される両親媒性α−ヘリックスの量は一般的にはディスク型脂質２層の端部（即ち粒子の周囲）に位置する脂質分子のその他の態様で露出した疎水性の表面を被覆するのに十分な量である。アポリポタンパク質がヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）であり脂質２層はパルミトイルオレオイルホスファチジルコリンを含む１つの実施形態においては、粒子はリン脂質約８０分子対ＡｐｏＡ−Ｉ約１分子の比率で２ＡｐｏＡ−Ｉ分子を含む。

本発明の送達粒子を形成するために使用してよいアポリポタンパク質の例は、ＡｐｏＡ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）およびアポリポホリンＩＩＩ（ＡｐｏＩＩＩ），アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ＡｐｏＡ−ＩＶ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｖ（ＡｐｏＡ−Ｖ）、アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ（ＡｐｏＣ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ（ＡｐｏＣ−ＩＩ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡｐｏＣ−ＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ｄ（ＡｐｏＤ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（ＡｐｏＡ−ＩＩ）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡｐｏＢ−１００），アポリポタンパク質Ｊ（ＡｐｏＪ）、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）またはそのフラグメント、天然の変異体、アイソフォーム、類縁体またはキメラ型を包含するが、これらに限定されない。一部の実施形態においては、アポリポタンパク質はヒトＡｐｏＡ−Ｉである。別の実施形態においては、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ｅ３のＣ末端またはＮ末端のドメインまたはそのアイソフォームである。一部の実施形態においては、アポリポタンパク質はターゲティング部分またはアポリポタンパク質に内因性ではない生物学的活性を有する部分のような合成または組み換えにより結合されている機能的部分を含む（図７参照）。

一部の実施形態においては、非交換可能なアポリポタンパク質を使用する。本明細書においては、「非交換可能なアポリポタンパク質」とは脂質表面と安定な相互作用をもたらし、そして本発明の粒子のリン脂質２層を安定化する機能を有し得るが、粒子の内因性の構造を破壊することなく粒子の表面から除去することができないタンパク質またはペプチドを指す。

本明細書に記載した送達粒子に取り込まれる生物活性剤は一般的には脂質２層の疎水性部分と会合するか、これに組み込むことができる少なくとも１つの疎水性（例えば親油性）の領域を含む。一部の実施形態においては、生物活性剤の少なくとも一部は送達粒子の内部の脂質分子の間に挿入されている。本発明の送達粒子内に取り込んでよい生物活性剤の例は、抗生物質または抗微生物剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤および抗ウィルス剤）、抗代謝剤、抗新生物剤、ステロイド、ペプチド、タンパク質、例えば細胞受容体タンパク質、酵素、ホルモン、および、神経伝達物質、放射標識、例えば放射性同位体および放射性同位体標識化合物、蛍光化合物、麻酔薬、生物活性脂質、抗癌剤、抗炎症剤、栄養物質、抗原、農薬、殺虫剤、除草剤または光力学的治療に用いられる光増感剤を包含するが、これらに限定されない。１つの実施形態においては、生物活性剤は抗真菌剤ＡｍＢである。別の実施形態においては、生物活性剤はカンプトテシン、全トランスレチン酸、アンナマイシン、ニスタチン、パクリタキセル、ドセタキセルパまたはエチオプルプリンである。少なくとも１つの疎水性領域を含む生物活性剤は当該分野で知られており、例えばイブプロフェン、ジアゼパム、グリセオフルビン、シクロスポリン、コルチゾン、プロロイキン、エトポシド、タキサン、α−トコフェロール、ビタミンＥ、ビタミンＡおよびリポ多糖類を包含するが、これらに限定されない。例えばＫａｇｋａｄｉｓら（１９９６）ＰＤＡＪＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ５０（５）：３１７−３２３；Ｄａｒｄｅｌ（１９７６）ＡｎａｅｓｔｈＳｃａｎｄ２０：２２１−２４；ＳｗｅｅｔａｎａａｎｄＡｋｅｒｓ（１９９６）ＰＤＡＪＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ５０（５）：３３０−３４２；米国特許６，４５８，３７３を参照できる。

脂質２層
本発明の粒子は粒子の内部から遠ざかる方向に面した極性のヘッド基を含むディスクの全般的に環状の面、および、２層形成脂質および存在する場合他の脂質成分の疎水性部分を含有する脂質２層の疎水性領域を含む粒子の内部（即ち環状の面の間の空間）を有する脂質２層を包含する。２層の端部の脂質分子の疎水性表面は（生物活性剤送達粒子の周囲の表面）は上記した通り粒子の脂質結合ポリペプチドに接している。粒子は１つ以上の種類の２層形成脂質、または、１つ以上の種類の２層形成脂質および１つ以上の種類の非２層形成脂質の混合物を含んでよい。本明細書において「脂質」とは、有機溶媒に可溶または部分的に可溶であるか、または、水相中に存在する場合に疎水性の環境内に分配できる生物学的または合成起源の物質を指す。

脂質結合ポリペプチドと会合してディスク型の構造を形成することができる何れかの２層形成脂質を本発明において使用してよい。本明細書においては、「２層形成脂質」とは疎水性の内部および親水性の外部を有する脂質２層を形成することができる脂質を指す。２層形成脂質は例えばリン脂質、スフィンゴリピド、糖脂質、アルキルホスホリピド、エーテル脂質およびプラズマロゲンを包含するが、これらに限定されない。２層形成脂質の１つの種類を使用するか、または２つ以上の種類の混合物を使用してよい。一部の実施形態においては、脂質２層はリン脂質を包含する。適当なリン脂質は、例えば、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＰＯＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、カルジオリピン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、卵黄ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカチオン性リン脂質を包含するが、これらに限定されない。他の適当な２層形成脂質の例はカチオン性脂質および糖脂質を包含する。１つの実施形態において、粒子は多くの場合、約７：３のモル比でＤＭＰＣおよびＤＭＰＧのリン脂質２層を含む。別の実施形態において、粒子はＰＯＰＣのリン脂質２層を含む。一部の実施形態においては、２層形成脂質の混合物を少なくとも約１：１００、１：５０、１：２０、１：１０、１．５、３：７、１：２または１：１の何れかのモル比で使用してよい。

