JPS5851758B2 - 酵素もしくは菌体固定化物およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素もしくは菌体固定化物およびその製造方法
、更に詳しくは、酵素もしくは微生物菌体の水性液を非
流動状態とし、これを半透膜で包括したことから成る上
記固定化物およびその製造方法に関する。

従来、酵素を固定して不溶化する方法としては、■酵素
を水不溶性ポリマー担体に化学結合せしめる方法、■酵
素をイオン交換樹脂などにイオン結合せしめる方法、■
酵素を活性炭などに吸着せしめる方法、■酵素タンパク
を二官能性試薬で架橋して不溶化する方法、■酵素に変
化を与えずこれをゲルの細かい格子の中に包み込み不溶
化する方法、および■酵素をマイクロカプセル中に包括
する方法が知られている。

しかし、これらの方法にあって、化学的反応法や物理的
吸着法（■〜■法）では、不溶化すべき酵素の至適活性
水素イオ／濃度や安定領域、更には活性部位および非活
性部位にある官能基の種類などを充分確認した上で、そ
れに合う条件を見いださねばならない。

また、包括法（■、■法）では、目的に合った透過性を
有する皮膜を形成する技術が確立されておらず、基質や
生成物の分子量の大きいものあるいは水への溶解性の低
い基質に対しては利用できないという制限がある。

一般に酵素の性質は、産生の条件によりそれぞれ異なる
場合が多いので、最適条件を得るための労力は少なくな
い。

また化学反応やイオン結合を利用する固定化法では、酵
素は不純物の含有しない精製されたものであることが必
要とされるので、かなりの労力および経費がかかること
になる。

また、包括法の一種で、包括材料として不飽和二重結合
をもつ低分子モノマーあるいは高分子物質を用いて固定
化する場合、電子線照射あるいは紫外線照射などが行な
われるが、同時に酵素タンパクに対しても必然的に照射
されることになり、タンパク質の変性を来たし易く、そ
の結果活性低下は免かれず最善の方法とはいい難い。

本発明の目的は、かかる酵素固定化法の欠点を解消せし
めた方法、即ち活性低下を大巾に低減せしめ且つ広範囲
の条件下で簡易に実施できる新規な包括法により所望の
酵素固定化物を提供することにある。

本発明者らは、この目的を遠戚せしめるため鋭意研究を
進めた結果、酵素水溶液は適当な手段で非流動状態とし
、酵素自体には何ら変化を与えずこれを手練水性の半透
膜で包括することにより、所期目的の固定化物を得るこ
とができ、更に上記酵素に代えて微生物菌体を適用して
も同様にその固定化物が得られることを見出した。

本発明は、上述の知見に基づいて完成されたもので、そ
の要旨は、（１）酵素もしくは微生物菌体のゲル状乃至
チクソトロピツク状水性体を半透膜で包括したことから
成ることを特徴とする酵素もしくは菌体固定化物、並び
に（２）半透膜を形成し、該膜上に酵素もしくは微生物
菌体のゲル状乃至チクソトロピツク状水性体を粒形もし
くは単粒形となるように付与した後再度半透膜を形成し
て上記粒形もしくは単粒形の水性体を包括することを特
徴とする酵素もしくは菌体固定化物の製造方法に存する
。

本発明で対象とする酵素もしくは微生物菌体は、特にそ
の種類に制限はなく、例えば酵素としては加水分解酵素
（アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ
、インベルターゼなど）、酸化還元酵素（グルコースオ
キシダーゼ、カタラーゼなと）、異性化酵素（グルコー
スイソメラーゼなど）等が挙げられる。

微生物菌体としてはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）、ストレプトミセス・ファエ
オクロモゼネス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏ
ｇｅｎｅｓ ）等が挙げられる。

本発明における酵素もしくは微生物菌体のゲル状乃至チ
クソトロピンク状水性体（以下、水性体と称す）は、酵
素もしくは微生物菌体、水およびその水溶液が常温付近
でゲル化乃至チクソトロピック化する水溶性高分子化合
物（以下、ゲル化剤と称す）で構成される。

なお、微生物菌体を含む系にあって、微生物菌体と水の
懸濁液自体がゲル状を呈する場合は、かかるゲル化剤の
使用は必要でない。

上記ゲル化剤としては、例えば天然多糖類（カラギーナ
ン、アルギン酸ソーダ、ザンサンガム／ローカストビー
ンガム混合物、寒天など）、タンパク質類（ゼラチン、
部分加水分解コラーゲンなど）等が挙げられ、これらの
１種または２種以上の混合物で使用に供する。

