JP2001507207A - 化合物を細胞に送達する方法 - Google Patents

化合物を細胞に送達する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、とりわけ化合物を細胞に送達する方法を対象とし、この方法は細胞に送達すべき化合物、有機ハロゲン化物および／またはキャリアーを投与することを含んで成る。所望により超音波も適用される。

Description

【発明の詳細な説明】 化合物を細胞に送達する方法関連分野 本出願は、1996年5月1日に出願された米国特許出願第08/640,554号の一部継続 出願である1997年1月17日に出願された米国特許出願第08/785,661号の一部継続 出願であり、引用により各々の開示内容の総てを、引用により本明細書に編入す る。発明の分野 本発明は、細胞内送達、特に化合物を細胞内に送達し易くするための有機ハロ ゲン化物および／または超音波の使用に関する。発明の背景 細胞は、すべての生きている生物の基本的構造および機能的単位である。すべ ての細胞が形質膜、すなわち細胞膜により囲まれた細胞質を含む。大部分の細菌 および植物細胞は、外側の硬質の、または半−硬質の細胞壁に囲まれている。細 胞は、１）核膜または２）核を含まない細胞中で自由に配列し得るＤＮＡを含む 。細胞膜が天然に存在するイオンチャンネルを含むことは知られているが、細胞 にとって治療的に有利な化合物は通常、大きすぎて天然に存在するイオンチャン ネルを通過できない。化合物を細胞中へ送達する従来の介入法は、化合物が細胞 膜、細胞壁および核膜を通って通過する必要がある観点から、困難であることが 証明された。 分子生物学は、ヒトゲノムのほとんどのマッピングを含め、多くの植物および 動物のゲノムのマッピングをもたらした。疾患の遺伝子を基本として解明して行 く進歩は潜在的に、そのような疾患の治療法を開発で きる点で重要である。しかしこれらの進歩および処置療法を完全に使用するため には、所望する化合物を標的細胞に送達できる方法が必要である。したがって研 究者達は、遺伝子および他の化合物を植物および動物細胞の両方に挿入するため の様々な細胞内送達法の開発を行った。 例えばリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法は、遺伝物質を細胞培養物中の細胞に送 達するために使用された。しかしこの方法の１つの欠点は、生じたトランスフェ クション（遺伝物質の細胞中への送達）および続く遺伝子発現の効率が大変低か ったことである。 改良されたトランスフェクションが、ウイルスベクター（例えばアデノウイル スおよびレトロウイルス）を使用して試みられたが、ここでも遺伝子発現での困 難さがつきまとった。さらに、抗原性に関する実質的な懸念、および突然変異体 ウイルスの可能性ならびに他の悪影響の可能性が存在する。 ウイルスベクターよりも容易に調製できるリポソームは、遺伝子送達剤として 有望であることが示された。リポソームは生物学的な不安が少ない（すなわち、 例えばリポソームは一般的に非抗原性である）が、リポソームを使用するトラン スフェクションおよび遺伝子の発現効率は、ウイルスを用いた場合よりも低いこ とが多い。 遺伝子が金のような重金属粒子に付いている遺伝子銃は、細胞中に高速で粒子 を発射するために使用された。しかし、遺伝子銃は培養系で遺伝子発現を生じた ものの、インビボでは作用しなかった。さらに、重金属粒子のブラストが細胞に 傷害を引き起こす可能性があり、そして望ましくない外来物質（例えば金粒子断 片）を細胞中に導入するかもしれない。 電気穿孔法は、遺伝子を細胞に送達する別の方法である。この技法では、電気 エネルギーのパルスが細胞にかけられて、ＤＮＡを細胞に通過させ易くするため の孔または開口を作成する。しかし電気穿孔法は細胞を損傷し、そしてさらにイ ンビボでは高度に効率的であると示されなかった。 種々の報告では、細胞内遺伝子転移ならびに他の化合物の送達を行うための砕 石術衝撃波の使用が開示され、それらには例えばDelius,Mらの「遺伝子治療用の 体外衝撃波(Extracorporeal Shock Waves for Gene Therapy)」、Lancet，May 2 7,1995,345:13777；Lauer,Uら、「新たな遺伝子転移システムに向けて:衝撃波− 媒介ＤＮＡ転移(Towards A New Gene Transfer System:Shock Wave-Mediated DN A Transfer)」、J.Cell ．Biochem．1994,16A:226;Gambihler,S.ら、「砕石術衝 撃波を使用するL1210マウス白血病細胞の形質膜の透過性化(Permeabilization o f the Plasma Membrane of L1210 Mouse Leukemia Cell Using Lithotripter Sh ock Waves)」、J Membr Biol 1994,141:267-75;およびMobley,T.B.ら、「リソス ターを用いた低エネルギー砕石術:19,962例の頬及び尿管結石での処置結果(Low Energy Lithotripsy with Lithostar:Treatment Results with 19,962 Genal an d Ureteral Calculi)」、J Urol 1993,149:1419-24がある。砕石術は200−380バ ールの範囲のエネルギー、および60−120Hzの周波数を送達するが、1200−1300 バールもの高さも可能である。このエネルギーおよび周波数範囲は、典型的には 患者にとっては痛く、そして通常は患者の鎮静化が必要である。Lauerらは、砕 石器を用いて25kVで250の衝撃波で、Ｂ型ヘルペスウイルス表面タンパク質を発 現するプラスミドＤＮＡをHela細胞懸濁液へ送達したことを開示する。Gambih lerら（上記）は、デキストランを送達するためにインビトロのマウス細胞の透 過性化を教示する。砕石器衝撃波は、60/分の放電速度で25kVで送られる。Moble yら(上記)は、砕石術を腎臓および尿管結石の処置に使用することを開示する。 この衝撃波圧は、200−380バールそして10−29kVの発電機範囲であった。 Zhang,L.らは、「超音波直接的遺伝子転移 タバコに関する高効率遺伝子形質 転換系の樹立(Ultasonic diret gene transfer The Establishment of High Eff iciency Genetic Transformation System for Tobacco)」、Sci Agric.Sin.1991 ,24:83-89で、0.5W/cm2で30分間の連続的超音波を使用したタバコによる遺伝子 発現の増加を開示する。Zhangらは、超音波周波数を開示していない。この高エ ネルギーレベルは、穿孔(poration)をタバコ植物の細胞壁に生じるために必要な エネルギー範囲である。 Rabinらは、1995年5月20-23日の米国臨床癌学会の第31回年次総会で、超音波 誘導を用いるプラスミド／カチオン性脂質複合体の肝腫瘍への注入を開示する。 超音波は、複合体を肝細胞に送達するというよりは、むしろ腫瘍の注入をモニタ ーするための視覚的ガイドとして開示されている。 本発明は、遺伝物質を初めとする化合物の細胞への新規かつ／またはより良い 送達法を提供する。本発明の方法は、細胞内送達レベルの増強、そしてヌクレオ チドの場合には遺伝子発現の増強という点において、従来技術に勝る重要な利点 を提供することができる。さらに、本発明の方法は、他の従来の手段を使用する のでは細胞内送達および遺伝子発現に抵抗し得る細胞系において行うことができ る。本発明のこれらの、およ び／または他の観点は、さらに本明細書での検討から明らかになるだろう。発明の要約 本発明は、とりわけ化合物を細胞に送達する方法を対象とし、この方法は細胞 に送達すべき化合物および有機ハロゲン化物を含んでなる組成物を投与すること を含んで成る。 さらに本発明は、患者に治療上有効な量の化合物および有機ハロゲン化物を含 んで成る組成物を投与することを含んで成る、患者の処置法を提供する。 本発明は、細胞にヌクレオチド配列および有機ハロゲン化物を含んで成る組成 物を投与することを含んで成る、細胞中でヌクレオチド配列の発現を行う方法を 提供する。 所望により、組成物はさらにキャリアーを含んでよい。加えて本発明の方法は 、所望により超音波の適用をさらに含んで成ることができる。 また本発明は、細胞に送達すべき化合物、または送達すべき化合物を含む組成 物を投与し、そして超音波を適用することを含んで成る、細胞への化合物の送達 法を対象とする。 さらに本発明は、患者に治療上有効な量の化合物、または治療上有効な量の化 合物を含む組成物を投与し、そして超音波を適用することを含んで成る、患者の 処置法に関する。 さらに本発明は、細胞にヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列含んで成る 組成物を投与し、そして超音波を適用することから成る、細胞中でヌクレオチド 配列を発現する方法を提供する。 所望により、この組成物はさらにキャリアーを含んでいてもよい。 また本発明は、例えば治療上有効な、または診断上有効な量の送達すべき化合 物、有機ハロゲン化物および／またはキャリアーを、そしてキットの場合では、 場合によっては他のキット成分を含んで成る組成物およびキットを含む。 本発明のこれらの、または他の観点を、以下に詳細に説明する。図面の簡単な説明 図１は、インビトロおよびインビボで細胞に化合物を送達するための試験機構 を説明する。Ａは隔離碍子プラットホームを表す。Ｂは個々にウェルＢ'を持つ ６ウェルプレートである。Ｃは超音波ゲルを表す一方、Ｄは治療用超音波変換器 を表す。本発明に従い、細胞、送達されるべき化合物、（所望により）有機ハロ ゲン化物、そして場合によってはキャリアーがウェル内に置かれる。超音波変換 器Ｄを使用して、超音波を個々のウェル（Ｂ'）に集中させるために、隔離碍子 プラットホーム（Ａ）が各ウェル（Ｂ'）の下で切断（Ｇ）されて、次に超音波 が細胞培養プレートＢにかけられる。超音波変換器Ｄはまた、超音波ゲルＣを用 いて、変換器Ｄを適用することにより、細胞培養プレートの代わりに患者に化合 物をインビボ送達するためにも使用することができる。 図２は、エネルギー蓄積、超音波エネルギー強度および使用率（パルス幅）間 の関係を表す。組織の深さの関数としての緩和効果ならびに空間ピーク時間平均 力(spatial peak temporal average power)も描かれる。 図３は、実施例２および３で細胞中に挿入する配列の調製に使用するpCAT(商 標)対照ベクター(GeneBank登録番号X65321)の地図である。 図４は、図１の一部であり、６ウェルプレートＢの６つのウェルＢ' の１つを示す。図４では、Ａは隔離碍子プラットホームの一部であり、Ｂ'は６ ウェルプレートＢの１つであり、Ｃは超音波ゲルであり、Ｄは超音波変換器であ り、Ｅは細胞を表し、そしてＦは送達すべき化合物用の微小球キャリアーを表す 。 図５は、増強された超音波効果のために、Ｘおよび２Ｘ周波数を出し、そして ２つのビームを１つの焦点で重ねる、試作型の第二調波変換器である。この変換 器は本発明の化合物および組成物のインビトロ、エクスビボおよびインビボ送達 と一緒に使用できる。 図６は、実施例１０で細胞中に挿入する配列の調製に使用するpCAT(商標)基本 ベクター(プロメガ：promega)モンゴメリービレ、ペンシルバニア州)の地図であ る。 図７は、実施例２３で説明するマウスを対象としたインビボトランスフェクシ ョンの結果を表す。発明の詳細な説明 上記および本開示を通して使用する場合に、以下の用語は特に言及しないかぎ り、以下の意味を有すると考える。 本発明の目的のために、「有機ハロゲン化物」（ハロゲン化有機化合物と呼ば れることもある）は、少なくとも１つの炭素原子（または場合によっては、SF6 およびSeF6の場合には硫黄またはセレン原子）、およびフッ素、塩素、臭素もし くはヨウ素から成る群から選択される少なくとも１つのハロゲン原子を含む化合 物を表す。好ましくはハロゲンはフッ素（すなわち、化合物はフッ素化された化 合物）である。 最も好ましくは、有機ハロゲン化物は過フッ素化されたフッ素化化合物（すな わち、完全にフッ素化されており、例えば炭素原子に直接結合 しているすべての水素原子がフッ素原子に置き換えられている）である。過フッ 素化有機ハロゲン化物（過フッ素化化合物）は、好ましくはペルフルオロカーボ ンまたはペルフルオロエーテルである。この有機ハロゲン化物は、ガス、液体（ ガス前駆体を含む）または固体であってよい。好ましくは有機ハロゲン化物は、 液体であり、一層好ましくは投与するとガスに転換するガス前駆体の液体である 。最も好ましくは、ガス前駆体は細胞の部位（近いか、近接している）でガスに 転換するガス前駆体である。 「ガス前駆体」は、特定の温度または圧力に達すると活性化されてガスに転換 する液体または固体を称する。細胞の部位でガスに転換できるガス前駆体は、化 合物の細胞性の取り込み効率を上げることができるので好ましい。 理想的には、周囲温度（室温、例えば２５℃）でガス前駆体は液体（または固 体）であるが、患者に投与されるような生理学的温度（例えば３７℃）で、ある いは細胞の部位に熱（例えば超音波を使用することなどにより）を適用すると都 合よくガスに転換する。熱を適用するならば、ガス前駆体をガスに転換するにた めに十分であるが、細胞にとって有害にはならない（例えばタンパク質を変性し ない等）温度で行われるべきである。このように理想的にはガス前駆体は、約８ ０℃未満でガスになる。より一層理想的には、ガス前駆体は約３０℃から約７０ ℃の間でガスになる。最も理想的には、ガス前駆体は約３７℃から約５０℃未満 でガスになる。 多種多様の有機ハロゲン化物を、本発明に採用することができる。有機ハロゲ ン化物が炭素に基づくハロゲン化物である場合、有機ハロゲン 化物は好ましくは１〜約３０個の炭素原子、より好ましくは１〜約２４個の炭素 原子、一層好ましくは１〜約１２個の炭素原子、さらに一層好ましくは約５〜約 １２個の炭素原子、そして最も好ましくは約６〜約１０個の炭素原子を含む。す なわち有機ハロゲン化物中の炭素原子数は、１、２、３、４、５、６、７、８、 ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２ １、２２、２３、２４個の炭素原子、およびそれ以上である。六フッ化硫黄およ び六フッ化セレンのような硫黄またはセレンに基づくハロゲン化化合物も本発明 および本明細書で使用する句である有機ハロゲン化物の範囲内にある。本明細書 で意図する有機ハロゲン化物は、例えば−Ｏ−結合（エーテル化合物の場合）の ような１つ以上のヘテロ原子で中断された炭素原子を有し、またはアミン等の他 の置換基を有してよい。本発明の好適な有機ハロゲン化物は、ペルフルオロカー ボンおよびペルフルオロエーテルのような過フッ素化ハロゲン化物である。 表１は、本発明に有用な有機ハロゲン化物を表す。本発明の使用に有用な他の 有機ハロゲン化物は、いったん本開示で装備された当業者にとって容易に明らか であろう。すべてのそのような有機ハロゲン化物は、本明細書で使用する用語、 有機ハロゲン化物の範囲内に入る。表１ 有機ハロゲン化物 好適な有機ハロゲン化物には、1-ブロモ-ノナフルオロブタン、1,1,1,3,3-ペ ンタフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロシクロヘキサン、 1-ブロモ-1,1,2,3,3,3-ヘキサフルオロプロパン、ヘプタフルオロ-2-ヨードプロ パン、1,1,2,2,3,3,4,4-オクタフルオロブタン、1-フルオロブタン、テトラデカ ペルフルオロヘプタンおよびドデカペルフルオロシクロヘキサンを含む。特に好 適であるのは、ペルフルオロヘキサン（特にn-ペルフルオロヘキサン）およびペ ルフルオロシクロヘキサンである。本発明において有用な他の広範な有機ハロゲ ン化物は、当業者がいったん本開示で装備されれば容易に明らかとなるだろう。 さらに適当な有機ハロゲン化物は、例えばLong,Jr.、米国特許第4,987,154、同 第4,927,623号および同第4,865,836号明細書に開示されているものを含み、その 開示内容は全部、引用により本明細書に編入する。 本発明に使用する有機ハロゲン化物の量は、いったん本開示で装備されれば当 業者には認識されるように、変動してよく、そして使用する特定の有機ハロゲン 化物、送達すべき化合物の種類および性質、年齢、体重、処置すべき細胞および 患者（動物）、目的とする特定の診断的応用、 治療的応用または他の応用（もしあるならば処置すべき疾病状態を含む）のよう な因子に依存し得る。典型には低量で使用し、そして所望する送達効果が達成さ れるまで増加する。各々の量は本明細書の実施例で説明する。もちろん、当業者 に認識されるような、より高いまたは低い量を使用することもできる。 化合物を細胞に導入する方法（本明細書では化合物を細胞に送達する方法、細 胞内送達法、化合物の細胞への取り込みを促進し、行い、容易にし、または増強 する方法など、様々に表現する）は、「トランスフェクション」を含み、これは 遺伝物質（すなわち、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）の宿主細 胞への導入を意味する。またトランスフェクションは、形質転換とも言う。取り 込んだ細胞にとって新たなＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、典型的にはヘテロロガス ＤＮＡ（またはＲＮＡ）、あるいは外因性ＤＮＡ（またはＲＮＡ）と言う。いく つかの細菌種は、外因性ＤＮＡを取り込み、そして類似または同種からの、ある いは全く異なる種まはた生物からのＤＮＡと区別しないものもある。外因性ＤＮ Ａは、細胞により取り込まれることができるが、遺伝可能な様式で核物質に取り 込まれることができるか、またはできない。宿主細胞のトランスフェクションの 目的は、１つ以上の慎重に選択された配列の発現を行うことを可能にすることで ある。 「発現」および「遺伝子発現」とは、アミノ酸、ペプチドおよび／またはタン パク質を生成する核酸配列の転写および／または翻訳を言う。核酸配列は、宿主 細胞の遺伝物質中に取り込まれても、取り込まれてなくてもよい。例えば核酸配 列は、宿主細胞のゲノム中に取り込ませることができ、あるいはゲノムには取り 込まれずに単に細胞に導入されるの でよい。 本発明の組成物の投与により、遺伝子発現を行うことができ（得られ、促進さ れ、助長され、または増強されることができ）、そして実際、核酸配列の発現は 、従来のトランスフェクション法、例えばリン酸カルシウム沈殿法、ウイルスベ クター、マイクロインジェクション、衝撃波（例えば砕石術）および電気穿孔法 と比べたときに増強される得る。増強された遺伝子発現の測定法は、当業者がい ったん本開示で装備すれば容易に分かり、そしてそれには酵素−結合免疫吸収ア ッセイ(ELISA)ならびにSambrookら、モレキュラークローニング:ア ラボラトリ ーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第２版、コールドス プリングハーバーラボラトリー出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、 コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)に開示された方法を含み、そ の開示内容は全部、引用により本明細書に編入する。このように、本発明の方法 の結果、生成物（例えばタンパク質）が生成され得る。さらに、宿主細胞による 生成物の産生の抑制（例えば、アンチセンス配列が細胞に導入された結果として ）も起こり得る。 いずれかの理論に拘束されることを望まないが、本発明の方法に従う核酸配列 および他の化合物の送達は、そこに運ばれる化合物を取り込むように細胞を誘導 することができる。本発明の方法に従い、化合物を細胞に送達するという定義の 中には、細胞性取り込みの能動的および受動的機構も含む。細胞に送達される化 合物を含め、細胞外物質を細胞内環境中に取り込むために、細胞により利用され るイオンチャンネルおよび他の輸送手段は、本発明により包含される。 「ヌクレオチド配列および核酸配列」は、一本および二本鎖ＤＮＡお よびＲＮＡ配列を言い、限定するわけではないが長さ約100kb〜約1,000,000kb（ 全染色体を含む）、好ましくは約４kb〜約６kb、より好ましくは長さ約1,000ヌ クレオチド、好ましくは長さ約500ヌクレオチド、より好ましくは長さ約250ヌク レオチド、より好ましくは長さ約100ヌクレオチド、より好ましくは長さ約50ヌ クレオチド、より好ましくは長さ約25ヌクレオチド、より好ましくは長さ約10ヌ クレオチド、より一層好ましくは長さ約３〜１０kbpヌクレオチドのオリゴヌク レオチド配列を含む。用語「ヌクレオチド配列」により表されるのは、遺伝子の 全てまたは一部、少なくとも遺伝子の一部、遺伝子断片、センス配列、アンチセ ンス配列、アンチジーン核酸(antigene nucleic acid)、ホスホロチオネートオ リゴヌクレオチドおよび改変、欠失、ミスマッチ、転移、転換、突然変異、保存 的置換および配列の相同体である。本明細書で使用する句、「少なくとも一部の 」および「全てまたは一部の」とは、使用する配列の種類に依存して、表される 遺伝子の一部が遺伝子発現を効果的に遮断または発現するかぎり、配列により全 遺伝子が表される必要がないことを意味する。配列は、限定するわけではないが プラスミド、フェジミド、コスミド、酵母人工染色体（YAC）、ウィルス（例え ば、アデノウイルス、種痘ウイルス、レトロウイルス）および欠陥ウイルス（「 ヘルパーウイルス」としても知られている）のような発現ベクター中に取り込ま れ得る。ヌクレオチド配列は、裸、すなわち発現ベクター無しに投与されること ができる。 「細胞」および「宿主細胞」は、原核細胞および真核細胞を意味し、植物細胞 、動物細胞、単細胞性生物の細胞、多細胞生物の細胞等を含む。特に好適なもの は動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞、そし て最も特に好ましくはヒトの細胞であり、限定するわけではないが、生きている 細胞、組織および器官を含む。真核細胞は、高等生物の細胞であり、この遺伝物 質は核膜に包まれている。原核細胞は、核を定める壁がない下等生物の細胞、そ して独自の膜に包まれていない遺伝物質を含む。細胞はインビボまたはインビト ロ（例えば細胞培養物）で存在してよい。 本発明は、細胞内送達（例えばトランスフェクション）および／またはヌクレ オチドの場合には遺伝子発現を、インビトロおよびインビボの両方の応用で行い （得る、促進する、助長する、または増強する）、かつ／または効率を増すため に広い応用を有し、そして特に原核細胞および真核細胞動物細胞、特に哺乳類細 胞で有用である。細胞内送達は、細胞膜（形質膜）、細胞壁、および／または核 膜を通って細胞への送達を含む。 句「細胞膜」（「形質膜」とも呼ばれる）は、生きている細胞の細胞質の外層 または境界を表す通例の意味で使用される。細胞膜は典型的には、タンパク質お よび脂質を含んで成り、そして一般的に動物細胞に見いだされる。 句「細胞壁」とは、植物細胞および多くの原核細胞の細胞質の回りの硬質また は半−硬質の外側の覆いを表すための通例の意味で使用される。