粒子はまた２層形成脂質ではない脂質中に含有させてもよい。このような脂質は、例えばコレステロール、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン（この脂質は特定の状況下に２層を形成し得る）、オキシステロール、植物ステロール、エルゴステロール、シトステロール、カチオン系脂質、セレブロシド、スフィンゴシン、セラミド、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、ガングリオシド、エーテル脂質、アルキルリン脂質、プラズマロゲン、プロスタグランジンおよびリソリン脂質を包含するが、これらに限定されない。一部の実施形態においては、送達粒子を調製するために使用する脂質は１つ以上の結合した官能性部分、例えばターゲティング部分、生物活性剤または精製または検出のためのタグを含んでよい。

（キメラ脂質結合ポリペプチド）
本発明は上記した送達粒子を調製するために使用してよいキメラ脂質結合ポリペプチドを提供する。キメラ脂質結合ポリペプチドは１つ以上の結合した「官能性部分」、例えば１つ以上ターゲティング部分、所望の生物学的活性を有する部分、精製のためのアフィニティータグ、および／または、特性化または位置決めの試験のためのレポーター分子を含んでよい。生物学的活性を有する結合した部分は送達粒子に取り込まれた生物活性剤の生物学的活性の増強および／または相乗作用が可能な活性を有してよい。例えば生物学的活性を有する部分は抗微生物（例えば抗真菌、抗細菌、抗原虫、細菌殺傷、真菌殺傷、または抗ウィルス）活性を有してよい。１つの実施形態においては、キメラ脂質結合ポリペプチドの結合した官能性部分は、脂質結合ポリペプチドが生物活性剤送達粒子内に取り込まれているときには脂質２層の疎水性表面と接触していない。別の実施形態においては、結合した官能性部分は、脂質結合ポリペプチドが生物活性剤送達粒子内に取り込まれているときには脂質２層の疎水性表面と接触している。一部の実施形態においては、キメラ脂質結合ポリペプチドの官能性部分は天然のタンパク質に内因性のものであってよい。一部の実施形態においては、キメラ脂質結合ポリペプチドは細胞表面の受容体または他の細胞表面部分により認識されるか、または、これと相互作用ができるリガンドまたは配列を含む。

一部の実施形態においては、キメラ脂質結合ポリペプチドはキメラアポリポタンパク質である。１つの実施形態において、キメラアポリポタンパク質はネイティブのアポリポタンパク質に内因性ではないターゲティング部分、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−交配因子ペプチド、葉酸、トランスフェリンまたはラクトフェリンを含む。別の実施形態においては、キメラアポリポタンパク質は送達粒子に取り込まれた生物活性剤の活性の増強および／または相乗作用をもたらす所望の生物学的活性を有する部分、例えばヒスタチン−５、マガイニンペプチド、メリチン、デフェンシン、コリシン、Ｎ−末端ラクトフェリンペプチド、エキノカンジン、ヘプチジン、バクテニシンまたはシクロスポリンを含む。１つの実施形態においてキメラ脂質結合ポリペプチドはアポリポタンパク質に内因性の官能性部分を含んでよい。アポリポタンパク質内因性官能性部分の一例は、ヒトＡｐｏＥのアミノ酸１３０〜１５０により概ね形成された内因性のターゲティング部分であり、これは低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーにより認識される受容体結合領域を含む。アポリポタンパク質内因性官能性部分の別の例は低密度リポタンパク質受容体と相互作用するＡｐｏＢ−１００の領域およびスカベンジャー受容体Ｂ１型と相互作用するＡｐｏＡ−Ｉの領域を包含する。別の実施形態においては、官能性部分を合成により、または、組み換えにより付加してキメラ脂質結合ポリペプチドを製造してよい。

本明細書においては、キメラ分子に関して「リンカー」または「スペーサー」とは、キメラ分子の構成成分分子に連結または接合する何れかの分子を指す。多くのリンカー分子が例えばＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，ＲｏｃｋｆｏｒｄＩｌｌｉｎｏｉｓ等から市販されている。適当なリンカーは当業者の知る通りであり、例えば直鎖または分枝鎖の炭素リンカー、複素環炭素リンカーまたはペプチドリンカーが包含されるが、これらに限定されない。キメラ分子が融合タンパク質である場合は、リンカーは融合タンパク質を含むタンパク質に接合するペプチドであってよい。スペーサーは一般的にはタンパク質に接合するか、またはある程度の最小距離または他の空間的関連性をそれらの間に温存する以外の生物学的活性は特に有さないが、ペプチドスペーサーの構成成分であるアミノ酸は分子の何らかの性質、例えば折りたたみ構造、実質電荷または疎水性に影響するように選択してよい。

一部の実施形態においては、ポリペプチド官能性部分を含む脂質結合ポリペプチド融合タンパク質は組み換え発現系を用いて合成する。典型的には、これには脂質結合ポリペプチドおよび官能性部分をコードする核酸（例えばＤＮＡ）配列を、２つのポリペプチドが発現されればインフレームとなるように作成すること、プロモーターの制御下にＤＮＡをおくこと、宿主細胞内でタンパク質を発現すること、および、発現されたタンパク質を単離することが包含される。

本明細書に記載する脂質結合ポリペプチド配列および官能性部分をコードする配列をクローニングするか、または、インビトロの方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写系増幅系（ＴＡＳ）または自己持続性配列複製系（ＳＳＲ）により増幅してよい。広範な種類のクローニングおよびインビトロの増幅方法が当該分野で知られている。インビトロの増幅法を介して当業者に指示できる手法の例は、例えば、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）の米国特許４，６８３，２０２；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ１，１９９０）Ｃ＆ＥＮ３６−４７；ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌＯｆＮＩＨＲｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７−１０８０；ＶａｎＢｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１−２９４；ＷｕａｎｄＷａｌｌａｃｅ，（１９８９）Ｇｅｎｅ，４：５６０；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ，８９：１１７に記載されている。

