DE19834612A1 - Verfahren zum intrazellulären Transfer von Oligonukleotiden und Vorrichtung zur Durchführung desselben - Google Patents

Verfahren zum intrazellulären Transfer von Oligonukleotiden und Vorrichtung zur Durchführung desselben

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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Abstract

Verfahren zum intrazellulären Transfer von Oligonukleotiden und Vorrichtung zur Durchführung desselben. DOLLAR A Unter dem Einfluß von Schockwellen werden Oligonukleotide in Zellen transferiert.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum intrazellulären Transfer von Oligonukleotiden gemäß dem Verfahrensanspruch 1 und einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß dem Vorrichtungsanspruch 4.
Der intrazelluläre Transfer von Oligonukleotiden dient zur gezielten Synthesehemmung von einzelnen Proteinen in der Zelle. Um die Synthese eines Proteins zu hemmen wird eine kurzkettige synthetische Nukleinsäure mit einer frei wählbaren Abfolge von Basen in das Zytoplasma der Zelle eingebracht. Sobald vom Zellkern der Zelle die zur Synthese eines Proteins notwendige sogenannte mRNS abgegeben wird, kann sich das in der Zelle befindliche Oligonukleotid an die Stelle der mRNS anlegen, deren Abfolge komplementär zu der Basenabfolge des Oligonukleotids aufgebaut ist. Durch dieses "Anlegen" wird die Synthese genau eines Proteins blockiert. Folglich fehlt in dieser Zelle ein ansonsten vorhandenes Protein. Das Fehlen dieses Proteins kann in einer Änderung der Zelleigenschaften oder Mortalität der Zelle resultieren.
Bei einem bekannten Verfahren zum intrazellulären Transfer von Oligonukleotiden werden sogenannte Träger Lipide verwendet, durch welche eine Verbesserung der Aufnahme der Oligonukleotide in das Zytoplasma der Zelle erzeugt wird. Nachteilig bei diesem bekannten Verfahren ist die Notwendigkeit diese relativ teuren Träger Lipide zusätzlich zu den Oligonukleotiden als Verbrauchsmaterial für den intrazellulären Transfer.
Eine andere bekannte Möglichkeit des Transfers von Oligonukleotiden sieht ein direktes Einbringen etwa durch Mikroinjektionen oder Elektroporation vor. Nachteilig bei der Methode des direkten Einbringens ist jedoch die Effektivität.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen wodurch in effektiver Weise ein intrazellulärer Transfer von Oligonukleotiden ohne den aufwendigen Zusatz von Träger Lipiden möglich ist.
Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe erfolgt durch die kennzeichnenden Merkmale des Verfahrensanspruchs 1 und des Vorrichtungsanspruchs 4.
Die jeweiligen Unteransprüche betreffen Weiterbildungen der Erfindung und/oder besonders vorteilhafte Ausgestaltungsformen.
Die Überlegungen die zu der vorliegenden Erfindung führten gingen davon aus, daß unter dem Einfluß von Stoßwellen in Flüssigkeiten Kavitation entsteht. Diese Kavitation läßt sich vereinfacht darstellen als Bildung und Bewegung von Blasen oder Hohlräumen in einer Flüssigkeit. Zusätzlich zu dadurch entstandenen Scherkräften kommt es zur Bildung eines sehr feinen, nadelartigen Flüssigkeitsstrahls. Dieser Flüssigkeitsstrahl durchdringt die Zellmembran und transferiert eine geringe Menge der Flüssigkeit in die Zelle.
Wenn sich in dieser Flüssigkeit stochastisch verteilt die zu transferierenden Oligonukleotide befinden, besteht eine von der Konzentration der Oligonukleotide in der Flüssigkeit abhängige Wahrscheinlichkeit, daß Oligonukleotide in die Zelle transferiert wurden.
Nachfolgend wird ein mögliches Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand einer Zeichnung näher erläutert:
Die Fig. 1 zeigt einen schematischen Aufbau eine Vorrichtung 1 mit welcher das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist. Die Vorrichtung 7 ist mit einer Flüssigkeit 2 gefüllt. Durch einen Stoßwellengenerator 3 kann die Flüssigkeit 2 einer Stoßwellen ausgesetzt werden.
In die Flüssigkeit 2 ist ein Probenbehälter 4 teilweise eingetaucht. Der Probenbehälter 4 ist an einem aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht gezeichneten Halter befestigt.
Im Probenbehälter 4 befindet sich eine im wesentlichen wässrige Lösung 5. In dieser Lösung 5 befinden sich die Oligonukleotide und die Zellen in welche die Oligonukleotide transferiert werden sollen.
Das Material des Probenbehälters 4 ist für Stoßwellen durchgängig, die im wesentlichen wässrige Lösung 5 in der sich die Oligonukleotide und die Ziel-Zellen für den Transfer der Oligonukleotide leitet die Stoßwellen ebenfalls weiter.
Durch Aktivieren der Stoßwellenquelle 3 entsteht in der wässrigen Lösung 5 Kavitation.
Bei der Kavitation tritt ein sehr feiner, nadelartiger Fluidstrahl aut. Wenn dieser Fluidstrahl auf die Zelle trifft durchdringt er ähnlich einer Microinjektion die Zellmembran. Eine geringe Menge der Flüssigkeit aus welcher der Fluidstrahl besteht verbleibt in der Zelle.
Da sich in der Flüssigkeit stochastisch verteilt die zu transferierenden Oligonukleotide befinden, werden ebenso stochastisch verteilt in einzelne Zellen die Oligonukleotide transferiert.
Durch mehrmaliges Aktivieren der Stoßwellenquelle erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, daß Oligonukleotide in die Zelle transferiert werden.
Auf diese Weise ist es rationell möglich mit verhältnismäßig geringem Aufwand in eine größere Anzahl von Zellen Oligonukleotide zu transferieren.
Ebenso ist es auch möglich "in vivo" Oligonukleotide in Zellen zu transferieren. Dabei können sich die Ziel Zellen in einem Lebewesen befinden, und die Oligonukleotide können durch geeignete Maßnahmen (etwa Blutkreislauf oder Injektion) in der Nähe der Ziel Zellen befinden. Durch Einleiten von extrakorporalen Stoßwellen in den Körper des Lebewesens und Fokusierung auf die einen Bereich des Körpers ist es möglich lokal Oligonukleotide in Zellen des Körpers einzubringen und so die Eigenschaften der Zellen und/oder deren Mortalität bzw Letalität verändern.