細胞壁は典型的 には、例えば細菌、植物、藻類およびカビの細胞に見いだされる。一方、細胞壁 は、一般的に動物細胞には存在しない。植物では、壁は典型的には幾つかの層か ら成る：第１壁は、一般的に種々の程度に木化されているセルロースから成る第 ２壁により囲まれたヘミセルロースおよびペクチン物質のマトリックスを通るセ ルロースミクロフィ ブリルからなる。カビの細胞壁は、様々な量のキチンを含んでいる。原核細胞の 細胞壁は、典型的にはムコペプチドにより強化され、そして粘液質のカプセルに より囲まれている。 広範な種々の化合物が、本発明に従い細胞に送達される化合物から成ることが でき、例えば生活性剤、診断薬、医薬品等を含み、そしてタンパク質、ＤＮＡお よびＲＮＡ（一本鎖および二本鎖の両方）、アンチ−センスおよび遺伝子構築物 、ならびに他の有機または無機化合物を含む。全遺伝子、多遺伝子配列、および 遺伝子断片、ならびに全染色体および染色体断片を使用できる。 上記のように本発明の方法は、例えば超音波を適用してもしなくても有機ハロ ゲン化物の存在下で、あるいは有機ハロゲン化物無しで超音波を適用して行うこ とができる。ヌクレオチド以外の生活性剤を送達する化合物として使用する場合 は、一般的に最高の結果のために、そのような状況に有機ハロゲン化物の使用が 必要でなくても有機ハロゲン化物を使用する。 所望により、組成物はさらにキャリアーを含んでいてもよい。この使用するキ ャリアーは、広範な種々の材料から成ることができる。キャリアーは、例えば脂 質、ポリマー、タンパク質、界面活性剤、無機化合物、金属イオン等を単独で、 または水および／または溶媒と組み合わせて含むことができ、あるいはキャリア ーは単に水および／または溶媒から成ることができる。脂質、タンパク質および ポリマーは、例えば液状または固体状（例えば粒子、ファイバー、シート、層等 の状態）でよく、あるいは小胞または他の安定な組織化された状態をとってもよ く、それには限定するわけではないが、例えばリポソーム、ミセル、バブル、マ イ クロバブル、微小球、脂質−、ポリマー−、および／またはタンパク質−被覆化 バブル、マイクロバブルおよび／または微小球、マイクロバルーン、エーロゲル 、ヒドロゲル、包接物、ヘキサゴナルＨII相構造物等と、通常呼ばれるような形 態でよい。小胞または他の安定な形態の内部空隙は、例えば液体（例えばガス前 駆体を含む）、ガス、固体または溶質材料、あるいは例えば送達されるべき化合 物、有機ハロゲン化物および／または任意の標的リガンドを所望により含むそれ らの任意の組み合わせが充填される。典型的には、他のキャリアー成分を含んで も含まなくても、水、塩水（リン酸塩バッファーのような）等のようなキャリア ーが水性環境として提供されるが、他の非水性溶媒も所望により使用できる。キ ャリアーは、乳液、懸濁液、分散液、溶液等の状態の混合物を含んでいても良い 。水中の脂質（油を含む）乳液が特に好適である。上記に示したように、キャリ アーは緩衝液を含んでよい。 すなわち本明細書で使用する「小胞」は、一般的に１つ以上の内部空隙を形成 する１つ以上の壁または膜の存在が特徴である物体を言う。小胞は、例えば脂質 （本明細書に記載する種々の脂質を含む）、ポリマー（本明細書に記載した種々 のポリマーを含む）、またはタンパク質（本明細書に記載する種々のタンパク質 を含む）のような安定化化合物、ならびに当業者には容易に明らかな他の材料か ら形成することができる。他の適当な材料は、例えば任意の広範な界面活性剤、 無機化合物および当業者には容易に明らかな他の化合物を含む。また本開示を読 めば当業者には明らかなように、有機ハロゲン化物はそれ自体が適当なキャリア ーとして作用し、そして特定の態様では、それら自体が小胞および他の組織化構 造を形成し得る。このように本発明の有機ハロゲン化物と送達 されるべき化合物との組み合わせの使用は、さらにキャリアーとして役立つ化合 物を加えなくても、本発明の範囲内にある。脂質、ポリマー、タンパク質、界面 活性剤、無機化合物および／または他の化合物は、天然、合成または半合成でよ い。好適な小胞は、脂質から形成された壁または膜を含んで成るものである。こ の壁または膜は、同心でもそうでなくてもよい。好適な小胞では、安定化化合物 は単層または二重層の状態であり、そして単−または二重−層安定化化合物は、 １つ以上の単−もしくは二重−層を形成するために使用できる。１つ以上の単− もしくは二重−層の場合には、単−もしくは二重−層は所望により同心である。 安定化化合物は、ユニラメラ小胞（１つの単層または二重層から成る）、オリゴ ラメラ小胞（約２つまたは約３つの単層または二重層から成る）またはマルチラ メラ小胞（約３つ以上の単層または二重層から成る）を形成するために使用でき る。脂質、ポリマーまたはタンパク質から調製される小胞の壁または膜は、実質 的に固体（均質）であるか、あるいそれらは多孔性または半−孔性であることが できる。本明細書で記載する小胞は、例えばリポソーム、ミセル、バブル、マイ クロバブル、微小球、脂質−、タンパク質−および／またはポリマー−被覆バブ ル、マイクロバブル、および／または微小球、マイクロバルーン、マイクロカプ セル、エールゲル、小胞に結合した包接物、ヘキサゴナルＨII相構造等と一般的 に言われるような物体を含む。また小胞は、所望により標的リガンドを含んでい てもよい。 「脂質小胞」、「ポリマー小胞」および「タンパク質小胞」とは、それぞれ１ つ以上の脂質、ポリマーおよびタンパク質から形成された小胞を言う。 「リポソーム」とは、典型的には１つ以上の同心層状（例えば単層または二重 層）の、一般的に脂質化合物を含む両親媒性化合物の球状または回転楕円状クラ スターまたは凝集体を言う。これらは本明細書で脂質小胞とも呼ぶことができる 。リポソームは、例えばイオン性脂質および／または非イオン性脂質から形成で きる。非イオン性脂質から形成されるリポソームは、「ニオソーム」と呼ぶこと もできる。 「ミセル」は、脂質から形成されるコロイド状の物体を言う。特定の好適な態 様では、ミセルは単層またはヘキサゴナルＨ２相配置を含んで成る。別の好適な 態様では、ミセルは二重層配置を含んで成ることができる。 「エーロゲル」は、複数または小さい内部空隙が特徴である一般的に球状また は回転楕円状の物体を言う。このエーロゲルは、合成または半合成材料（例えば レソルシノールまたはホルムアルデヒド）、ならびに多糖またはタンパク質のよ うな天然物質から形成できる。 「包接物」とは、小胞に会合した固体、半−孔性または多孔性粒子を言う。好 適な状態では、包接物は小胞を含んで成るキャビティを含むケーク−様を形成し てよい。１つ以上の小胞が包接物に結合することができる。安定化材料は所望に より、包接物に会合して小胞と包接物との会合を促進する。包接物を形成できる 適当な材料は、例えばヒドロキシアパタイトのような多孔性アパタイト、および カルシウム塩とのアルギン酸沈殿物のようなポリマーと金属イオンとの沈殿物を 含む。 「乳液」は、２つ以上の一般的に非混和性液体の混合物を言い、そして一般的 にはコロイド状である。液体は乳液中に均質に、または不均一に分散してよい。 あるいは液体は、単−または二重層を含む例えばクラ スターまたは層の状態で凝集する。 「懸濁液」または「分散液」は、例えば液体中の液体、液体中の固体、ガス中 の液体等のような、好ましくは細かく分割された２つ以上の相（固体、液体また はガス）の混合物を言い、これは好ましくは長時間安定に維持される。 「ヘキサゴナルＨII相構造」とは、一般的に液体媒質（例えば水性媒体）中の 脂質、タンパク質またはポリマー（好ましくは脂質）の管状の凝集を言い、その 中で任意の疎水性タンパク質（１つまたは複数）が一般的に、管の内側で水性液 体環境と内側に向かい合って会合する。疎水性部分（１つまたは複数）は、一般 的に外側放射状に広がり、そして複合体は六角管の形をとる。複数の管が、一般 的にヘキサゴナル相構造中で一緒に包まれている。 「生体適合性」とは、一般的に生物機能に対して有害ではなく、そしてアレル ギー性反応および疾患状態を含む許容できない程度の毒性を生じない材料を称す る。本発明の組成物、および／またはその成分は、典型的には生体適合性である 。 送達されるヌクレオチド配列または他の化合物は、所望により有機ハロゲン化 物と「組み合わせて」投与することができ、そしてさらに所望によりキャリアー （小胞または他の安定化形態を含む）と「組み合わせて」投与することができる 。「組み合わせて」とは、送達されるべき化合物および有機ハロゲン化物（およ び／または所望によりキャリアー）と同時に投与することを言う。送達されるべ き化合物および有機ハロゲン化物（および／またはキャリアー）は、単に互いに 混和材料中に入れることを含む種々の異なる任意の様式により組み合わせること ができる。 さらに例えば、送達されるヌクレオチドまたは他の化合物および／または有機ハ ロゲン化物は、所望により包埋され、カプセル化され、または互いに結合され、 あるいは含まれる（それらの任意の、およびすべての組み合わせを含む）。句「 混和材料中」とは、溶液、懸濁液、乳液、分散液、混合物等を含む。本明細書で 使用する句「結合した」またはその変更形は、共有結合またはイオン結合または 他の化学的もしくは電気化学的連結または相互作用を介するように、幾つかの様 式で連結されていることを表す。本明細書で使用する句「カプセル化された」お よびその変更形は、小胞または他の構造の内側内部空隙の場所を言う。本明細書 で使用する句「中に包埋された」またはその変更形は、小胞の壁または他の構造 内に配置されることを意味する。すなわちヌクレオチド配列は、例えば小胞の内 部空隙内に封入されるか、小胞の内壁に位置するか、小胞の外面上に取り込まれ るか、および／または小胞構造自体の中に編み込まれるような、不定に配置する ことができる。さらに、１つ以上の小胞をキャビテイターとして投与することが できる。そのような場合は、小胞は化合物の投与を伴い、そして超音波の効率増 強に役立つことができる。 脂質はキャリアーとして本発明で使用できる。脂質は天然、合成または半合成 （すなわち修飾された天然物）であることができる。本発明に有用な脂質は、限 定するわけではないが、脂肪酸、リソリピッド、油（ベニバナ、ダイズおよびピ ーナッツ油を含む）、ホスファチジルコリンを含む飽和および不飽和の脂質を含 むホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルコリン；ジミリストイル ホスファチジルコリン；ジペンタデカノイルホスファチジルコリン；ジラウロイ ルホスファチジ ルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジル コリン；ジステアロイルホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルエ タノールアミンのようなホスファチジルエタノールアミン類；ホスファチジルセ リン；ホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ ミエリンのようなスフィンゴ脂質；ガングリオシドＧＭ１およびＧＭ２のような 糖脂質；グルコリピッド；スルファチド；グリコスフィンゴリピッド；ホスファ チジン酸；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；ポリエチ レングリコール、キチン、ヒアルロン酸またはポリビニルピロリドンのようなポ リマーを担持する脂質；スルホン化モノ−、ジ−、オリゴ−またはポリサッカラ イドを有する脂質；コレステロール、硫酸コレステロールおよびコレステロール ヘミスクシネート；トコフェロールヘミスクシネート、エーテル−およびエステ ル−結合脂肪酸を持つ脂質、重合化脂質（当該技術分野で周知の広範なもの）、 ジアセチルホスホネート、ステアリルアミン、カルジオリピン、長さが約６〜約 ８炭素の短鎖脂肪酸を持つリン脂質、非対称アシル鎖（例えば１つのアシル鎖が 約６炭素であり、そしてもう１つのアシル鎖が約１２炭素）を持つ合成リン脂質 、6-(5-コレステン-3b-イルオキシ)-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド、ジガラ クトシルジグリセリド、6-(5-コレステン-3β-イルオキシ)ヘキシル-6-アミノ-6 -デオキシ-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド、6-(5-コレステン-3β-イルオキシ )ヘキシル-6-アミノ-6-デオキシル-1-チオ-α-D-マンノピラノシド、12-(((7'- ジエチルアミノ-クマリン-3-イル)カルボニル)メチルアミノ)-オクタデカン酸； N-[12-(((7'-ジエチルアミノクマリン-3-イル)カルボニル)メチル-アミノ)-オク タデカノイル]-2-アミノパル ミチン酸；(コレステリル)4'-トリメチル-アンモニオ)ブタノエート；N-スクシ ニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；1,2-ジオレオイル-sn-グリ セロール；1,2-ジパルミトイル-sn-3-スクシニル-グリセロール；1,3-ジパルミ トイル-2-スクシニルグリセロール；1-ヘキサデシル-2-パルミトイル-グリセロ ホスホエタノールアミンおよびパルミトイルホモシステインおよび／またはそれ らの組合わせを含む。小胞または他の構造は、単層、二重層または多重層として 脂質から形成することができ、そしてさらにコーティングを含んでも含まなくて もよい。 好適な脂質キャリアーは、単層または二重層の状態であることができ、そして 単−または二重層は、１つ以上の単−または二重層を形成するために使用できる 。１つ以上の単−または二重層の場合には、単−または二重層は同心でよい。キ ャリアーはユニラメラ小胞（１つの単層または二重層から成る）、オリゴラメラ 小胞（約２または約３の単または二重層から成る）あるいはマルチラメラ小胞（ 約３以上の単層または二重層からなる）を形成できる。小胞の壁または膜は、実 質的に固体（均質）でよく、またはそれらは多孔性もしくは半−孔性であってよ い。 限定するわけではないが、PEG2,000MW、5,000MWおよびPEG8,000MWを含むポリ エチレングリコール（PEG）のような親水性ポリマーを持つ脂質は、特に有機ハ ロゲン化物を含有する組成物の安定性およびサイズ分布を向上させるために有用 である。ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)は、約70〜約90％で本発明 において有用であり、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエ チレングリコール5000(DPPE-PEG5000)は約０〜約20％で有用であり、そしてジパ ルミトイルホスファチジン酸(DPPA)は約０〜約20％で有用である(全ての割合は 、モ ルパーセント分子量である)。本発明においてキャリアーとして高度に有用な好 適な生成物は、約82モルパーセントのDPPC、約８モルパーセントのDPPE-PEG 5,0 00MW、および約10モルパーセントのDPPAを含む。種々の異なるモル比のPEG化脂 質も有用である。 さらに重合可能な脂質部分は、小胞のコーティングとして本発明に含まれる。 これらの例には、限定するわけではないが、オレイルおよびリノレイル基のよう なアルケニルおよびアルキニル部分、水への溶解性を増すために極性基を持っ、 または持たないジアセチレン、アクリロイルおよびメタクリロイル基、場合によ っては親油性エステル化基を持つシアノアクリル酸エステルあるいは以下のＡお よびＢで説明するような化合物を含む。そのような多数の化合物は、例えばKlav enessら、米国特許第5,536,490号明細書に記載されている。Klavenessら、米国 特許第5,536,490号明細書の開示内容は全部、引用により本明細書に編入する。 フッ素化または過フッ素化脂質も、有機ハロゲン化物成分またはさらなるキャ リアー材料として、本発明で使用できる。適当なフッ素化脂質の例には、限定す るわけではないが、式 CnF2n+1(CH2)mC(O)OOP(OO-)O(CH2)wN+(CH3)3CnF2n+1(CH2)mC(O)O の化合物を含み、式中、ｍは０〜約１８であり、ｎは１〜約１２であり；そし てｗは１〜約８である。本発明で有用なこれらの、ならびに他のフッ素化脂質の 例および合成法は、1995年6月6日に出願された米国特許出願第08/465,868号明細 書、Reissら、米国特許第5,344,930号明細書、Frezard,Fら、Biochem Biophys A cta 1994,1192:61-72およびFrezard,Fら、Art.Cell Blood Subs and Immob Biot ech 1994,22:1403-1408に説明されており、各々の開示内容は全部、引用により 本明細書に編入する。 ジフルオロアシルグリセリルホスファチジルコリン、９フッ素化ジアシルグリセ リルホスファチジルコリンの１つの具体的な例を、以下の化合物Ａにより示す。 当業者は、他の通例のリン脂質（ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホス ファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシル ホスファチジルグリセロール等）の類似のフッ素化誘導体、ならびに脂肪アシル エステルおよび遊離脂肪酸のフッ素化誘導体も、本発明の範囲に従い機能できる と考えるだろう。さらに、脂質に基づき、しかもフッ素化（過フッ素化を含む） された界面活性剤自体も、本発明でキャリアーとして使用できる。 広い範囲の種々のそのようなフッ素化化合物を使用でき、例えば末端リン酸ま たは硫酸基を有するフルオロ界面活性剤であるZONYL(商標)リン酸塩およびZONYL (商標)硫酸塩を含むZONYL(商標)フルオロサーファクタンツ(デュポン社:DuPontC ompany、ウィルミントン、デラウエア州)として販売されている種類の化合物を 含む。各々の化合物は、例えば米国特許第5,276,145号明細書に記載されており 、その開示内容は全部、引用により本明細書に編入する。また適当なZONYL(商標 )サーファクタンツは、例えばペギル化(pegylated)された(すなわち、ポリエチ レングリコール基がそこに結合した)Telomer Bサーファクタンツを含むTelomer Bと確認され、PEG-Telomer Bとしても知られているディュポン社から販売されて いるZONYL(商標)サーファクタンツがある。最も好ましくはそのようなペルギル 化フルオロサーファクタンツである。 適当な重合可能な、かつ／またはフッ素化合物には、以下を含む。 上記の式Ａにおいて、好ましくはｘは約８〜約18の整数であり、そしてｎは２ ｘである。最も好ましくは、ｘは12であり、そしてｎは24である。 カチオン性脂質および他の誘導化脂質および脂質混合物も、キャリアーとして 本発明に有用である。適当なカチオン性脂質には、ジミリスチルオキシプロピル -3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、ジラウリルオキシ プロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DLRIE)、N-[1-(2, 3-ジオレオイルオキシ)プロパル]-n,n,n-トリメチルアンモニウムサルフェート( DOTAP)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジパルミトイル エチルホスファチジルコリン(DPEPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC )、ポリリシン、リポポリリシン、ジドセイルメチルアンモニウムブロミド(DDAB )、2,3-ジオレオイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキサミドエチル] -N,N-ジ-メチル-1-プロパンアミニウム トリフルオロアセテート(DOSPA)、セチ ルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、リシル-PE、3,β-[N,(N',N'-ジメチ ルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール(DC-コレステロール、DC-Cholと しても知られている)、(-アラニルコレステロール、N-[1-(2,3-ジオレオイルオ キシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム クロライド(DOTMA)、ジパルミ トイルホスファチジルエタノールアミン-5-カルボキシスペルミルアミド(DPPES) 、ジカプロィルホスファチジルエタノールアミン(DCPE)、4-ジメチルアミノピリ ジン(DMAP)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジオレオ イルエチルホスホコリン(DOEPC)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミジン( DOGS)、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N-[1-(2-ヒドロキシエチル)] -N,N-ジメチルアンモニウムヨージド(DOHME)、Lipofectin(DOTMA+DOPE、ライフ テクノロジーズ社：Life Technologies Inc.、ゲチスバーグ、メリーランド州) 、Lipofectamine(DOSPA+DOPE、ライフテクノロジーズ社、ゲチスバーグ、メリー ランド州)、Transfectace（ライフテクノロジーズ社、ゲチスバーグ、メリーラ ンド州）、Transfectam(プロメガ社:Promega Inc.、マジソン、ウィスコンシン 州)、Cytofectin(ライフテクノロジーズ社、ゲチスバーグ、メリーランド州)を 含む。他の代表的なカチオン性脂質には、限定するわけではないが、ホスファチ ジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、グリセロ-3-エチルホスファチ ジルコリンおよびそれらの脂肪アシルエステル、ジ-およびトリメチルアンモニ ウムプロパン、ジ-およびトリエチルアンモニウムプロパンおよびそれらの脂肪 アシルエステルを含む。この群からの好適な誘導体は、N-[1-(2,3-ジオレオイル オキシ)プロピル]-N,N,N- トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)である。さらに広範な合成カチオン 性脂質が、本発明に有用な化合物として機能する。これらには、１つ以上の塩基 性官能基を含むように誘導化された通例の天然脂質を含む。そのように修飾でき る脂質の例には、限定するわけではないが、ジメチルジオクタデシルアンモニウ ムブロミド、スフィンゴ脂質、スフィンゴミエリン、リソリピッド、ガングリオ シドＧＭ１のような糖脂質、スルファチド、グリコスフィンゴ脂質、コレステロ ールおよびコレステロールエステルおよび塩、N-スクシニルジオレオイルホスフ ァチジルエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール、1,3-ジパルミ トィル-2-スクシニルグリセロール、1,2-ジパルミトイル-sn-3-スクシニルグリ セロール、1-ヘキサデシル-2-パルミトイルグリセロホスファチジルエタノール アミンおよびパルミトイルホモシステインを含む。 