JPH0249710B2

JPH0249710B2 -

Info

Publication number: JPH0249710B2
Application number: JP61066156A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Kajiwara; Hidekatsu Maeda; Hideo Suzuki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1986-03-25
Filing date: 1986-03-25
Publication date: 1990-10-31
Also published as: US4978619A; JPS62224289A

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明は、固定化酵素及びその製造方法に関す
るものである。

〔従来技術〕

各種の酵素反応を行う場合、その触媒として用
いる酵素は水溶性であるため、１回の使用しかで
きなかつた。このような欠点を克服するため、酵
素を固定化させて使用する技術が開発され、広く
利用されている。

近年、アミラーゼやプロテアーゼ等の加水分解
酵素以外に、ATPや、NAD、NADPといつた補
酵素を必要とする合成酵素や酸化還元酵素等も、
医療分析の分野に応用され始めた他、医薬品、化
学品の製造用触媒としても順次用いられようとし
ている。しかしながら、一般的に、補酵素を必要
とするような酵素は、従来の加水分解酵素あるい
は異性化酵素より更に高価でしかも安定性に劣る
ため、従来の酵素固定化法では満足すべき固定化
酵素は得られず、従来の固定化法よりも一層すぐ
れた固定化法の開発が要望されている。

酵素の固定化法は、大きく３つの方法に大別さ
れる。その第１の方法は、イオン交換樹脂や活性
炭等に酵素を物理的に吸着させる方法である。こ
の方法は、操作が簡単であるが、比較的弱い結合
で、担体と相互作用しているために、連続反応時
に酵素の脱離が起り、応用し得る条件が限られる
という欠点がある。第２の方法は、共有結合法
で、担体と酵素を化学的に共有結合させるもので
あり、担体と酵素が強い結合で結ばれるために、
酵素の脱離は極めて少ないが、酵素分子を化学修
飾するために失活等が起りやすいという欠点があ
り、特に、脱水素酵素やモノオキシゲナーゼ等の
不安定な酵素の場合、その失活の問題は大きい。
第３の方法は包活法であり、酵素をアクリルアミ
ドやκ−カラギーナン等のゲルマトリツクスやマ
イクロカプセルに包括させる方法である。この包
括法は、共有結合法とは異なり、酵素分子を直接
化学修飾しないので、失活などが起らないという
利点がある他、ゲルの網目や、マイクロカプセル
膜の孔径を適当に調整することにより、酵素分子
をゲル及びマイクロカプセル内に捕捉、固定しな
がら小さな基質分子のみを通すようにする事が可
能であり、酵素分子の脱離を防止することができ
るという利点もある。この包括法は、前記補酵素
を必要とするような酵素の固定化に好ましく適用
される。即ち、このような酵素の場合、酵素は２
量体あるいは４量体を形成している場合が多い
が、その場合、各単量体同士の結合力は非常に弱
く、例えば、４量体のどこか一個所を担体に共有
結合させた時に、４量体のままで長時間維持させ
るのはきわめて困難である。従つて、このような
酵素の場合では、ゲル包括法による固定化が好ま
しく適用される。また、２種類の酵素を同時に固
定化するような場合、今までの固定化法で対応で
きるのは、マイクロカプセル内に酵素群を包括固
定化する方法のみであり、ゲル包括法といえども
ゲルの１区画に２種類の酵素をはめ込むのはきわ
めて困難である。しかしながら、マイクロカプセ
ル化法でも、従来のマイクロカプセル法では、酵
素の洩出は殆んどないものの、カラムに詰めて連
続的な生産を行う場合、マイクロカプセルが変形
して目詰りが起り、圧損失が高くなるという実用
上の根本的な欠陥を有していた。

〔目的〕

本発明は、従来の固定化酵素及びその製造方法
に見られる前記欠点を克服することを目的とす
る。

〔構成〕

本発明によれば、第１の発明として、高分子ゲ
ルマトリツクス中に酵素を含有する空隙を分散保
持させた構造を有する固定化酵素が提供され、第
２の発明として、この固定化酵素を製造するため
に、酵素又は酵素を含有する微粉体を重合性モノ
マーもしくはプレポリマーの有機溶媒溶液中に分
散させた状態で該モノマーもしくはプレポリマー
を重合させてゲルを生成させた後に、該有機溶媒
を水性溶媒に交換し、分散固定された酵素を溶解
せしめることを特徴とする固定化酵素の製造方法
が提供される。