キメラ脂質結合ポリペプチド融合ポリペプチドをコードする核酸は宿主細胞内における発現に適する形態の組み換え発現ベクター内に取り込むことができる。本明細書においては、「発現ベクター」とは適切な宿主細胞に導入されれば転写され翻訳されてポリペプチドとなり得る核酸である。ベクターはまたプロモーター、エンハンサーまたは他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）のような調節配列を含んでよい。このような調節配列は当該分野でよく知られている（例えばＧｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ；ＢｅｒｇｅｒａｎｄＫｉｍｍｅｌ，ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版）Ｖｏｌ．１−３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＮＹ，ｅｔｃ．参照）。

一部の実施形態においては、キメラ脂質結合ポリペプチドの製造のための組み換え発現ベクターはプラスミドまたはコスミドである。他の実施形態において、発現ベクターはウィルス核酸内に導入された核酸によりコードされるタンパク質の発現を可能とするウィルスまたはその部分である。例えば複製欠損レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルスを使用できる。発現ベクターは全てのＤＮＡおよびＲＮＡファージ（例えばコスミド）を含むバクテリオファージから誘導してよく、あるいは、ウィルスベクターは全ての真核生物のウィルス、例えばバキュロウィルスおよびレトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルスおよび全ての１本鎖、２本鎖および部分２本鎖のＤＮＡウィルス、全ての正鎖および負鎖のＲＮＡウィルス、および複製欠損レトロウィルスから誘導する。発現ベクターの別の例は酵母人工染色体（ＹＡＣ）であり、これは動原体と２つのテロメアの両方を含んでおり、小型線状染色体としてＹＡＣが複製できるようになっている。別の例は細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。

本発明のキメラ脂質結合ポリペプチド融合タンパク質は宿主細胞内で発現できる。本明細書においては、「宿主細胞」という用語は上記したキメラアポリポタンパク質融合タンパク質の製造のための組み換え発現ベクターを発現のためにトランスフェクトしてよい何れかの細胞または細胞系統を指す。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を包含し、そして子孫は天然、偶発的または意図的な突然変異により必ずしも元の親の細胞と完全に同一（形態学的または全ゲノムＤＮＡ相補性において）である必要はない。宿主細胞は上記した発現ベクターでインビボでトランスフェクトまたは形質転換された細胞を包含する。適当な宿主細胞は、例えば、細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、無脊椎動物細胞（例えばＳＦ９細胞のような昆虫細胞）、および哺乳類細胞を含む脊椎動物細胞を包含するが、これらに限定されない。

キメラ脂質結合ポリペプチド融合タンパク質をコードする発現ベクターは標準的な手法で宿主細胞にトランスフェクトすることができる。「トランスフェクション」または「形質転換」とは、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す。外因性ポリヌクレオチドは非組み込みベクター、例えばプラスミドとして維持されるか、または、宿主細胞ゲノム内に組み込んでよい。トランスフェクション方法の例は、リン酸カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを包含するが、これらに限定されない。宿主細胞をトランスフェクトするための適当な方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓおよび他の実験テキストに記載されている。核酸もまたインビボの細胞への核酸の導入に適する送達機序を介して、例えばレトロウィルスベクター（例えばＦｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：８３７７−８３８１；およびＫａｙら（１９９２）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：６４１−６４７参照）、アデノウィルスベクター（例えばＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５；およびＨｅｒｚａｎｄＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：２８１２−２８１６参照）、受容体媒介ＤＮＡ取り込み（例えばＷｕａｎｄＷｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；および米国特許５，１６６，３２０参照）、ＤＮＡの直接注入（例えばＡｃｓａｄｉら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３３２：８１５−８１８；およびＷｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５−１４６８）または粒子衝突（バイオリスティックス）（例えばＣｈｅｎｇら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：４４５５−４４５９；およびＺｅｌｅｎｉｎら（１９９３）ＦＥＢＳＬｅｔｔｓ．３１５：２９−３２参照）を介して細胞に転移できる。

（修飾脂質結合ポリペプチド）
一部の実施形態においては、脂質結合ポリペプチドが上記した生物活性剤送達粒子に取り込まれた場合に修飾により粒子の安定性が増大するかターゲティング能力が付与されるように修飾されたポリペプチドが提供される。一部の実施形態においては、修飾は粒子の脂質結合ポリペプチドが粒子のディスク型構造またはコンホーメーションを安定化できるようにする。１つの実施形態においては、修飾は例えば部位指向的突然変異誘発による分子内または分子間のジスルフィド結合の形成を可能にするアポリポタンパク質分子へのシステイン残基の導入を包含する。別の実施形態においては、化学的交差結合剤を用いてアポリポタンパク質分子の間に分子間連結を形成することにより粒子の安定性を増大させる。分子間の交差結合は粒子からのアポリポタンパク質分子の解離を防止または低減、および／または粒子を投与する個体内におけるアポリポタンパク質分子による置換を防止する。

本明細書においては、「個体」とは生物活性剤を送達することが望まれる何れかの原核生物または真核生物を指す。一部の実施形態においては、個体は細菌のような原核生物である。別の実施形態においては、個体は真核生物、例えば真菌、植物、無脊椎動物、例えば昆虫、または脊椎動物である。一部の実施形態においては、個体は脊椎動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、実験動物、例えばマウスまたはラット、愛玩動物、例えばネコまたはイヌ、または農業用動物、例えばウマ、ヒツジ、ウシまたはブタ、トリ（即ち鳥類の個体）または爬虫類（即ち爬虫類の個体）である。

一部の実施形態においては、送達粒子は個体への投与に適するキャリア中に処方される。本明細書においては、「キャリア」とは生物活性剤の投与を容易にする比較的不活性である物質を指す。例えばキャリアは組成物に形状またはコンシステンシーを付与し得るか、または、希釈剤として作用し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは生体適合性を有し（即ち宿主に対して毒性でない）、そして薬理学的に有効な物質の投与の特定の経路に適しているキャリアを指す。適当な薬学的に受容可能なキャリアは、例えば安定化剤、水和および乳化剤、浸透圧調節用の塩、カプセル化剤、緩衝液および皮膚浸透増強剤を包含するが、これらに限定されない。薬学的に受容可能なキャリアの例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＡｌｆｏｎｓｏＲ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，第１８版，１９９０）に記載されている。

