DE3012233C2

DE3012233C2 -

Info

Publication number: DE3012233C2
Application number: DE3012233A
Authority: DE
Inventors: Franklin Richmond Va. Us Lim
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1979-03-28
Filing date: 1980-03-28
Publication date: 1988-03-31
Also published as: GB2046209B; CH653914A5; BE882476A; NO160380B; DK130580A; JPS61293919A; GB2046209A; NO160380C; JPS6242889B2; JPS55157502A; CA1145258A; CH657786A5; FR2452285B1; FR2452285A1; SE8002357L; NO800901L; IT1133081B; FR2457688A1; SE448060B; JPS6239131B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Einkapseln von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe oder Einzelzellen derart, daß sie lebensfähig und in geschütztem Zustand in Mikrokapseln mit Membranen enthalten sind, die für Nährstoffe, Ionen, Sauerstoff und andere Stoffe, die zur Lebenderhaltung des Gewebes bzw. der Zellen und Unterstützung ihrer normalen Stoffwechselfunktionen notwendig sind, durchlässig, aber für Bakterien, Lymphocyten und große Proteine, wie sie für immunchemische Reaktionen, die in einer Abstoßung resultieren, verantwortlich sind, undurchlässig sind.

Mit diesem Verfahren wird z. B. die Erzeugung von insulinerzeugenden Systemen oder anderen hormonerzeugenden Systemen ermöglicht, da das Verfahren beispielsweise die Einkapselung von Pankreas-α-Zellen, Pankreas-β-Zellen, intakten Lagerhans'schen Inseln und anderen Gewebe oder Gewebefraktionen von Säugetieren und Menschen, die Hormone ausscheiden, ermöglicht. Die Kapseln sind in einem Kulturmedium suspendierbar und scheiden über einen langen Zeitraum Hormone aus. Die Kapseln können auch als künstliche Bauchspeicheldrüse verwendet werden, die z. B. durch Injektion in den Körper von Säugern implantierbar ist und im lebenden Körper Insulin und andere Hormone entsprechend der Zuckerkonzentration ihrer Umgebung ausscheidet.

Es gibt bisher kein Verfahren zum Einkapseln von lebendem Gewebe, bei dem das Gewebe lebensfähig bleibt, da die bei der für Kapselmembranbildung notwendigen Bedingungen für lebende Systeme schädlich sind.

Aus der DE-AS 23 34 900 ist ein Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen bekannt, bei dem die Enzymmoleküle kovalent über funktionelle Gruppen des Enzyms, die für die enzymatische Aktivität nicht wesentlich sind, an eine Gelmatrix gebunden werden.

In der Zeitschrift CHEMTECH, November 1973, S. 682, insbesondere rechte Spalte, Absatz 3, ist in sehr allgemeiner Form auf die Möglichkeit hingewiesen, Mikrokapseln zu erzeugen, in denen Enzymmoleküle eingeschlossen sind, wobei die Kapselwandungen für die Enzymmoleküle undurchlässig, jedoch für Substrat- und Produktmoleküle durchlässig sind. Weitere Angaben, insbesondere zur Erzeugung und Struktur derartiger Mikrokapseln, finden sich in dieser Druckschrift nicht.

Aus US 27 66 478 ist das Verfahren des Oberbegriffs des Anspruchs 1 bekannt.

Eingekapselte lebende Zellen, Zellorganellen oder Gewebe sind in vielfacher Weise einsetzbar. So kann z. B. das eingekapselte lebende Material in einer halbdurchlässigen Membran in einer dauernd sterilen Umgebung bewahrt und vor direktem Kontakt mit großen, potentiell zerstörerischen Molekülarten geschützt werden, während gleichzeitig der freie Durchtritt von niedermolekularen Nährstoffen und Stoffwechselprodukten möglich ist. Somit könnte die Entwicklung eines solchen Einkapselungsverfahrens zu Systemen führen, die nützliche Hormone, wie Insulin, erzeugen. In solchen Systemen würde das für die Produktion des jeweiligen Stoffs einsetzbare Gewebe in einer Weise eingekapselt, daß ein freier Durchtritt von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten durch die Membran möglich, der Durchtritt von Bakterien hingegen unmöglich ist. Wenn die Membran-Durchlässigkeit kontrollierbar ist, könnte ein solches Verfahren auch zu künstlichen Organen führen, die z. B. in den Körper einpflanzbar sind, ohne daß sie abgestoßen werden, wobei ein kontrollierter Hormonaustritt, z. B. von Insulin, dessen Erzeugung durch die Glucosekonzentration ausgelöst wird, möglich wäre.

Es wurde verschiedentlich versucht, künstliche Organe herzustellen, die für die Implantation in den Körper geeignet sind, indem eine mechanische halbdurchlässige Sperrschicht, z. B. eine Diffusionskammer oder eine Kapillarrohrkammer, um Gewebe, das von einem Spender entnommen wurde, vorgesehen wurde. Derartige künstliche Organe erfordern allerdings normalerweise eine chirurgische Einpflanzung. Außerdem werden durch die Schutzmechanismen von Säugerkörpern die Implantate isoliert, und zwar typischerweise durch Verstopfen von Poren mit fibroblastischen Wucherungen.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Einkapseln von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebenden Zellen, Zellorganellen oder von Gewebe in Membranen anzugeben, die für Nährstoffe und andere für die Lebenderhaltung und den Stoffwechsel erforderliche Substanzen sowie für Stoffwechselprodukte durchlässig, jedoch für Bakterien und Stoffe mit einer Molekülmasse oberhalb eines bestimmten Werts undurchlässig sind, so daß für eine immunchemische Abstoßung von fremdem Gewebe verantwortliche Stoffe ausgeschlossen werden. Ferner soll mikroverkapseltes lebendes Gewebe vorgesehen werden, das für die Erzeugung von Hormonen, wie Insulin, nutzbar ist und komplexe chemische Änderungen, die für das im lebenden Körper befindliche Gewebe charakteristisch sind, bewirkt, insbesondere ein Insulin-Erzeugungssystem, wobei die lebenden Gewebe nichtchirurgisch in den Körper implantierbar sein sollen.