本発明で用いる酵素としては、その固定化時に
酵素が固体で存在するため、特に不安定なもので
ない限り、いずれの酵素も使用可能である。この
ような酵素の具体例としては、例えば、アルコー
ル脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルタミ
ン酸脱水素酵素、イソロイシン脱水素酵素、ギ酸
脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵
素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素等の脱水素
酵素；オルシノール−２−モノオキシゲナーゼ、
フエノール−２−モノオキシゲナーゼ等のモノオ
キシゲナーゼ；酢酸キナーゼ、ヘキソナーゼ、グ
リセロールキナーゼ等のキナーゼ；等の各種の補
酵素を必要とする酵素群の他、β−アミラーゼ、
グルコアミラーゼ、β−グルコシダーゼ、リパー
ゼ、ホスフアターゼ、プロテアーゼ、エステラ−
ゼなどの加水分解酵素、グルコースオキシダー
ゼ、パーオキシダーゼのようなオキシゲナーゼ等
が挙げられる。また、酵素は精製物の他、粗製物
であつてもよい。従つて、必要な酵素活性を持つ
培養液乾燥物、培養濾液乾燥物、生菌体、乾燥菌
体、菌体破砕物、動植物細胞、細胞破砕物、細胞
器官でも良い。但し、それらのものが固定化時に
微粉体状の固体である必要がある。これらの酵素
は単独又は混合物の形で用いることができる。補
酵素を仲介とするような共役反応を行う酵素系
は、本発明の好適な原料である。即ち、本発明の
場合は、酵素は、同一の空隙中に閉じ込められて
いるにもかかわらず、遊離で存在するため、共有
結合等に見られるような物理的あるいは立体的な
障害による反応阻害が存在せず、また、高分子ゲ
ル中では空隙という限られた空間に酵素が濃縮さ
れて存在するために、共役反応が速く行なわれ、
すぐれた固定化酵素を与える。しかし、酵素が高
分子ゲル中に含まれるため、高分子を基質とする
ような酵素や、α−アミラーゼ、キチナーゼ、セ
ルラーゼ等の加水分解酵素の場合には、酵素活性
の点で不十分であるが、低分子基質の分解に対し
ては十分な活性を発揮する。

本発明により酵素を固定化するには、先ず、酵
素又は酵素を含有する微粉体（以下、単に酵素を
含む微粉体あるいは単に微粉体とも言う）を、重
合性モノマーもしくはプレポリマーの有機溶媒溶
液と混合し、重合性モノマーもしくはプレポリマ
ーの有機溶媒溶液中に酵素を含む微粉体が分散し
た乳濁液を調製する。この場合、微粉体中には、
酵素の他、慣用の補助添加剤、例えば、安定剤等
を含有させることができる。前記乳濁液の調製に
際しては、重合性モノマー及びプレポリマー有機
溶媒溶液への微粉体の分散を促進させるために、
あらかじめ有機溶媒溶液中に慣用の界面活性剤を
添加しておいても良い。

前記酵素を含む微粉体に含有させる安定剤と
は、酵素を安定化する薬剤のことであり、従来公
知の種々のものが用いられ、このようなものに
は、例えば、ヘモグロビン、ゼラチン、血清アル
ブミンのような蛋白質；アラビアゴム、澱粉のよ
うな多糖類；ポリエチレングリコール、ポリビニ
ルアルコールのような水溶性合成高分子；NAD、
NADP、ATPのような補酵素；EDTAのような
キレート剤；特別の場合では、各種金属塩、グル
タチオン等の抗酸化剤が含まれ、使用される酵素
に応じて適当に選定される。このような安定剤
は、通常、市販の酵素標品に含まれるもので、長
期間の酵素活性の維持に役立つものであり、それ
自体で安定性の高い酵素の場合には特に必要とさ
れない。また、低分子の安定化剤を用いる場合は
高分子のゲル化（架橋反応）を阻害するものを用
いることが好ましくない。