投与経路は投与すべき生物活性剤の性質、個体または治療すべき状態により変動し得る。個体が哺乳類である場合は、一般的には投与は非経口である。投与経路は例えば静脈内、筋肉内、皮下、経粘膜、経鼻、脊髄内、局所および経皮を包含するが、これらに限定されない。１つの実施形態においては、粒子はエアロゾルとして投与する。送達粒子は場合により薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤中の、個体への投与のために薬学的に許容される形態において処方してよい。本発明は非経口投与のための溶液中の送達粒子の形態の薬学的組成物を提供する。このような組成物の調製のためには、当該分野でよく知られた方法を使用してよく、そして、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤または当該分野で通常使用されるその他の添加物を使用してよい。

本発明の送達粒子は適切な医薬品用のキャリアまたは希釈剤と組み合わせることにより薬学的組成物に調製できる。例えば送達粒子を注射用溶液の製造に通常用いられている溶媒、例えば生理食塩水、水、または水性デキストロースに溶解し得る。他の適当な薬学的キャリアおよびその処方は上記したＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。このような処方は乾燥粉末または凍結乾燥粉末の形態における送達粒子および場合により賦形剤を含有する滅菌バイアル中に製造され得る。使用前に、生理学的に許容される希釈剤を添加し、そして溶液をシリンジで採取して個体への投与に付す。

送達粒子は制御放出のために処方できる。本明細書においては、「制御放出」とは個体内の生物活性剤の血中濃度が数時間、数日、数週間またはそれ以上の期間に渡る長期間、治療範囲内に維持されるような速度における処方からの生物活性剤の放出を指す。送達粒子は生態分解性または非生態分解性の制御マトリックス中に処方してよく、それらの多くは当該分野で知られている。制御放出マトリックスは例えばヒドロゲルの形態の合成重合体または共重合体を包含し得る。このような重合体の例はポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物、多糖類、ポリ（ホスホエステル）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリ（イミドカーボネート）およびポリ（ホスファゼン）およびポリラクチドコグリコリド（ＰＬＧＡ）、即ちポリ（乳酸）とポリ（グリコール酸）の共重合体を包含する。コラーゲン、アルブミンおよびフィブリノーゲン含有物質も使用してよい。

送達粒子は多くの状態、例えば細菌感染症、真菌感染症、疾患状態、代謝障害を治療するため、または、例えば細菌または真菌の感染（例えば術前または術後）を防止するための予防的投与として、本明細書に記載の方法に従って投与してよい。送達粒子は例えば腫瘍に抗腫瘍剤（例えば化学療法剤、放射性核種）を送達するために使用してよい。１つの実施形態において、脂質結合ポリペプチドは特定の腫瘍に対して粒子をターゲティングする部分を含む。送達粒子はまた栄養保健物質、即ち健康上の利益をもたらす食品または食餌補給物の投与のために使用してよい。一部の実施形態においては、送達粒子は他の従来の治療薬と共に、例えば複数の薬剤「カクテル」の部分として、または、例えば真菌感染の治療のための経口投与薬剤１つ以上と組み合わせて、同時投与される。送達粒子はまた殺虫剤または除草剤として投与してよい。

別の特徴において、本発明は個体における腫瘍を治療するための方法を提供する。方法は薬学的に受容可能なキャリア中の上記した生物活性剤送達粒子中の化学療法剤の治療有効量を投与することを包含する。１つの実施形態においては、化学療法剤はカンプトテシンである。送達粒子の脂質結合ポリペプチド成分は腫瘍細胞に粒子をターゲティングするためのターゲティング部分を含んでよい。１つの実施形態においては、血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）を脂質結合ポリペプチドに結合させる。乳癌細胞はＶＩＰ受容体を過剰発現する場合が多いため、１つの実施形態においては、カンプトテシンおよび脂質結合ポリペプチド−ＶＩＰキメラを含む生物活性剤送達粒子は乳癌の治療の方法において使用される。

（ターゲティング）
本発明の送達粒子は例えば特定の細胞または組織の型に対して、または、それ自体感染物質に対して、粒子をターゲティングするためのターゲティング機能を有し得る。一部の実施形態においては、粒子は脂質結合ポリペプチドまたは脂質成分に結合したターゲティング部分を含む。一部の実施形態においては、粒子に取り込まれる生物活性剤はターゲティング能力を有する。

１つの特徴において、受容体媒介ターゲティング手法を用いて、リーシュマニア属由来の原虫寄生虫に関する感染の原発部位であるマクロファージに抗リーシュマニア剤を送達してよい。このような種の例は、熱帯リーシュマニア、ドノバンリーシュマニアおよびブラジルリーシュマニアを包含する。抗リーシュマニア剤を含有する生物活性剤送達粒子は粒子の脂質結合ポリペプチド成分を改変してマクロファージ細胞内クラスＡスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）による認識をもたらすことにより、マクロファージにターゲティングしてよい。例えばＳＲ−Ａと相互作用するように化学的または遺伝子的に修飾されているアポリポタンパク質を、リーシュマニア種に対して有効な生物活性剤１つ以上、例えばＡｍＢ、５価アンチモニーおよび／またはヘキサデシルホスホコリンを含有する送達粒子内に取り込んでよい。マクロファージに特異的に抗リーシュマニア剤を含有する送達粒子をターゲティングすることは、リーシュマニア種の生育および増殖を抑制する手段として使用してよい。

（生物活性剤送達粒子の調製方法）
本発明は生物活性剤送達粒子を処方するための方法を提供する。１つの実施形態においては、２層形成脂質および生物活性剤分子を含む混合物に脂質結合ポリペプチド分子を添加することを包含する方法が提供される。

好ましくは、例えば水性媒体中に分散されると脂質ベシクルが生物活性剤の沈殿や相分離を伴うことなくキャリア溶媒から水性の環境への生物活性剤の遷移に適する環境を与えるような適当な２層形成脂質組成物を使用する。予備形成された脂質２層ベシクルはまた好ましくは、脂質結合ポリペプチド誘導の転換を起こして本発明の送達粒子を形成することが可能なものである。さらにまた、脂質生物活性剤複合体は好ましくは、適切な条件下で脂質結合ポリペプチドとともにインキュベートすることにより生物活性剤送達粒子内への変換を可能にする脂質ベシクルの特性を温存している。脂質基質生物活性剤複合体の組織化および脂質結合ポリペプチドの特性の独特の組み合わせによりある系が創生され、これにより、ｐＨ、イオン強度、温度および脂質生物活性剤脂質結合ポリペプチド濃度の適切な条件下で、安定な脂質結合ポリペプチド限局脂質２層が２層の脂質環境内へ取り込まれた生物活性剤とともに創生されるようなこれらの物質の三次構造の再組織化が起こる。ディスク型の粒子への種々のリン脂質ベシクルの変換を誘導する脂質結合ポリペプチドの能力に対するｐＨ、イオン強度および脂質結合ポリペプチド濃度の影響に関する説明は例えば、Ｗｅｅｒｓら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３７２８−３５を参照できる。