本発明に有用な他の合成カチオン性脂質は、1995年2月2日に出願した係属中の 米国特許出願第08/391,938号明細書に開示されたものであり、そして例えば、N, N'-ビス(ドデシルアミノカルボニルメチレン)-N,N'-ビス((-N,N,N-トリメチルア ンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン)エチレンジアミンテトラヨージド ：N,N''-ビス(ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン)-N,N',N''-トリス((N,N, N-トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレンジ-エチレントリア ミン ヘキサヨージド：N,N'-ビス(ドデシルアミノカルボニルメチレン)-N,N''- ビス((-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルアミノカルボニルメチレン)シクロ ヘキシレン-1,4-ジアミン テトラヨージド：1,1,7,7-テトラ-((-N,N,N,N-テトラ メチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン)-3-ヘキサデシルアミノカ ルボニル-メチレン-1,3,7-トリアアザヘプタン ヘプタヨージド：およびN,N,N',N-テトラ((-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチ ルアミノカルボニルメチレン)-N'-(1,2-ジオレオイルグリセロ-3-ホスホエタノ ールアミノカルボニルメチレン)ジエチレントリアミンテトラヨージドを含む。 当業者は、陽性に荷電した部分を持つ無数の他の天然および合成の変異体も、本 発明で機能すると認識するだろう。 また本発明においてキャリアーとして有用であるのは、広範な種々の界面活性 剤（すなわち表面−活性剤）であり、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル（ポ リオキシエチレン脂肪酸エステルのような）、ポリオキシアルキレン脂肪アルコ ール（ポリオキシエチレン脂肪アルコールのような）、ポリオキシアルキレン脂 肪アルコールエーテル（ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルのような） 、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪エステル（例えば、TWEEM(商標)と呼ば れる化合物、ICIアメリカズ社:ICI Americas Inc.、ウィルミントン、デラウエ ア州から市販されている）を含み、ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピ レン）コポリマー（Pluronicのような）、ポリソルベート(Tween20、Tween40お よびTween80のような)、ポリオキシエチレンアルコール（Brijのような）および プラスマロゲンを含み、この用語は加水分解で高級脂肪アルデヒド（例えばパル ミタル）を遊離し、そして血液凝固において、血小板の特別な機能に関連する、 血小板に存在する多数のリン脂質群に適用され、そしてプラスマロゲンはまた、 筋肉の細胞膜および神経繊維のミエリン鞘にも存在する。 本発明の好適な態様では、有機ハロゲン化物は、小胞キャリアーがＤＮＡのよ うな送達される化合物と複合化するためにも使用される小胞の芯（コア）に組み 込まれる。 本発明でキャリアーとして好ましく使用できる広い種類の油には、限定するわ けではないが、ベニバナ、ダイズおよびピーナッツ油を含む。組成物は所望によ り、水中油型の乳液の状態をとってもよい。 最も好適なキャリアーは、カチオン性脂質（カチオン性リポソームを含む）で あり、特に水性環境中で使用される。好適なカチオン性脂質は、天然のフソジェ ニック(fusogenic)な脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン( DOPE)との混和物である。好適な脂質対有機ハロゲン化物の比率は、５：１（重 量／重量）である。好適な態様は、脂質またはポリマーを、脂質であるジパルミ トイルホスファチジルコリン(DPPC)、ポリエチレングリコール5000に結合したジ パルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE-PEG5000)およびジパルミト イルホスファチジン酸(DPPA)を用いて形成された微小球のような有機ハロゲン化 物−充填微小球として形成することである。DPPC:DPPE-PEG5000:DPPAは、約82％ ：８％：10％（モル％）または83％：８％：５％の比率で組み合わせることがで きる。DPPE-PEG5000は、約20％：80％（重量％）の比率のDPPEおよびPEG5000か らなる。PEG5000は、約5000の平均分子量を有するPEGを言う。 本発明に従い、キャリアーとして有用なタンパク質（ペプチドを含む）は、ペ プチド結合のα−アミノ酸から成る、そして好ましくは本質的にそれからなる分 子を含む。本発明ではキャリアーとして、天然、合成または半−合成タンパク質 を含む広範なタンパク質を使用することができる。用語「タンパク質」の中には 、アルブミン、グロブリンおよびヒストンのような球状タンパク質およびコラー ゲン、エラスチンおよびケラチンのような繊維状タンパク質を含む。また、核タ ンパク質、ムコタン パク質、リポタンパク質および金属タンパク質のような、タンパク質分子が非タ ンパク質分子と結合している「化合物タンパク質」も含まれる。好ましくいタン パク質様高分子には、例えばアルブミン、コラーゲン、ポリアルギニン、ポリリ シン、ポリヒスチジン、γ-グロブリンおよびβ-グロブリンを含み、アルブミン 、ポリアルギニン、ポリリシンおよびポリヒスチジンがより好ましい。フッ素化 ペプチドおよび合成擬ペプチドも、有用なキャリアーである。本発明で有用なフ ッ素化ペプチドは、Lohrmannの米国特許第5,562,892号明細書により記載されて いるものを含み、その開示内容は全部、引用により本明細書に編入する。カチオ ン性ペプチドも、本発明でキャリアーとして有用に使用できる。本発明の使用に 適する種々のペプチドは、本開示に基づき、当業者には明らかであろう。 本発明の方法は、タンパク質、ペプチドおよび／またはそれらの誘導体から形 成された小胞または他の組織化された安定な形態も含むことができる。タンパク 質から形成され、そして本発明の方法に適する小胞は、例えばFeinsteinの米国 特許第4,572,203号、同第4,718,433号および同第4,774,958号明細書、ならびにC ernyら、米国特許第4,957,656号明細書に記載され、各々の開示内容は全部、引 用により本明細書に編入する。上記特許明細書に記載されたものに加えて、他の タンパク質に基づく小胞は、当業者がいったん本開示から準備を始めれば明らか となるだろう。 タンパク質に基づく小胞の調製のために、上記の特許明細書中に記載された方 法の中には、タンパク質溶液の超音波処理が含まれる。好適な形態では、出発材 料は、熱−変性性の水溶性の生体適合タンパク質水溶液であり得る。タンパク質 のカプセル化は、好ましくは熱−感受性であ り、そのためタンパク質は超音波処理中に加熱で一部不溶化され得る。適当な熱 −感受性タンパク質には、例えばアルブミン、ヘモグロビン、コラーゲン等があ る。好ましくはタンパク質はヒトのタンパク質であり、ヒト血清アルブミン（HS A）がより好ましい。HSAは滅菌５％水溶液として市販されており、これはタンパ ク質に基づく小胞の調製に使用するために適している。もちろん、当業者には他 の濃度のアルブミン、ならびに熱−変性性の他のタンパク質も小胞を調製するた めに使用できることが明らかであろう。一般的に言うと、HSA濃度は変動でき、 そして約0.1〜約25重量％の範囲でよく、そしてすべての組み合わせおよびサブ コンビネーションの範囲がその中にある。タンパク質に基づく特定の小胞の調製 法との関連で、希釈水溶液状態のタンパク質を利用することが好ましいかもしれ ない。アルブミンに関して、約0.5〜約7.5重量％のアルブミンを含有する水溶液 を使用することが好適であり、約５重量％未満の濃度が好ましく、例えば約0.5 〜約３重量％の範囲が好ましい。 タンパク質に基づく小胞は、市販の装置を使用して調製できる。例えば、Cern yらの米国特許第4,957,656号明細書に記載されているような送り調製操作(feed preparation operation)との関連では、ウォーカー ステンレス エクイップメ ント社(Walker Stainless Equipment Co、ニューリスボン、ウィスコンシン州) から販売されているステンレス鋼タンクおよびミリポア（Millipore、ベットフ ォード、マサチューセッツ州）から販売されているプロセスフィルターを使用で きる。 超音波処理操作は、熱交換およびフロースルー型の超音波処理容器の両方を連 続して利用することができる。この種の熱交換装置は、ITTスタンダード（ITT S tandard、バッファロー、ニューヨーク州）から得る ことができる。熱交換器は、媒体の組成に依存して超音波工程の操作温度を維持 し、温度制御は約65℃〜約80℃の範囲である。超音波装置の振動周波数は、例え ば約５〜約40キロヘルツ(kHz)の広い範囲で変動でき、大部分の市販されている 超音波装置は約10または20kHzで操作する。適当な超音波処理装置には、例えば フラットチップ型ソニケーターホーン(flat-tipped sonicator horn)を装備した ソニックス アンド マタリアルズ社(Sonic & Materials Inc.、ダンバリー、コ ネチカット州)から市販されているソニックス アンド マタリアルズVibra-Cell がある。ソニケーターホーンに供給される電力は、製造元のソニックス アンド マタリアルズVibre-Cell Model VL 1500により、１〜10の設定スケールの電力範 囲で変動できる。例えば５〜９の中間的な電力設定も使用できる。供給される振 動周波数および電力は、超音波処理される液体中でキャビテーションを生成する のに十分であることが好ましい。供給流速は、約50mL／分〜約1000mL／分の範囲 でよく、そしてすべての組み合わせおよびサブコンビネーションがこの範囲内に ある。超音波処理容器中での滞留時間は、約１秒〜約４分の範囲であることがで き、そしてガス状流体添加速度は、１分あたり約10単位立方センチメートル(cc) から約100cc／分、また５％〜25％の供給流速度の範囲でよく、そしてすべての 組み合わせおよびサブコンビネーションがこの範囲内にある。 超音波処理は、溶液の発泡、そして特に強力な発泡が生じる様式で行われるこ とが好ましい。一般的に言って、強力な発泡およびエーロゾル化は、増強された 濃度および安定性を有するコントラスト剤を得るために重要である。発泡を促進 するために、ソニケーターホーンに出力される電力を増すことがてき、そして工 程を例えば約１〜約５psiの穏やか な圧力下で操作することができる。発泡は溶液の曇った外観、および生成した泡 から容易に検出できる。 そのような超音波法は、当業者には明らかであるように、脂質に基づく、また は他の種類のキャリアーを調製するためにも使用できる。 タンパク質に基づく小胞を調製するための適当な方法には、水溶液中で物理的 および化学的にタンパク質またはタンパク質誘導体を改変し、材料を変性または 固定することが関与する。例えば、タンパク質に基づく小胞は、５％ＨＳＡ水溶 液から、超音波処理を介してコントラスト剤を形成している間、または後に加熱 することにより調製できる。化学的改変にはタンパク質を二官能性アルデヒド（ グルタルアルデヒドのような）で結合することにより、化学的に変性または固定 することが関与する。例えば、小胞を１グラムのタンパク質当たり0.25グラムの 50％グルタルアルデヒド水と、pH4.5で6時間反応させることができる。次に未反 応のグルタルアルデヒドを、タンパク質から洗い出すことができる。 キャリアーは、天然、合成または半合成ポリマーを用いて形成することもでき る。本発明でキャリアーとして使用できる広範なポリマーには、ポリエチレン（ 例えば、ポリエチレングリコールのような）、ポリオキシエチレン（例えばポリ オキシエチレングリコールのような）、ポリプロピレン（例えばポリプロピレン グリコールのような）、プルロン酸およびアルコール、ポリビニル（例えばポリ ビニルアルコールのような）およびポリビニルピロリドンを初めとする合成ポリ マーが含まれる。本発明の使用に適する天然ポリマーの例には、多糖がある。多 糖には、例えばアラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン 、グルカン、マンナン、キシラン（例えばイヌリンのような）、レバン、 フコイダン、カシゲーナン、ガラクトカロロース、ペクチン（高メトキシペクチ ンおよび低メトキシペクチンを含む：低メトキシペクチンは、40％未満のカルボ ン酸基がエステル化および／またはアミド化されているペクチンを表し、そして 高メトキシペクチンは、40％以上のカルボン酸基がエステル化および／またはア ミド化されているペクチンを表す）、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリ コーゲン、アミロペクチン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、メドロ キシプロピルメチルセルロース、デキストラン、プツラン、キチン、アガロース 、ケラタン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸およびアルギン酸、な らびに以下の１つ以上のアルドース、ケトース、酸またはアミンを含むような種 々の他のホモポリマーまたはヘテロポリマー：エリトロース、トレオース、リボ ース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グル コース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトル ロース、リブロース、キシルロース、ピシコース、フルクトース、ソルボース、 タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌ ロン酸、グルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸を含む 。幾つかのポリマーは、天然に存在するポリマーを化学的に修飾することにより 製造できることが分かる。そのような化学的に修飾された天然ポリマーも、半合 成ポリマーと呼ぶ。利用するポリマーはフッ素化ポリマーを含んで成るものでも よく、Lohrmannの米国特許第5,562,892号明細書に記載のものを含み、その開示 内容は全部、引用により本明細書に編入する。さらにポリマーは例えば、Unger の米国特許第5,205,290号明細書に記載されているような小胞状でもよく、その 開示内容は全部、引用により本明細 書に編入する。本明細書で使用する、用語「ポリマー」は、２つ以上の反復単位 の化学結合から形成される分子を示し、そしてダイマー、トリマーおよびオリゴ マーを含む。好適な態様では、「ポリマー」は、10以上の反復単位を含んで成る 分子を言う。 金属イオンもキャリアーとして本発明に利用できる。適当な金属イオンには、 カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン等、ならびに多種の無機化 合物を含む。他の適当な金属イオンならびに他の適当な無機化合物は、いったん 本開示から準備し始めれば、当業者には容易に明らかとなるだろう。 本発明にキャリアーとして採用できる他の有用な薬品は、所望する特別な組成 に依存して、浸透剤、抗生物質、増粘剤、沈殿防止剤、保湿剤および抗保湿剤が 含まれる。 １つ以上の乳化剤または安定化剤をキャリアーとして、またはキャリアー中に 使用することもできる。これらの薬品は、有機ハロゲン化物および／または組成 物を形成した送達されるべき化合物の任意の個別の単位（例えば、液滴、粒子、 ガス泡等）のサイズを維持するために役立つ。これら個別の単位のサイズは、一 般的に任意のガス前駆体から形成され得る生成するガス泡のサイズに影響を及ぼ す。乳化剤および安定化剤は、一般的に有機ハロゲン化物、送達される化合物等 を被覆するか、または安定化するためにも使用できる。安定化は、細胞内送達効 果を最大にするために望ましい。安定化は好ましいが、絶対に必要なわけではな い。有機ハロゲン化ガス前駆体から生成するガスは空気よりも安定であるため、 それらが有用な送達手段を提供するようにさらに設計することができる：例えば 、１つ以上のコーティングまたは乳化剤により特別に安定 化されていない時でさえも、ガスは末梢静脈注射後に肺循環を通過する。１つ以 上のコーティングまたは安定化剤は好ましいが、それらは柔軟な安定化材料とし てである。多糖、ガングリオシドおよびポリマーにより安定化される組成物は、 一般的にアルブミンおよび他のタンパク質により安定化されたものよりは効果的 であることに注目されたい。また脂肪族化合物を使用して調製されたリポソーム は、これらの化合物により安定化された微小球が圧力変化に対してより一層柔軟 で、しかも安定であることから好適である。 本発明のキャリアーは、広範な粘度調整剤も含んで成ることができ、それらに は限定するわけではないが炭水化物およびそれらのリン酸化およびスルホン化誘 導体：好ましくは400から8000の分子量範囲を有するポリエーテル；ジ-およびト リヒドロキシアルカンおよびそれらのポリマー、好ましくは800から8000の間の 分子量範囲を有するものを含む。グリセロールプロピレングリコール、ポリエチ レングリコール、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコールも、本発明 のキャリアーまたは安定化剤として有用である。ヒドロキシアパタイト、金属酸 化物およびゲルの共沈物（例えばヒアルロン酸とカルシウム）のような多孔性ま たは半固体の粒子を使用でき、そして本発明の組成物を安定化するための中心ま たは種を形成することができる。 乳化剤および／または可溶化剤も、特に脂質またはリポソームと組み合わせて キャリアー中に使用できる。そのような薬品には限定するわけではないが、アカ シア、コレステロール、ジエタノールアミン、グリセリル モノステアレート、 ラノリンアルコール、レシチン、モノ-およびジ-グリセリド、モノ-エタノール アミン、オレイン酸、オレイルアル コール、ポロキサマー、ポリオキシエチレン50ステアレート、ポリオキシル35ひ まし油、ポリオキシ10オレイルエーテル、ポリオキシ20セトステアリルエーテル 、ポリオキシ40ステアレート、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソル ベート60、ポリソルベート80、プロピレングリコールジアセテート、プロピレン グリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウ ム、ソルビタン、ソルビタン モノ-ラウレート、ソルビタン モノ-オレート、ソ ルビタン モノ-パルミテート、ソルビタン モノステアレート、ステアリン酸、 トロラミンおよび乳化ワックスを含む。植物または動物起源の脂質に見いだされ る飽和または不飽和炭化水素脂肪酸の代わりに、ペルフルオロ脂肪酸を含むすべ ての脂質を脂質の成分として使用してよい。脂質またはリポソーム溶液に特に有 用な沈殿防止剤および／または増粘整剤は、限定するわけではないがアカシア、 カンテン、アルギン酸、モノ−ステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、マグ マ、カーボマー934P、カルボキシメチルセルロース、カルシウムおよびナトリウ ムおよびナトリウム12、グリセロール、カラゲーナン、セルロース、デキストリ ン、ゼラチン、グアガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメ チルセルロース、珪酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン 、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、プロピレングリコ ール、アルギネート、二酸化珪素、アルギン酸ナトリウム、トラガカントおよび キサンタンガムを含む。本発明の好適な生成物は、８：１：１または９：１：１ の比率の生理食塩水：グリセロール：プロピレングリコール混合溶媒系として脂 質を包含する。 当業者が本開示を入手すれば認識するように、本発明と関連して使用 されるキャリアー材料の量は変動してよく、そして使用する特定のキャリアー、 送達されるべき化合物の種類および性質、年齢、体重、処置する細胞または患者 （動物）、目的とする特定の診断的、治療的または他の応用（もしあるならば、 処置すべき疾患状態を含む）、および使用する有機ハロゲン化物（もし使用する ならば）のような因子に依存し得る。一般的に、より少ないキャリアーを使用し て、所望の送達効果が得られるまで増加させる。各々の量は、本明細書の実施例 で説明する。もちろん、当業者には認識されるように、より多い、または少ない 量を使用してもよい。 有機ハロゲン化物、送達すべき化合物および／またはキャリアーを混合し、そ して送達すべき化合物を任意の有機ハロゲン化物および／またはキャリアーと、 またはその中に包含するために、広範な種々の方法を使用できる。方法には、手 による震盪、ボルテックス混合、機械的震盪（例えばEspe CapMixを用いて、エ スペ メジジン−デンタル：Espe Medizin-Dental GMBH、シーフィールド、独国 ）、押し出し機（例えばリペックス バイオメンブラン エクストルーダーデバ イス：Lipex Biomembranes Extruder Deviceを用いて、バンクーバー、ブリティ ッシュコロンビア州、カナダ）、ミクロ乳化法（例えばミクロ流動化装置を用い て、マイクロフルイディクス社:Microfluidics Corp.、ニュートン、マサチュー セッツ州）、ラインミキサー中で静電気を用いて混合（コール−パーマーインス ツルメント社：Cole-Parmer Instrument Co.、バーノンヒル、イリノイ州）、噴 霧乾燥（例えばブッシー：Bucchiスプレードライヤーを用いて、ブリンクマンイ ンド社:Brinkmann Ind.,Inc.、ウエストベリー、マサチューセッツ州）、機械的 撹拌／混合（例えばシル バーソンミキサー：Silverson Mixerを用いて、シルバーソンマシーンズ社：Sil verson Machines,Ltd.、ウォーターサイド、チェスハムブックス、英国）および 超音波を含む。一般的に、キャリアー(例えばDPEPCおよびDOPEのような脂質)と 有機ハロゲン化物とを、送達されるべき化合物（例えばDNA）を加える前に混合 することが望ましい。DNAを加えた後、ＤＮＡとキャリアーと有機ハロゲン化物 との会合が形成するだろう。