前記酵素を含む微粉体の分散媒となる有機溶媒
中に溶解させる重合性モノマーもしくは、プレポ
リマーとしては、有機溶媒可溶性のものであり、
使用する有機溶媒中でゲル化が可能で、かつ使用
する有機溶媒と水が置換可能であれば任意のもの
が使用できる。このようなものの具体例として
は、例えば、可溶性の付加重合モノマー、例え
ば、ビニルエステル、ビニルエーテル、アクリル
酸エステル、メタクリル酸エステル、アクリルア
ミド、アクリロニトリルなどのモノマーやプレポ
リマー等が挙げられる。また、有機溶媒可溶性
で、PH変化によつて溶解性が変るモノマーも使用
可能である。例えば、アルカリ可溶、酸不溶なも
のとして、アクリル酸モノマー、メタクリル酸モ
ノマーの他、クロトン酸、マレイン酸、イタコン
酸、シトラコン酸、ビニル安息香酸等のモノマ
ー、あるいは、ビニルモノマーと酸基を持つモノ
マーや、セルロース誘導体、でん粉のフタル酸、
こはく酸又はマレイン酸誘導体、及びセルロース
のフタル酸誘導体等がある。更に酸可溶、アルカ
リ不溶の塩基性モノマーとして、ビニルピリジ
ン、ビニリイミダゾール、ビニルアミン、ビニル
アニリン等がある。

さらに、ポリビニルアルコールやポリエチレン
イミン、ポリアクリルアミドやポリビニルピロリ
ドンなどの高分子でも架橋反応によりゲルを生成
するものは使用できる。本発明では、このような
ゲル化可能なものは、プレポリマーとして取扱わ
れる。

また、酵素を含む微粉体の分散媒として用いる
有機溶媒としては、水を著量に含有せず、また水
に少量でも溶解するものであれば良く、例えば、
アセトン、メタノール、エタノール、エチレング
リコール、ホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ジオキサン、ベンゼン、シクロヘキサン、エ
チルエーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ハロ
ゲン化エチレン等が挙げられ、これらは単独もし
くは混合物として用いても良い。

次に、前記のようにして得られた乳濁液に重合
開始剤等を投入することにより、その重合性モノ
マーもしくはプレポリマーをゲル化（架橋化）す
る。この場合の重合性モノマーもしくはプレポリ
マーのゲル化は、その重合性モノマーもしくはプ
レポリマーに応じた適当なゲル化法が採用され、
従来公知の方法によつて行うことができる。

本発明においては、前記したように、酵素を含
む微粉体の分散が終了した後、ゲル化処理し、分
散媒としての有機溶媒中に含まれる重合性モノマ
ーもしくはプレポリマーをゲル化させるが、この
場合のゲル化法は、そのモノマーもしくはプレポ
リマーに応じて適宜選定される。この場合のゲル
化法を使用する高分子との関連で具体的に示す
と、例えば、ポリエチレングリコールジアクリレ
ートのようなビニル基を持つ合成プレポリマーで
は、そのビニル基のラジカル重合架橋化；ポリビ
ニルアルコールでは、グルタルアルデヒドやエピ
クロルヒドリンによる架橋化、放射線架橋化、安
息香酸ナトリウムと共に紫外線照射による光架橋
化；ポリエチレンイミンでは、エピクロルヒドリ
ンによる架橋化；ポリアクリルアミドやポリビニ
ルピロリドンでは、放射架橋化等が適用される。

本発明により固定化酵素を製造する場合、酵素
を含有する微粉体に対する分散媒として用いる有
機溶媒中に含まれる重合性モノマーもしくはプレ
ポリマーの量は、一般には、0.01〜50重量％、好
ましくは0.5〜30重量％であり、また、酵素を含
有する微粉体と、これを分散させるための重合性
モノマーもしくはプレポリマーを含む有機溶媒溶
液との重量比は、一般には、１：２〜100、好ま
しくは１：５〜20である。

前記のようにして得られる酵素を含有する微粉
体を分散保持する高分子ゲル化物は、これをカラ
ム充填に適した適当な寸法（例えば、粒径0.01〜
５mm程度）に細分割した後に、多量の緩衝液等の
水性溶媒で洗浄し、ゲル中の有機溶媒を水性溶媒
に交換する。この際に、水性溶媒中にエタノール
等の水と混合する溶媒を混和して、交換を促進す
ることもできる。ゲルの溶媒が有機溶媒から水性
溶媒に交換されることによつて、今まで有機溶媒
に不溶であつた微粉体中の酵素がゲルマトリツク
ス中の空隙中で溶解し、活性のある固定化酵素が
調製される。この微粉体が存在した、またこの時
点で溶解した酵素の存在する空隙は、分散した微
粉体の粒子径に依存するが、数μｍ〜数百μｍの
大きさを有している。