（保存および安定性）
本発明の粒子は種々の条件下において長期間安定である（例えば図５参照）。本発明の粒子または粒子を含む組成物は室温、冷蔵（例えば約４℃）または凍結（例えば約−２０℃〜約−８０℃）で保存してよい。それらは溶液中または乾燥（例えば凍結乾燥）して保存してよい。生物活性剤送達粒子は不活性雰囲気下凍結乾燥状態で、凍結して、または溶液において４℃で保存してよい。粒子は、個体への生物活性剤の投与の方法において使用するために、液体媒体、例えば緩衝液（例えばリン酸塩または他の適当な緩衝液）中で、または、キャリア、例えば薬学的に受容可能なキャリア中で保存してよい。あるいは、粒子は乾燥、凍結乾燥形態で保存し、その後、使用前に液体媒体中に希釈再調製してよい。

（キット）
本明細書に記載した試薬および粒子はキット形態中にパッケージできる。１つの実施形態においては、本発明は適当なパッケージ中に送達粒子および／または送達粒子を調製するために有用である試薬を含むキットを提供する。本発明のキットは以下の要素、即ち：脂質結合ポリペプチド（例えばアポリポタンパク質）、リン脂質、生物活性剤、ベクター、試薬、酵素、宿主細胞および／または組み換え脂質２層ポリペプチド（例えば組み換えアポリポタンパク質）および／または脂質結合ポリペプチドキメラ（例えばアポリポタンパク質キメラ）のクローニングおよび／または発現のための生育培地、および、個体に投与するための送達粒子を処方するための試薬および／または薬学的に受容可能なキャリアを個別または組み合わせて包含する。

各試薬または処方は固体形態、液体緩衝液、または、保管に適する、または場合により交換、または、反応、培養または注射用の媒体への添加に適する薬学的に受容可能なキャリア中に提供される。適当なパッケージが提供される。本明細書においては、「パッケージ」とは系において慣用的に使用され、そして生物活性剤の送達のための方法において使用するための試薬または成分（例えば送達粒子）１つ以上、または、送達粒子の調製または処方のための試薬１つ以上（例えばアポリポタンパク質分子、リン脂質、生物活性剤）を固定された限界内において保持することができる固体マトリックスまたは物質を指す。このような物質は例えば、ガラスおよびプラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）のボトル、バイアル、紙、プラスチックおよびプラスチックホイルラミネートの封筒等を包含するが、これらに限定されない。

更に、キットは場合により、例えば送達粒子の製造、処方および／または使用に関する、本発明の方法の実施に関する指示（すなわち、プロトコル）を示したラベルおよび／または取扱説明書または解説資料を含む。指示の資料は典型的には形式を特に限定しないが書面による、または印刷された資料を包含する。このような取扱説明書を保存し、それをエンドユーザーまで連絡することができる何れかの媒体が本発明に包含される。そのような媒体は、例えば、電子的保存媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えばＣＤＲＯＭ）等を包含するが、これらに限定されない。このような媒体はそのような取り扱い説明の資料を与えるインターネットサイトアドレスを含んでよい。

特性化試験によればＡｐｏＡ−Ｉ、リン脂質およびＡｍＢは、密度勾配超遠心分離に付した際には個別の粒子集団として移行したことがわかった（図３）。複合体は粒子中のタンパク質／脂質の比に依存する勾配の特徴的な密度で浮遊する。

実施例３生物活性剤送達粒子の長期安定性
組み換えＡｐｏＥ３ＮＴ末端ドメイン（ＡｐｏＥ３ＮＴ）をＦｉｓｈｅｒら（１９９７）ＢｉｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ７５：４５−５３に記載の通り調製した。ＡｐｏＲ３ＮＴ−ＡｍＢ含有粒子は実施例１に記載の通りコレート透析法により調製し、長期安定性の評価に用いた。

実施例５ミクロ流動化プロセッサーを用いたＡｍＢ含有粒子の調製
ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｍＢ、卵ＰＣ、ＤＰＰＧおよびコレステロールをミクロ流動化試料ホルダー内であわせ、ミクロ流動化プロセッサーの反応チャンバーに１８０００ｐｓｉで通した。得られた溶液を収集し、粒子の形成、疎水性物質の取り込み、粒径および安定性について特性化した。直径約１６ｎｍのＡｍＢ含有粒子が得られ、これは凍結乾燥および水溶液希釈再調製に対して安定であった。

これらのデータはＡｍＢ、リン脂質およびアポリポタンパク質が組み合わさってＡｍＢが粒子の２層部分内に完全に組み込まれた生物活性剤送達粒子の均質な集団が形成されたことを強力に示唆している。ＡｍＢ含有粒子の分光光度計分析によれば生物活性剤送達粒子内のＡｍＢ可溶化に合致して可視光範囲におけるピークの特徴的なセットが明らかになった。

実施例８リポソームＡｍＢ処方とのＡｍＢ含有生物活性剤送達粒子の抗真菌活性の比較
実施例６に記載の通り調製したＡｐｏＡ−Ｉ−ＡｍＢ粒子の抗真菌活性および市販のＡｍＢリポソーム処方であるＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）を酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生育を抑制するその能力に関して比較した。図１０のデータはＡｐｏＡ−Ｉ−ＡｍＢ生物活性剤送達粒子はＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）として処方されたＡｍＢの同じ量よりも効果的にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生育を抑制した。ＡｐｏＡ−Ｉ−ＡｍＢ生物活性剤送達粒子は１μｇ／ｍｌで９０％の生育抑制を達成したのに対し、この抑制の水準には２５μｇ／ｍｌのＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）を必要とした。