上記水性体における各成分の配合割合としては、例えば
酵素もしくは微生物菌体では通常Ｏ１１〜４０重量％濃
度となるように、そしてゲル化剤ではそのゲル化能が発
揮される範囲で適宜に決定すればよく、通常０．１〜１
０重量％濃度となるように選定すればよい。

かかる水性体は、以下の如くして調製される。

先ず、所定割合の水とゲル化剤を配合し、これを要すれ
ば７０〜１００℃の加熱下で均一に混合溶解せしめ、次
いで所定割合の酵素もしくは微生物菌体をそれが失活し
ない温度で且つ当該水性体の流動性が保持できる温度（
通常は常温〜５０℃）に冷却した後配合して均一混合す
ればよい。

なお、常温付近の水温で溶解するゲル化剤（例えばアル
ギン酸ソーダ、グアガムおよびザンサンガム／ローカス
トビーンガム混合物）を使用する場合は、上記三成分を
常温下で一括混合して調製することができる。

このようにして調製された当該水性体は、最小限必要と
される流動性を保持しており、次の目的固定化物の製造
に供することができる。

なお、かかる水性体中にそのゲル化物の物質透過性を調
整する上で、セルロース微粉末を添加してもよい。

この場合のセルロース微粉末の粒径は、通常約２０μ以
下、好ましくは約２０μ以下に設定すればよく、またそ
の添加量は水性体中６０重量％以下の濃度となるように
選定すればよい。

かかるセルロース微粉末の添加は、上記調製時のゲル化
剤水溶液中に混入すればよい。

本発明における上記半透膜の形成樹脂としては、半透膜
性能を有し且つ溶剤可溶型であるセルロース系樹脂（コ
ロジオン、セロハン、エチルセルロース系樹脂など）、
ポリビニルアルコール系樹脂（ブチラール樹脂など）、
塩化ビニル−酢酸ビニル共重合樹脂、ポリアミノ酸エス
テル系樹脂が挙げられ、これらの１種または２種以上の
混合物を通常溶液の形状で使用に供する。

更に、半透膜の親水性、透過性、膨潤性を適度に調整す
る上で、かかる樹脂溶液中にセルロース微粉末を添加し
てもよい。

この場合のセルロース微粉末のね径は、通常約２０μ以
下、好ましくは約５μ以下に設定すればよく、またその
添加量は樹脂分１００重量部に対し５０重量部以下、好
ましくは２０重量部以下となるように選定すればよい。

添加方法としては、セルロース微粉末を樹脂溶液中に配
合し、ホモジナイザー、ボールミル、三本ロール等の分
散機を使用して充分分散微粉細化すればよい。

以下、目的とする酵素もしくは菌体固定化物の製造方法
について詳述する。

先ず、適当な金属板（例えばブリキ板）上に、上述の樹
脂溶液を通常の方法（例えばスプレー法、刷毛塗り法等
）で塗布して膜厚１〜１００μ、好ましくは５〜５０μ
の半透膜を形成し、次いで該膜上に上述の酵素もしくは
微生物菌体を含む水性体を粒形もしくは単粒形となるよ
うに付与する。

かかる付与手段としては、例えば手動式もしくは機械式
により、スポイトで滴下したりあるいは適当な太さの棒
を用いて滴下する方法が採用されてよい。

付与後、必要に応じて放冷もしくは急冷することにより
、直径約１〜１０ｍｍのゲル化物（塊り）が多数散在し
て形成されることになる。

次に、その全面に上述と同様な半透膜を形成（通常はス
プレー塗布による）して上記ゲル化物を包括せしめる。

このようにして目的固定化物が得られる。かかる固定化
物を用に供するには、一塊ずつ適当に切断して相互に分
離した不溶化酵素もしくは不溶化菌体の形状で使用する
か、あるいはこれらをカラムに詰めて使用すればよい。

また使用に際しては、予め乾燥状態に保存してから適時
用いてもよい。

上記不溶化酵素もしくは不溶化菌体は、粒状乃至半粒状
の形状を有し且つ充分な膜強度を有するので、上述の如
くカラムに充填して連続的に酵素反応を行なうことがで
きる。

