CN107312767B - 一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法 - Google Patents

一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107312767B
CN107312767B CN201710579688.7A CN201710579688A CN107312767B CN 107312767 B CN107312767 B CN 107312767B CN 201710579688 A CN201710579688 A CN 201710579688A CN 107312767 B CN107312767 B CN 107312767B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glucosidase
beta
particle
aggregate
cross
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710579688.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107312767A (zh
Inventor
魏胜华
钱伟
孟娜
马小淋
周清华
柯文君
郭良昊
徐书春
王韩杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Polytechnic University
Original Assignee
Anhui Polytechnic University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Polytechnic University filed Critical Anhui Polytechnic University
Priority to CN201710579688.7A priority Critical patent/CN107312767B/zh
Publication of CN107312767A publication Critical patent/CN107312767A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107312767B publication Critical patent/CN107312767B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法，属于酶的固化领域。所述组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒包括交联β‑葡萄糖苷酶聚集体核心和交联的高分子聚合物外壳；所述制备方法是通过交联‑包埋组合式固定化方法，首先在油包水乳化体系中制备了颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合反应得到了该组合固定化β‑葡萄糖苷酶颗粒。本发明不仅操作简单、成本低廉、酶活回收率高、酶的稳定性强，而且方便回收重复利用，具有较广阔的应用前景。

Description

一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于酶的固定化技术领域，涉及一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法。
背景技术
β-葡萄糖苷酶是广泛存在于自然界中的一类水解酶，它能够水解糖苷和寡糖中非还原性末端的β-糖苷残基从而释放葡萄糖和相应的配基。另外，β-葡萄糖苷酶可催化逆水解反应和转糖基反应，并合成相应的糖苷类化合物。随着糖苷类化合物在医药、食品、日用化工工业上有着重要的应用和经济价值，以及与化学法相比酶法合成糖苷具有高选择性、条件温和、反应过程简单以及环保等众多优点。因此，利用β-葡萄糖苷酶催化各类糖苷的合成和应用受到越来越多的关注。但是β-葡萄糖苷酶催化各类糖苷的合成反应大多数需要在非水相体系和较高温度环境中进行，然而，天然β-葡萄糖苷酶的稳定性较差、易失活，导致催化效率低，限制了其工业化应用，因而增强β-葡萄糖苷酶的稳定性是当前急需解决的问题。
交联酶聚集体是近些年发展起来的一种无载体固定化酶技术。它的制备通常分为沉淀和交联两步，首先利用蛋白沉淀剂(如中性盐、水溶性有机溶剂、非离子型高聚物等)将溶解状态的酶进行物理沉淀得到酶沉淀聚集体，随后利用交联剂(例如戊二醛)与酶聚集体分子上的氨基发生反应，从而得到不溶性固定化酶颗粒。该方法获得的固定化酶制备过程简单、酶活保留率高、具有良好的稳定性和重复操作性，但是多次重复利用后聚集体表面结构容易被破坏而造成酶活损失，在非水相催化过程中酶的稳定性也不够。酶的包埋技术是借助化学或者物理的方法将酶固定在某种载体中的过程，载体的形成可以通过化学的方法(如交联、聚合)、物理的方法(物理的凝胶化)或这两种方法的结合。酶分子可以通过聚合物形成的凝胶载体而被包埋于其中，从而获得固定化酶。该方法制备过程简单、酶活保留率高，但是该方法固定的酶往往稳定性不够而且酶容易渗漏、重复回收利用率低。
单一的固定化方法常常存在一些缺陷，如上述交联聚集体在非水相催化过程中稳定性不够，包埋法中易发生酶的泄漏和难以回收等。
发明内容
根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法，通过交联-包埋组合式固定化方法制备出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。本发明首先在油包水乳化体系中制备出颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合制备出一种回收率高且稳定性强的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：本发明提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，包括核心与外壳，所述核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，所述外壳为交联的高分子聚合物，所述核心位于外壳内部,所述核心与外壳之间通过化学键链接。
本发明还提出一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将沉淀剂加入到蛋白浓度为10～50g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡搅拌得到混合液；
(2)向步骤(1)所得混合液中依次加入油相和乳化剂，磁力搅拌乳化1～3min，形成油包水体系后，在4～25℃下沉淀反应0.5～1h；