所望により、上記技法の１つの技法によりさらに混 合してもよい。場合によっては、例えばカルシウム沈殿、DNA、有機ハロゲン化 物およびカチオンを、１つ以上の安定化剤と一緒に加えて、DNA／キャリアー／ 有機ハロゲン化物の沈殿を１工程で形成することができる。ここでも上記の種々 の混合技法の１つを、生成する粒子のサイズを下げるために使用できる。 当業者には本開示から準備すれば理解されるように、キャリアーは、送達され るべき化合物および有機ハロゲン化物と種々の量および割合で組み合わせること ができる。典型的には、より少量ですべての構成成分を使用し、そして所望の送 達効果が得られるまで、増分を選択的に増す。一般的には、送達されるべき化合 物をキャリアーと使用する時、有機ハロゲン化物および任意のキャリアー対送達 されるべき化合物の比率は、約６対約１〜約１対約６、およびその間の変数であ る。好ましくは、キャリアー対送達されるべき化合物の割合は、約６対約１であ る。各々の比率は本明細書の実施例で提供する。もちろん、当業者により認識さ れるように、所望により広い範囲にわたる他の比率を適当に採用することができ 、そしてすべてのそのような比率が本発明の範囲内にある。 生成した組成物は、凍結乾燥、すなわちフリーズドライで、吸入また は使用前に水和するための材料として、または懸濁した状態で保存することがで きる。当業者には周知の寒冷沈殿物を、いったん本開示から準備すれば組成物の 凍結乾燥状態で使用できる。凍結乾燥の結果として小胞の凝集または融合を防止 するために、そのような融合または凝集が起こることを防ぐ添加物を含むことが 有用である。有用な添加物には、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウム 、グルコース、トレハロース、ポリビニルピロリドンおよびポリ(エチレングリ コール)(PEG)を含み、例えば約400〜約10,000の分子量を有するPEGポリマー、約 1,000、3000(PEG3350のような)および5,000の分子量を有するPEGポリマーが好適 である。これらのおよび他の添加物は、米国薬局方USP ＸXII、NF ＸVII、米国 薬局方、国民医薬品集、米国薬局方会議社、12601、ツインブロック、パークウ ェイ、ロックビレ、メリーランド州、20852のような文献に記載され、その開示 内容は全部、引用により本明細書に編入する。凍結乾燥調製物は、一般的により 長い使用期限という利点を有する。上記のように、所望により、凍結乾燥組成物 は（好ましくは）使用前に再水和される。 投与経路は、目的とする応用に依存して変化する。細胞培養の応用には、組成 物は例えば細胞を培養基に加えるか、または培養基を直接細胞に適用することに より、典型的には細胞と接触させる。細胞培養基中でのトランスフェクションに ついて、本発明の利点は、血清を含む培地中での高い活性、および他のより複雑 な系よりも高効率のトランスフェクションを有する１工程トランスフェクション 法である点にある。実際に、本発明はトランスフェクションが不可能であるか、 または大変難しかった細胞中での遺伝子発現を得ることを可能とする。インビボ 投与には、 組成物を単に例えば静脈内、血管内、リンパ管内、非経口的、皮下、筋肉内、鼻 内、直腸内、腹腔内、間質内に注射でき、気管には噴霧器を介して、高圧的に、 経口的に、局所的に、あるいは腫瘍内に、あるいは他の様式で投与できる。 １つ以上の標的リガンドを、選択した細胞による取り込みを容易にするために キャリアー中に包含することができる。標的リガンドには、例えばペプチド、抗 体、抗体断片、糖タンパク質、炭水化物等が含まれる。好ましくは標的リガンド は、キャリアー、たとえば脂質に共有結合している。好ましくは標的リガンドは 、キャリアーの表面に付けられたリンカーに付けられる。好適なリンカーはポリ マーであり、例えば約1,000〜約10,000、最も好ましくは5,000の分子量を有する 二官能性ＰＥＧである。一般的には、標的リガンドは約0.1モル％〜約25モル％ 、好ましくは約１モル％〜約10モル％でキャリアーに包含される。 これに関して、組成物は選択した細胞の被覆された壁孔(coated pits)を標的 とすることができ、そしてレセプターが媒介するエンドサイトーシスのプロセス を通してエンドソームに取り込まれる。所望により、超音波エネルギーを標的組 織にかけて、遺伝子を発現し易くすることができる。吸入については、組成物は 噴霧器を介するか、または吸入器を介して吸入することができる。また経口もし くは直腸経路は、これらの組成物を投与するために利用できる。経皮的適用は、 ソノホレシス(sonophoresis)(例えば、10〜100khzの範囲の低周波数の音波)また はイオントホレシス(iontophoresis)を適用して、または適用せずに浸透増強剤 を使用することにより行うことができる。また、間質(例えば腫瘍内)および皮下 注射を行い、組成物を投与することができる。 また本発明は遺伝子銃法または電気穿刺法により、あるいは当該技術分野で周 知な他のトランスフェクション法とを組み合わせて実施することができる。いず れの場合でも、超音波を遺伝子銃または電気穿刺法の前、後および／または同時 に適用することができる。電気穿刺法の電場は、トランスフェクションの効率を さらに上げるために、超音波エネルギーでタンデムにパルス化することができる 。 本発明に従い化合物および組成物は、単独で、または超音波と一緒に投与する ことができる。超音波を使用するならば、超音波は化合物の細胞への取り込みの 誘導を補助するのに十分な周波数およびエネルギーレベルで投与される。有機ハ ロゲン化ガス前駆体が使用される場合、超音波は有機ハロゲン化ガス前駆体をガ スに転換するために十分な周波数およびエネルギーレベルでかけることができる 。例えば、本発明の化合物の細胞への投与には、ヌクレオチド配列（または他の 送達されるべき目的化合物）を細胞に投与し、そしてヌクレオチド配列（または 他の化合物）の取り込みを誘導するために十分な時間、細胞に超音波を適用する ことを含む。化合物の増強された送達（およびヌクレオチド配列が投与された場 合は、ヌクレオチド配列の発現）が生じる。超音波処理は、ヌクレオチド配列の 送達を誘導するために十分な治療に効果的な時間、任意の周波数、エネルギーレ ベルおよび使用率で行われる。適当な周波数、エネルギーレベルおよび使用率は 本明細書に開示され、そして他の範囲は当業者が本開示から準備し始めれば容易 に明らかとなるだろう。 本発明の方法は、種々のタンパク質の遺伝子発現をコードする配列、および種 々のタンパク質の遺伝子発現を遮断するアンチセンス配列の送達を可能にする。 その結果、多くの疾患を本発明のトランスフェクショ ン法により処置できる。さらに本発明のトランスフェクション法は、インビボ、 エクスビボおよびインビトロで実施することができる。 微小球によるヌクレオチド配列の投与は、上記に説明したように微小球に関し て様々な位置で微小球に付けられたヌクレオチド配列を利用する。いずれかの理 論により拘束されることを望まないが、微小球法はヌクレオチドを含有する微小 球と宿主細胞の形質膜の様式に依存していると考えられる。ヌクレオチド配列は 、続いて細胞質を移動し、そして核に入る。微小球の使用により、宿主細胞、組 織および患者に対する毒性効果はもたらされない（インビボ使用の場合）。 本発明の方法に従う細胞内送達およびトランスフェクションは、インビボ、エ クスビボおよびインビトロで行うことができる。上記３つの手法には、処理すべ き細胞が患者から取り出されるヒトの遺伝子治療が含まれる。細胞を適当なヌク レオチド配列で処理し、そして超音波を用いたトランスフェクションを細胞培養 物で行う。トランスフェクトされた細胞を、適切なタンパク質の遺伝子発現に関 して分析する。遺伝子発現により測定された成功裏にトランスフェクトされた細 胞は、次に患者の体内に戻される。超音波を用いたトランスフェクションにより 、遺伝子治療による疾患の処置が行われる。本発明の方法を用いて処置される疾 患には、限定するわけではないが、後天的免疫不全症候群、自己免疫疾患、慢性 ウイルス感染、血友病、筋ジストロフィー、嚢胞性繊維症、糖尿病、アテローム 性動脈硬化症、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、腎臓癌、黒色腫、神経 繊維腫および乳癌を含む。当業者には本発明の開示を読めば明らかであるように 、もちろん多くの他の疾患も、本発明の方法を用いて処置することができ、その ようなすべての疾患の処置 は本発明の範囲内にあると考える。 本発明において、例えば超音波、砕石法衝撃波および体温上昇の状態での熱の 使用は、化合物を送達する（例えば治療を目的としてヌクレオチド配列を細胞へ ）目的において有用である。ヌクレオチド配列の細胞への導入は、配列をゲノム に取り込む第１段階である。そのようなトランスフェクション法は、ヌクレオチ ドを含む化合物の細胞への送達の誘導において、有用な超音波周波数の範囲を試 験することと組み合わせて有用である。 本発明の各方法は、インスリンのセンスまたはアンチセンス配列の全部または 一部(GiddingsおよびCarnaghi、Mol.Endocrinol.1990 4:1363-1369)、Bcl 2(Tsu jimoto.Yら、PNAS,USA 1986,83:5214-5218)、ヒト白血球抗原(Trucco,G.ら、Dia betes 1989,38:1617-1622)、チミジンキナーゼ(Axel,R.ら、J.Supramol.Struct. 1979,8(補追３):41)、HLA-B7、第VIII因子(Higuchi,M.ら、Genomics 1990,6:65- 71)、ras/p53(Arai,N.ら、Mol.Cell.Biol 1986,6:3232-3239、Mitsudomi,T.ら、Chest 1993,104:362-365)、高密度リポタンパク質(hdl)、黄体形成ホルモン放出 ホルモン(Maier,C.C.ら、Cell Mol Neurobiol 1992,12:447-454)、および黄体形 成ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、限定するわけではないがインスリン− 様増殖因子−１のような抗腫瘍剤(IGF-1,Barnes,M.ら、Obsterics and Gynecolo gy 1997,89:145-155)、抗-IGF-1(公開された独国特許出願第2241703号明細書か ら公開されたヒトIGF-1遺伝子断片、GeneBank寄託番号A29119)、抗-K-ras(イヌ 脾臓mRNA 212ヌクレオチド、GeneBank寄託番号S42999)、抗-c-fos(ラット:Rattu s norvegicus、プラージ ダウレイ：Sprague Dawley c-fos遺伝子、５’平滑領 域、GeneBan k寄託番号U02631)、bcr-abl(Barnes,M.ら、Obstetrics and Gynecology 1997,89 :145-155)、c-mys(マウスc-myc遺伝子、エキソン１および２ GeneBank寄託番号 L00038、J00373およびJ00374)、c-mycプロモーター(Barnes,M.ら、Obstetrics a nd Gynecology 1997,89:145-155)、erbB-2プロモーター(Barnes,M.ら、Obstetri cs and Gynechology 1997,89:145-155)、erbB2プロモーター−シトシンデアミナ ーゼ(ヒトc-erb B2/neuタンパク質遺伝子、部分的cDNA(cds)GeneBank寄託番号M9 5667)のような抗腫瘍剤、ならびに限定するわけではないが抗-ヒトパピローマウ イルス(HPV)、HIVenv+rev(HIV １型、BTSPR単離物、env遺伝子、C2V3領域、部分 的cds GeneBank寄託番号U53195)、tar/Td-rev(HIV １型、rev-1遺伝子、5'末端G eneBank寄託番号M38031、合成HIV TAR、5'末端GeneBank寄託番号M27943)のよう な抗-ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、リボザイム、ゼータ−チンパンジーレセプタ ー等、ならびに限定するわけではないがインターロイキン２(IL-2)(ヒト脳MRNA 418ヌクレオチドGeneBank寄託番号S77835)、インターロイキン４(Arai,N.ら、J. Immumol 1989,142:274-282)、インターロイキン７(ヒト遺伝子、エキソン１Gene Bank寄託番号M29048)、インターロイキン12(IK-12p35遺伝子のマウス5'平滑末端 領域GeneBank寄託番号D63334)、インターロイキン４(ヒトIL-4遺伝子、完全なcd s GeneBank寄託番号M23442)、インターロイキン６（核因子NF-IL-6のヒト遺伝子 GeneBank寄託番号X52560)のようなサイトカイン類をコードする配列の全部また は一部；gp130(LIFレセプター/IL-6レセプター複合体成分MRNA 150ヌクレオチド GeneBank寄託番号S80479)、インターロイキン６レセプター、顆粒球マクロファ ージコロニー刺激因子(GM-CSF)(ヒトGM-CSF因子、5'平滑/プロモータ ー領域GeneBank寄託番号U31279)、インターフェロンガンマ（ヒト免疫IFN-γ遺 伝子、完全なcds GeneBank寄託番号J00219、M37264、V00536）を含むインターフ ェロン、腫瘍壊死因子ベータ、TNF-β、(TNF-β遺伝子のヒト5'配列GeneBank寄 託番号X59351))、血管内皮増殖因子(VEGF)、ヒト成長ホルモン(hGH、Fidders,J. C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)1979 76:4294-4298)、コロニー刺激因子、第VI II因子、第IX因子、第Ｘ因子等を含む。本発明の方法に有用な他の配列は、ハン マーヘッド型２次構造を有することができる触媒的RNAを含むリボザイム(Bratty ら、Biochem.Biophys.Acta 1993 1216:345-349およびMcKay,D.B.,RNA 1996 2:39 5-403)、c-myc、c-myb、限定するわけではないがヒト腫瘍抗原p53(5'末端GeneBa nk寄託番号M26864)のような腫瘍抑制遺伝子、限定するわけではないが多剤耐性 タンパク質(MDR)(ヒトmdr1遺伝子GeneBank寄託番号X78081)をコードするような ケモプロテクション(chemoprotection)を提供する遺伝子、限定するわけではな いがHLA-B7(ベータ２マイクログロブリン)(マウスMHCクラスＩ HLA-B7遺伝子、5 '平滑領域GeneBank寄託番号M35971)、がん胎児性抗原(CEA)(ヒト5'領域GeneBank 寄託番号U17131)の抗原過剰発現遺伝子、限定するわけではないがチミジンキナ ーゼ(TK)(TKおよびプロモーター領域をコードするヒトTK遺伝子GeneBank寄託番 号M13643)のような自殺遺伝子、Ras、限定するわけではないが嚢胞性繊維症膜貫 通調節タンパク質(CFTR)(ヒトCFTR遺伝子、エキソン１ GeneBank寄託番号M55106 およびM55499)、アデノシンデアミナーゼ(ADA)(ヒトADA遺伝子、完全なcds Gene Bank寄託番号M13792)のような遺伝子相補遺伝子、グルコセレブロシダーゼ、IRA P/TK(IRAPのヒトMRNAGeneBank寄託番号X53296)、血管内皮増殖因子(VEGF)(ハツ カネズミ： mus musculus VEGF遺伝子、部分的cdsおよびプロモーター領域GeneBank寄託番号 U41383)、LDLR(ヒトLDLレセプター遺伝子断片GeneBank寄託番号M60949)、ファン コーニ貧血相補群Ｃ(FACC)(ヒトFACC遺伝子5'領域GeneBank寄託番号X83116)、p4 7-phox(ヒトP47 LBC癌遺伝子MRNA、完全なcds GeneBank寄託番号U03634)、第IX 因子(ヒト第IX因子、エキソン１ GeneBank寄託番号K02048)、α-１アンチトリプ シン(ヒトα-１アンチトリプシン遺伝子Ｓ変異体、完全なcds GeneBank寄託番号 K02212)、α-１ィジュロニダーゼ(iduronidase)(ヒト イジュロニダーゼ遺伝子 配列GeneBank寄託番号M88001)、およびイジュロネートスルファターゼ(Ids)(ハ ツカネズミ:Mus musculus Ids MRNA、完全なcds GeneBank寄託番号L07921)、な らびに限定するわけではないがNeoRおよびLacZのような遺伝子マーカー(バクテ リオファージT4 td遺伝子、エキソン２、３'末端；ORF2、完全なcdsおよびORF3 、５'末端GeneBank寄託番号M22627、およびクローニングベクターpZEO(隔離SVLa cZ)、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子、フェレオマイシン(Phleomycin)/ゼオ シン(zeocin)−結合タンパク質(ShBle)遺伝子、（完全なcds GeneBank寄託番号L 36850)を含む。 特定のタンパク質をコードするDNAは、多くの異なる種類の疾患の処置に使用 できる。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ADA欠損症を処置するために提供 でき；腫瘍壊死因子および／またはインターロイキン-２は進行した癌を処置す るために提供でき：HDLレセプターは肝臓疾患を処置するために提供でき：チミ ジンキナーゼは卵巣癌、脳腫瘍またはHIV感染を処置するために提供でき：HLA-B 7は悪性黒色腫を処置するために提供でき：インターロイキン-２は神経繊維腫、 悪性黒色腫または 腎臓癌を処置するために提供でき：インターロイキン-４は癌を処置するために 提供でき：HIV envはHIV感染を処置するために提供でき：アンチセンスras/p53 は肺癌を処置するために提供でき：そして第VIII因子は血友病Ｂを処置するため に提供できる。例えば、Thompson,L.,Science,1992,258,744-746を参照にされた い。上記の同定されたタンパク質のヌクレオチド配列は、GENEBANKを含む科学文 献から入手でき、そして当業者には周知である。 コーディング配列またはアンチセンス配列に加えて、細胞に投与されるヌクレ オチド配列は、配列の発現を補助するさらなる配列を含んでよい。適当な発現ベ クター、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素は、当該技術分野 では周知であり、そしてSambrookら、モレキュラークローニング：ア ラボラト リーマニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、第２版、コール ドスプリングハーバーラボラトリー出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press )、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、(1989)に見いだすことができ る。限定するわけではないが、SV40、RSV、CMV、cd5k、IL5R α pgk-1、srα、T K等のプロモーターは、本発明に有用である。転写および／または翻訳調節要素 は、この配列に操作可能に結合することができる。例えば上流位置中に、プロモ ーター続いてリボゾーム結合部位および開始コドンを含んで成る翻訳開始シグナ ル、そして下流位置中に転写終止シグナルを配置することができる。転写および 翻訳調節要素は、任意の機能的組み合わせまたは順序で連結できる。本発明の特 定の態様において使用する転写および翻訳調節要素は、発現系を作成するために 発現ベクターが導入される細胞の種類に関して選択されるだろう。本発明の使用 に適するプ ロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素の選択、および発現ベクター の調製は、本開示から準備は始めれば当該技術分野の範囲内である。また、配列 を組み込んだ発現ベクターの宿主細胞への導入は、当該技術分野で周知の様々な 方法で行われる。 哺乳動物細胞は、当業者には周知であり、そして上記のSambrook（同上）に説 明した種々の媒質、緩衝液および化学品を加えることにより、遺伝子治療用のDN Aをより取り込み易くすることができる。ヌクレオチド配列のインビボ投与には 、所望により、１つ以上の配列を含むことができる。例えば、１つのキャリアー が１つ以上の配列を含むことができ、または異なる配列を含有するキャリアーを 同時に投与することができる。さらに、１つの配列がキャリアー中で送達され、 そして別の裸の配列を同時投与してもよい。それらの発現を増すために、プロモ ーター配列のようなさらなる配列は、治療的に送達される配列と一緒に送達する ことができる。例えば熱ショックタンパク質のヌクレオチド配列は、第２遺伝子 配列の発現を増すために使用できる、アップレギュレイティング遺伝子配列(upr egulating gene sequence)の１例である。 広範な種々の化合物（遺伝物質に加えて）も、本発明の方法に従い細胞に送達 することができる。そのような他の化合物には、種々の他の生活性剤を含む。本 明細書で使用するように、「生活性剤」とは、例えば患者に疾患があるかないか を診断するための方法、または患者の疾患を処置するため方法に於けるような、 治療または診断的性質の応用との関係で使用できる任意の物質を言う。本明細書 で使用する「生活性剤」とは、インビトロ、インビボおよび／またはエクスビボ で生物学的な効果を現すことができる物質も言う。この生活性剤は、所望により 中性また は正もしくは負に荷電している等でよい。適当な生活性剤には、診断薬および医 薬品を含み、薬剤、合成有機分子、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ステロイ ド、ステロイド同族体；およびヌクレオシド、ヌクレオチドおよびポリヌクレオ チドを含む遺伝物質も含む。 本明細書で使用する句「診断薬」とは、患者の内部を造影するための方法、お よび／または患者に疾患があるかないかを診断するための方法との関連で使用で きる任意の薬品を言う。診断薬の例として、例えば患者の超音波造影、磁気共鳴 造影またはコンピューター断層撮影法との関連で使用するためのコントラスト剤 を含む。診断薬には、造影法を使用してもしなくても、患者の疾患または他の症 状の診断を容易にするために有用な別の薬品も含む。 本明細書で使用する「医薬品」または「薬剤」は、患者の疾病、痛み、疾患ま たは怪我の処置（予防、診断、寛解、または治癒を含む）の治療用または予防用 の薬剤を言う。治療に有用なペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは 、種々の他の治療に有用な有機または無機化合物と同様に、用語、医薬品または 薬剤の意味に含まれる。 