以上の構成から成る本発明方法は、活性低下が少なく且
つ使用範囲の広い所期目的の本発明固定化物を製造する
ことができ、以下に示す利点を兼備した方法といえる。

■ 酵素の固定化法が簡便であり、固定化操作中酵素の
活性低下を従来法に比し減小できる。

■ 対象とする酵素の種類に制限はほとんどなく、粗酵
素品でも何ら問題なく適用することができる。

■ 使用するゲル化剤の種類は、常温付近でゲル化能を
有するものであればよく、その種類の選択は広範囲であ
る。

■ 酵素の流出を防止することができ且つ半透膜の透過
性を適当にコントロールすることにより、反応させる物
質の大きさに合わせた半透膜をつくることが可能である
。

次に、実施例および比較例を挙げて本発明を具体的に説
明する。

なお、実施例中「％」とあるは「重量％」を意味する。

実施例 １ ブリキ板上に、１０％ブチラール樹脂溶液をスプレー塗
布し厚さ１０μの半透膜を形成する。

次に、８０℃で加温溶解した５％カラギーナン水溶液１
０７７１１を３０℃に冷却し、これに異性化酵素として
５％グルコースイソメラーゼ水溶液１１ｒＬｌを添加混
合せしめたものを、上記半透膜上にスポイト滴下して直
径約３〜５關の半粒形物を多数形成し、次いで室温下で
約１時間放置してゲル化せしめ、この時点でその全面に
再度１０％ブチラール樹脂溶液をスプレー塗布し、厚さ
１０μの半透膜を形成して酵素を固定化する。

このようにして目的とする酵素固定化物が得られる。

上記酵素固定化物を一塊ごとに切断して不溶化酵素を得
、これらを下記組成の液と共に６０℃で３０分間ゆっく
り攪拌しながら反応させ、次いでｉ ７２Ｍ−ＨＣｌＯ
４２０ｒ７１１を加え反応を停止する。

反応により生じたフラクトース量をシスティンカルバゾ
ール法により測定する。

組成 ３０％グルコース溶液 ・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・１０ｍ１１／１０Ｍ−リン酸緩
衝液（ｐＨ７，５） −・−６０ｍ１１／ＩＯＭ−硫酸
マグネシウム溶液 ・・・・・・１０ｒＩＬｌ純水 ・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１０ｍ
１一方、５％グルコースイソメラーゼ水溶液１ ｍｌを
用いて同様に向応せしめ、生じたフラクトース量を測定
する。

この二つの測定結果から、当該不溶化酵素の活性度は不
溶化していないものに比べ３４．５％の活性を示してい
た。

なお、参考までに特開昭５０１５７５８７号開示の不溶
化酵素の活性度は上記不溶化していないものに比べ２０
．１％の活性を示していた。

比較例 １ 蒸留したヒドロキシエチルメタクリレート１５０ｆ、メ
タノール６００５’および第３ブチルパーオクトエート
（触媒）０．３ｆをかきまぜ機および還流コンデンサー
を備えた３つ首フラスコの中で窒素雰囲気下で６７℃で
重合させる。

こうして得たヒドロキシエチルメタクリレート重合体を
次に１０倍の過剰量の蒸留水中で徐々に沈殿させること
により精製する。

沈殿した重合体を蒸留水で充分に洗浄し、減圧下で室温
で一晩乾燥する（収率８５％）。

上記乾燥重合体１０１のエチレングリコールモノメチル
エーテル８５ｆ溶液を作り、５℃に冷却する。

ニクロム酸アンモニウム０．２ｒの蒸留水５ＴＬｌ溶液
を次に添加し、この溶液を電磁かきまぜ機で５分間混合
してヒドロキシエチルメタクリレート重合体溶液を作る
。

ブリキ板上に、上記重合体溶液をスプレー塗布し次いで
紫外線ランプを照射して厚さ１０μの半透膜を形成する
。

次に、８０℃で加温溶解した５％カラギーナン水溶液１
０１１１１を３０℃に冷却し、これに異性化酵素として
５％グルコースイソメラーゼ水溶液１１ｒＬｌを添加混
合せしめたものを、上記半透膜上にスポイト滴下して直
径約３〜５ｍｍの半粒形物を多数形成し、次いで室温下
で約１時間放置してゲル化せしめ、この時点でその全面
に再度上記重合体溶液をスプレー被覆し、厚さ１０μの
半透膜を形成して酵素を固定化する。

このようにして目的とする酵素固定化物が得られる。

上記酵素固定化物を一塊ごとに切断して不溶化酵素を得
、その酵素活性を実施例１に準じて比較測定した所、不
溶化していないものに比べ９．８％の活性を示していた
。

実施例 ２ 実施例１の酵素固定化物の製造方法において、１０％ブ
チラール樹脂溶液の代わりに１０％エチルセルロース樹
脂溶液を使用する以外は、同様にして酵素固定化物を得
、更に実施例１に準じて切断した不溶化酵素の酵素活性
を比較測定した所、不溶化していないものに比べ３７．
１％の活性を示していた。