Die Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen 1, 21 und 26 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche. In diesem Zusammenhang wird noch auf § 2b PatG 1978 verwiesen.

Die in Schritt C erhaltenen temporären Kapseln sind aus jedem nichtgiftigen wasserlöslichen Stoff herstellbar, der durch eine Änderung der Bedingungen im Medium, in dem er sich befindet zu einer formbeständigen Masse gelierbar ist und der ferner eine Vielzahl von Gruppen umfaßt, die in einfacher Weise zu anionischen oder kationischen Gruppen ionisierbar sind. Die Anwesenheit solcher Gruppen im eingesetzten Polymer ermöglicht die Vernetzung von Oberflächenschichten der Kapseln zu dauerhaften, permanenten Membranen, wenn diese Gruppen mit Polymeren zusammengebracht werden, die eine Vielzahl funktioneller Gruppen entgegengesetzter Ladung aufweisen.

Bevorzugte Stoffe zur Erzeugung der temporären Kapseln sind natürliche und synthetische Polysaccharid-Gummiharze, die a) gelierbar sind unter Bildung einer formbeständigen Masse, indem sie einer Änderung der Bedingungen, etwa des pH-Werts, oder mehrwertigen Kationen, wie Ca ⁺⁺, ausgesetzt werden, und die b) permanent vernetzbar oder härtbar sind durch Polymerisate, die reaktionsfähige Gruppen, wie Amino- oder Iminogruppen, enthalten, die mit sauren Gruppen des Polysaccharids reagieren können. Bevorzugte Gummiharze sind Alkalimetallalginate. Andere verwendbare wasserlösliche Gummiharze sind Guargummiharz, Gummiarabicum, Carrageenan, Pectin, Tragantgummiharz, Xanthangummiharz und saure Fraktionen dieser Substanzen. Wenn wärmebeständige Stoffe einzukapseln sind, können anstelle der Gummiharze auch Gelatine oder Agar-Agar eingesetzt werden.

Bevorzugt wird zur Erzeugung der Tröpfchen die Suspension des einzukapselnden Materials, z. B. von Gewebeteilchen im Gummiharz-Nährstoff-Medium durch ein vibrierendes Kapillarrohr gepreßt, das im Zentrum eines durch schnelles Rühren einer Lösung mit mehrwertigen Kationen erzeugten Wirbels angeordnet ist. Von der Spitze des Kapillarrohrs abgeschleuderte Tröpfchen gelangen sofort mit der Lösung in Kontakt und gelieren als kugelige Körper. Bevorzugt werden bei der Erzeugung einer permanenten halbdurchlässigen Membran um die temporären Kapseln Oberflächenschichten eines gelierten Gummiharzes, das freie Säuregruppen aufweist, mit Polymeren vernetzt, die reaktionsfähige Säuregruppen, wie Amino- oder Iminogruppen, enthalten. Typischerweise erfolgt dies in einer verdünnten Lösung des jeweils ausgewählten Polymers. Normalerweise gilt: Je niedriger die Molekülmasse des Polymers, desto größer seine Eindringtiefe in die temporären Kapseln und um so geringere Permeabilität der erhaltenen Membranen. Permanente Vernetzungen werden über Salzbindungen zwischen den reaktionsfähigen Säuregruppen des zur Vernetzung eingesetzten Polymers und den Säuregruppen der Polysaccarid- Gummiharze erzeugt. In gewissen Grenzen ist die Permeabilität dadurch kontrollierbar, daß die Molekülmasse des zur Vernetzung eingesetzten Polymers, seine Konzentration und die Reaktionsdauer entsprechend eingestellt werden. Zur Vernetzung günstig geeigneter Polymere sind Polyethylenimin und Polylysin. Die Molekülmasse kann in Abhängigkeit von der erwünschten Permeabilität im Bereich von ca. 3000 und 100 000 oder mehr liegen. Gute Ergebnisse werden beim Einsatz von Polymeren mit einer mittleren Molekülmasse von 35 000 erzielt.

Durch entsprechende Wahl des Vernetzungs-Polymers können die Kapseln mit einer vorgegebenen Lebensdauer im lebenden Körper versehen werden. Proteine oder Polypeptide, z. B. Polylysin, werden im lebenden Körper leicht angegriffen, so daß sich eine relativ schnelle Zerstörung der Membran ergibt. Vernetzungsmaterialien, die im Körper nicht leicht abbaubar oder resorbierbar sind, z. B. Polyethylenimin, ergeben Membranen mit größerer Lebensdauer. Durch Wahl des Vernetzungs-Polymers oder durch gleichzeitiges oder aufeinanderfolgendes Vernetzen mit zwei oder mehr derartigen Materialien kann die Zeit, während der das implantierte Gewebe geschützt bleibt, eingestellt werden.

Bei Einsatz bestimmter Stoffe zur Erzeugung der temporären Kapseln kann gegebenenfalls die Stoffübertragung innerhalb der Kapsel nach Erzeugung der permanenten Membran dadurch verbessert werden, daß die Bedingungen wiederhergestellt werden, unter denen der Stoff flüssig ist, z. B. durch Entfernen der mehrwertigen Kationen. Dies kann durch Ionenaustausch erfolgen, z. B. durch Einbringen in phosphatgepufferte Salzlösung oder Citratpufferlösung. In manchen Fällen, wenn es z. B. erwünscht ist, das eingekapselte Gewebe aufzubewahren, oder wenn die temporäre gelierte Kapsel durchlässig ist, kann bevorzugt das eingekapselte Gummiharz im vernetzten, gelierten Zustand belassen werden.