(3)向步骤(2)所得产物中加入交联剂，磁力搅拌乳化1～3min，在4～25℃下交联反应1～3h，将反应得到的产物在5000r/min转速下离心10～15min，收集沉淀，用去离子水重复清洗2～3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体；
(4)将步骤(3)得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体和能与β-葡萄糖苷酶表面氨基发生反应的且含有碳碳不饱和双键的酶修饰剂依次加入到pH值为4.0～7.0的缓冲溶液中，振荡搅拌，形成聚集体悬液，在4～25℃下反应0.5～6h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h；
(5)向步骤(4)透析后的反应液中依次加入乙烯基单体和引发剂，在4～25℃下反应3～10h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h，在5000r/min转速下离心10～15min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，将该酶颗粒置于4℃冰箱中保存或冷冻干燥24h后置于4℃冰箱中保存。
上述步骤(1)中沉淀剂为(NH4)2SO4、PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000中的一种；所述(NH4)2SO4的加入量为30～80％(w/v)，所述PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000的加入量分别为10～30％(w/v)。
上述步骤(2)中油相为大豆油、橄榄油、花生油、液体石蜡、菜籽油、色拉油、蓖麻油、丁酸乙酯、辛癸酸甘油酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、油酸聚乙二醇甘油酯中的一种；所述步骤(2)中的油相与步骤(1)制备出的混合液的体积比为5～50:1。
作为优选，上述油相与混合液的体积比为10:1。
上述步骤(2)中的乳化剂为Tween60、Tween80、span40、span60、span80、AOT、SDS中的一种；所述乳化剂的加入量为0.2～3％(w/v)。
上述步骤(3)中交联剂为戊二醛或葡聚糖聚醛；所述交联剂的加入量为0.5～5％(v/v)。
上述步骤(4)中酶修饰剂为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与二甲基亚砜组成的混合物A、丙烯酰氯与二甲基亚砜组成的混合物B、甲基丙烯酸缩水甘油酯与二甲基亚砜组成的混合物C中的一种或几种，所述酶修饰剂的加入量为0.2～1％(w/v)。
上述步骤(4)中缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中的一种。
上述步骤(5)中乙烯基单体可以通过自由基聚合反应形成聚合物的单烯烃单体和多烯烃单体中的一种或多种，具体为丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基炳烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、N-异丙基丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯中的一种或几种，所述乙烯基单体的加入量为2～5％(w/v)。
上述步骤(5)中引发剂为a和b组成的混合物，所述a为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化氢、过氧化苯二甲酰中的一种或几种，所述b为N,N'-二甲基苯胺、氨水、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、N-甲基吗啉和哌啶中的一种或几种。
作为优选，上述步骤(5)中引发剂为1份过硫酸铵和1份N,N,N',N'-四甲基乙二胺组成的混合物，且加入量为0.5～1.5％(w/v)。
本发明的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的粒径大小为10～60μm。
本发明有益效果是:本发明首先在油包水乳化体系中制备了颗粒大小均匀的交联酶聚集体，然后对交联酶聚集体表面进行化学修饰引入碳碳双键基团，最后以乙烯基单体为原料，通过自由基原位聚合得到了该组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。该组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒为核壳结构，其核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，外壳层为交联的高分子聚合物，核壳之间通过化学键链接，而且具有生物催化活性、稳定性高。本发明操作简单、成本低、酶活回收率高、酶颗粒大小均匀、酶的稳定性强，而且酶能够方便回收重复利用，具有广阔的应用前景。
附图说明
下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：
图1是本发明的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒制备过程示意图；
图2是本发明实施例一的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒重复利用稳定性变化图。
图中1、游离状β-葡萄糖苷酶，2、交联β-葡萄糖苷酶聚集体，3、组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，4、沉淀剂，5、交联剂，6、酶修饰剂，7、聚合单体，8、引发剂。
具体实施方式
通过对实施例的描述，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1
本实施例的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段和酶的组合固定化阶段。
交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段，包括以下具体步骤：
(1)将70％的沉淀剂(NH4)2SO4加入到5mL蛋白浓度为30g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡摇匀，即得混合液；
(2)将上述混合液按油水体积比为10:1的比例加入到包含1％(w/v)的Tween80的大豆油中，磁力搅拌乳化3min，形成油包水体系，在25℃条件下沉淀反应1h；
(3)向步骤(2)中再加入2％(v/v)的交联剂戊二醛，磁力搅拌乳化3min，在25℃条件下交联反应2h，反应结束后将得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体在5000r/min下离心10min，收集沉淀，用去离子水清洗3次，得到交联β-葡萄糖苷酶聚集体。