実施例１０ＡｍＢ含有生物活性剤送達粒子の凍結割断電子顕微鏡観察
凍結割断電子顕微鏡観察のためのＡｍＢ含有生物活性剤送達粒子の調製物を以下の通り作成した。即ち、実施例６の通り調製したＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ（７：３モル比）ＡｍＢ生物活性剤送達粒子（３ｍｇ／ｍｌタンパク質）の試料をサンドイッチ法および液体窒素冷却プロパンによりクエンチングした。低温固定試料を２時間未満液体窒素中に保存した後、処理を行った。割断法はＪＯＥＬＪＥＤ−９００凍結エッチング装置を用いて実施し、そして曝露された割断面をＰｔで３０秒間２５〜３５℃の角度で、そして炭素で３５秒間（２ｋＶ／６０−８０ｍＡ、１×１０^−５Ｔｏｒｒ）陰影化した。この方法で作成されたレプリカを濃発煙ＨＮＯ _３で２４時間洗浄した後、新しいクロロホルム／メタノール（１：１容量）と共に少なくとも５回反復して攪拌した。この方法で洗浄されたレプリカをＪＯＥＬ１００ＣＸまたはＰｈｉｌｉｐｓＣＭ１０電子顕微鏡で検査した。

ＡｍＢ含有生物活性剤送達粒子の凍結割断より得た電子顕微鏡写真を図９に示す。数種の凍結割断調製物より得た電子顕微鏡写真は、高濃度の小型のタンパク質脂質複合体の存在を示している。見かけの直径は、約２０〜６０ｎｍの範囲であり、約４０ｎｍが高頻度であった。凍結割断電子顕微鏡観察により得られた粒子の見かけの直径はネイティブの細孔制限勾配ゲル電気泳動により測定した数値より大きい。この相違は電子顕微鏡観察により粒子を可視化するために使用した試料の取り扱いまたは染色方法の影響と考えられる。

（毒性試験）
３匹のマウスの群に、各々、ＡｍＢ含有生物活性剤送達粒子中の用量（例えば１、２、５、１０または１５ｍｇ／ｋｇＡｍＢ）またはＡｍＢを含有しない対照粒子を、１０ｍＭリン酸ナトリウムでｐＨ７．４に緩衝された食塩水中で投与した。単回用量は０．１ｍｌ容量を腹腔内に投与した。予備試験によれば生物活性剤送達粒子はこれらの条件下で十分可溶性であった。

ＡｍＢに感受性のＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの臨床単離株を培養し、２×１０^６分生子／ｍｌの濃度で感染できるような接種物に調製した。各マウスには全身麻酔下に頭蓋内に規定食塩水０．０５ｍｌ中１×１０^５分生子の接種物を与えた。

感染したマウスを１日２回モニタリングし、疾患や死亡の兆候があればそれを２８日まで記録した。体重は同じ期間毎日記録した。自然に動くことができないか、飼料や水の摂取ができない瀕死の動物は安楽死させた。これらの試験の結果に基づいて、所見を確認し、再現性を見るために、第２のセットの試験を実施した。使用したＡｍＢ用量ならびに対照群および投与群のマウスの数は前の実験で得られた知見が反映されるように調節し得る。

（薬物動態試験）
０．８および２．０ｍｇ／ｋｇの用量でＡｍＢ生物活性剤送達粒子またはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）の静脈内注射後、１０分、２、８および２４時間の時点で血液、肝、腎、肺および脳脊髄液の試料を感染マウスから採取した。マウスは全身麻酔状態とし、全血液を腋窩血管より採取した。開胸し、組織試料を規定食塩水で灌流し、次に外科的に摘出した。組織を１−アミノ−４−ニトロナフタレンを含有するメタノールでホモゲナイズした。血清および組織ホモジネートの上澄みは分析まで保存した。各試料中のＡｍＢの濃度はＧｒａｎｉｃｈら（１９８６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．２９：５８４−８８に記載の通り高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。慨すれば、血清試料（０．１ｍｌ）をミリリットル当たり内標準である１−アミノ−４−ニトロナフタレン１．０ｍｇを含有するメタノール１．０ｍｌと合わせ、回転混合した。遠心分離の後、上澄みを減圧下に乾燥し、その後ＨＰＬＣカラム（Ｃ_１８逆相）上の注入用に、メタノール０．２ｍｌ中に再溶解した。計量した湿潤組織試料は、ガラスホモゲナイザーを用いてミリリットル当たり内標準５．０ｍｇを含有するメタノール１０容量中でホモゲナイズし、遠心分離した。移動層はアセトニトリルおよび１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０；１１：１７（ｖ／ｖ））の混合物とし、流量は１．０ｍｌ／分とした。ＡｍＢの濃度は内標準に対するＡｍＢのピーク高さの比により求めた。

カンプトテシン含有粒子の脂質結合ポリペプチド成分は脂質結合ポリペプチドのコーディング配列を保有するプラスミドベクターで形質転換されているＥｓｃｈｅｌｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組み換え形態として作成してよい。例えば、組み換えヒトＡｐｏＡ−Ｉを使用してもよい。ＡｐｏＡ−Ｉ発現プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞は３７℃の培地中で培養した。６００ｎｍにおける培養物の光学密度が０．６に達した時点でイソプロピルチオガラクトシド（０．５ｍＭ終濃度）の添加によりＡｐｏＡ−Ｉの合成を誘導した。更に３時間培養した後、細菌を遠心分離により沈殿させ、超音波処理により粉砕した。細胞溶解物を４℃で３０分間２０，０００×ｇで遠心分離し、ＡｐｏＡ−Ｉを上澄み画分から単離した。

例えばＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラは、末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を有するＶＩＰ配列のコーディング配列に相当する相補オリゴヌクレオチドプライマーを合成することにより構築してよい。オリゴヌクレオチド（〜１００塩基対）をアニーリングして所望の「付着末端」を有する２本鎖ＤＮＡを作成し、そして、適切に位置づけられたＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を有するＡｐｏＡ−Ｉコーディング配列含有プラスミドベクター内にサブクローニングした。ライゲーション、形質転換および陽性キメラ構築物のスクリーニングの後、プラスミドＤＮＡを単離し、自動ジデオキシ鎖終止配列分析に付した。配列が所望のキメラについて予測されたものに相当することが確認された後、組み換えＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラの作成を野生型ＡｐｏＡ−Ｉに関して前記した通り、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて実施した。次に精製された組み換えキメラを、ゲル電気泳動、質量スペクトル分析により、そして、実施例８に記載した野生型ＡｐｏＡ−Ｉと同様の態様で本発明の生物活性剤送達粒子を作成する能力があるかどうかについて、評価した。

ＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラ−カンプトテシン含有生物活性剤送達粒子を乳癌細胞生育抑制試験において使用することにより、脂質粒子ターゲティングの程度を測定し得る。例えば、ヒト乳癌細胞系統ＭＣＦ−７をＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ウシ胎児血清および抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した変性Ｅａｇｌｅ培地中単層培養物として湿潤５％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で維持した。単離した野生型のＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラを放射性ヨウ素化し、本発明のカンプトテシン含有生物活性剤送達粒子に取り込み、細胞と共にインキュベートした。４℃で培養ＭＣＦ−７細胞と共に標識カンプトテシン含有生物活性剤送達粒子をインキュベートした後、細胞に会合した放射能を測定した。ＭＣＦ細胞へのＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラまたは生物活性剤送達粒子会合ＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラの結合と競合するＶＩＰの能力を競合的結合試験において測定した。細胞結合データはＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により評価した。ＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラ生物活性剤送達粒子のＭＣＦ−７細胞内在化の程度は、３７℃において放射標識ＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラ含有生物活性剤送達粒子と共にインキュベートしながら測定した。インキュベーションおよび洗浄の後、トリクロロ酢酸可溶性放射能を測定し、脂質結合ポリペプチド分解の尺度とした。

種々の生物活性剤送達粒子を用いた生育抑制および細胞毒性試験を試験管内腫瘍細胞感受性試験において評価した。指数生育期の細胞を培地に再懸濁し、細胞数を電子カウンターで計数した。あるいは、ＭＣＦ−７クローン生育のカンプトテシン−ＡｐｏＡ−Ｉ−ＶＩＰキメラ生物活性剤送達粒子の抑制を低下した^３５Ｓ−メチオニン取り込みに基づいて評価し得る。細胞の一部を三連で培養皿に接種した。インキュベーションの後、特定の脂質粒子を保存溶液から採って皿に添加し、カンプトテシンの終濃度を０、０．１、１、５、１０、５０、１００および２５０ｎＭとした。０〜７２時間の特定の時間間隔の後、培地を吸引除去し、新しい培地を添加した。種々の曝露時間による各薬剤濃度における生存率をトリパンブルー排除細胞の数の比から求め、カンプトテシンを含まない対照粒子で得られた結果と比較した。

図１は実施例１に記載の通り調製した生物活性剤を含まないＡｐｏＡ−Ｉ−リン脂質粒子の２５０〜４５０ｍｍのＵＶ／可視光の吸収スペクトルを示す。図２は実施例１に記載の通り調製したＡｐｏＡ−Ｉ−リン脂質−ＡｍＢ粒子の２５０〜４５０ｍｍのＵＶ／可視光の吸収スペクトルを示す。図３は密度勾配超遠心分離の後のＡｐｏＡ−Ｉ−リン脂質−ＡｍＢ粒子の画分番号ｖｓタンパク質濃度のプロットを示す。粒子は実施例２に記載の通り調製し、そしてＫＢｒを添加することにより１．３ｇ／ｍｌの密度に調節した。溶液を１０℃２７５，０００ｇで５時間にわたり断続的な勾配で遠心分離した。遠心分離の後、試験管の内容物を上部から分画し、各画分のタンパク質濃度を測定した。図４は４〜２０％アクリルアミド勾配スラブゲル上のＡｐｏＡ−Ｉ−リン脂質粒子のネイティブのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を示す。粒子をＡｐｏＡ−Ｉおよび２種の脂質調製物、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧまたはパルミトイルオレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を用いて調製した。ゲルはクーマシーブルーで染色した。レーン１：ＡｐｏＡ−ＩＰＯＰＣ粒子；レーン２：ＡｐｏＡ−Ｉ−ＰＯＰＣ−ＡｍＢ粒子；レーン３：ＡｐｏＡ−Ｉ−ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ−ＡｍＢ粒子。粒径標準物の相対的移行を左側に示す。図５はアポリポタンパク質ＥのＮ末端ドメイン（ＡｐｏＥ３ＮＴ）−ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ−ＡｍＢ粒子の安定性の粒径と構造の一貫性に対する種々の保存条件の作用を比較したものである。粒子は密度超遠心分離により単離し、ネイティブのＰＡＧＥ４〜２０％勾配スラブゲル上の電気泳動に付した。ゲルはアミドブラックで染色した。レーン１：２４時間４℃でリン酸塩緩衝液中に保存した粒子；レーン２：２４時間−２０℃でリン酸塩緩衝液中に保存した粒子；レーン３：凍結乾燥し、２４時間−８０℃で凍結保存し、その後水中で再希釈した粒子。粒径標準物の相対的移行を左側に示す。図６は生物活性剤送達粒子の形状および分子の組織を模式的に説明するものである。図７はキメラ脂質結合ポリペプチドおよび生物活性剤送達粒子へのその取り込みを模式的に示すものである。キメラタンパク質はターゲティング部分（図７Ａ）または所望の生物活性を有する部分（図７Ｂ）を含み得る。図７Ｃは生物活性剤送達粒子内への図７Ａおよび７Ｂに示すキメラポリペプチドの取り込みを模式的に示すものである。図８は実施例２に記載した培養物中のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対するＡｍＢ含有生物活性剤送達粒子の抗真菌活性をグラフにより示したものである。図９は実施例１０に記載の通り調製したＡｍＢ含有生物活性剤送達粒子のフリーズフラクチャー電子顕微鏡写真である。図１０は実施例８に記載したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生育を抑制するＡｐｏＡ−Ｉ−ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ−ＡｍＢ粒子およびＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）の能力を比較したものである。図１１は実施例９に記載したＳＤＳ中に可溶化されたカンプトテシン（図１１Ａ）とカンプトテシン含有生物活性剤送達粒子（図１１Ｂ）の蛍光スペクトルを比較したものである。図１２は実施例７に記載した通り調製した脂質粒子（図１２Ａ）および実施例６に記載した通り調製した生物活性剤送達粒子（図１２Ｂ）へのＡｍＢ取り込みのＵＶ／可視光スペクトルの比較を示す。図１３は生物活性剤送達粒子の調製の操作法の実施形態を説明している。