Nach einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Erzeugung der permanenten Membranen eine Grenzflächen-Polykondensation oder -Polyaddition in an sich bekannter Weise durchgeführt. Dabei wird eine Suspension der temporären Kapseln in einer wäßrigen Lösung des wasserlöslichen Reaktanten von zwei komplementären Monomeren, die ein Polymerisat bilden können, hergestellt. Dann wird die wäßrige Phase in einer hydrophoben Flüssigkeit suspendiert, in der der komplementäre Reaktant löslich ist. Wenn der zweite Reaktant dem Zweiphasensystem zugesetzt wird, erfolgt die Polyreaktion an der Grenzfläche. Die Permeabilität der resultierenden Membranen ist durch Einstellen der Zusammensetzung des hydrophoben Lösungsmittels und der Konzentration der Reaktionsteilnehmer kontrollierbar. Es ist auch möglich, die permanenten Membranen dadurch zu erzeugen, daß in den temporären Kapseln eine bestimmte Proteinmenge vorgesehen wird und die Kapseln durch Einbringen in eine Lösung eines Vernetzungsmittels, wie Glutaraldehyd, in ihren Oberflächenschichten vernetzt werden.

Das vorstehend angegebene Verfahren eignet sich dazu, lebensfähige Langerhans'sche Inseln einzukapseln, die in einem Medium, das die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Unterstützung des Gewebe-Stoffwechsels notwendigen Nährstoffe und andere Stoffe enthält, Insulin in Anwesenheit von Glucose ausscheiden. Eingekapseltes Gewebe wurde so für drei Monate in lebensfähigem Zustand gehalten. Auch wurden Leberzellen eingekapselt, und es wurde demonstriert, daß sie sich in einem physiologisch aktiven Zustand befanden.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Mikrokapseln mit eingekapselten Gewebeteilchen können nichtchirurgisch in den Körper eingebracht werden und vermeiden Probleme der Immunabstoßung. Die Kapseln werden in eine geeignete Stelle des Körpers injiziert und funktionieren normal, bis entweder das Gewebe abstirbt oder natürliche Vorgänge im Körper dafür sorgen, daß die Kapseln isoliert werden, so daß für die Lebensfähigkeit des Gewebes notwendige Stoffe nicht länger zur Verfügung stehen. Zu diesem Zeitpunkt kann, da die Implantation nichtchirurgisch erfolgt, neues mikroverkapseltes Gewebe durch eine weitere Injektion eingebracht werden. Dem Körper kann somit die spezielle Funktion des betreffenden Gewebes für eine erwünschte Zeitspanne vermittelt werden.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung werden Langerhans'sche Inseln oder Inselpräparate, die ausgewählte Mengen von α-, β- und/oder δ-Zellen von Langerhans'schen Inseln enthalten, in mit Polylysin und Polyethylenimin vernetzten Alginatmembranen eingekapselt. Diese können periodisch, z. B. in die Bauchhöhle injiziert werden und funktionieren als künstliche Bauchspeicheldrüse.

Durch die Erfindung ist es also möglich, lebensfähiges Gewebe, z. B. Langerhans'sche Inseln oder Lebergewebe von Säugetieren und Menschen, in halbdurchlässige Membranen einzukapseln, die den Durchtritt von Sauerstoff, Aminosäuren und Nährstoffen erlauben, die für die Lebenderhaltung und den Stoffwechsel des Gewebes notwendig sind, aber für Bakterien, Lymphocyten und Proteine, die eine über einem vorgegebenen Wert liegende Molekülmasse haben, undurchlässig sind, so daß potentiell schädliche große Moleküle, wie Immunglobuline, ausgeschlossen sind. Eingekapseltes Lebergewebe kann als Entgiftungssystem eingesetzt werden. Das eingekapselte Lebergewebe ist gegen Blutproteine, die für immunchemische Abstoßung verantwortlich sind, sowie gegen Leukocyten und Bakterien geschützt, Giftstoffe und für die Lebenderhaltung und den normalen Stoffwechsel des Gewebes erforderliche Nährstoffe treten jedoch ungehindert durch die Membranen. Die Kapseln sind in eine geeignete Stelle in den Körper injizierbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Einkapselung biologisch labiler Stoffe sowie etwa von Aktivkohleteilchen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Die Zeichnung zeigt schematisch eine bevorzugte Verfahrensweise beim Einkapseln von lebendem Gewebe sowie das mikroverkapselte Produkt. Die einzukapselnden Gewebeteilchen, Zellorganellen oder Zellen werden nach bekannten Verfahren in feinverteilter Form vorbereitet und in einem wäßrigen Medium suspendiert, das zur Lebenderhaltung und Unterstützung der weitergehenden Stoffwechselvorgänge geeignet ist. Zu diesem Zweck geeignete Medien sind handelsüblich. Der mittlere Durchmesser des einzukapselnden Stoffs kann in einem weiten Bereich zwischen weniger als 1 µm und mehreren mm liegen. Langerhans'sche Inseln haben typischerweise einen Durchmesser von 140-200 µm. Erfindungsgemäß können erwünschtenfalls einzelne Zellen, wie α-, β- oder δ-Zellen der Bauchspeicheldrüse oder verschiedene Teile dieser Zellen, ganze Langerhans'sche Inseln, einzelne Hepatocyten, Zellorganellen oder andere Gewebeeinheiten eingekapselt werden. Auch können Mikroorganismen sowie nichtlebende Substanzen, etwa biologische Stoffe, eingekapselt werden.