酶的组合固定化阶段，包括以下步骤：
步骤一、将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体加入到5mL pH＝6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，振荡混匀，形成聚集体悬液，再加入0.5％(w/v)的酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺，在25℃条件下反应3h，结束后置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析24h；
步骤二、向步骤一透析后的反应液中加入3％(w/v)的丙烯酰胺单体和0.5％(w/v)的过硫酸铵与N,N,N',N'-四甲基乙二胺组成的复合引发剂，在25℃条件下聚合反应6h，结束后置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析24h，在5000r/min下离心10min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。
β-葡萄糖苷酶的酶活力测定过程中，以未处理的游离酶酶液的酶活力为100％，计算交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率。以酶的组合固定化阶段前的β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活力为100％，计算酶的组合固定化阶段得到的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率。
Figure BDA0001351908410000041
β-葡萄糖苷酶的酶活力的测定方法为：取1mL适当稀释的β-葡萄糖苷酶(或β-葡萄糖苷酶聚集体或组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒)酶液，在50℃下预热5min，加入1mL已预热5min的10mmol/L pNPG溶液，置于50℃水浴锅中反应10min，反应结束后立即加入2mL浓度为1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，并将反应液置于室温下静置5min。取1mL反应液适当稀释后测定其在405nm处吸光度，再根据标准曲线换算出反应生成的对硝基苯酚(pNP)的量，计算酶活力。酶活定义为：在pH7.0、50℃条件下，每分钟水解pNPG产生1μmol pNP所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
本实施例中交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段产生的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为85.6％；本实施例中酶的组合固定化阶段产生的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率为91.3％；如图2所示，本实施的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒在连续使用5次后，组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的残余相对酶活力仍然保持在85％以上。
实施例2
本实施例的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段和酶的组合固定化阶段。
交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段，包括以下具体步骤：
(1)将60％的沉淀剂(NH4)2SO4加入到5mL蛋白浓度为30g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡摇匀,得到混合液；
(2)将上述混合液按油水体积比为10:1的比例加入到包含1％(w/v)的Tween80的橄榄油中，磁力搅拌乳化3min，形成油包水体系，在4℃条件下沉淀反应1h；
(3)向步骤(2)中再加入2.5％(v/v)的交联剂戊二醛，磁力搅拌乳化3min，在4℃条件下交联反应2h，反应结束后将得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体在5000r/min下离心10min，收集沉淀，用去离子水清洗3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体。
酶的组合固定化阶段，包括以下具体步骤：
步骤一、将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体加入到5mL pH＝6.0的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液中，振荡混匀，形成聚集体悬液，再加入0.5％(w/v)的酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺，在4℃条件下反应3h，结束后置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析24h；
步骤二、向步骤一透析后的反应液中加入4％(w/v)的丙烯酰胺单体和0.5％(w/v)的过硫酸铵与N,N,N',N'-四甲基乙二胺组成的复合引发剂，在4℃条件下聚合反应6h，结束后置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析24h，在5000r/min下离心10min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。
本实施例交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为82.7％；本实施例酶的组合固定化阶段制备出的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率为88.4％。
实施例3
本实施例的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段和酶的组合固定化阶段。
交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段，包括以下具体步骤：
(1)将70％的沉淀剂(NH4)2SO4加入到5mL蛋白浓度为30g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡摇匀,得到混合液；