〔効果〕

本発明の方法は、前記したように、酵素を含有
した微粉体を高分子ゲルマトリツクス中に分散保
持させた後に、溶媒交換を行つて固体であつた酵
素を溶解、活性化させる方法である。このように
ゲル化反応の溶媒として有機溶媒を選んだ理由と
しては、各種のプレポリマー、あるいは重合によ
つて形成されたポリマーが、水系の場合よりも有
機溶媒系の方が高分子鎖が線状構造を保ちながら
架橋させることができるという考えからである。
したがつて、ゲル化反応において、従来のゲル包
括法では水性媒体中でゲル化させるために酵素の
洩出を抑えるのが困難であるのに対し、本発明で
は、均一ではるかにゲル網目を広範囲に調節する
ことが出来るため、固定化すべき酵素に対してそ
のゲル網目を最適化することが出来る。そして、
その酵素固定化率は高く、しかも酵素洩出率は極
めて低いという特徴を有する。本発明によれば、
酵素は、菌体粉砕物、乾燥菌体、生菌体等の形で
そのまま固定化することが可能であり、しかも不
安定な酵素や複数種の酵素、例えば複数の共役反
応系の酵素を効果的に固定化することができる。

〔実施例〕

次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明す
る。

実施例１ギ酸脱水素酵素（ベーリンガー社製、商品名、
「ギ酸脱水素酵素」、酵母由来、以下「FDH」と
略称する。）2.5ユニツト（凍結乾燥物）を試験管
中に取り、ガラス棒で固まりを粉砕した。ここへ
20分間脱気したポリエチレングリコール（＃400）
ジアクリレート（以下「PEGDA＃400」と略称
する。）400mgを含有したクロロホルム２mlを窒素
気流下で撹拌し、分散させる。充分に粒子が分散
してから、重合開始剤（過酸化ベンゾイル）５mg
及重合促進剤（ジメチルアニリン）5μを加え、
重合を行なわせた。約１分でゲル化が起り、更に
30分間室温に放置して重合を完了させた。このゲ
ルを荒砕し、クロロホルム50mlに30分間浸漬し
て、未反応の重合開始剤、重合促進剤などを除去
した。荒砕ゲルを吸引濾過し、クロロホルムを除
いた後、0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）中でカ
ツターで約0.2mm角にゲルを切断した。このゲル
を１の0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）中で１
晩撹拌しながら洗浄し、ゲル中のクロロホルム溶
媒を緩衝液と交換した。吸引濾過で洗浄液を除
き、固定化酵素（1.3ｇ）を得た。

次に、未固定化FDHの活性、ゲル洗浄液中の
未固定化FDHの活性、さらに固定化FDH活性を
以下のようにして測定した。なお、FDHにおい
て、その１ユニツト（ｕ）は、PH7.5、30℃、１
分間に1μモルのギ酸を酸化するのに必要な酵素
活性を示す。

未固定化FDHの活性測定では、ギ酸33mM及
びNADH 1mMの濃度条件の0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）を用い、30℃で340nmの吸光度を増加の
初速度から、FDH活性を求めた。固定化FDH活
性も同条件で求めた。

その結果、ゲル洗浄液中には、投入FDH活性
の5.5％が検出され、きわめて効率よく酵素活性
が固定化されることが示された。固定化酵素の総
酵素活性は、固定化されたと期待されるFDH活
性（投入FDH活性−洗浄液FDH活性）の14％が
測定された。この見かけの活性の低下は、ゲルの
内部拡散抵抗によるものと推察され、高分子ゲル
素材及び固定化溶媒等の条件を選択することによ
つて、更に高い活性を得ることができるものと思
われる。

実施例２ FDHを蒸留水に溶解し、飽和硫安溶液を加え、
硫安80％飽和にしてFDHを析出させ、遠心分離
（15000rpm、４℃、３分間）で沈澱させて回収し
た。この硫安沈澱物に冷アセトンを加え、水分を
除去し、遠心分離によりアセトン処理FDHを得
た。また、この硫安沈澱物を界面活性剤〔スパン
80（商品名）〕を極少量含んだヘキサン中に分散し
た後、遠心分離（15000rpm、４℃、３分間）し、
ヘキサンを除いた後、更に沈澱物に冷アセトンを
加え、残与の水分を除き、遠心分離（15000rpm、
４℃、３分間）によりアセトンを除き、ヘキサ
ン・アセトン処理FDHを得た。