Die Erhaltung der Lebensfähigkeit von solchen lebenden Stoffen hängt u. a. davon ab, daß die erforderlichen Nährstoffe verfügbar sind, ferner von der Sauerstoffzufuhr, der Abwesenheit von Giftstoffen im Medium und dem pH-Wert des Mediums. Bisher ist es nicht möglich gewesen, solche lebenden Gewebe während einer Einkapselung in einer physiologisch verträglichen Umgebung lebensfähig zu erhalten. Das Problem dabei ist, daß die für die Membranbildung notwendigen Bedingungen für Gewebe tödlich oder schädlich sind, und bisher kein Verfahren der Membranbildung bekannt ist, das von Gewebe in gesundem Zustand überlebt werden könnte. Erfindungsgemäß werden nun bestimmte wasserlösliche Stoffe, die mit lebendem Gewebe physiologisch verträglich sind und wasserunlöslich gemacht werden können, eingesetzt, um zur Bildung von temporären Kapseln eine formbeständige, zusammenhängende Masse zu bilden, die eine Schutzschicht um die Gewebeteilchen bildet. Die wasserlöslichen Stoffe werden typischerweise in geringer Konzentration dem Gewebekultursubstrat oder -medium zugefügt. Aus der Lösung werden dann Tröpfchen erzeugt, die Gewebe zusammen mit dem Kultursubstrat enthalten und zumindest in einer Oberflächenschicht sofort wasserunlöslich gemacht und geliert werden. Dann erhalten die formbeständigen temporären Kapseln eine permanente halbdurchlässige Membran. Wenn der zur Bildung der temporären Kapseln eingesetzte Stoff es erlaubt, kann das Kapselinnere nach Bildung der permanenten Membran wieder verflüssigt werden, was durch Wiederherstellen der Bedingungen im Medium erfolgt, unter denen der Stoff löslich ist.

Der zur Erzeugung der temporären Kapseln eingesetzte Stoff kann ein beliebiger ungiftiger wasserlöslicher Stoff sein, der durch eine Änderung der Umgebungstemperatur, des pH- Werts oder der Ionenkonzentration in eine formbeständige Masse überführbar ist. Bevorzugt enthält dieser Stoff mehrere leicht ionisierbare Gruppen, z. B. Carboxyl- oder Aminogruppen, die durch Salzbildung mit Polymeren reagieren können, die eine Vielzahl von Gruppen enthalten, die ionisieren und entgegengesetzte Ladung aufweisen. Wie noch erläutert wird, können hierdurch permanente Membranen mit vorbestimmter Porosität und Lebensdauer im lebenden Körper in Oberflächenschichten der temporären Kapseln erzeugt werden.

Bevorzugte Stoffe zur Erzeugung der temporären Kapseln sind wasserlösliche natürliche oder synthetische Polysaccharid- Gummiharze. Viele dieser Stoffe sind handelsüblich. Typischerweise werden sie aus pflanzlichen Stoffen gewonnen und häufig als Zusätze zu verschiedenen Nahrungsmitteln eingesetzt. Natriumalginat ist ein bevorzugtes wasserlösliches Gummiharz. Andere einsetzbare Gummiharze sind Guargummiharz, Gummiarabicum, Carrageenan, Pectin, Tragant- und Xanthangummiharz sowie ihre sauren Fraktionen.

Diese Stoffe enthalten glykosidisch gebundene Saccharidketten. Viele enthalten freie Säuregruppen, die häufig in Form der Alkalisalze, z. B. in Form der Natriumsalze vorliegen. Wenn die Alkalimetallionen gegen mehrwertige Ionen, wie Calcium- oder Strontiumionen, ausgetauscht werden, werden die wasserlöslichen Polysaccharidmoleküle vernetzt, so daß ein wasserunlösliches, formbeständiges Gel gebildet wird, das bei Abtrennung der Ionen durch Ionenaustausch oder über einen Komplexbildner resolubilisierbar ist. Zwar kann im wesentlichen jedes ein Salz bildende mehrwertige Ion eingesetzt werden, jedoch werden physiologisch verträgliche Ionen, z. B. Calciumionen bevorzugt eingesetzt. Calciumionen tragen dazu bei, Gewebe lebend zu erhalten. Für weniger empfindliche Stoffe können andere mehrwertige Kationen eingesetzt werden.

Andere Gummiharze können nach Belieben in den wasserlöslichen und den gelierten, wasserunlöslichen Zustand übergeführt werden, indem einfach der pH-Wert des Mediums, in dem sie gelöst sind, geändert wird.

Eine typische Zusammensetzung einer Gewebe-Gewebemedium- Gummiharz-Lösung umfaßt gleiche Volumenanteile des Gewebes in seinem Medium und einer 1- bis 2%igen Lösung des Gummiharzes in physiologischer Kochsalzlösung. Bei Einsatz von Natriumalginat wird eine 1,0- bis 1,5%ige Lösung erfolgreich eingesetzt.

Beim Einkapseln von Stoffen, die Temperaturänderungen standhalten können, kann zur Erzeugung der temporären Kapseln Gelatine oder Agar-Agar eingesetzt werden. Diese können durch Einspritzen in ein Milieu niederer Temperatur geliert werden. Andere wasserlösliche Stoffe, wie Hydroxyethylmethacrylat, sind ebenfalls verwendbar.

Im Schritt A der Zeichnung wird zunächst eine Gummiharzlösung hergestellt, die die Gewebeteilchen und das Gewebesubstrat enthält.

Beim nächsten Schritt des Einkapselungsverfahrens wird diese Gummiharzlösung zu Tröpfchen der gewünschten Größe geformt. Anschließend werden die Tröpfchen sofort geliert, so daß sie formbeständige kugelförmige oder kugelähnliche Massen bilden. Eine Vorrichtung zur Durchführung dieser Schritte ist bei BC in der Zeichnung dargestellt. Ein Becherglas 10, das eine wäßrige Lösung mit mehrwertigen Kationen, z. B. eine 1,5%ige CaCl₂-Lösung, enthält, ist mit einem magnetischen Rührstab 11 und einem Rührwerk 12 ausgestattet. Die Rührvorrichtung erzeugt einen Wirbel 14 mit einem hohlen Zentrum 16. Ein Kapillarrohr 18 mit einem geeignet ausgewählten Innendurchmesser ist im hohlen Zentrum 16 des Wirbels positioniert und mit einem Vibrator 20 versehen. Die Gewebeteilchen und das gelöste Gummiharz enthaltende Lösung wird durch das Kapillarrohr zugeführt. Die Auswirkung der Oberflächenspannung, welche die Bildung relativ großer Tropfen fördern würde, wird durch den Vibrator minimiert, so daß Tröpfchen 22 einer Größe, die dem Innendurchmesser des Kapillarrohrs entspricht, von seiner Spitze abgeschleudert werden. Diese Tröpfchen gelangen in sofortigen Kontakt mit der Lösung, aus der sie Calciumionen absorbieren. Dies führt zu einer Vernetzung des Gels und zur Bildung formbeständiger, hochviskoser schützender temporärer Kapseln, die das suspendierte Gewebe und sein Kultursubstrat oder Medium enthalten. Die Kapseln sammeln sich in der Lösung als getrennte Phase und werden durch Absaugen von der Lösung getrennt.