Claims (7)

1. Verfahren zum Transfer von Oligonukleotiden in eine Zelle, wobei die Zellmembran temporär und partiell durchlässig gemacht wird um ausserhalb der Zelle vorhandene Oligonukleotide in die Zelle einbringen zu können dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle in welche die Oligonukleotide transferiert werden sollen und die zu transferierenden Oligonukleotide gemeinsam einer Stoßwelle ausgesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle in welche die Oligonukleotide transferiert werden sollen und die zu transferierenden Oligonukleotide sich gemeinsam in einer im wesentlichen wässrigen Lösung befinden während sie der Stoßwelle ausgesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle in welche die Oligonukleotide transferiert werden sollen sich in einem lebenden Zellverbund befinden und die zu transferierenden Oligonukleotide sich in der die Zellen umgebenden Flüssigkeit befinden während die Zellen und die Oligonukleotide der Stoßwelle ausgesetzt werden.
4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch einen Stoßwellengenerator eine oder mehrere Zellen in welche die Oligonukleotide transferiert werden sollen und die Oligonukleotide mit einer Stoßwelle beaufschlagbar sind.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
  • 1. die Zellen in welche die Oligonukleotide transferiert werden sollen und die zu transferierenden Oligonukleotide in einem Stoßwellen weiterleitenden Medium innerhalb eines gemeinsamen Behälters angeordnet sind,
  • 2. der Behälter die Stoßwellen weiterleitet und seinerseits in ein Stoßwellen weiterleitendes Medium einsetzbar sind und in dieses Medium eine durch eine Stoßwellenquelle erzeugte Stoßwelle einleitbar ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stoßwellen auf den Behälter, in welchem sich die Zellen und die Oligonukleotide befinden fokusierbar ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Zellen in welche die Oligonukleotide transferiert werden sollen und die zu transferierenden Oligonukleotide innerhalb eines Körpers eines Lebewesens befinden und die Stoßwellen von aussen in den Körper einleitbar sind.
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