Claims

脂質結合ポリペプチド、脂質２層および生物活性剤を含む生物活性剤送達粒子であって、該脂質２層の内部が疎水性領域を含み、そして該生物活性剤が脂質２層の疎水性領域と会合している、生物活性剤送達粒子。
前記粒子が親水性コアを含まない、請求項１に記載の生物活性剤送達粒子。
前記粒子がディスク型である、請求項１または２に記載の生物活性剤送達粒子。
前記ディスク型粒子が約７〜約２９ｎｍの直径を有する、請求項１〜３の何れかに記載の生物活性剤送達粒子。
前記生物活性剤が疎水性領域少なくとも１つを含む、請求項１〜４の何れかに記載の生物活性剤送達粒子。
前記生物活性剤の疎水性領域が前記脂質２層の内部で疎水性の表面と会合している、請求項１〜５の何れかに記載の生物活性剤送達粒子。
前記生物活性剤がアンホテリシンＢである、請求項１〜６の何れかに記載の生物活性剤送達粒子。
前記生物活性剤がカンプトテシンである、請求項１〜６の何れかに記載の生物活性剤送達粒子。
前記脂質結合ポリペプチドがアポリポタンパク質である、請求項１〜８の何れかに記載の生物活性剤送達粒子。
前記アポリポタンパク質が交換可能なアポリポタンパク質である、請求項９に記載の生物活性剤送達粒子。
前記アポリポタンパク質がヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉである、請求項１０に記載の生物活性剤送達粒子。
前記アポリポタンパク質が機能性部分を含むキメラアポリポタンパク質である、請求項９に記載の生物活性剤送達粒子。
前記機能性部分がターゲティング部分である、請求項１２に記載の生物活性剤送達粒子。
前記機能性部分が生物学的活性を含む、請求項１２に記載の生物活性剤送達粒子。
前記アポリポタンパク質が粒子の安定性を増大させるように修飾されている、請求項９に記載の生物活性剤送達粒子。
前記修飾が分子間または分子内のジスルフィド結合を形成するためのシステイン残基の導入を含む、請求項１５に記載の生物活性剤送達粒子。
前記脂質２層がリン脂質を含む、請求項１〜１６の何れかに記載の生物活性剤送達粒子。
前記リン脂質がジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を含む、請求項１７に記載の生物活性剤送達粒子。
請求項１〜１８の何れかに記載の生物活性剤送達粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、個体への生物活性剤の投与のための薬学的組成物。
前記組成物が制御放出のために処方される、請求項１９に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物が生物活性剤治療有効量を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
前記生物活性剤がアンホテリシンＢである、請求項１９または２１に記載の薬学的組成物。
前記生物活性剤がカンプトテシンである、請求項１９または２１に記載の薬学的組成物。
前記投与が非経口である、請求項１９または２１〜２３の何れかに記載の薬学的組成物。
前記非経口投与が静脈内、筋肉内、経粘膜および脊髄内よりなる群から選択される、請求項２４に記載の薬学的組成物。
前記組成物がエアロゾルとして投与される、請求項１９または２１に記載の薬学的組成物。
前記組成物が制御放出のために処方される、請求項１９または２１に記載の薬学的組成物。
前記生物活性剤が抗真菌剤である、個体における真菌感染症を治療するための請求項１９に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物が抗真菌剤の治療有効量を含む、請求項２８に記載の薬学的組成物。
前記抗真菌剤がアンホテリシンＢである、請求項２８または２９に記載の薬学的組成物。
前記生物活性剤が抗腫瘍剤である、個体における腫瘍を治療するための請求項１９に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物が抗腫瘍剤の治療有効量を含む、請求項３１に記載の薬学的組成物。
前記抗腫瘍剤がカンプトテシンである、請求項３１または３２に記載の薬学的組成物。
前記脂質結合ポリペプチドが血管作用性腸ペプチドを含み、そして、前記腫瘍が乳癌である、請求項３１〜３３の何れかに記載の薬学的組成物。
請求項１に記載の生物活性剤送達粒子を処方するための方法であって、該方法が、２層形成脂質ベシクルを生物活性剤に接触させて２層形成脂質ベシクル生物活性剤混合物を形成する工程、および、２層形成脂質ベシクル生物活性剤混合物を脂質結合ポリペプチドに接触させる工程を包含する、方法。
請求項１に記載の生物活性剤送達粒子を処方するための方法であって、該方法が以下：
（ａ）脂質ベシクルの水性分散液を形成する工程であって、ただしここで該脂質ベシクルは２層形成脂質を含む工程；
（ｂ）生物活性剤を脂質ベシクル分散液に添加して脂質ベシクル生物活性剤混合物を形成する工程；
（ｃ）脂質結合ポリペプチドを脂質ベシクル生物活性剤混合物に添加して脂質生物活性剤脂質結合ポリペプチド混合物を形成する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）で形成された混合物をインキュベートする工程
を包含する、方法。
前記方法が更に、工程（ｄ）の混合物を超音波処理する工程を包含する、請求項３６に記載の生物活性剤送達粒子を処方するための方法。
前記生物活性剤がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に可溶化された後に、２層形成脂質ベシクルと接触させる、請求項３５に記載の方法。
前記生物活性剤がＤＭＳＯ中に可溶化された後に、脂質ベシクル分散液に添加される、請求項３６または３７に記載の方法。
前記生物活性剤がアンホテリシンＢである、請求項３５〜３９の何れかに記載の方法。
前記生物活性剤がカンプトテシンである、請求項３５〜３９の何れかに記載の方法。
請求項３５〜４１の何れかの方法により調製された、生物活性剤送達粒子。
請求項４２に記載の通り調製された生物活性剤送達粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
請求項１８、１９または４３の何れかに記載の薬学的組成物および個体に生物活性剤を投与するための方法に関する指示書を含む、キット。