Bei einem anderen Ausführungsbeispiel des Verfahrens wird eine geringe Menge eines Polymerisats, wie es zum permanenten Vernetzen des Gummiharzes eingesetzt wird, in der Lösung zusammen mit den mehrwertigen Ionen (oder in einer anderen Lösung, die das jeweils verwendete Gummiharz gelieren kann) verwendet. Dadurch werden permanente Vernetzungen gebildet.

Kapseln dieser Art bieten gewisse Vorteile, wenn die Erhaltung des Gewebes erwünscht ist.

Beim nächsten Verfahrensschritt wird um die Oberfläche der temporären Kapseln eine halbdurchlässige Membran erzeugt. Zur Durchführung dieses Schritts sind zahlreiche Verfahren anwendbar, von denen einige bekannt sind. So können z. B. Grenzflächen-Polymerisationsverfahren angewandt werden. Dabei werden zwei zumindest bifunktionelle, miteinander umsetzbare Monomere oder ein Monomer und ein relativ niedermolekulares Polymerisat, wobei eines davon in polaren Lösungsmitteln, wie Wasser, und das andere in hydrophoben Lösungsmitteln, wie Hexan, löslich ist, an der Grenzfläche einer Emulsion vom Wasser-in-Öl-Typ zur Reaktion gebracht. Der einzukapselnde Stoff wird zusammen mit der wasserlöslichen Komponente der Reaktion in Wasser suspendiert oder gelöst; die wäßrige Phase wird in einem hydrophoben Lösungsmittel emulgiert, und das komplementäre Monomer wird der kontinuierlichen Phase des Systems zugesetzt, so daß eine Polymerisation um die wäßrigen Tröpfchen herum erfolgt. Durch Wahl der Art des Lösungsmittels der kontinuierlichen Phase und der Konzentration des darin enthaltenen Reaktanten kann die Porengröße eingestellt und können halbdurchlässige Mikrokapseln erzeugt werden.

Dieses Verfahren kann bei der Erfindung angewandt werden, wenn der wasserlösliche Reaktant in einer wäßrigen Lösung gelöst und die Lösung zum Suspendieren der temporären Kapseln verwendet wird. Diese Suspension wird dann z. B. in Hexan oder einem Hexan-Chloroform-Gemisch emulgiert. Anschließend wird das komplementäre Monomer vorzugsweise nach und nach zugefügt, um die Grenzflächen-Polymerisation an der Oberfläche der wäßrigen Tröpfchen hervorzurufen. Aufgrund der gelierten Polysaccharidmasse, die das suspendierte Gewebe umgibt, und insbesondere bei Einsatz von geeignet gepufferten, polyfunktionellen, Aminogruppen enthaltenden Polymerisaten, wie bestimmten Proteinen, als wasserlösliche Reaktionsteilnehmer geht das Verfahren so vor sich, daß das Gewebe die Einkapselung in gesundem Zustand überlebt. Die bei der Erzeugung von Membranen mit den polyfunktionellen Aminen brauchbaren Stoffe sind Disäuren, Disäurehalogenide und multifunktionelle Sulfonylhalogenide. Zusätzlich zu den Polyaminen können Diamine, Polyole und Diole eingesetzt werden. Zahlreiche Aminogruppen enthaltende Moleküle können zur Erzeugung von Membranen auch mit Glutaraldehyd vernetzt werden. Ein weiteres einsetzbares Verfahren zur Membranerzeugung besteht in der Grenzflächen-Polyaddition. In diesem Fall werden z. B. multifunktionelle Amine, die in Oberflächenschichten der temporären Kapseln absorbiert sind, mit Epichlorhydrin, epoxidierten Polyestern oder Diisocyanaten umgesetzt.

Bei dem als Schritt D in der Zeichnung dargestellten bevorzugten Schritt zur Membranerzeugung werden Oberflächenschichten der Tröpfchen dadurch permanent vernetzt, daß sie einer wäßrigen Lösung eines Polymerisats ausgesetzt werden, das Gruppen enthält, die mit funktionellen Gruppen in den Gelmolekülen reaktionsfähig sind. Zu diesem Zweck können in manchen Fällen bestimmte langkettige quaternäre Ammoniumsalze eingesetzt werden. Bei Verwendung von sauren Gummiharzen können Polymerisate, wie Polyethylenimin und Polylysin eingesetzt werden, die saure reaktive Gruppen enthalten. In diesem Fall werden die Polysaccharide durch Wechselwirkung zwischen den Carboxylgruppen und den Aminogruppen vernetzt. Vorteilhafterweise ist die Permeabilität dadurch kontrollierbar, daß die Molekülmasse des zur Vernetzung eingesetzten Polymers entsprechend gewählt wird. So dringt z. B. eine Lösung eines Polymers mit niederer Molekülmasse in einem bestimmten Zeitraum weiter in die temporären Kapseln ein als ein hochmolekulares Polymerisat. Der Penetrationsgrad des Vernetzungsmittels ist mit der resultierenden Permeabilität korreliert. Im allgemeinen gilt, daß die Porengröße um so größer ist, je höher die Molekülmasse und je geringer die Eindringtiefe sind. Allgemein sind Polymere innerhalb eines Molekülmassenbereichs von 3000 bis 100 000 oder höher einsetzbar, je nach der Dauer der Reaktion, der Konzentration der Polymerlösung und der erwünschten Permeabilität. Günstig geeignete Reaktionsbedingungen unter Einsatz von Polylysin mit einer mittleren Molekülmasse von ca. 35 000 waren eine Reaktionsdauer von 2 min, Rühren und Einsatz einer physiologischen Kochsalzlösung mit 0,0167% Polylysin. Optimale Reaktionsbedingungen, die zur Einstellung der Permeabilität bei einem bestimmten System geeignet sind, können vom Fachmann leicht empirisch ermittelt werden.