上記、アセトン処理FDH1.68ユニツトもしく
はヘキサン・アセトン処理FDH1.05ユニツトを
１mlベンゼンに分散させた。またPEGDA＃400
を400mg含有する１mlベンゼンを用意し、両者を
別々に20分間脱気を行い、さらに両者を合一させ
た後10分間脱気を行つた。窒素気流下で重合開始
剤（過酸化ベンゾイル）５mg及び重合促進剤（ジ
メチルアニリン）5μを加え、重合を行なわせ
た。約30分で重合が起こり、更に１時間室温で放
置して、重合を完了させた。このゲルを荒砕き
し、50mlのベンゼンに浸漬して、未反応の重合開
始剤や重合促進剤を除去した。１時間後、吸引濾
過し、ベンゼンを除いた後、0.1Mトリス塩酸緩
衝液（PH7.5）中で、カツターで約0.2mm角にゲル
を切断した。このゲルを250mlの0.1mトリス塩酸
緩衝液（PH7.5）中で１晩撹拌しながら洗浄し、
ゲル中のベンゼン溶媒を緩衝液と交換した。吸引
濾過で洗浄液を除き、固定化酵素（1.1ｇ）を得
た。

次に、実施例１と同様にしてゲル洗浄液の
FDH活性及び固定化FDHの活性を測定した。そ
の結果、アセトン処理FDHの場合には、投入
FDH活性の11％が、ヘキサン・アセトン処理
FDHの場合には、26％が検出された。また固定
化FDHの総酵素活性はアセトン処理FDHの場合
固定化されたと期待されるFDH活性の18％、ヘ
キサン・アセトン処理FDHの場合25％が検出さ
れ、高い酵素活性を持つ固定化FDHを得ること
ができた。

さらに、この固定化FDH1ｇを25mlの0.1mトリ
ス塩酸緩衝液（PH7.5）に分散させ、室温で振と
うしながら、再洗浄を行つた。２日間の洗浄の
後、吸引濾過により、洗浄液を除いた。

この洗浄液及び固定化FDHの活性を測定した。
その結果、洗浄液中には、アセトン処理FDHの
場合はFDH活性が検出されず、またヘキサン・
アセトン処理FDHの場合には、投入FDH活性の
0.15％と極めて少量の活性のみが検出された。従
つてゲルからの酵素の漏出のない固定化酵素が得
られたことになる。最初の洗浄時に多くの酵素活
性が失なわれたのは、ゲルを切断する事により露
出したゲルの空隙酵素ポケツトから、直接酵素が
流出したものであり、ゲルの粒子整形などによ
り、酵素固定化率を向上することができる。ま
た、固定化FDHの活性はどちらの場合も固定化
時と全く同一の活性を有していた。

実施例３ FDH（凍結乾燥物）2.5ユニツトを粉砕し、ア
クリルアミド360mg及びＮ，Ｎ−メチレンビスア
クリルアミドを含有するジメチルスルホキシド２
mlに分散し、30分間脱気後、窒素気流下で重合開
始剤（過酸化ベンゾイル）５mg及び重合促進剤
（ジメチルアニリン）5μを加え重合を行なわせ
た。約１分でゲル化が起こり、更に１時間室温に
放置して、重合を完了させた。このゲルをカツタ
ーで約0.2mm角に切り、１の0.1Mトリス塩酸緩
衝液（PH7.5）中で１晩撹拌しながら洗浄し、ゲ
ルの溶媒を交換した。吸引濾過で洗浄液を除き、
固定化酵素（3.3ｇ）を得た。

次に、実施例１と同様にして、ゲル洗浄液中の
FDH活性及び固定化FDHの活性を測定した。そ
の結果、ゲル洗浄液中には、活性が検出されず、
また固定化FDHの総酵素活性は固定化されたと
期待される活性の9.6％で、このアクリアミドと
メチレンビスアクリルアミドの組合せを用いて
も、PEGDA同様に活性のある固定化酵素を得る
事が出来た。

さらに、固定化酵素３ｇを１の0.1Mトリス
塩酸緩衝液（PH7.5）中で撹拌しながら、５日間
洗浄し、吸引濾過で洗浄液を除いた。この洗浄液
及び固定化FDHの活性を測定した。その結果、
ゲル洗浄液中にはFDH活性が検出されず酵素の
漏出の少ない固定化酵素が得られた。また固定化
FDHの活性は、調製時とほぼ同じ活性を示し、
安定な固定化酵素を得ることが出来た。