本発明の方法により送達できる医薬品の特別な例には、限定するわけではない が以下のものを含む：ビンカアルカロイドのような有糸分裂阻害剤、放射性ヨウ 素、リンおよびコバルト同位体のような放射性医薬品；プロゲスチン、エストロ ゲンおよびアンチエストロゲンのようなホルモン；抗蠕虫剤、抗マラリア剤およ び抗結核剤；免疫血清、アンチトキシンおよびアンチベニンのような生物製剤； 狂犬病予防生成物；細菌ワクチン；ウイルスワクチン；アミノグリコシド；キサ ンチン誘導体、テオフィリンおよびアミノフィリンのような呼吸製剤；ヨウ素塩 および抗 −甲状腺剤のような甲状腺治療剤；錯化剤および水銀利尿剤および強心性グリコ シドを含む心血管製剤；グルカゴン；非経口鉄、ヘミン，ヘマトプロフィリンお よびそれらの誘導体のような血液製剤；ペプチド、抗体および抗体断片のような 標的リガンド；ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド、微生物細胞壁成分 、リンホカイン（例えばリポポリサッカライドのような細菌エンドトキシンおよ びマクロフィージ活性化因子）のような生物反応モディファイヤー；細菌サブユ ニット（マイコバクテリアおよびコリネバクテリアのような）；合成ジペプチド N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン；ケトコナゾール、ナイス タチン、グリセオフルビン、フルシトシン(5-fc)、ミコナゾールおよびアンホテ リシンBのような抗カビ剤；リシンのような毒素；シクロスポリンのような免疫 抑制剤；β-ラクタムおよびスルファゼシンのような抗生物質；成長ホルモン、 メラノサイト刺激ホルモン、エストラジオール、ジプロピオン酸ベクロメタゾン 、ベータメタゾン、酢酸ベータメタゾン、リン酸ベータメタゾンナトリウム、リ ン酸ベータメタゾン２ナトリウム、リン酸ベータメタゾンナトリウム、コルチゾ ンアセテート、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナ トリウム、フルニソリド、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコ ルチゾンシピオネート、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコ ルチゾンナトリウム、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハ ク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢 酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテー ト、プレドニゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアム シノロンジアセテート、トリアムシノ ロンヘキサセトニド、酢酸フルドロコルチゾン、オキシトシンおよびバソプレッ シンのようなホルモン、ならびにそれらの誘導体；ニコチン酸シアノコバラミン のようなビタミン；レチノイドおよびレチノールパルミテートおよびα-トコフ ェノールのような誘導体；ペプチドおよび過酸化マンガンジスムターゼおよびア ルカリホスファターゼのような酵素；アメレキサノックスのような抗−アレルゲ ン剤；フェンプロクーモンおよびヘパリンのような抗凝血剤；組織プラスミノー ゲンアクチベーター(TPA)、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ；プロプラ ノルオールのような循環剤；グルタチオンのような代謝増強剤；p-アミノサリチ ル酸、イソニアジド、カプレオマイシンサルフェートシクロセリン、エタンブト ールヒドロクロライドエチオンアミド、ピラジンアミド、リファンピン、ストレ プトマイシンサルフェートダプゾン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、セ フラクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファドリンエリスロマイシ ン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、バカ ンピシリン、カルベニシリン、ジクロキシシリン、シクラシリン、ピクロキシシ リン、ヘタシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン（Ｇお よびＶ）、チカルシリン、リファンピンおよびテトラサイクリンのような抗生物 質；アシクロビル、ＤＤＩ、フォスカルネ、ジドブジン、リバビリンおよびビダ ラビン１水和物のような抗ウイルス剤；ジリアゼン、ニフェジピン、ベラパミル 、エリトリトールテラニトレート、イソソルビド、ジニトレート、ニトログリセ リン（グリセリルトリニトレート）およびペンタエリトリトールテトラニトレー トのような抗狭心症剤；ジフルイザル、イブプロフィン、インドメタシン、メク ロフェナメート、メフェナム酸、 ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリ ンダック、トルメチン、アスピリンおよびサリチレートのような抗炎症剤；クロ ラクイン、ヒドロキシクロラクイン、メトラニダゾール、キニンおよびメグルミ ンアンチモネートのような抗原虫剤；ペニシラミンのような抗リューマチ剤；ア ヘン安息香チンキのような麻酔剤；コデイン、ヘロイン、メタドン、モルホリン およびオピウムのようなアヘン剤；デスラノシド、ジギトキシン、ジゴキシン、 ジギタリンおよびジギタリスのような強心性グリコシド；ネシル酸アトラクリウ ム、ガラミントリエチオダイド、臭化ヘキサフロレニウム、ヨー化メトロクリン 、臭化パンクリウム、スクシニルコリンクロライド（スキサメトニウムクロライ ド）、ツボクラリンクロライドおよび臭化ベクロニウムのような神経筋遮断剤； アモルバリタール、アモバルビタールナトリウム、アプロバルビタール、ブタバ ルビタールナトリウム、クロラルヒドレート、エトクロルビノール、エチナメー ト、フルラゼパムヒドロクロライド、グルテチミド、メトトリメプラジンヒドロ クロライド、メチプリロン、ミダゾラムヒドロクロライド、パラアルデヒド、ペ ントバルビタール、ペントバルビタールナトリウム、セコバルビタールナトリウ ム、ツルブタール、テマゼパムおよびトリゾラムのような鎮静剤；ブピバカイン ヒドロクロライド、クロロプロカインヒドロクロライド、エチドカインヒドロク ロライド、リドカインヒドロクロライド、メピバカインヒドロクロライド、プロ カインヒドロクロライドおよびテトラカインヒドロクロライドのような局部麻酔 剤；ドロペリドール、エタミンヒドロクロライド、メトキシタールナトリウムお よびチオペンタールナトリウムのような汎用麻酔剤；メトトレキセート、フルオ ロウラシル、アドリアマイシ ン、マイトマイシン、アンサミトマイシン、ブレオマイシン、システインアラビ ノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリシン、ビンクリスチン、ブズ ルファン、クロラムブシル、アジドチミジン、メルファラン(例えばPAM、L-PAM またはフゥニルアラニンマスタード)、メルカプトプリン、ミトタン、プロカル バジンヒドロクロライドダクチノマイシン（アクチノマイシンD）、ダノルビシ ンヒドロクロライド、ドソルビシンヒドロクロライド、タキソール、プリカマイ シン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、リン酸エストラムスチンナトリ ウム、フロタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲステロール 、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン(m-A MSA)、アスパラギナーゼ、エトポシド(VP-16)、インターフェロンα-2a)インタ ーフェロンα-2b、テニポシド(VM-26)、硫酸ビンブラスチン(VLB)、硫酸ビンク リスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバキシンおよびダカルバジンのような抗 腫瘍剤。 ヌクレオチドを含む広範な種々の化合物を本発明に従い送達することができる が、好ましくはヌクレオチドは約10,000塩基(または塩基対)より短い長さ、より 好ましくは約20から約10,000塩基(または塩基対)の間の長さ、一層好ましくは約 2,000から約8,000塩基(または塩基対)の間の長さ、そして最も好ましくは約4,00 0から6,000塩基(または塩基対)の間の長さである。送達される他の（非−ヌクレ オチド）化合物または生物活性剤は、好ましくは約5000キロダルトン(5000kD)未 満の分子量であり、より好ましくは約10から約1000kDの間、一層好ましくは約10 0から約500kDの間である。しか当業者が認識するように、より大きな、または小 さいサイズの化合物も本発明により送達できる。 投与または送達されるべきヌクレオチド配列または他の化合物の有用な投与量 、ならびに投与様式は、送達されるべき化合物の種類および性質、年齢、体重、 処置する細胞または患者（動物）、目的とする特定の診断的、治療的または他の 応用（もしあれば処置すべき疾患状態）、ならびに使用する有機ハロゲン化物（ もしあれば）およびキャリアー（もしあれば）に依存して変動するだろう。典型 的には投与量は低レベルから始め、そして所望の治療効果が達成されるまで増加 する。治療的または診断的に効果的な投与量を含む望ましい投与量は、医学文献 および本開示から準備し始めれば、当該技術分野の範囲内にあるだろう。各々の 量は、本明細書の実施例で与えられている。もちろん、当業者が考えるように、 より多い、または少ない量を使用することもできる。 当業者が考えるように発明の化合物の投与は、静脈内、リンパ内、非経口的、 皮下、筋肉内、鼻内、直腸内、腹腔内、間質内、噴霧器を介して気道に、高圧的 に、経口的に、局所的にまたは腫瘍内に、様々な様式で種々の剤形を使用して行 うことができる。局所的投与の１つの方法は、ヌクレオチド配列（または送達さ れるべき他の化合物）を、好ましくは限定するわけではないが、バルーンカテー テルの外側に適用されたヒドロゲルのようなキャリアー中へ添加することである 。カテーテルは患者の血流中に挿入される。いったんカテーテルのバルーンがそ の配列を投与する部位へ到達すれば、バルーンが弾け、そして配列を含むヒドロ ゲルが血管面に付着し、このようにして配列を送達する。さらに超音波は細胞に 、内視鏡的かつ血管内に、例えば、ならびに、もちろん外部から適用することが できる。 多数のトランスフェクションおよび他の細胞内送達技法が、主題とな る方法および本明細書に開示する有機ハロゲン化物および／またはキャリアーを 使用して、本発明の方法に従い可能となる。リン酸カルシウムおよびウイルスベ クターを使用する２つの方法は、トランスフェクトされる細胞による配列の受動 的取り込みが関与するので、細胞へのヌクレオチド配列の間接的導入法である。 リン酸カルシウム共沈法は、化学品が媒介する間接的なトランスフェクション 法である。ヌクレオチド配列（または投与される他の化合物）は、配列をリン酸 カルシウム、塩化カルシウム、ヒドロキシ酪酸カルシウム等と一緒に沈殿させ； 次に混合物を細胞に与えることにより哺乳類細胞に導入される。この精製された ヌクレオチド配列は、大変微細な沈殿物の形成を生じるリン酸塩および塩化カル シウムと混合し、そして混合物を培養物中の細胞に与える。Keown,W.A.ら「哺乳 動物細胞中へのDNAの導入法(Methods for Introducing DNA into Mannalian Cel ls)」、Methods in Enzymology.vol.185中、遺伝子発現技法(Gene Expression T echnology )、Goeddel,David V．編集、第527-537頁、アカデミック出版社(Acade mic Press,Inc.)、ニューヨーク、ニューヨーク、1991に説明されているように 、基底に付いて成長する細胞に関する手順は、この文献を引用することにより全 部、本明細書に編入する。簡単に説明すると、１日目に、細胞を２−３×104細 胞／cm2で正常成長培地に播き、そして付着させる。トランスフェクション時に 、細胞は80−90％の集密度であるべきである。２日目に、ヌクレオチド配列−リ ン酸カルシウム共沈を調製し、混合し、そして室温に約30分間静置する。ヌクレ オチド配列をＴＥ緩衝液(10mM tris、１mM EDTA Ph8.0)、２×HBAS(ハンクスの バランス塩、1.4mM Na2HPO4、10mM KCl、12mMグルコース、275mM NaClおよ び40mM HEPES、Ph 6.95)および2M CaCl2(10mM HEPES，pH5.8中の塩化カルシウム )に加える。培地を細胞から取り出し、そして新しい培地に交換する。沈殿物を 穏やかに震盪またはピペッティングし、そして直接細胞を含む皿中の培地に加え る。細胞を37℃で４時間インキューベーションする。沈殿物を含む培地を取り出 し、そしてジメチルスルフォキシド(１×HBS中)。２分後、４mlの無血清培地を 各皿に加える。混合物を吸引し、無血清培地で２回洗浄し、そして培地を加え、 そして37℃で一晩インキューベーションする。細胞をトリプシン処理し、そして 各プレートの内容物を３−４枚の新しいプレートに分ける。安定なトランスフェ クションのために選択をかけることができ、この選択培地はこの時点で、または 翌日使用できる。 本発明の方法および有機ハロゲン化物および／またはキャリアーを採用する本 発明は、マイクロインジェクションおよび電気穿孔法と同時に使用しても有用で ある。マイクロインジェクションには、ヌクレオチド配列の宿主細胞の核への直 接的なマイクロインジェクションが関与する。マイクロインジェクションでは、 ヌクレオチド配列を細胞中の細胞質またはオルガネラに暴露しない。細胞外から 核へ移動する間にＤＮＡにかなりの損傷が生じ得るので、これは大変な利点であ る。電気穿孔法は、電場が媒介するヌクレオチド配列のトランスフェクションが 関与する。膜が十分に高い電圧の電場に供されると、膜の領域は不可逆的な分解 を受け、ヌクレオチド配列が通過するのに十分大きい孔を形成する。電気穿孔さ れたヌクレオチド配列は、サイトゾルおよび核質中で自由に留まる。トランスフ ェクトしたヌクレオチド配列の大変少数のコピーが、電気穿孔法で導入され得る 。電気穿孔法し易い細胞には、例えばリンパ球、 造血幹細胞および肝ガン細胞がある。 「超音波」、「Sonoporation(商標)」および類似語は、音波エネルギーのパル ス、好ましくは化合物の細胞への送達の誘導を補助するのに十分であり、所望に よりガス前駆体からのガスを生成する反復パルスを言う。好ましくは、超音波は 約10キロヘルツから約50メガヘルツ未満の周波数範囲、そして約200ミリワット ／cm2から約10ワット／cm2のエネルギーレベルである。いかなる理論にも拘束さ れることを望まないが、超音波は細胞膜に開口を誘導することにより、あるいは おそらくの細胞の内側のエンドソームを破り化合物が抜けられるようにすること により、化合物を細胞に送達することを補助することができる。実際に細胞は従 来の方法に比べて、容易に化合物（例えばヌクレオチド配列）の取り込み（例え ばトランスフェクションされる）が誘導され得る。典型的には超音波は、標準的 な臨床用超音波デバイスを介して外部から適用されるが、上記のように内視鏡的 および血管内のような別の様式で適用してもよい。超音波の使用を本発明と組み 合わせると、特定の態様では好ましいかもしれない。しかし本明細書で記載する ように、超音波の使用は本発明の方法の操作に必ずしも必要ではなく、そして重 大ではない。すなわち主題の方法は、超音波を適用して、あるいは超音波は適用 しないで行うことができる。 本発明に従い、インビボの応用について、通常は低周波数の音が、深部にある 細胞または厚い組織に選択される（例えば深部にある筋肉の細胞あるいは腹部ま たは腹膜内の器官への超音波の経皮的適用）。小さい組織の細胞（例えば目）に は、より高い周波数の音のエネルギーが適用される。血管内遺伝子治療のために 超音波変換器を装備した血管内カテ ーテルを使用することができる血管内の応用には、約20メガヘルツ以上のより高 い周波数を使用できる。しかし大部分の応用には、音の周波数は約500キロヘル ツから約３メガヘルツの範囲であり、好ましくは約500キロヘルツから約１メガ ヘルツ、より好ましくは約200キロヘルツ、より好ましくは約40キロヘルツから 約25メガヘルツ、一層好ましくは約10メガヘルツである。砕石術と比較して、本 発明に使用する周波数は約２または３次数高く、そして本発明のエネルギーレベ ルはより低い。 音のエネルギーは、音波エネルギーの波で所定の使用率（パルス幅と呼ばれる こともある）および強度レベルにわたり適用される。一般的に超音波パルスの定 常列(costant train)を適用する連続波超音波が使用される。使用率はエネルギ ー出力レベルが所望の範囲となるように選択される。使用率は時間の１％から10 0％の間で変動してよく、超音波エネルギーが時間の１％から100％でパルス化さ れることを意味する。例えば超音波処置の時間は、３回の超音波使用率で25分間 にわたって起こり、各々が５分の長さであり、超音波が無い２回のの期間により 中断される。好ましくは使用率は約100％、より好ましくは約75％、より好まし くは約50％、一層好ましくは約20％、さらに一層好ましくは約15％、そして最も 好ましくは約10％である。 本発明に使用するための超音波は、典型的には超音波による造影に使用される 周波数よりは低い周波数で提供される。選択される超音波の周波数は、トランス フェクトされる細胞の部位、およびまたは本開示に基づき当業者に容易に明らか な他の因子に依存して変動するだろう。 周波数に加えて、エネルギーレベル（パワーの強さまたはパワーレベルとも呼 ぶことがある）も、超音波強化トランスフェクションのために、 細胞または組織に適用する全エネルギーに対して大きな効果を有する。適当なエ ネルギーレベルは、本開示に基づき容易に当業者には明らかである。典型的には 、エネルギーレベル設定は、診断用超音波で使用するレベルより幾分高いが、約 500ミリワット／cm2〜約10ミリワット／cm2、より好ましくは約200ミリワット／ cm2〜約10ミリワット／cm2、そしてより好ましくは約50ミリワット／cm2〜約２ ミリワット／cm2の範囲でよい。適用するパワーレベルは、ピーク空間時間力お よび総エネルギー蓄積の両方が、一般的に細胞または組織の細胞障害しきい値未 満である。一般的には周波数およびエネルギーレベルは低量で適用し、そして次 に投与した化合物の所望する細胞性の取り込みが達成されるまで増加する。 当業者は超音波の高エネルギーが、組織を加熱し、そして大変高いレベルのエ ネルギーで組織を直接除去するための高体温に使用できると認識するだろう。本 発明の超音波強化トランスフェクションおよび遺伝子発現では、エネルギーレベ ルは組織除去を引き起こすエネルギーレベルよりははるかに低く、しかも有意な 高体温効果を引き起こすエネルギーレベルよりも低い。当業者は本開示に基づき 準備すればすぐに認識するように、エネルギー蓄積はパワーの強さおよび使用率 の両方の関数である。より高い空間ピーク時間平均力は、より低い全エネルギー を適用して、より大きなバイオエフェクトを生じるように、バイオエフェクトカ ーブをシフトさせる傾向がある。より高いエネルギーレベルおよびより低い超音 波周波数が、深部にある組織中への浸透には必要とされる；逆に、表面上の組織 あるいは超音波変換器が組織表面に直接適用される時には、より低いエネルギー レベルおよびより高い超音波周波数が必要である。少容量の細胞培養試料は、超 音波強化トランスフェクションに、 サイズが数倍のリットルであるのでより高いエネルギーレベルが遺伝子発現に必 要な大容量のバイオリアクターチャンバーよりも少ないパワーを必要とする。細 胞培養容器のジオメトリーも、超音波エネルギーの必要量に影響を与える。 本発明に従い、超音波エネルギーは、化合物を取り込ませるように細胞を誘導 することにより、化合物の取り込み（例えばトランスフェクション）効率を上昇 させるために使用できる。さらにヌクレオチド配列の遺伝子発現は、超音波の適 用により強められる。 超音波エネルギーは、組織または細胞に、化合物を細胞に投与する前、してい る間に同時に、または後に適用することがてき、好ましくは同時か後である。典 型的には超音波エネルギーは、化合物または遺伝物質を細胞に投与前する約48時 間以内、および／または遺伝物質を細胞に投与した後48時間以内に適用するが、 より長い、または短い時間を適用することもできる。より好ましくは、超音波エ ネルギーは、化合物または遺伝物質の投与前約４時間以内から投与後約24の何時 か、または種々の時点で適用される。最も好ましくは、超音波エネルギーはトラ ンスフェクシヨンの約１時間前からトランスフェクションの約12時間後までに適 用される。 １つまたは多数のいずれかの超音波エネルギーの適用を使用することができる 。超音波エネルギーの暴露期間（暴露時間）は、超音波エネルギーのパワーレベ ルおよび使用率に依存する。好適な期間を決定するために、超音波は典型的には 低い暴露時間で適用され、そして投与した化合物の所望の細胞性取り込みが達成 されるまで、増加させる。高い強度（高いパワーレベル；パルス幅に依存して典 型的には約２ワット／cm2 より大きく、好ましくは約５ワット／cm2より大きく、そしてまた好ましくは10 ワット／cm2より大きい）の超音波衝撃波は、暴露のわずか２〜３ミリ秒の暴露 が必要とされるだけである。これはガス充填リポソームまたはペルフルオロカー ボン乳液のようなキャビテーション核が、媒質内に存在する時の場合でもあり得 る。この大変短い高エネルギー超音波への暴露は、トランスフェクションを強め るために十分であり得る。トランスフェクション媒質中のキャビテーション核の 存在は、キャビテーションしきい値を下げ、したがって超音波強化トランスフェ クションに必要なエネルギーを減少させる可能性があり、ならびに必要な暴露時 間を下げる可能性がある。最も効果的な超音波強化遺伝子トランスフェクション を達成するために、より典型的には暴露時間は、細胞への超音波エネルギーの適 用がおよそ数秒から最高約１時間の範囲である。より一層好ましくは超音波暴露 の期間は、約数秒から約数分の範囲であり、そしてトランスフェクション中に種 々の間隔で繰り返すことができる。超音波エネルギー暴露の時間は、所望の効果 を引き出すために十分であるが、有意な細胞障害性が生じるほど長くはない。 超音波強化トランスフェクションの効果は、高体温とは無関係である。トラン スフェクションの効率を上げるために必要な超音波エネルギーの適用は、温度を 数度上げるかもしれないが、温度上昇は多くは一時的であり、温度は急速に元に 戻る。より好ましくは温度は超音波の適用中に有意に上昇しない。温度の上昇は 、典型的には約１℃〜約２℃未満である。累進的により高いレベルの超音波エネ ルギーにより、温度は累進的に上昇するが、温度は好ましくは有意な細胞障害性 が起こるレベル（例えば44℃以上）未満に維持される。注目されるように、試料 は超音波に 暴露された時に、生理食塩水溶液中の温度を測定する。適用するエネルギーは、 10ワットが5.0cm2変換器、または２Wcm-2を通して与えられる。超音波変換器か らの音のエネルギーは、水性環境中で単に熱エネルギーに変換され得る。エネル ギーの量および／または暴露時間は、温度により誘導される細胞の破壊を防ぐよ うに、改変することができる。 