Die Wahl des Vernetzungsmittels bestimmt auch die Verweilzeit der Kapseln im lebenden Organismus. Bei dem vorstehend angegebenen System besteht die permanente Kapselmembran aus Polysaccharid (einen leicht aufnehmbaren Stoff), das mit einem Polypeptid oder Protein, z. B. Polylysin, und/oder einem synthetischen Stoff, z. B. Polyethylenimin, vernetzt ist. Die einzelnen Polymere unterscheiden sich hinsichtlich der Geschwindigkeit, mit der sie im lebenden Körper verteilbar sind. Manche werden ohne Schwierigkeiten verdaut, z. B. Proteine; andere werden langsam abgebaut und wieder andere bleiben praktisch unbegrenzte Zeit unverändert.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung sieht eine Vernetzung mit einem oder mehreren Polymeren zur Erzeugung von Kapseln vor, die eine vorgegebene Auflösungsdauer im lebenden Organismus haben, die im allgemeinen zwischen einigen Stunden oder Tagen und praktisch unendlich liegt. Das folgende Beispiel zeigt, wie Kapseln herzustellen sind, die wenigstens ca. zwei Monate in der Bauchhöhle von Ratten funktionstüchtig bleiben. Die Erfindung ist jedoch weder auf diese bestimmten Kapselmembranen noch auf Kapseln mit dieser Lebensdauer im lebenden Organismus beschränkt. Tatsächlich hängt die optimale Lebensdauer der Mikrokapseln im Körper von der angestrebten Verwendung und vom Implantationsort ab. Der Fachmann ist aufgrund der obigen Erläuterungen ohne weiteres in der Lage, Mikrokapseln einer vorbestimmten Lebensdauer im Körper empirisch herzustellen.

Nach der eigentlichen Einkapselung liegen Kapseln vor, die eine permanente semipermable Membran aufweisen, die eine gelierte Lösung eines Gummiharzes und von gewebeverträglichem Kultursubstrat sowie der Gewebeteilchen umgibt. Wenn lediglich angestrebt ist, das Gewebe in einer schützenden Umgebung aufzubewahren, brauchen keine weiteren Schritte durchgeführt zu werden. Wenn aber in den Kapseln und durch die Membranen hindurch Stoffübertragung stattfinden soll, wird bevorzugt das Gel wieder zu seiner wasserlöslichen Form verflüssigt. Dies kann durch Wiederherstellen der Bedingungen erfolgen, unter denen das Gummiharz flüssig ist, z. B. durch Ändern des pH-Werts des Mediums oder durch Entfernen von Calciumionen oder anderen eingesetzten mehrwertigen Kationen. Bei Gelen, die in Abwesenheit mehrwertiger Kationen unlöslich sind, kann das Medium in der Kapsel einfach dadurch resolubilisiert werden, daß die Kapseln in phosphatgepufferte Kochsalzlösung gebracht werden, die Alkalimetallionen und Wasserstoffionen enthält. Einwertige Ionen ersetzen dann Calciumionen oder andere mehrwertige Ionen im Gummiharz, wenn (vgl. Stufen E in der Zeichnung) die Kapseln unter Rühren in eine entsprechende Lösung eingebracht werden. Andere Salze, wie Natriumcitrat, können für den gleichen Zweck eingesetzt werden. Schließlich kann es in Abhängigkeit von der zur Bildung der halbdurchlässigen Membranen angewandten Technik erwünscht sein, die Kapseln so zu behandeln, daß freie Aminogruppen oder dgl., die sonst zu einer Verklumpungstendenz der Kapseln führen würden, unwirksam gemacht werden. Das kann z. B. durch Einbringen der Kapseln in eine Natriumalginatlösung geschehen.

Durch Injektion von eingekapseltem feinverteiltem Gewebe, vielzelligen Fraktionen davon oder einzelnen Zellen an einem geeigneten Ort im Körper kann dieser zumindest vorübergehend mit den speziellen physiologischen Funktionen des betreffenden Gewebes versehen werden. Die erfindungsgemäßen Kapseln bieten den doppelten Vorteil, daß einerseits die Notwendigkeit einer chirurgischen Implantation entfällt (obwohl die Kapseln erwünschtenfalls auch chirurgisch eingepflanzt werden können) und andererseits Probleme der von Immunabstoßung und natürlicher körperlicher Isolierung beseitigt werden. Bevorzugt bestehen die Kapselmembranen dabei aus Stoffen, die nach dem Absterben des Gewebes vom Körper aufgenommen werden. Wie erwähnt, kann dies durch Einsatz eines Vernetzungsmittels geschehen, das im lebenden Körper nicht abgebaut wird, so daß eine bestimmte nutzbare Lebensdauer im lebenden Körper erzielbar ist.

Aus der vorstehenden Erläuterung ist ersichtlich, daß das Einkapselungsverfahren gemäß der Erfindung unter Einsatz einer großen Vielzahl von Reagentien und einzukapselnden Stoffen durchführbar und in vielen Modifizierungen abwandelbar ist. Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Einkapselung von Langerhans'schen Inseln

Langerhans'sche Inseln wurden aus Ratten-Bauchspeicheldrüsen entnommen und einem vollständigen Gewebekulturmedium (CMRL-1969) in einer Konzentration von ca. 10³ Inseln je ml zugesetzt. Das Gewebekulturmedium enthielt alle für die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Inseln erforderlichen Nährstoffe sowie die von den β-Zellen zur Insulinerzeugung verwendeten Aminosäuren. 0,4 ml der erhaltenen Suspension wurden dann zu 0,5 ml einer 1,2%igen Natriumalginatlösung in physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt.