実施例 ３ ブリキ板上に、１０％塩化ビニル−酢酸ビニル共重合樹
脂溶液をスプレー塗布し厚さ８μの半透膜を形成する。

次に、９５℃で加温溶解した２％寒天水溶液１０ｒｒＬ
ｌを４０℃に冷却し、これに加水分解酵素として５％イ
ンベルターゼ水溶液ＩＴＬｌを添加混合せしめたものを
、上記半透膜上にスポイト滴下して直径約３〜５朋の半
粒形物を多数形威し、次いで室温下で約１時間放置して
ゲル化せしめ、この時点でその全面に再度ｌＯ％塩化ビ
ニルー酢酸ビニル共重合樹脂溶液をスプレー塗布し、厚
さ８μの半透膜を形成して酵素を固定化する。

このようにして目的とする酵素固定化物が得られる。

上記酵素固定化物を一塊ごとに切断して不溶化酵素を得
、これらを下記組成の液と共に４０℃で３０分間ゆっく
り攪拌しながら反応させる。

反応により生じた還元糖量をウィルシュテラター・シュ
ーデル法により測定する。

組成 １０％ショ糖液 ０ｍ１ １／２５Ｍ−クエン酸／リン酸緩衝液・・・・・・８０
ｍ１（ｐＨ３，８） 一方、５％インベルターゼ水溶液１ｍｌを用いてｐＨ４
で同様に反応せしめ、生じた還元糖量を測定する。

この二つの測定結果から、当該不溶化酵素の活性度は不
溶化していないものに比べ５１．３％の活性を示してい
た。

なお、参考までに特開昭５０１５７５８７号開示の不溶
化酵素の活性度は上記不溶化していないものに比べ３５
，２〜５５．１％の活性を示していた。

実施例 ４ ブリキ板上に、１０％ブチラール樹脂溶液（粒径５μ以
下のセルロース微粉末を全固形分中５％含む）をスプレ
ー塗布し厚さ１０μを半透膜を形成する。

次に、８０℃で加温溶解した５％カラギーナン水溶液１
０ｍ１を３０℃に冷却し、これに加水分解酵素として５
％α−アミラーゼ水溶液１ｍｌを添加混合せしめたもの
を、上記半透膜上にスポイト滴下して直径約３〜５１１
１７１Ｌの半粒形物を多数形成し、次いで室温下で約１
時間放置してゲル化せしめ、この時点でその全面に再度
セルロース微粉末を含むブチラール樹脂溶液をスプレー
塗布し、厚さ１０μの半透膜を形成して酵素を固定化す
る。

このようにして目的とする酵素固定化物が得られる。

上記酵素固定化物を一塊ごとに切断して不溶化酵素を得
、これらを下記組成の液と共に４０℃で３０分間ゆっく
り攪拌しながら反応させ、次いで３・５−ジニトロサリ
チル酸溶液５０ＴＬｌを加え反応を停止する。

反応液を１０ｒｒＬｌ取り、沸騰浴中に５分間漬け、次
いで流水で冷却した後純水１０ｍ１を加え、生じた還元
糖量を光電比色計で測定する。

組成 可溶性デンプン ・・・・・・−・・−・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・ １１１１５０Ｍ−
リン酸緩衝液（ｐＨ６，９）＝” ９０ｒａｌ一方、５
％α−アミラーゼ水溶液１ｒｕｌを用いて同様に反応せ
しめ、生じた還元糖量な測定する。

この二つの測定結果から、当該不溶化酵素の活性度は不
溶化していないものに比べ４６．１％の活性を示してい
た。

なお、参考までに「昭和５１年度農芸化学会講演要旨集
Ｊ （３８５頁）に開示の不溶化酵素の活性度は上記不
溶化していないものに比べ３０〜５０％の活性を示して
いた。

実施例 ５ 実施例４の酵素固定化物の製造方法において、５％カラ
ギーナン水溶液１０ｍ１の代わりに２％寒天水溶液（粒
径５μ以下のセルロース微粉末を全固形分中５％含む）
１０ｍｌを使用する以外は、同様な条件で酵素固定化物
を得、更に実施例４に準じて切断した不溶化酵素の酵素
活性を比較測定した所、不溶化していないものに比べ４
８．４％の活性を示していた。