実施例４ FDH（凍結乾燥物）2.6ユニツトを粉砕し、ポ
リエチレングリコール（＃1000）ジメタクリレー
ト400mgを含有するクロロホルム２mlに分散し、
20分間脱気後、窒素気流下で重合開始剤（過酸化
ベンゾイル）５mg及び重合促進剤（ジメチルアニ
リン）5μを加え重合を行なわせた。約６分で
ゲル化が起こり、更に30分間室温に放置して重合
を完了させた。このゲルを荒砕きし、クロロホル
ム50mlに１時間浸漬して、未反応の重合開始剤等
を除いた。荒砕ゲルを吸引濾過し、クロロホルム
を除いた後、ワーリングブレンダーで粉砕し、１
の0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）中で１晩撹
拌しながら洗浄し、ゲルの溶媒を交換した。吸引
濾過で洗浄液を除き、固定化酵素（1.4ｇ）を得
た。

次に、実施例１と同様にして、ゲル洗浄液中の
FDH活性及び固定化FDHの活性を測定した。そ
の結果、ゲル洗浄液中には、投入FDH活性の7.5
％が検出された。また、固定化FDHの総酵素活
性は固定化されたと期待される活性の10.5％で、
このモノマーを用いてもPEGDA同様に活性のあ
る固定化酵素を得る事が出来た。

さらに、この固定化酵素１ｇを100mlの0.1Mト
リス塩酸緩衝液（PH7.5）中で撹拌しながら５日
間洗浄し、吸引濾過で洗浄液を除いた。この洗浄
液及び固定化FDHの活性を測定した。その結果、
ゲル洗浄液中には投入FDH活性の0.8％が含まれ
ており、酵素の漏出の少ない固定化酵素が得られ
た。また、固定化FDHの活性は、調製時とほぼ
同じ活性を示し、安定な固定化酵素を得ることが
出来た。

実施例５アルコール脱水素酵素（ベーリンガー社製、馬
肝臓由来、商品名「アルコール脱水素酵素」、以
下「ADH」と略称する。）の硫安沈澱物を遠心分
離（15000rpm、４分間）した。残渣に冷アセト
ンを加え、水分を除去し、更に遠心分離
（15000rpm、４分間）を行つた。得られた残渣を
減圧乾燥し、粉末ADHを得た。

この粉末ADH2.5ユニツトをポリエチレングリ
コール（＃400）ジアクリレート（以下、
PEGDA＃400と略称する）400mgもしくは、ポリ
エチレングリコール（＃600）ジメタクリレート
（以下、PEGDMA＃600と略称する）400mgを含
有するクロロホルム２mlに分散し、30分脱気後、
窒素、気流下で重合開始剤（過酸化ベンゾイル）
５mg及重合促進剤（ジメチルアニリン）5μを
加え、重合を行なわせた。どちらも約６〜７分で
ゲル化が起こり、更に30分間室温で放置して重合
を完了させた。このゲルを荒砕きし、クロロホル
ム50mlに30分間浸漬して、未反応物を除いた。荒
砕ゲルを吸引濾過し、クロロホルムを除いた後、
ワーリングブレンダーで粉砕し、１の0.1Mト
リス塩酸緩衝液（PH7.5）中で１晩撹拌しながら
洗浄し、ゲルの溶媒を交換した。吸引濾過で洗浄
液を除き、固定化酵素（PEGDA＃400の場合、
1.1ｇ、PEGDMA＃600の場合1.0ｇ）を得た。

次に、未固定化ADH、ゲル洗浄液中のADH、
さらに固定化ADH活性を以下のようにして測定
した。

なお、ADHにおいて、その１ユニツトはPH
9.0、30℃、１分間で1μmoleのエタノールを酸化
するのに必要な酵素活性を示す。

未固定化ADHの活性測定では、エタノール
577mM、NAD1.8mM、グルタチオン還元型
10mM、セミカルバジド72.8mMの濃度条件の
62.1mMグリシン・ピロリン酸ナトリウム緩衝液
（PH9.0）を用い、30℃で、340nmの吸光度の増加
の初速度からADH活性を求めた。

この結果、PEGPA＃400で固定した場合の洗
浄液中には、投入ADH活性の5.4％が検出され、
またPEGDMA＃600で固定化した場合の洗浄液
中には、ADH活性が検出されず、きわめて効率
よく酵素活性が固定化された事が示された。また
固定化ADHの総酵素活性は、固定したと期待さ
れるADH活性の20％（PEGDA＃400の場合）及
び15％（PEGDMA＃600の場合）であり、FDH
以外の脱水素酵素にもこの方法が適用可能な事が
示された。