Anschließend wurden 80 ml einer 1,5%igen Calciumchloridlösung in ein 150-ml-Becherglas auf einem Rührwerk eingebracht und mit solcher Geschwindigkeit gerührt, daß ein Wirbel mit einem konischen Hohlraum im Zentrum entstand. Ein Glas-Kapillarrohr mit stetig abnehmendem Durchmesser, das in einer Spitze mit einem Innendurchmesser von ca. 300 µm endete, wurde dann mit einem Vibrator (60 Hz) verbunden. Die Spitze des Kapillarrohrs wurde anschließend in das Zentrum des Wirbels eingebracht, worauf der Vibrator eingeschaltet und die Suspension des Gewebes in der Natriumalginat-Kulturmedium-Lösung mit einer Infusionspumpe aus der Spitze herausgedrückt wurde. Tröpfchen in der Größenordnung von 300-400 µm Durchmesser wurden dabei von der Spitze des Kapillarrohrs abgeschleudert und gelangten sofort in die Calciumlösung.

Nach 10 min wurde das Rührwerk abgeschaltet; der Lösungsüberstand wurde durch Absaugen entfernt. Dann wurden die gelierten Kapseln in ein Becherglas verbracht, das 15 ml einer Lösung aus 1 Teil einer 2%igen Lösung von 2-(Cyclohexylamino-) ethansulfonsäure in 0,6%iger NaCl-Lösung (isotonisch, pH-Wert 8,2), verdünnt mit 20 Teilen 1%iger CaCl₂-Lösung enthielt. Nach einer Eintauchzeit von 3 min wurden die Kapseln zweimal in 1%iger CaCl₂-Lösung gewaschen.

Dann wurden die Kapseln in 32 ml einer Lösung übergeführt, die 0,0125% Polylysin (mittlere Molekülmasse 35 000) in physiologischer Kochsalzlösung enthielt. Nach 3 min wurde die Polylysinlösung abdekantiert. Dann wurden die Kapseln mit 1%iger CaCl₂-Lösung gewaschen und danach 3 min in einer Polyethyleniminlösung (Molekülmasse 40 000 bis 60 000) suspendiert, die durch Verdünnen einer 3,3%igen Stammlösung von Polyethylenimin in Morpholinopropansulfonsäure- Puffer (0,2 mol/l, pH-Wert 6) mit genügend 1%iger CaCl₂-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,12% hergestellt worden war. Die resultierenden Kapseln, die permanente halbdurchlässige Membranen aufwiesen, wurden dann zweimal mit 1%iger CaCl₂-Lösung und zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und mit 10 ml einer 0,12%igen Alginsäurelösung vermischt.

Die Kapseln verklumpten nicht; zahlreiche Kapseln enthielten Langerhans'sche Inseln. Das Gel im Inneren der Kapseln wurde durch Einbringen der Kapseln in ein Gemisch aus Kochsalz- und Citratpufferlösung (pH-Wert 7,4) für 5 min wieder verflüssigt. Schließlich wurden die Kapseln in CMLR-69-Medium suspendiert.

Unter dem Mikroskop besaßen die Kapseln das in der Zeichnung wiedergegebene Aussehen. Sie umfaßten eine sehr dünne Membran 24, die eine Insel 26 umschloß, in der Einzelzellen 28 erkennbar waren. Moleküle mit einer Molekülmasse bis zu ca. 100 000 können die Membran 24 passieren. Somit können Sauerstoff, Aminosäuren, Nährstoffe und Plasmakomponenten, die in Kulturmedien eingesetzt werden (z. B. Kälberfetalplasmakomponenten), die Inseln erreichen und ermöglichen die Ausscheidung von Insulin.

Beispiel 2 Insulinerzeugung durch Mikrokapseln

Nach wiederholtem Waschen in physiologischer Kochsalzlösung wurden Mikrokapseln, die entsprechend Beispiel 1 hergestellt waren und ca. 15 Langerhans'sche Inseln enthielten, in 3 ml CMRL-1969-Medium suspendiert. Nach acht Tagen sonderten die Kapseln in Anwesenheit von 600 mg/dl Glucose in einer Versuchsreihe 67 Einheiten Insulin/ml in 1,5 h ab. In einer zweiten Versuchsreihe wurden während der gleichen Zeit 68 Einheiten Insulin/ml erzeugt. Eine Woche alte Kapseln, die im gleichen Medium suspendiert waren, in dem jedoch 100 mg/dl Glucose vorhanden war, sonderten in einer ersten Versuchsreihe 25 Einheiten Insulin/ml in 1,2 h und in einer zweiten Versuchsreihe 10 Einheiten Insulin/ml ab.

Beispiel 3 Einkapselung von Hepatocyten

Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren, wobei jedoch 0,5 ml einer Leberzellensuspension in Hank'scher Lösung anstelle der 0,4-ml-Suspension der Langerhans'schen Inseln eingesetzt wurden. Die Lebenderhaltung des Lebergewebes wurde durch das Farbstoffausschlußverfahren (Ausschluß von Trypanblau) demonstriert. Es ist bekannt, daß Lebergewebe in vitro Giftstoffe aus seiner Umgebung aufnehmen kann. Entsprechend werden Toxine mit ausreichend niedriger Molekülmasse um die halbdurchlässigen Membranen passieren zu können, aufgenommen und vom Gewebe zerstört. Praktisch alle von der Leber verarbeiteten Giftstoffe sind niedermolekular. Die Toxine können jedoch in Form von Proteinkomplexen vorliegen. Die Permeabilität der Kapseln kann nach Bedarf geändert werden.