超音波エネルギーは、任意の市販されている様々な超音波システムを用いて適 用できる。例えば、Rich-Marモデル25超音波治療用装置(リッチーマー社：Rich- Mar Corporation、イノーラ、オクラホマ州)は、中央周波数が約1.0Mhzにあり、 パルス化または連続的モードで本発明の実施に使用できる。本発明を実施するた めに、従来から利用されている変換器、出力増幅器および他の構成システムも容 易に集成することができる。ウェイブシンセサイザーおよびパルサーも、このシ ステムに組み込んで、パルス反復間隔、使用率等を制御することができる。有利 には、これらの構成部品は、超音波パルスを改変するために使用して、周波数お よび、例えばCHIRP(周波数を上げる)およびPRICHパルス（周波数を下げる）波形 パターンのような増幅効果を変動させることができる。超音波エネルギーは市販 されている増幅器、変換器および周波数発生機から供給することもできる。例え ば、バルペイ-フィッシャー(Valpey-Fisherホプキントン、マサチューセッツ州) からの1.0Mhzの中央周波数を有する出力変換器、ENI（ENIロチェスター、ニュー ヨーク）からのパワーＲＦ増幅器、およびヒューレットパッカード（Hewlett Pa ckerd、サニーバレ、カリフォルニア州）からの関数発生機は、上記目的を達成 するために適当な設備である。あるいは、パルス／関数発生機または任意関数発 生機も、可変パルスフォーマットを達成するために使用できる。 さらに、種々の信号を一緒にゲートで制御できる方法も行えると考えられる。 高エネルギー超音波システムは、1995年6月6日に出願された米国特許出願第08 /468,052号明細書(この開示内容は全部、引用により本明細書に編入する)に記載 されているような超音波撮影法にも組み込むことができる。また高エネルギー超 音波の適用は、内視鏡（例えばファイバスコープ）、コンピューター断層撮影法 、磁気共鳴撮影法、血管造影法のょうな従来の造影法の他の形態および核医療で も行うことができる。そのような造影法は、例え超音波で誘導した加熱（または 他の）加熱を適用すべき患者中の細胞を捜し当て、そして確認するために使用で き、あるいは本発明の組成物を患者に投与した後に追跡し、そして／または捜し 当てるために使用される。 超音波は、トランスフェクションの効力を増すために、組織の標的治療ゾーン に第２調波の重なり(second harmonic superimposition)を生成するように適用 できる。例えば、図５に示す基本型のセクター−ボルッテックス位相化アレイ変 換器は、直径が120mmであり、750kHzおよび1.5MHzの超音波を使用できる。K.Kaw abataおよびS.UmemuraによりUltrasonics Sonochemistry,1996,3:1-5に記載され ているように、変換器はジルコン酸鉛PZT材料からの32圧電性(PZT)変換器要素で 構成できる。変換器は、各トラックに16セクターを含むように２つのトラックか ら構成できる。より低周波数超音波は、外側のトラックから適用でき、そしてよ り高周波数、1.5MHzは内側のトラックから適用できる。殻は幾何学的集中のため に120mmの曲率半径を持つように構成できる。変換器セルアッセンブリーの圧電 性要素および球状の形により提供されるビームプロフィ ールは、超音波の２つの異なる周波数の集中ゾーンを重ねるように設計すること ができる。これにより低周波数および高周波数超音波源の重なりにより、焦点音 響力を生じることができる。これは効果的に超音波信号の第２調波音の重なりを 生じる。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、この超音波集成は、低 い全エネルギー量でトランスフェクション効率を向上することを可能とし、そし て細胞への害を減じることになるだろう。 当業者はいったん本開示から準備し始めれば、２つの超音波エネルギーは第１ 供給源（低周波数）が第２供給源の半分の周波数となるように別の周波数でよい と認識するだろう。例えば、外側のアッセンブリーでは500kHz、そして内側のア ッセンブリーでは１MHzを採用できる。異なる周波数の範囲は、外側アッセンブ リーが１Ｘであり、そして内側アッセンブリーが２Ｘとなるように選択できる。 あるいは、アッセンブリーは、より高いエネルギーを外側アッセンブリーに、そ してより低いエネルギーを内側アッセンブリーに設計してもよい。あるいはさら に外側および内側のトラックがｘおよび３Ｘ周波数またはＸおよび５Ｘ周波数で 表すことができるような、奇数調波を使用することもできる。第２倍音の、超調 波の(ultraharmonic)、または低調波の(subharmonic)周波数は、トランスフェク トされる標的組織または細胞に対して向けられた集中ゾーンで重ねられる。この ように、超音波は２つ以上の周波数で同時に投与されて、第２倍音周波数を含み 、そしてそれに限定されない超音波周波数の重なりを生じる。 また本発明は、送達すべき化合物、細胞への化合物の望ましい送達に使用する ための有機ハロゲン化物および／またはキャリアー（それらの 組み合わせを含む）を含んで成る医薬キットも対象とする。化合物、有機ハロゲ ン化物、および／またはキャリアーを一緒に混合して、または別々に（例えば、 別個のバイアルまたは包装のような別個の容器中で）提供され得る。医薬キット はさらに、混合バイアル、シリンジ、ガーゼ等のような、いったん本開示から準 備し始めれば当業者には周知の通例のキット成分を含むことができる。 本発明は、さらに以下の実際の実施例１−３、１０−１９および２３、および 予想される実施例４−９、２０−２２により示される。しかし実施例は、本発明 の範囲を何等限定することを意図するものではない。 実施例 実施例１：超音波が、培養プレートウェル模型中の水性−基本培地の温度および 細胞生存能に及ぼす効果 超音波の効果を評価する第１段階は、超音波エネルギーにより引き起こされる 加熱量を測定することであった。この実験手順は、超音波に暴露している間に６ ウェル培養プレートの個々のウェルの加熱を評価するために設計された。超音波 を各ウェルに30秒間適用し、そしてエネルギーと加熱との間の関係を以下の表２ に示す。 表２ 追跡実験は、超音波暴露後に細胞生存能をアッセイすることにより行っ た。ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)3,4-テトラゾリウム]-ビス-( 4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸水和物(XTT、ベーリンガー−マンハイ ム:Boehringer-Mannheim、インディアナポリス、インディアナ州)を細胞生存能 表示物として使用する細胞増幅キットを、細胞傷害が生じたかどうかを評価する ために使用した。この実験では、より高い吸収は、生きている細胞のＸＴＴの取 り込みにより生じるものである。表３は、この実験結果を含む。 表３ 入力した超音波力の関数としての細胞生存能 表３のデータが示すように、第１に注目されうる細胞生存能における変化は、 １W/cm2のエネルギーおよび100％の使用率で起こる。100％の使用率でより高い エネルギーを用いると、有意に多数の細胞が破壊され る。 実施例２：細胞培養物中の遺伝子発現に対する超音波の効果トランスフェクションの材料および方法ならびに遺伝子発現の測定 使用したDNAプラスミドは、pCATコントロール(GeneBank登録番号X65321)(プロ メガ、マジソン、ウィスコンシン州)（図３を参照にされたい）であった。 このプラスミドをDH-5α大腸菌(Escherichia coli)コンピテント細胞（ライフ テクノロジーズ:Life Technologies、ゲチスバーグ、メリーランド州）中で形質 転換した。細胞を、アンピシリン（ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ： BMB、インディアナポリス、インディアナ州）を含むLB寒天プレート（Bio 101、 ビスタ、カリフォルニア州）に播いた。耐性コロニーを選択し、増殖させ、そし てWizard mini-prep(プロメガ)プラスミドDNA抽出を行った。プラスミドDNAを制 限酵素EcoRI（BMB）で切断し、そして１％アガロースゲル(BMB)で泳動した。断 片のサイズを評価した後、残りの培養物を使用して大量培養およびWizard mini- prepを行い、トランスフェクション用のDNAを生成した。このDNAをHoefer TKO-1 00 mini-DNAフルオロメーターを使用して定量した。このDNAはすぐにトランスフ ェクションに使用した。 カチオン性リポソームは、ジパルミトイルエチルホスファチジルコリンおよび ジオレオイルホスホエタノールアミン（ハダンチ ポーラーリピッズ:Avanti Pol ar-Lipids、アラバスター、アラバマ州）を混合することにより作成した。脂質 混合物を水に再懸濁し、そして次に超音波処理して小さいリポソームを形成した 。 ヒト子宮頸癌細胞系(HeLa)を、アメリカンタイプカルチャーコレク ション（ロックピル、メリーランド州）から得、そしてウシ血清(ライフテクノ ロジーズ)を捕充したEMEM培養基(メディアテク:Mediatech、ワシントン、D.C.) 中で増殖させた。これらの細胞をトランスフェクションに使用した。 DNA／脂質複合体は、HEPES緩衝化塩溶液(HEPES 20ミリモル/リットル、NaCl、 150ミリモル／リットル、pH7.4)(シグマ：Sigama、セントルイス、モンタナ州) 中で、脂質およびDNAを６部の脂質対１部のDNAを混合することにより形成した。 これを室温で30分間、インキューベーションし、そして次にトランスフェクショ ンに使用した。 pCATコントロールプラスミドは、酵素であるクロラムフェニコールアセチルト ランスフェラーゼ(CAT)をコードする。この酵素は、哺乳動物系には見いだされ ていない。このCAT発現は、CAT ELISAキット(BMB)を使用してアッセイする。こ の非放射性キットはCAT発現の感度の良い検出が可能である。このキットは、抗 体のサンドイッチに基づいている。96ウェルプレートを抗-CATで被覆し、この抗 体は試料中のCATに結合する。次の抗体は抗-CAT-ジゴキシゲニンであり、ジゴキ シゲニンはジキタリス植物中にのみ見いだされるハプテンである。この化合物を 希少性により、非放射性標識が理想的なものになる。次に加えた抗体は、西洋ワ サビペルオキシダーゼで標識した抗−ジゴキシゲニンである。西洋ワサビペルオ キシダーゼは基質を分解し、そして発色反応を起こし、これは次にSLT Spectra Shell plateリーダー(SLT-ラボインスツルメンツ：Labinstruments Ges.m.b.h., グロエジン／ザルツブルグ、オーストリア)で読む。標準曲線を使用して、この プレートリーダーにより、タンパク質濃度の測定が可能となる。手順 DNA複合体を形成し、そしてウェルあたり30μgの脂質および５μgのDNA濃度で 、HeLa細胞(４mlのEMEM中)を含む６ウェルプレートに加えた。Rich-Marモデル25 治療用超音波機(リッチーマー社：Rich-Mar Corporation、イノーラ、オクラホ マ州)を使用して、超音波を６ウェルプレートのウェルに適用した。超音波は、D NA／脂質複合体を加える30分前、複合体を加えてから１時間後、または複合体を 加えてから４時間後のいずれかに加えた。第１実験では、６ウェルプレートの全 台を覆う隔離碍子パットを使用し、そして１つのウェルからもう１つのウェルへ の音の伝導を可能にした。パワーの設定は、0.5W／cm2で10％の使用率であった 。 ３つの条件を試験した。超音波無し、トランスフェクション前に30分間、超音 波を適用、そしてトランスフェクション後に１時間、超音波を適用した。 表４に説明する結果は、ジパルミトイルエチルホスホコリンおよびジオレオイ ルホスホエタノールアミン（アバンチ ポーラー リピッド、アラバスター、ア ラバマ州）の１：１混合物を用いたトランスフェクションからの結果である。こ のトランスフェクションは、血清の存在中で行った。さらに、陰性対照を加え、 これはジパルミトイルエチルホスホコリンおよびジオレオイルホスホエタノール アミンの１：１混合物を用いてトランスフェクションせず、しかも超音波処理を せずに成長させた細胞を含んだ。 表４ 超音波に暴露された細胞中の遺伝子発現の定量 この実験は、互いにウェルを隔離するように設計された隔離碍子パッドを用い て繰り返した（図１および図４を参照にされたい）。６ウェルプレートの台は、 変換器が接近できるように取り外し、そして第２の６ウェルプレートをその上で 逆にした。２％アガロースをこの型に注いで隔離碍子パッドを形成した。この隔 離碍子パッドは、６ウェルプレートと接する隔離碍子の部分間に開放空間（デッ ドエアー）を可能とするように構成されているので、各ウェルは隔離碍子が取り 外された各ウェルの下の開放空間の垂直支持体上の隔離碍子上に上がっている。 垂直支持体は、２％アガロースゲルで作られ、そして超音波変換器からの音を伝 える。この変換器は、隔離碍子パッドの下に置かれ、そして音はパッドを通って ６ウェルプレートの各ウェルへ上に放出される。６ウェルプレートはウェルの底 の細胞が変換器に近づくように、隔離碍子パッド上に直立して配置される。両実 験で、CATタンパク質の発現は、インキューベーションの48時間後にCAT ELISAに より測定した。超音波は１W/cm2および100％使用率で適用した。超音波は各ウェ ルに30秒間適用した。 第１実験と同じトランスフェクション試薬を使用した。この試験条件は、超音 波無し、トランスフェクションの30分前、トランスフェクショ ンの１時間後、およびトランスフェクション後４時間であった。ここでも、トラ ンスフェクションは血清の存在中で行った。さらに、CAT/脂質複合体でトランス フェクトせず、しかも超音波処理せずに成長させた陰性対照を加えた。結果は表 ５に示す。 表５ 実施例３：脂質キャリアーおよびキャビテイターを含むＤＮＡを使用する応用 細胞およびDNA／脂質複合体は、実施例２のように調製した。６ウェルプレー トにHeLa細胞を播き、そして16mlの培地で実施例２のように満たした。加えた脂 質は、容量の増加が許されるまで、ウェルあたり135μgまで増やし、DNAも22.5 μgまで増やした。複合体を加えてから１時間後、脂質ジパルミトイルホスフソ チジルコリン(DPPC)、ポリエチレングリコール5000に結合したジパルミトイルホ スファチジルエタノールアミン(DPPE-PEG5000)およびジパルミトイルホスファチ ジン酸(DPPA)の約82％：８％：10％(モル％)比率から成る100μlのリポソームを 各ウェルに加えた。DPPE-PEG5000は、約20％：80％（重量％）の比率のDPPEおよ びPEG5 000から成る。PEG5000は、約5000の平均分子量を有すPEGを言う。さらに、CAT/ 脂質複合体でトランスフェクトせず、しかも超音波処理せずに成長させた陰性対 照を含んだ。 漏れを防止するために次に６ウェルプレートをパラフィルムのシートで覆い、 蓋を取り替え、そしてプレートを逆転させた。プレートを逆転させることにより 、ガス充填リポソーム（キャビテイター）が、ここでは隔離碍子パッド、プレー ト構造物の頂点にある細胞に流れる。しかしこの場合、超音波は底から適用され 、音は媒体を通って細胞に届く。超音波に暴露した後、プレートを垂直位置に戻 し、そしてパラフィルムを取り外す。次にプレートを４時間インキューベーショ ンし、そしてCAT ELISAを行い、その結果を表６に説明する。 表６ 実施例４：超音波強化トランスフェクションの工業的応用 遊離懸濁細胞を含有する大規模バイオリアクター容器は、超音波変換器を覆う フロースルーチャンバーを装備している。目的遺伝子を含むプラスミドDNAを、 有機ハロゲン化物を含む、および含まない細胞懸濁液に加える。細胞がチャンバ ーを通って循環すると、500キロヘルツの超 音波が10パーセントの能力（duty）サイクルで、そして１cm2あたり200ミリワッ トのエネルギーレベルで適用される。強化された遺伝子発現は、有機ハロゲン化 物を含む、および含まない両方で達成される。フロースルーチャンバーを通る細 胞懸濁液の流速を変動させることにより、至適なトランスフェクション効率のた めの適切な超音波暴露時間が達成される。 実施例５：ヒトの細胞を対象した遺伝子発現のエクスビボ強化 プラズマホレシスを使用して、転移性悪性黒色腫の患者のＴ細胞を得る。この Ｔ細胞を組織培養中に置き。そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM CSF）とインキューベーションして、リンパ球の増殖を増した。十分な細胞密度 に達した後、インターロイキン−２(IL-2)の遺伝子をカチオン性リポソームベク ターと、有機ハロゲン化物と共に、または無しで細胞に加える。１時間後、１メ ガヘルツの超音波エネルギーは、10％の使用率で0.5ワットのパワーレベルを５ 分間適用する。24時間後、転移性腫瘍を処置するための試みとして、患者に細胞 を潅流し戻す。有機ハロゲン化物を用いても、用いなくても、腫瘍塊の顕著な減 少状態で有望な結果が観察される。さらに試験すると、処置した細胞で強化され たIL-2発現も明らかとなる。 実施例６：超音波媒介遺伝子送達の治療的応用：デュシェーヌ筋ジストロフィー デュシェーヌ筋ジストロフィーの患者に、ジストロフィンの遺伝子をコードす るプラスミドDNAを、有機ハロゲン化物を用いて、および用いずに、大腿および 脚の筋肉の多くの部位に注射する。次に超音波は、カプラントとしてシリコーン ゲルを使用して、変換器と患者の皮膚との間 で大腿および脚に適用する。周波数は、10％の使用率で200キロヘルッであり、 そしてパワーレベルは１ワットである。変換器は皮膚上の任意の位置に、約２〜 ３分間維持する。有機ハロゲン化物を用いても、用いなくても、ジストロフィン の遺伝子に関する強化された遺伝子発現が達成され、筋肉の強さを増す。 実施例７：超音波媒介遺伝子送達の治療的応用：アテローム硬化性心臓疾患 アテローム硬化症の患者は、左冠状動脈の狭窄が顕著である。有機ハロゲン化 物を用いて、および用いずに、血管内皮増殖因子（VEGF）の遺伝子を結合したヒ ドロゲル材料で被覆したバルーン血管造影カテーテルを、動脈狭窄の部位に配置 し、そしてバルーンを９気圧の圧力まで膨らませる。血管内超音波カテーテルを 、血管造影を行い、そして超音波エネルギーを適用する管内の領域に配置する。 周波数は、３分間、１cm2あたり１ワットで15％の使用率で20メガヘルツである 。強化されたVEGFの遺伝子発現は、有機ハロゲン化物を用いても、用いなくても 、血管造影部位で再狭窄の傾向の減少で観察される。 実施例８：超音波媒介遺伝子送達の治療的応用 実施例７と同様に、有機ハロゲン化物を用いて、および用いずにVEGFの遺伝子 で被覆したバルーンカテーテルを使用して、患者に血管造影を行うが、この場合 は、造影および治療要素の両方を装備した１メガヘルツの集中変換器を用いて経 皮的に超音波エネルギーを適用する。治療用の１メガヘルツの音を、５分間、20 ％の使用率を使用して500ミリワット／cm2のエネルギーレベルで適用する。この エネルギーを血管造影部位上に集中する。ここでも有機ハロゲン化物を用いても 、用いなくても、 強化されたVEGF遺伝子発現が観察され、そして再狭窄の傾向の減少する。 実施例９：超音波媒介遺伝子送達の治療的応用 結腸癌の遺伝的素因のある患者に結腸鏡検査を行う。上皮化生の領域を下行結 腸で確認する。半透膜およびBcl 2と有機ハロゲン化物を含む、および含まない 両方のリポソームベクターを含む薬剤保存リザーバーを備えた超音波変換器を、 上皮化生の領域に配置し、そして超音波エネルギーを500ミリワット/cm2のエネ ルギーレベルおよび10％の使用率で３〜５分間適用し、Bcl 2遺伝子をその領域 の細胞に送達する。結腸鏡検査の８週間後の追跡では、特に投与過程で有機ハロ ゲン化物を使用した場合に、上皮化生が有意に減少した。さらに試験して、デリ バリーシステムに有機ハロゲン化物を使用してもしなくてもこの領域での強化さ れたBcl 2発現が明らかとなる。 実施例１０：有機ハロゲン化物を含む、および含まないDPEPC/DOPEのトランスフ ェクション効率 ジパルミトイルエチルホスホコリン(DPEPC)(アバンチ ポーラー リピッズ、ア ラバスター、アラバマ州)を、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DO PE)(アバンチ ポーラー リピッズ、アラバスター、アラバマ州)と、１：１(重量 ：重量)の比率で、10mlの脱イオン水中で、脂質濃度１mg/mlで混合した。100マ イクロリットルのn-ペルフルオロヘキサン（PCR社、ゲインズビレ、フロリダ州 ）を加え、そして５分間、Heavy Duty#6 Wig-L-Bug(クレセント デンタル:Cresc ent Dental、ライオンズ、イリノイ州)で震盪することにより混合した。次に混 合物を５回、リペックス バイオメンブラン エクストルーダー デバイス(Lipex Biomembranes Extruder Device、バンクーバー、ブリティッシュコロン ビア州、カナダ)の２つの0.8μmフィルターで押し出した。有機ハロゲン化物を 含まない粒子を室温で10分間、水浴ソニケーター中で超音波処理した。次に混合 物をHEPES緩衝化塩溶液で、ウェルあたり30μlの脂質を70μlのHBSと混合する割 合で希釈した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子およ びヒトサイトメガロウイルス(CMV)からのプロモーターを含むpCMVCAT（ライフ テクノロジーズ社、ゲチスバーグ、メリーランド州）をHeLa細胞をトランスフェ クトするために使用した。pCMVCATは、FoeekingおよびHofstetter、Gene 1986 4 5 :101-105（この内容は全部、引用により本明細書に編入する）に説明されてい る方法に従い調製した。 pCAT(商標)(プロメガ、モンゴメリービレ、ペンスルバニア州)基本ベクターは 、真核プロモーターおよびエンハンサー配列を欠いている。これにより任意の推 定上の調節配列を、便利なマルチプルクローニング部位へクローニングする最大 限の柔軟性が得られる。このベクターによりトランスフェクトされた細胞中のCA T活性の発現は、CAT遺伝子から上流の機能的プロモーターの挿入に依存する。エ ンハンサー要素を、CAT遺伝子から下流のBamHＩ部位に挿入することができる。 このベクター地図配列の参考点は、マルチプルクローニング部位(HindIII−XbaI )2242−2271、SV40スモールＴ抗原領域3064−3917、CAT遺伝子開始部位2315、CA T遺伝子終止部位2974、およびβ-ラクタマーゼ(Amp')コーディング領域209−106 9である。 プラスミドDNAを、100μlのHBSあたり５μgに希釈した。このDNAおよび脂質混 合物を合わせ、そして室温で45分間、インキューベーションした。HeLa細胞(ATC C認定細胞系２(CCL2))を、非必須アミノ酸およびアーレ の(Earl's)BSS、90％；ウシ胎児血清10％を含むイーグルのMEM中にウェルあたり ４×105の濃度で播いた。200μlの脂質／DNA複合体を各ウェルに加え、そして血 清の存在中で48−72時間インキューベーションした。