実施例６本発明の固定化法が、前記脱水素酵素だけでは
なく、他のキナーゼ酵素にも適用可能なことを示
すために、ATP関与のキナーゼについても実験
を行つた。

ヘキソキナーゼ（ベーリンガー社製、酵母由
来、商品名、「ヘキソキナーゼ」、以下「HK」と
略称する）及びグルコース−６−リン酸脱水素酵
素（ベーリンガー社製、酵母由来、商品名「グル
コース−６−リン酸脱水素酵素」、以下
「G6PDH」と略称する）の硫安沈澱物を遠心分
離（15000rpm、４分間）した。残渣に冷アセト
ンを加え、水分を除き更に遠心分離（15000rpm、
４分間）した。残渣を乾燥し、粉末酵素を得た。
この粉末HK8.0ユニツト及び粉末G6PDH9.3ユニ
ツトをポリエチレングリコール（＃400）ジアク
リレート400mgを含むクロロホルム２mlに分散し、
30分脱気後、窒素気流下で重合開始剤（過酸化ベ
ンゾイル）５mg及び重合促進剤（ジメチルアニリ
ン）5μを加え、重合を行なわせた。約１分間
でゲル化が起こり、更に30分間室温に放置し、重
合を完了させた。このゲルを荒砕きし、クロロホ
ルム50mlに２時間浸漬して、未反応物を除いた。
荒砕ゲルを吸引濾過し、クロロホルムを除いた
後、ワーリングブレンダーで粉砕し、１の
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）中で１晩撹拌しなが
ら洗浄し、ゲルの溶媒を交換した。吸引濾過で洗
浄液を除き、固定化酵素（960mg）を得た。

次に、未固定化G6PDH及びHK、ゲル洗浄液
中の未固定G6PDH及びHK、さらに固定化
G6PDH及びHKの活性を以下のようにして測定
した。

なお、G6PDHにおいて、その１ユニツト
（ｕ）は、PH7.6、30℃、１分間で1μモルのグルコ
ース−６−リン酸を酸化するのに必要な酵素活性
を示し、また、HKにおいて、その１ユニツト
（ｕ）は、PH7.6、30℃、１分間で1μモルのグルコ
ースをリン酸化するのに必要な酵素活性を示す。
HKの生産物は、グルコース−６−リン酸で、過
剰に存在するG6PDHがその量をNADHの量に変
換し測定する。

未固定化G6PDHの活性測定では、グルコース
−６−リン酸1.2mM、NADP0.37mM、塩化マグ
ネシウム6.7mMの濃度条件の86.3mMトリエタノ
ールアミン緩衝液（PH7.6）を用い、30℃で、
340nmの吸光度の増加の初速度から、G6PDH活
性を求めた。固定化G6PDHの活性も前記と同じ
測定法で求めた。HKの活性測定では、グルコー
ス222mM、ATP（アデノンシン−51−３リン酸）
2.7mM、NADP（ニコチン・アデニン・ジヌクレ
オチド・リン酸）0.73mM、塩化マグネシウム
6.7mM、G6PDH0.5u／mlの濃度条件の82.3mM
トリエタノールアミン緩衝液（PH7.6）を用い、
30℃で340nmの吸光度の増加の初速度から、HK
活性を求めた。固定化HKの活性も前記と同じ測
定法を用いた。

HKとG6PDHの共役反応は、HKの活性測定の
試薬から、G6PDHを除いたものを用い、30℃に
おいて、固定化酵素のみで、NADPHの生成、
すなわち340nmの吸光度の増加を調べた。

その結果、この固定化酵素には、固定したと期
待されるHK活性の8.2％、固定したと期待される
G6PDH活性の12.7％が測定された。更に、固定
化されたHK活性とG6PDH活性の共役反応を調
べた所、固定化酵素のHK活性と匹敵する共役活
性を有することが確認され、この固定化酵素によ
つてグルコース量を測定し得ることが確認され
た。