Beispiel 4 Einkapselung von Aktivkohle

Es wurde wie in Beispiel 1 verfahren, wobei jedoch Aktivkohleteilchen direkt in der Natriumalginatlösung suspendiert wurden, die 0,5 ml Gewebesuspension entfielen und als Vernetzungsmittel Polylysin mit einer mittleren Molekülmasse von 35 000 eingesetzt wurde. Solange die Aktivkohlepartikel kleiner als der kleinste Innendurchmesser des zum Erzeugen der Tröpfchen verwendeten Kapillarrohrs sind, resultiert Aktivkohle mit großer Oberfläche, die von einer halbdurchlässigen Membran umschlossen ist. Diese verhindert in wirksamer Weise den Austritt von Aktivkohleteilchen oder -staub. Die eingekapselten Aktivkohleteilchen können dazu verwendet werden, Stoffe mit mittlerer Molekülmasse (bis zu ca. 2000) aus Flüssigkeiten zu absorbieren.

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde ferner auch mit anderen lebenden Zellen demonstriert, z. B. an roten Blutkörperchen unter Einsatz von Blutserum als Medium, an Samenzellen unter Einsatz von Sperma als Medium sowie an Bäckerhefe. Selbstverständlich können auch beliebige andere Stoffe eingekapselt werden, wobei die für den jeweiligen Anwendungszweck gewünschte Membranpermeabilität eingestellt werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Einkapseln von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe und Einzelzellen in Membranen, durch

(A) Suspendieren von Teilchen des chemisch oder biologisch aktiven Stoffs oder von lebendem Gewebe bzw. der Einzelzellen in einem damit physiologisch verträglichen Medium, das einen wasserlöslichen Stoff enthält, der
- a) mit dem Gewebe physiologisch verträglich und
- b) gelierbar ist,
(B) Formen des Mediums zu Tröpfchen und
(C) Gelieren der Tröpfchen,

dadurch gekennzeichnet, daß man

(D) eine Membran von kontrollierter Durchlässigkeit um die in Schritt C erhaltenen Kapseln erzeugt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gel in den Kapseln wieder verflüssigt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt D eine halbdurchlässige Membran erzeugt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt A eine Lösung eines wasserlöslichen Gummiharzes einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlösliches Gummiharz ein Alkalimetallalginat einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlösliches Gummiharz ein freie Säuregruppen enthaltendes Polysaccharid einsetzt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Kernmaterial in eine Lösung eines wasserlöslichen Gummiharzes durch ein Kapillarrohr preßt, dessen Spitze in dem leeren Raum auf der Rotationsachse eines Wirbels in einer Lösung, die das Gummiharz gelieren kann, liegt, und das Kapillarrohr zum Abschleudern von Tröpfchen in die Lösung in Vibration versetzt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt A die Lösung eines Gummiharzes, das freie Säuregruppen enthält, einsetzt und in Schritt D die Kapseln aus Schritt C mit einem Polymer mit einer mittleren Molekülmasse von 3000 bis 100 000, das freie Aminogruppen enthält, in Kontakt bringt, wobei durch die Kontaktierung dauerhafte Polymerisat- Vernetzungen in einer Oberflächenschicht der Kapsel gebildet werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt C eine Lösung, die physiologisch verträgliche mehrwertige Kationen als Gelierungsmittel enthält, einsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt C eine Calciumionen enthaltende Lösung einsetzt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt D Lösungen von Polylysin oder Polyethylenimin einsetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt D Polylysin oder Polyethylenimin mit einer mittleren Molekülmasse von 35 000 einsetzt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Membranen von kontrollierter Durchlässigkeit in Schritt D durch Grenzflächen-Polymerisation erzeugt, wobei die Kapseln aus Schritt C als Kernmaterial in der wäßrigen Phase einer Wasser-in-Öl-Emulsion eingesetzt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktanten in Schritt D wasserlösliche Polyole, Diole, Diamine oder Polyamine sowie nicht mit Wasser mischbare Disäurehalogenide, Disäuren oder multifunktionelle Sulfonylhalogenide einsetzt.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt D eine Grenzflächen-Polyaddition durchführt.

16. Verfahren nach Anspruch 5 in Verbindung mit Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gel in den Kapseln in Schritt E durch Entfernen der in den Kapseln enthaltenen Calciumionen wieder verflüssigt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als chemisch oder biologisch aktive Stoffe Hormone, Enzyme, Antikörper oder Aktivkohleteilchen einkapselt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als lebendes Gewebe, Langerhans'sche Inseln oder Teile davon oder Lebergewebe oder Einzelzellen derselben einkapselt.

19. Verfahren nach Anspruch 5 in Verbindung mit Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man einzelne Pankreas- α-Zellen und/oder Pankreas-β-Zellen einkapselt.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt A als wäßriges Medium ein vollständiges Gewebekulturmedium einsetzt, das zur Lebenderhaltung des Gewebes in vitro ausreicht.

21. Verkapseltes Gewebe, chemisch oder biologisch aktive Stoffe und Einzelzellen, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20.

22. Mikroverkapseltes Gewebe nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch Kapselmembranen, die für Gewebenährstoffe und vom Gewebe produzierte Stoffwechselprodukte permeabel, jedoch für Immunproteine impermeabel sind, wobei die Kapseln einen Durchmesser 0,5 mm aufweisen.

23. Mikroverkapseltes Gewebe, chemisch oder biologisch aktive Stoffe und Einzelzellen nach Anspruch 21 oder 22, gekennzeichnet durch Kapselmembranen, die für Proteine mit einer mittleren Molekülmasse 100 000 permeabel sind.

24. Mikroverkapseltes Gewebe nach einem der Ansprüche 21 bis 23, gekennzeichnet durch Kapselmembranen, die im lebenden Organismus eine vorbestimmte Lebensdauer besitzen.

25. Mikroverkapseltes Gewebe nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die vorbestimmte Lebensdauer im lebenden Körper durch natürliche Aufnahme der Membranen beendbar ist.

26. Verwendung der nach Anspruch 18 erhältlichen Kapseln zum Einbringen in den Körper eines Säugers.