この工程を50、25および12 .5マイクロリットル容量のn-ペルフルオロヘキサンを使用して繰り返した。CAT 発現は、ベーリリンガー マンハイムバイオケミカル(インディアナポリス イン ディア州)からのCAT ELISAを使用してアッセイした。結果を表７に示す。 表７：種々の細胞系におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェ ラーゼの発現に対する種々の濃度の有機ハロゲン化物の効果 DPEPC/DOPEは、ジパルミトイルエチルホスファチジルコリン：ジオレオイルホ スファチジルエタノールアミン；CAT発現単位はng/ml(タンパ ク質) 実施例１１：有機ハロゲン化物を含むDPEPCのトランスフェクション効率 ペルフルオロヘキサンおよび1-ブロモノナフルオロブタン(BNFB、フルオロシ ール：Fluoroseal、ヒューストン、テキサス州)を含むDPEPCのトランスフェクシ ョン例を行った。粒子は、BNFB試料を液体状態に保つために、Wig-L-Bugで震盪 する前および後に冷却したことを除いて、実施例１０に説明したように調製した 。結果を表７に示す。 実施例１２：通常はペルフルオロヘキサンを用いたトランスフェクションに耐性 の細胞系での改良されたトランスフェクション COS-1細胞(ATCC細胞保存系1650(CRL 1650))を、ダルベッコの改良イーグル培 地、90％およびウシ胎児血清、10％中で増殖させ、そして１×105／ウェル濃度 で播いた。NIH/3T3細胞(ATCC細胞保存系1658(CRL1658))を、4.5g／リットルのグ ルコース、90％および子ウシ血清10％を含むダルベッコ改良イーグル培地中で増 殖させ、そして１×105／ウェル濃度で播いた。C127:LT細胞(ATCC細胞保存系180 4(CRL1804))を、4.5g／リットルのグルコース、90％およびウシ胎児血清10％を 含むダルベッコ改良イーグル培地中で増殖させ、そして１×105／ウェル濃度で 播いた。DPEPC:DOPEを、実施例１０のように、12.5マイクロリットル容量のペル フルオロヘキサンを用い、およびペルフルオロヘキサンは用いずに調製した。脂 質／DNA混合物を細胞と72時間、実施例１０に記載したようにインキューベーシ ョンした。リポフェクチンおよびリポフェクタミン（ライフテクノロジーズ、ゲ チスバーグ、メリーランド州）は、市販されている対照であり、これを製造元の 指示に従い使用した。結果を表７に示 す。 実施例１３：ペルフルオロブタンガスを充填したカチオン性微小球を使用するト ランスフェクション １mlあたり１：１(重量：重量)のDPEPCとジパルミトイルホスファチジルエタ ノールアミン(DPPE)からなる脂質１mgの脂質溶液を調製し、そしてペルフルオロ ブタンガスの頭隙の有する２mlのバイアル中に入れた。この試料を１分間、ESPE CapMixを用い4500RPMで震盪し、ガス充填脂質を被覆した微小球を得た。各試料 にpCMVCATを、６μgの脂質あたり１μgのDNA濃度で加えた。この工程を１：１（ 重量：重量）のDPEPCとDOPEを使用して繰り返した。DPEPC/DPPE(ゲル状態の飽和 脂質)から調製したガス充填微小球は、DNAを結合する安定なガス充填微小球を形 成した。しかしトランスフェクション実験を実質的に実施例１１に概説したよう に取り返した時、測定できる遺伝子発現の証拠はなかった。ガス充填微小球をDP EPC/DOPE脂質(DOPEは生理的に等しい温度で液体結晶状)から調製した時、粒子数 はDPEPC/DPPE小胞よりは低かった。DNAを脂質に加えた時、小胞はばらばらに壊 れ、微小球の内部が液体PFC(上記を参照にされたい)とは対照的にガスPFC(ペル フルオロブタン)で充填されている時に、いかに液体結晶状態の脂質からなる脂 質微小球がDNAの結合に不安定であるかを示した。 実施例１４：有機ハロゲン化物を用いたトランスフェクション フッ素化有機ハロゲン化物を８つの試料に用い、そして８つの試料を超音波に 供した点を除き、実施例１２で行った実験を繰り返した。DNA／脂質複合体を細 胞とインキューベーションした60分後、超音波は１Mzの変換器の頭を直接、細胞 培養ウェルの頭頂に浸し、そして超音波を10 ％の使用率で30秒間かけるすることにより適用した。対照群は、トランスフェク ション材料を含む、および含まない、超音波を暴露しない細胞であった。表８は 有機ハロゲン化物が、低レベルのエネルギーでより効率的となるように、超音波 の効力を増すことを示している。1-ブロモノナフルオロブタン(BNFB)は超音波と 一緒に、発現を約50％強化した：一方、約30％の発現強化が、ペルフルオロヘキ サン(PFC6)および超音波で明らかである。表８ 上記のすべての場合で、細胞系はNIH/3T3である。DNA発現の単位は、ng/mlタ ンパク質である。超音波は0.5W/cm2、10％使用率で適用した。ＯＨ−有機ハロゲ ン化物、ＵＳ(sec)−秒での超音波、BNFB−(1-ブロモナノフルオロブタン)、PFC 6−(ペルフルオロヘキサン)、ＳＤ−標準偏差。 上記からわかるように、遺伝子を含むDPEPC/DOPEの脂質混合物は、リポフェク チンまたはリポフェクタミンと比較してバックグラウンドより高い発現を生じる 。この発現は、フルオロカーボンの添加または超音波により増強される。最高の 結果は、フルオロカーボンおよび超音波の組合わせから得られた。 実施例１５：ペルフルオロエーテルを用いたトランスフェクション 以下のペルフルオロエーテル：ペルフルオロメチルブチルエーテル(PFMBE)、 ペルフルオロ-4-メチル-テトラヒドロフラン(PMTH)およびペルフルオロテトラヒ ドロピラン(PFTH)を用いて、実施例１０に記載した実験を繰り返した。トランス フェクションデータは、以下の表９に示す、表９では、ペルフルオロエーテルが 前記実施例のペルフルオロカーボン類と同様な達成度であることを示す。ペルフ ルオロエーテルのレベルを増加しても、トランスフェクションおよび発現に対す る明らかな効果は無いようである。各ペルフルオロエーテルは、対照脂質(DODO) よりトランスフェクションを100％以上強化する。表９ 上記すべての場合で、細胞系はHeLaであり、そして脂質コーティングはペルフ ルオロエーテル ジオレイル-グリセロ-3-ホスホコリンに関する。CAT発現の単位 は、ng/mlタンパク質である。Std.dev−標準偏差、PEE(vol)−容量でのペルフル オロエーテル。 実施例１６：ペルフルオロヘキサンを用いたトランスフェクション効率 この実験は、HeLa細胞で、ペルフルオロヘキサンを用い、および用いずに、DM RIE-C、DODO、DPDOまたは他の市販のカチオン性脂質を使用して実施例１０を繰 り返した。結果を以下の表１０に示す。表１０は、ペルフルオロカーボンが種々 の脂質と共に効果的であることを示す。実際に、発現の増強は、使用した脂質の 種類に依存しない。DODO＋PFC6は、約８〜約１０倍の発現の上昇をもたらし、DM RIE-Cは約40％の発現強化を、そしてDPDOは約４倍の増加を生じる。表１０ DPDO−ジオレイルーグリセロー３−ホスホエチルコリン。CAT発現単位は、ng/ mlタンパク質である。DPDO−ジパルミトイル-グリセロ-3-ホスホコリン、Std.De v−標準偏差、PFC(vol)−容量でのペルフルオロカーボン。 実施例１７：DMRIEおよびDODO小胞トランスフェクションに及ぼす超音波単独の 効果 前記実施例の上記の実験を、DMRIE、DODOおよび脂質無しで、各々の場合に有 機ハロゲン化物を用いずに、上記実施例１６に説明したものと同じ手順を使用し て繰り返した。表１１ 上記すべての場合で、細胞系はHeLaである。DNA発現の単位は、ng/mlタンパク 質である。超音波は0.5W/cm2、10％使用率で適用した。ＯＨ−有機ハロゲン化物 、PFC−ペルフルオロカーボン、US(sec)−秒での超音波、Std.dev−標準偏差。 実施例１８：ペルフルオロヘキサンを用いたトランスフェクションに対するポリ -L-リシン(脂質の代わり)の効果 フッ素化有機ハロゲン化物を含む、または含まないDODO、フッ素化有機ハロゲ ン化物を含む、または含まないポリ-L-Lys、および脂質無し、かつ有機ハロゲン 化物無しを使用して、実施例１６に説明した同じ手順を使用して、前記実施例で すでに記載した実験を繰り返した。表１２ DODO-ジオレイル-グリセロ-3-ホスホエチルコリン。CAT発現単位は、ng/mlタ ンパク質である。ＯＨ−有機ハロゲン化物、ＯＨ(vol)−ml容量での有機ハロゲ ン化物、Std.Dev−標準偏差。 実施例１９：トランスフェクションエンハンサーとしての種々の有機ハロゲン化 物の比較 この実験は、HeLa細胞、脂質キャリアーとしてジオレイル-グリセロ-3-ホスホ エタノールアミン(DOPE)、およびペルフルオロペンタン(PFC5)。1-ブロモペルフ ルオロオクタン(ペルフルオロ-オクチルブロミド、BrPFC8)、ペルフルオロデカ ン(PFC10)またはペルフルオロヘキサン(PFC6)のいずれかを使用して、実施例１ ０のように行った。表１３はトランスフェクション結果を説明する。表１３ ＯＨ−有機ハロゲン化物、ＯＨ(vol)−容量での有機ハロゲン化物、Std.Dev−標 準偏差。 上記の結果は、液体（ペルフルオロヘキサンまたはペルフルオロデカン）のペ ルフルオロカーボンが、生理的温度で少なくとも部分的に液体からガスへ相転移 を受けるペルフルオロカーボン（ペルフルオロペンタン）と同様によく作用する ことを示している。臭化化合物、BrPFC8だけがトランスダクションを強化する効 率が際立って低かった。 またこのデータは、トランスフェクションに好適なペルフルオロカーボンの量 が、一般的に0.125ml〜0.250mlの範囲、または約１％〜３（容 量／容量）％の範囲であることも示している。 実施例２０：フッ素化界面活性剤の存在中でのトランスフェクション 脂質を、Zony(商標)サーファクタント(デュポンケミカル社:Du Pont Chemical Co.、ウィルミントン、デラウエア州)の量を変えながら（1.25％〜５％）懸濁 することを除いて、実施例１０に記載の実験を繰り返した。幾つかの試料では、 ペルフルオロヘキサン(0.125ml、0.250mlまたは0.500ml)を、サーファクタント と共に震盪する。サイズは約300nm〜約900nmの範囲である。Zony(商標)から調製 した試料のトランスフェクション効率は、Zony(商標)無しで調製した試料の場合 のトランスフェクションの約10％〜約25％である。 実施例２１：有機ハロゲン化物を含むカチオン性脂質キャリアーおよび脂質懸濁 液を用いた、超音波処理有り、および無しのトランスフェクション 実施例１４に記載のこの実験は、対照脂質混合物がDPPC/DPPA/PEG-5000＋ペル フルオロプロパンであるように変更し、そして結果をカチオン性脂質DOTMA＋ペ ルフルオロプロパンの懸濁液を使用するトランスフェクションと比較するように 変更する。インキューベーション後、幾つかの試料には超音波を実施例１４のよ うに適用する。得られた結果は、実施例１４で観察された結果と同様である。 実施例２２：超音波処理および1-ブロモノナフルオロブタンを用いたカチオン性 脂質キャリアーおよび脂質懸濁液でのトランスフェクション カチオン性リポソームを、ジオレイルエチルホスホコリンおよびDOPEから、１ mg/ml脂質濃度で調製する。これに0.125μlの1-ブロモノナフルオロブタン(BNFB )を加える。混合物をWig-L-Bugで60秒間撹拌し、そし て生成した小胞を0.8ミクロンフィルターで押し出す。生成したBFNB充填カチオ ン性リポソームを、次に血管内皮増殖因子(VEGF)に特異的な触媒性RNAをコード するリボゾームRNA（ヒトモチーフ）と、１：６の脂質：RNA比率で従来の方法を 使用して複合化する。このリボゾームRNA調製物(1.0ml)を、糖尿病網膜症の患者 にIV注射する。５メガヘルツの超音波変換器を患者の角膜にシリコーン音響カッ プリングゲルを使用して置く。超音波エネルギーは、2.0ワットおよび10％使用 率を使用して患者の網膜に集中させる。リポソームが超音波の領域に入ると、ガ ス前駆体が膨らみ、そして搏動する。局所的な衝撃波が作られる。リボゾームRN Aが、超音波を適用した領域中の内皮細胞に送達され、治療用RNA構築物が標的内 皮細胞に入る。次に触媒性RNAがVEGF産生の減少を引き起こす。患者の網膜の悪 化は治癒され、そして失明が回避される。 実施例２３：ペルフルオロカーボンを使用するインビボトランスフェクション リポソームを、ジパルミトイルエチルホスホコリン(DPEPC)およびジオレイル ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から調製した。両脂質は、アバンチ ポ ーラー リピッズ(ハラバスター、アラバマ州)から購入した。リポフェクチン（L ipofectin（商標））およびリポフェクタミン（Lipofectamine(商標)）ならびに DMRIE-C(商標)は、ライフテクノロジーズ社（ゲチスバーグ、メリーランド州） から、即使用できる状態で得た。ヒト サイトメガロウイルスプロモーターおよ びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpC MVCATは、ライフテクノロジーズ社（ゲチスバーグ、メリーランド州）から提供 されたものであった。プラスミドDNAを大腸菌(E.Coli)から大規模抽出法 により調製し、そしてロフストランドラボス社(Lofdtrand Labs Limited、ゲチ スバーグ、メリーランド州)によりCsClバンド化により精製した。予備実験では 、１：１比のDPEPC/DOPE、６：１比の脂質：DNA(脂質およびDNAの組み合わせを 、集合的にDPDOと呼ぶ)を使用して、pCMVCATプラスミドを用いたトランスフェク ション後のHeLa細胞中の遺伝子発現レベルを測定することにより、２つの脂質の 比率ならびにDNAに対する脂質の比率を至適化した。リポソームは、乾燥した脂 質を水に懸濁し、そして混合した脂質を凍結乾燥し、そして再度、脂質の水に懸 濁することにより調製した。再水和した脂質を、歯科用混永器（Heavy duty#6 W ig-L-Bug Crescent Dental、ラィオンズ、イリノイ州）で約2,000rpmにて５分間 撹拌し、そして次に約30psiで押し出しデバイス(リペックスバイオメンプランズ 、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）を使用して、２つの0. 8ミクロンのポリカーボネートフィルターを通して押し出した。ペルフルオロカ ーボン(PFC)充填リポソームの調製には、100マイクロリットル、50、25または12 .5マイクロリットルのPFCを脂質溶液に加え、その後に歯科用混永器で震盪した 。試験したPFCは、ペルフルォロペンタン、ペルフルオロヘキサン、1-ブロモノ ナフルオロブタン、ペルフルオロオクチルブロミドおよびペルフルオロメチルブ チルエーテルを含んだ。 インビボ実験を、50匹のオスのBalb/Cマウスで行った。マウスの体重は、15− 20gであった。リポプレックスは、DPEPC/DOPE脂質混合物を使用する細胞トラン スフェクションに関する様式と同じ様式で形成した。この実験で使用したペルフ ルオロカーボンは、ペルフルオロヘキサンであった。混合物を後脚あたり200μl の投与量で筋肉内に注射した。超音 波(US)を１W/cm2で１分間、超音波を受けた動物の各脚に適用した。動物は２日 間維持され、そして次に二酸化炭素で窒息させることにより安楽死させた。後脚 を動物から取り出し、そして筋肉を集めた。筋肉を液体窒素中で凍結し、そして 乳鉢および乳棒で挽いた。組織を予め測定した50mlのコニカル管に移し、そして 組織重量を記録した。組織は次に、CAT ELISAキットからの１mlの溶菌緩衝液に 入れた。このCAT ELISAは、製造元の手順に従い行った。データは、マイクロソ フトエクセル(Microsoft Excel)に移し、そして組織１グラムあたりのng CATタ ンパク質に転換した。統計的分析は、マッキントッシュのJMP3.1.5統計分析パッ ケージを使用して行った。 結果を図７に示す。図で示すように、ペルフルオロカーボンの使用で（超音波 を使用してもしなくても）、マウスでのCAT発現は大変強化された。 本明細書中に引用または記載した各特許、特許出願および公報の開示は、その 内容全部を引用により本明細書に編入する。 本明細書に記載したものに加えて、種々の変更が前述の記載から当業者には明 らかである。そのような変更も、添付の特許請求の範囲の範囲内にあると考える 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｋ 47/42 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 7/00 7/00 9/10 9/10 11/00 11/00 21/00 21/00 31/18 31/18 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ０８／８４１，１６９ (32)優先日 平成９年４月29日(1997．4．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．細胞に、送達されるべき化合物および有機ハロゲン化物を含む組成物を投与 することを含んで成る、化合物の細胞への送達法。 ２．上記組成物が、さらにキャリアーを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．上記有機ハロゲン化物が、ガス状有機ハロゲン化物および液体有機ハロゲン 化物から成る群から選択される、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．上記有機ハロゲン化物がガスである、請求の範囲第２項に記載の方法。 ５．上記有機ハロゲン化物が液体である、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６．上記有機ハロゲン化物がガス前駆体である、請求の範囲第２項に記載の方法 。 ７．上記有機ハロゲン化物がフッ素化化合物である、請求の範囲第２項に記載の 方法。 ８．上記有機ハロゲン化物が過フッ素化化合物である、請求の範囲第２項に記載 の方法。 ９．上記有機ハロゲン化物がペルフルオロカーボンである、請求の範囲第２項に 記載の方法。 １０．上記有機ハロゲン化物がペルフルオロエーテル化合物である、請求の範囲 第２項に記載の方法。 １１．上記ペルフルオロカーボンが液体である、請求の範囲第９項に記載の方法 。 １２．上記液体ペルフルオロカーボンがガス前駆体である、請求の範囲第１１項 に記載の方法。 １３．上記液体ペルフルオロカーボンがガスである、請求の範囲第９項に記載の 方法。 １４．上記有機ハロゲン化物が、1-ブロモ-ノナフルオロブタン、ペルフルオロ オクチルヨージド、ペルフルオロオクチルブロミド、1-クロロ-1-フルオロ-1-ブ ロモメタン、1,1,1-トリクロロ-2,2,2-トリフルオロエタン、1,2-ジクロロ-2,2- ジフルオロエタン、1,1-ジクロロ-1,2-ジフルオロエタン、1,2-ジクロロ-1,1,3- トリフルオロプロパン、1-ブロモペルフルオロブタン、1-ブロモ-2,4-ジフルオ ロベンゼン、2-ヨード-1,1,1-トリフルオロエタン、5-ブロモバレリルクロライ ド、1,3-ジクロロテトラフルオロアセトン、五フッ素化臭素、1-ブロモ-1,1,2,3 ,3,3-ヘキサフルオロプロパン、2-クロロ1,1,1,4,4,4-ヘキサフルオロ-2-ブテン 、2-クロロペルフルオロ-1,3-ブタジエン、ヨードトリフルオロエチレン、1,1,2 -トリフルオロ-2-クロロエタン、1,2-ジフルオロクロロエタン、1,1-ジフルオロ -2-クロロエタン、1,1-ジクロロフロオロエタン、ヘプタフルオロ-2-ヨードプロ パン、ブロモトリフルオロエタン、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフル オロメタン、ジブロモフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ブロモク ロロジフルオロメタン、ジクロロ-1,1,2,2-テトラフルオロエタン、1,1,1,3,3- ペンタフルオロペンタン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリプ ロピルアミン、3-フルオロベンズアルデヒド、2-フルオロ-5-ニトロトルエン、3 -フルオロスチレン、3,5-ジフルオロアニリン、2,2,2-トリフルオロエチルアク リレート、3-(トリフルオロメトキシ)-アセトフェノン、1,1,2, 2,3,3,4,4-オクタフルオロブタン、1,1,1,3,3-ペンタフルオロブタン、1-フルオ ロブタン、1,1,2,2,3,3,4,4-オクタフルオロブタン、1,1,1,3,3-ペンタフルオロ ブタン、ペルフルオロ-4メチルキノリジン、ペルフルオロ-N-メチル-デカヒドロ キノン、ペルフルオロ-N-メチル-デカヒドロイソキノン、ペルフルオロ-N-シク ロヘキシル-ピロリジン、テトラデカペルフルオロヘプタン、ドデカペルフルオ ロシクロヘキサン、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプ ロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、 ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、ペルフル オロデカン、ペルフルオロドデカン、ペルフルオロ-2-メチル-2-ペンテン、ペル フルオロシクロヘキサン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロドデカリン、ペ ルフルオロプロピレン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロ-2-ブチン、 ペルフルオロ-2-ブテン、ペルフルオロブタ-1,3-ジエン、ペルフルオロブチルエ チルエーテル、ビス（ペルフルオロイソプロピル）エーテル、ビス（ペルフルオ ロプロピル）エーテル、ペルフルオロテトラヒドロピラン、ペルフルオロメチル テトラヒドロフラン、ペルフルオロt-ブチルメチルエーテル、ペルフルオロイソ ブチルメチルエーテル、ペルフルオロn-ブチルメチルエーテル、ペルフルオロイ ソプロピルエチルエーテル、ペルフルオロn-プロピルエチルエーテル、ペルフル オロシクロブチルメチルエーテル、ペルフルオロシクロプロピルエチルエーテル 、ペルフルオロイソプロピルメチルエーテル、ペルフルオロn-プロピルメチルエ ーテル、ペルフルオロジエチルエーテル、ペルフルオロシクロプロピルメチルエ ーテル、ペルフルオロメチルエチルエーテル、ペルフルオロジメチルエーテル、 六フッ化硫黄およ び六フッ化セレンから成る群から選択される、請求の範囲第２項に記載の方法。 １５．