実施例７本発明の固定化法が、前記酵素のみならず、菌
体の固定にも適用可能なことを示すために、生菌
体の固定について実験を行つた。500ml容の坂口
フラスコにリン酸二水素カリウム0.1％、硫酸マ
グネシウム七水塩0.05％、塩化カルシウム二水塩
0.01％、塩化ナトリウム0.02％、カザミノ酸0.4
％、酵母エキス0.1％、Ｄ−キシロース８％含有
する培養液（PH7.0）50mlを入れ、オートクレー
ブ殺菌（120℃、20分）した後、Pichia xylosa
（IF00950）を接種し、30℃で３日間撹拌培養し
た。培養液を遠心分離（8000rpm、10分）し、残
渣を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で３回洗浄し、
洗浄菌体2.7ｇ（湿重量）を得た。

洗浄菌体20mgをベンゼン１mlに界面活性剤
（Span85）４滴加えて分散した。PEGDA＃400を
400ｇ含むベンゼン１mlと上記菌体分散液を別々
に20分間脱気した。両者を合併してさらに20分間
脱気した後、窒素気流下で過酸化ベンゾイル５mg
及びジメチルアニリン5μを加えた。約４分で
ゲル化が起り、さらに30分間放置してゲル化を完
了させた。生成ゲルを５mm角程度に砕き、ベンゼ
ン50mlを加え、未反応試薬を洗浄した。ベンゼン
を除いた後、ゲルを0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）
300mlで２時間洗浄し、吸引濾過で洗浄液を除い
て、固定化菌体（0.8ｇ）を得た。この固定化菌
体を上記培養液10ml中に移し、30℃で４日間振と
う培養を行つた。濾過により、培養液を除き、ゲ
ルの切片を作り、顕微鏡で観察した所、ゲル内に
菌体の生育が認められた。また、培養液の高速液
体クロマトグラフイーによる糖分析を行つた所、
Ｄ−キシロースの消費とキシリトールの生産が認
められた。高速液体クロマトグラフイーによる糖
分析は、イオン交換カラム（昭和電工社製、商品
名、Shodex Ｃ−811）を80℃に保ち、溶媒とし
て水を用い、1.0ml／分で送液した。検出器に示
差屈折計（昭和電工社製、商品名、Shodex SE
−11）を用いてその出力をクロマトデータ処理装
置（島津製作所製、商品名、クロマトパツクCR3
−Ａ）で処理して、各ピークの面積を得、既知濃
度の標準サンプルのピーク面積との比から、各物
質の濃度を得た。

実施例８実施例７の生産体を凍結乾燥し、凍結乾燥菌体
を得た（0.5ｇ乾燥菌体／2.7ｇ湿生菌体）。この
凍結乾燥菌体20mgをベンゼン１mlに分散し、
PEGDA＃400を400ｇ含有するベンゼン１mlと
別々に20分間脱気した。両者を混合した後、さら
に20分間脱気し、窒素気流下で過酸化ベンゾイル
５mg及ジメチルアニリン5μを加えた。約３分
でゲル化が起こり、30分間室温に放置して、ゲル
化を完了さてた。ゲルを荒砕きし、50mlのベンゼ
ンで30分間洗浄した。ベンゼンを除いた後ワーリ
ングブレダーを用いてゲルを粉砕し、0.05Mリン
酸緩衝液（PH7.0）350ml中で撹拌しながら、一晩
洗浄し、溶媒を交換した。吸引濾過で洗浄液を除
き、固定化乾燥菌体（1.0ｇ）を得た。

この固定化乾燥菌体200mgを、20mM NADP、
0.5Mグルコース、0.3Mグルコース−６−リン酸
及びG6PDH3.5ユニツトを含有する0.05Mリン酸
緩衝液（PH7.0）１mlに入れ、30℃で往復振とう
しながら24時間反応させた。この反応液を実施例
７で述べた高速液体クロマトグラフイーによる糖
分析にかけた結果、反応液のグルコースがソルビ
トールに変換した事が確認された。その活性は投
入した凍結乾燥菌体の変換活性の５％であつた。

Claims

【特許請求の範囲】１高分子ゲルマトリツクス中に、大きさ数μｍ
〜数百μｍの不定形の独立胞である空〓が分散保
持され、該空〓中に酵素が非マイクロカプセル化
状態で包含されていることを特徴とする固定化酵
素。２酵素又は酵素を含有する微粉体を重合性モノ
マーもしくはプレポリマーの有機溶媒溶液中に分
散させた状態で該モノマーもしくはプレポリマー
を重合させてゲルを生成させた後に、該有機溶媒
を水性溶媒に交換し、分散固定された酵素を溶解
せしめることを特徴とする固定化酵素の製造方
法。