実施例 ６ ブリキ板上に、１０％ブチラール樹脂溶液をスプレー塗
布し厚さ１０μの半透膜を形成する。

次に、８０℃で加温溶解した５％カラギーナン水溶液１
０ｒＩＬｌを３０℃に冷却し、これに微生物菌体として
ストレプトマイセス・ファエオクロモゼヌス（菌体を凍
結乾燥後融解しアセトン脱水したもの）１ｙを添加混合
せしめたものを、上記半透膜上にスポイト滴下して直径
約３〜５朋の半粒形物を多数形成し、次いで室温下で約
１時間放置してゲル化せしめ、この時点でその全面に再
度１０％ブチラール樹脂溶液をスプレー塗布し、厚さ１
０μの半透膜を形成して菌体を固定化する。

このようにして目的にする菌体固定化物が得られる。

上記菌体固定化物を一塊ごとに切断して不溶化菌体を得
、これらを実施例１に準じて反応させそのグルコースイ
ソメラーゼ活性を測定する。

一方、不溶化していないアセトン脱水処理した菌体につ
いても同様に測定する。

この二つの測定結果から、当該不溶化菌体の活性度は不
溶化していないものに比べ４２．８％の活性を示してい
た。

実施例 ７ 実施例６の菌体固定化物の製造方法において、５％カラ
ギーナン水溶液１０１ｒＬｌの代わりに１０％自己架橋
型アルギン酸ソーダ水溶液１０ｍ１を使用する以外は、
同様な条件で菌体固定化物を得、更に実施例６に準じて
切断した不溶化菌体のグルコースイソメラーゼ活性を比
較測定した所、不溶化していないものに比べ３８．７％
の活性を示していた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素もしくは微生物菌体のゲル状乃至チクソトロピ
   ック状水性体を、セルロース系樹脂、ポリビニルアルコ
   ール系樹脂、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合樹脂および
   ポリアミノ酸エステル系樹脂の少なくとも１種の樹脂か
   ら形成された半透膜で包括したことから成ることを特徴
   とする酵素もしくは菌体固定化物。 ２ 酵素もしくは微生物菌体のゲル状乃至チクソトロピ
   ツク状水性体が酵素もしくは微生物菌体、水およびゲル
   化剤で構成される上記第１項記載の固定化物。 ３ ゲル化剤として天然多糖類およびタンパク質類の少
   なくとも１種を使用する上記第２項記載の固定化物。 ４ 半透膜中にセルロース微粉末が混在する上記第１項
   記載の固定化物。 ５ 酵素もしくは微生物菌体のゲル状乃至チクソトロピ
   ンク状水性体中にセルロース微粉末が混在する上記第１
   項記載の固定化物。 ６ セルロース系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、
   塩化ビニル−酢酸ビニル共重合樹脂およびポリアミノ酸
   エステル系樹脂の少なくとも１種の樹脂から半透膜を形
   成し、該膜上に酵素もしくは微生物菌体のゲル状乃至チ
   クソトロピンク状水性体を粒形もしくは単粒形となるよ
   うに付与した後再度半透膜を形成して上記粒形もしくは
   半ね形の水性体を包括することを特徴とする酵素もしく
   は菌体固定化物の製造方法。 １ 半透膜の形成にスプレ一方式を採用する上記第６項
   記載の方法。 ８ 半透膜の膜厚が１〜１００μである上記第６項記載
   の方法。 ９ 半透膜中にセルロース微粉末が混在する上記第６項
   記載の方法。 １０ 酵素もしくは微生物菌体のゲル状乃至チクソト
   ロピツク状水性体の調製法として、水およびゲル化剤を
   要すれば加熱下で混合溶解せしめ、次いで常温〜５０℃
   付近に冷却後酵素もしくは微生物菌体を均一混合する上
   記第６項記載の方法。 １１ ゲル化剤として天然多糖類およびタンパク質類
   の少なくとも１種を使用する上記第１０項記載の方法。 １２ 酵素もしくは微生物菌体のゲル状乃至チクソト
   ロピック状水性体中にセルロース微粉末が混在する上記
   第６項の方法。 １３ 粒形もしくは単粒形の水性体の直径が１〜１０
   ｍｍである上記第６項記載の方法。 １４ 付与手段としてスポイト滴下を採用する上記第
   ６項記載の方法。 １５ 付与後放冷もしくは急冷してから再度半透膜を
   形成する上記第６項記載の方法。