上記有機ハロゲン化物が、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペ ルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオ ロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナ ン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロドデカン、ペルフルオロ-2-メチル-2-ペ ンテン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロド デカリン、テトラデカペルフルオロヘキサンおよびドデカペルフルオロシクロヘ キサンから成る群から選択される、請求の範囲第２項に記載の方法。 １６．上記有機ハロゲン化物が、ペルフルオロエチルエーテル、ビス（ペルフル オロイソプロピル）エーテル、ビス（ペルフルオロプロピル）エーテル、ペルフ ルオロテトラヒドロピラン、ペルフルオロメチルテトラヒドロフラン、ペルフル オロt-ブチルメチルエーテル、ペルフルオロイソブチルメチルエーテル、ペルフ ルオロn-ブチルメチルエーテル、ペルフルオロイソプロピルエチルエーテル、ペ ルフルオロn-プロピルエチルエーテル、ペルフルオロシクロブチルメチルエーテ ル、ペルフルオロシクロプロピルエチルエーテル、ペルフルオロイソプロピルメ チルエーテル、ペルフルオロn-プロピルメチルエーテル、ペルフルオロジエチル エーテル、ペルフルオロシクロプロピルメチルエーテル、ペルフルオロメチルエ チルエーテルおよびペルフルオロジメチルエーテルから成る群から選択される、 請求の範囲第２項に記載の方法。 １７．上記有機ハロゲン化物が、ペルフルオロヘキサンおよびペルフルオロシク ロヘキサンから成る群から選択される、請求の範囲第２項に記 載の方法。 １８．さらに上記細胞に超音波を適用することを含んで成る、請求の範囲第２項 に記載の方法。 １９．上記超音波が、約40キロヘルツ〜約25メガヘルツの周波数、そして約500 ミリワット／cm2〜約10ワット／cm2のエネルギーレベルで適用される、請求の範 囲第１８項に記載の方法。 ２０．上記超音波が、約500キロヘルツ〜約200キロヘルツの周波数で適用され、 そして上記エネルギーレベルが約500ミリワット／cm2〜約200ミリワット／cm2で ある、請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２１．上記超音波が、約20メガヘルツ〜約１メガヘルツの周波数で適用され、そ して上記エネルギーレベルが約200ミリワット／cm2〜約100ミリワット／cm2であ る、請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２２．上記超音波が、処置時間の約１％〜約100％の使用率で適用される、請求 の範囲第２１項に記載の方法。 ２３．上記化合物および上記超音波が投与され、そして同時に適用される、請求 の範囲第１８項に記載の方法。 ２４．上記キャリアーがポリマー、脂質、タンパク質および金属イオンから成る 群から選択される、請求の範囲第２項に記載の方法。 ２５．上記キャリアーがタンパク質である、請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２６．上記タンパク質がカチオン性タンパク質である、請求の範囲第２５項に記 載の方法。 ２７．上記カチオン性タンパク質が、ポリリシンおよびポリエチレンイミンから 成る群から選択される、請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２８．上記キャリアーが脂質である、請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２９．上記脂質がカチオン性脂質である、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０．キャリアーがカチオン性脂質であり、該カチオン性脂質が、N-[1(2,3-ジ オレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライドである 、請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１．上記脂質がフッ素化脂質である、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３２．上記フッ素化脂質が、式 CnF2n+1(CH2)mC(O)OOP(OO-)O(CH2)wN+(CH3)3CnF2n+1(CH2)mC(O)O 式中、ｍは０〜約１８であり、ｎは１〜約１２であり；そしてｗは１〜約８で ある、 の化合物から選択される、請求の範囲第３１項に記載の方法。 ３３．上記脂質がフッ素化リン脂質である、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３４．上記キャリアーがポリマーである、請求の範囲第２４項に記載の方法。 ３５．上記ポリマーが、ポリエチレン、ポリオキシエチレン、ポリプロピレン、 プルロン酸およびアルコール、ポリビニル、ポリビニルピロリドン、アラビナン 、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キ シラン、レバン、フコイダン、カシゲーナン、ガラクトカロロース、ペクチン、 ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロー ス、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキ ストラン、プツラン、 キチン、アガロース、ケラタン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、 アルギン酸、１つ以上のアルドース、ケトース、酸、アミン、エリトロース、ト レオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アル トロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロ ース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、ピスコース、フルクトース 、ソルボース、タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツ ロン酸、マンヌロン酸、グルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイ ラミン酸を含むホモポリマーおよびヘテロポリマーから選択される、請求の範囲 第３４項に記載の方法。 ３６．上記キャリアーが金属イオンである、請求の範囲第２４項に記載の方法。 ３７．上記キャリアーが金属イオンであり、そして該金属イオンがカルシウムイ オン、マグネシウムイオンおよび亜鉛イオンから成る群から選択される、請求の 範囲第２４項に記載の方法。 ３８．上記キャリアーがLipofectin、Lipofectamine、Transfectace、Transfect am、Cytofectin、DMRIE、DLRIE、GAP-DLRIE、DOTAP、DOPE、DMEAP、DODMA、DOPC 、DDAB、DOSPA、EDLPC、EDMPC、DPH、TMADPH、CTAB、リシル-PE、DC-Chol、-ア ラニルコレステロール、DCGS、DPPES、DCPE、DMAP、DMPE、DOGS、DOHME、DPEPC 、Pluronic、Tween、BRIJ、プラスマロゲン、ホスファチジルエタノールアミン 、ホスファチジルコリン、グリセロ-3-エチルホスファチジルコリン、ジメチル アンモニウムプロパン、トリメチルアンモニウムプロパン、ジエチルアンモニウ ムプロパン、トリエチルアンモニウムプロパン、ジメチルジオクタデシルアンモ ニウ ムブロミド、スフィンゴ脂質、スフィンゴミエリン、リソリピッド、糖脂質、ス ルファチド、糖スフィンゴ脂質、コレステロール、レステロールエステル、コレ ステロール塩、油、N-スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン 、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール、1,3-ジパルミトイル-2-スクシニルグリ セロール、1,2-ジパルミトイル-sn-3-スクシニルグリセロール、1-ヘキサデシル -2-パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルホモ システイン、N,N'-ビス(ドデシルアミノカルボニルメチレン)-N,N-ビス((-N,N,N -トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン)エチレンジアミンテ トラヨージド：N,N''-ビス(ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン)-N,N',N''- トリス((N,N,N-トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレンジ-エ チレントリアミン ヘキサヨージド：N,N-ビス(ドデシルアミノカルボニルメチレ ン)-N,N''-ビス((-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルアミノカルボニルメチ レン)シクロヘキシレン-1,4-ジアミン テトラヨージド：1,1,7,7-テトラ-(((-N, N,N,N-テトラメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン)-3-ヘキサデ シルアミノカルボニル-メチレン-1,3,7-トリアアザヘプタン ヘプタヨージド： およびN,N,N',N'-テトラ((-N,N,N-トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボ ニルメチレン)-N'-(1,2-ジオレオイルグリセロ-3-ホスホエタノールアミノカル ボニルメチレン)ジエチレントリアミンテトラヨージドから成る群から選択され る、請求の範囲第２項に記載の方法。 ３９．上記キャリアーが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、、脂 肪酸、リソリピッド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン 、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロー ル、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、糖脂質、グルコリピッド、 スルファチド、グリコスフィンゴ脂質、ホスファチジン酸、パルミチン酸、ステ アリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ポリマーを有する脂質、スルホン化サッ カライドを有する脂質、コレステロール、トコフェロールヘミスクシネート、エ ーテル−結合脂肪酸を持つ脂質、エステル−結合脂肪酸を持つ脂質、重合化脂質 、ジアセチルホスホネート、ステアリルアミン、カルジオリピン、長さが６〜８ 炭素の脂肪酸を持つリン脂質、非対称アシル鎖を持つリン脂質、6-(5-コレステ ン-3b-イルオキシ)-1-チオ-b-D-ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセ リド、6-(5-コレステン-3b-イルオキシ)ヘキシル-6-アミノ-6-デオキシ-1-チオ- b-D-ガラクトピラノシド、6-(5-コレステン-3β-イルオキシ)ヘキシル-6-アミノ -6-デオキシル-1-チオ-α-D-マンノピラノシド、12-(((7'-ジエチルアミノ-クマ リン-3-イル)カルボニル)メチルアミノ)-オクタデカン酸、N-[12-(((7'-ジエチ ルアミノクマリン-3-イル)カルボニル)メチル-アミノ)-オクタデカノイル]-2-ア ミノパルミチン酸；コレステリル)4'-トリメチル-アミノ)ブタノエート、N-スク シニルジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン；1,2-ジオレオイル-sn- グリセロール、1,2-ジパルミトイル-sn-3-スクシニル-グリセロール；1,3-ジパ ルミトイル-2-スクシニルグリセロール、1-ヘキサデシル-2-パルミトイル-グリ セロホスホエタノールアミン、パルミトイルホモシステインおよび／またはそれ らの込み合わせから成る群から選択される、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４０．上記キャリアーがホスファチジルコリンを含んで成り、そして該ホスファ チジルコリンが、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリ ストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジ ラウロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパル ミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンから 成る群から選択される、請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４１．上記キャリアーがホスファチジルエタノールアミンを含んで成り、そして 該ホスファチジルエタノールアミンが、ジオレオイルホスファチジルエタノール アミンである、請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４２．上記キャリアーがスフィンゴ脂質を含んで成り、そして該スフィンゴ脂質 が、スフィンゴミエリンである、請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４３．上記キャリアーが糖脂質を含んで成り、そして該糖脂質が、ガングリオシ ドＧＭ１およびガングリオシドＧＭ２から選択される、請求の範囲第３９項に記 載の方法。 ４４．上記キャリアーがポリマーを持つ脂質を含んで成り、そして該脂質の該ポ リマーが、ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸およびポリビニルピ ロリドンから成る群から選択される、請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４５．上記ポリマーが、ポリエチルエチレングリコールであり、該ポリエチレン グリコールが約2000、5000および8000の分子量を有するポリエチレングリコール から成る群から選択される、請求の範囲第４４項に記載の方法。 ４６．上記キャリアーが、スルホン化サッカライドを持つ脂質を含んで成る、請 求の範囲第３９項に記載の方法。 ４７．上記キャリアーが、コレステロールを含んで成り、そして該コレステロー ルが硫酸コレステロールおよびコレステロールヘミスクシネートから成る群から 選択される請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４８．上記キャリアーが、非対称アシル鎖を持つリン脂質を含んで成り、そして 該非対称アシル鎖を持つリン脂質が、１つの約６個の炭素長のアシル鎖およびも う１つの約１２個の炭素長のアシル鎖を有するリン脂質である、請求の範囲第３ ９項に記載の方法。 ４９．上記キャリアーが、約82モルパーセントのジパルミトイルホスファチジル コリン、約８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン −ポリエチレングリコール5000、および約10モルパーセントのジパルミトイルホ ステァチジン酸を含んで成る、請求の範囲第２項に記載の方法。 ５０．上記キャリアーがサーファクタントである、請求の範囲第２項に記載の方 法。 ５１．上記界面活性剤がフルオロサーファクタントである、請求の範囲第５０項 に記載の方法。 ５２．上記有機ハロゲン化物がガス前駆体であり、そして該ガス前駆体が投与後 にガスに転換される、請求の範囲第２項に記載の方法。 ５３．上記ガス前駆体が、上記細胞に熱を適用することによりガスに転換される 、請求の範囲第５２項に記載の方法。 ５４．上記熱が超音波により適用される、請求の範囲第５３項に記載の方法。 ５５．上記超音波が、約40キロヘルツ〜約25メガヘルツの周波数で適用され、そ して上記エネルギーレベルが約500ミリワット／cm2〜約10ワッ ト／cm2である、請求の範囲第５４項に記載の方法。 ５６．上記超音波が、約500キロヘルツ〜約200キロヘルツの周波数で適用され、 そして上記エネルギーレベルが約500ミリワット／cm2〜約200ミリワット／cm2で ある、請求の範囲第５４項に記載の方法。 ５７．上記超音波が、約20メガヘルツ〜約１メガヘルツの周波数で適用され、そ して上記エネルギーレベルが約200ミリワット／cm2〜約100ミリワット／cm2であ る、請求の範囲第５４項に記載の方法。 ５８．上記超音波が、処置時間の約１％〜約100％の使用率で適用される、請求 の範囲第５４項に記載の方法。 ５９．上記超音波が、約10％〜約20％の使用率で適用される、請求の範囲第５４ 項に記載の方法。 ６０．上記方法がインビボで行われる、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６１．上記方法がエクスビボで行われる、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６２．上記方法がインビトロで行われる、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６３．上記キャリアーが小胞を含んで成る、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６４．送達される上記化合物が上記小胞にカプセル化されている、請求の範囲第 ６３項に記載の方法。 ６５．上記細胞が哺乳動物細胞である、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６６．上記哺乳動物細胞がヒトの細胞である、請求の範囲第６５項に記載の方法 。 ６７．送達される上記化合物がヌクレオチド配列である、請求の範囲第 ２項に記載の方法。 ６８．上記ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である、請求の範囲第６７項に記載の 方法。 ６９．上記ＤＮＡ配列が、インターロイキン-２、インターロイキン-４、Bcl 2 、血管内皮増殖因子、ヒトパピローマウイルス、およびヒト免疫不全症ウイルス 、ヒト白血球抗原、腫瘍壊死因子、顆粒球−マクロファージ コロニー刺激因子 、嚢胞性繊維症膜貫通レセプター、アデノシンデアミナーゼ、黄体形成ホルモン 放出ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、ヒト成長ホルモ ン、インスリン、高密度リポタンパク質、チミジンキナーゼ、HLA-B7、第VIII因 子およびras/p53をコードするＤＮＡ配列から成る群から選択される、請求の範 囲第６８項に記載の方法。 ７０．上記ＤＮＡ配列が、後天的免疫不全症候群、血友病、筋ジストロフィー、 嚢胞性繊維症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵 巣癌、脳癌、腎臓癌黒色腫、神経繊維腫および乳癌から成る群から選択される疾 患を処置する目的のために投与される、請求の範囲第６８項に記載の方法。 ７１．上記ＤＮＡ配列が嚢胞性繊維症を処置する目的で吸入器により投与される 、請求の範囲第６８項に記載の方法。 ７２．上記ＤＮＡ配列がアテローム性動脈硬化症を処置する目的でバルーンカテ ーテルにより投与される、請求の範囲第６８項に記載の方法。 ７３．上記ＤＮＡ配列が血管内皮増殖因子をコードし、そして該ＤＮＡ配列が、 キャリアーがヒドロゲルであるキャリアーと組み合わせて投与される、請求の範 囲第６８項に記載の方法。 ７４．上記ＤＮＡ配列がインターロイキン−２をコードし、そして該ＤＮＡ配列 が、カチオン性リポソームと組み合わせて投与される、請求の範囲第６８項に記 載の方法。 ７５．上記ＤＮＡ配列が筋ジストロフィーを処置する目的で投与される、請求の 範囲第６８項に記載の方法。 ７６．上記ＤＮＡ配列がBcl 2をコードし、そして該ＤＮＡ配列が結腸癌を処置 する目的で投与される、請求の範囲第６８項に記載の方法。 ７７．送達されるべき化合物が生物活性剤である、請求の範囲第２項に記載の方 法。 ７８．送達されるべき化合物が診断薬である、請求の範囲第２項に記載の方法。 ７９．送達されるべき化合物が医薬品である、請求の範囲第２項に記載の方法。 ８０．上記方法が、リン酸カルシウム沈殿法、ウイルスベクターを用いるトラン スフェクション、マイクロインジェクションおよび電気穿孔法から成る群から選 択される別の細胞内送達技法と同時に行われる、請求の範囲第２項に記載の方法 。 ８１．上記方法が、リン酸カルシウム沈殿法、ウイルスベクターを用いるトラン スフェクション、マイクロインジェクションおよび電気穿孔法から成る群から選 択される別の細胞内送達技法と同時に行われる、請求の範囲第１８項に記載の方 法。 ８２．細胞にヌクレオチド配列および有機ハロゲン化物を含む組成物を投与する ことを含んで成る、細胞中でヌクレオチド配列の発現を行う方法。 ８３．上記組成物がさらにキャリアーを含む請求の範囲第８２項に記載の方法。 ８４．さらに超音波を適用する工程を含む請求の範囲第８３項に記載の方法。 ８５．細胞が哺乳動物細胞である、請求の範囲第８３項に記載の方法。 ８６．細胞がヒトの細胞である、請求の範囲第８３項に記載の方法。 ８７．患者に治療に効果的な量の化合物および有機ハロゲン化物を含む組成物を 投与することを含んで成る、患者の処置法。 ８８．さらに超音波を適用する工程を含む請求の範囲第８７項に記載の方法。 ８９．治療に効果的な量の化合物および有機ハロゲン化物を含んで成る組成物。 ９０．キャリアーをさらに含む請求の範囲第８９項に記載の組成物。 ９１．診断に効果的な量の化合物および有機ハロゲン化物を含んで成る組成物。 ９２．キャリアーをさらに含む請求の範囲第９１項に記載の組成物。 ９３．有機ハロゲン化物およびキャリアーを含んで成るキット。 ９４．細胞に送達する化合物をさらに含む請求の範囲第９３項に記載のキット。 ９５．従来のキット成分をさらに含む請求の範囲第９３項に記載のキット。 ９６．有機ハロゲン化物および細胞に送達されるべき化合物を含むキット。 ９７．さらにキャリアーを含む請求の範囲第９６項に記載のキット。 ９８．従来のキット成分をさらに含む請求の範囲第９６項に記載のキット。 ９９．細胞に送達すべき化合物を投与し、そして超音波を適用することを含んで 成る化合物の細胞への送達法。 １００．上記化合物が、さらにキャリアーを含む組成物中にある、請求の範囲第 ９９項に記載の方法。 １０１．患者に治療に効果的な量の化合物を投与し、そして超音波を適用するこ とを含んで成る患者の処置法。 １０２．上記化合物が、さらにキャリアーを含む組成物中にある、請求の範囲第 １０１項に記載の方法。 １０３．細胞にヌクレオチド配列を投与し、そして超音波を適用することを含ん で成る細胞中でヌクレオチド配列の発現を行う方法。 １０４．上記ヌクレオチド配列が、さらにキャリアーを含む組成物中にある、請 求の範囲第１０３項に記載の方法。
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