(2)将上述混合液按油水体积比为10:1的比例加入到包含1％(w/v)的span60的大豆油中，磁力搅拌乳化3min，形成油包水体系，在4℃条件下沉淀反应0.5h；
(3)向步骤(2)中再加入2％(v/v)的交联剂戊二醛，磁力搅拌乳化3min，在4℃条件下交联反应2h，反应结束后将得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体在5000r/min下离心10min，收集沉淀，用去离子水清洗3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体。
酶的组合固定化阶段，包括以下具体步骤：
步骤一、将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体加入到5mL pH＝7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，振荡混匀，形成聚集体悬液，再加入0.5％(w/v)的酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺，在4℃条件下反应3h，结束后置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析24h；
步骤二、向步骤一透析后的反应液中加入0.5％(w/v)的N,N'-甲叉双丙烯酰胺单体与2.5％(w/v)的丙烯酰胺单体和0.5％(w/v)的过硫酸铵与N,N,N',N'-四甲基乙二胺组成的复合引发剂，在4℃条件下聚合反应6h，结束后置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析24h，在5000r/min下离心10min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。
本实施例交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为83.5％；本实施例酶的组合固定化阶段制备出的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率为85.9％。
实施例4
本实施例的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段和酶的组合固定化阶段。
交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段，包括以下具体步骤：
(1)将加入20％(w/v)的沉淀剂PEG1000加入到5mL蛋白浓度为20g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡摇匀,得到混合液；
(2)将上述混合液按油水体积比为10:1的比例加入到包含0.5％(w/v)的span60的大豆油中，磁力搅拌乳化3min，形成油包水体系，在4℃条件下沉淀反应1h；
(3)向步骤(2)中再加入2％(v/v)的交联剂戊二醛，磁力搅拌乳化3min，在4℃条件下交联反应2h，反应结束后将得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体在5000r/min下离心10min，收集沉淀，用去离子水清洗3次，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体。
酶的组合固定化阶段，包括以下具体步骤：
步骤一、将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体加入到5mL pH＝5.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中，振荡混匀，形成聚集体悬液，再加入0.8％(w/v)的酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺，在4℃条件下反应4h，结束后置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析24h；
步骤二、向步骤一透析后的反应液中加入3％(w/v)的丙烯酰胺单体和0.6％(w/v)的过硫酸铵与N,N,N',N'-四甲基乙二胺组成的复合引发剂，在4℃条件下聚合反应6h，结束后置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析24h，在5000r/min下离心10min，收集沉淀，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。
本实施例交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段制备出的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为79.9％；本实施例酶的组合固定化阶段制备出的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的酶活回收率为86.5％。
实施例5
本实施例保持实施例1中的酶的组合固定化阶段制备条件不变，将交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段的油水体积比改为20:1，油相改为液体石蜡，其他条件与实施例1相同，测得交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率为75.7％，最终制备的组合固定化β-葡萄糖苷酶的酶活回收率87.2％。
本实施例与实施例1相比，制备的交联β-葡萄糖苷酶聚集体的酶活回收率和制备的组合固定化β-葡萄糖苷酶的酶活回收率都较低。实施例5中油水比例的增大，使得体系形成的乳滴较小，造成制备的交联β-葡萄糖苷酶聚集体粒径较小，小乳滴内的酶易受油水界面的作用而失活，而且交联β-葡萄糖苷酶聚集体粒径较小，易造成回收不完全而导致酶活的损失。另外，本实施例中的油相为液体石蜡，由于液体石蜡比重较小，形成的交联β-葡萄糖苷酶聚集体难以与油滴分离，影响酶活回收率。
实施例6
本实施例保持实施例1中交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备阶段条件不变，将实施例1中酶的组合固定化阶段加入酶修饰剂N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺改为不加酶的修饰剂，直接进行聚合反应。实验发现本实施例与实施例1相比，不加酶修饰剂制备的组合固定化β-葡萄糖苷酶其酶表面形成的聚丙烯酰胺层结构较为松散，导致β-葡萄糖苷酶容易脱落，不适合多次重复回收利用。
上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：包括核心与外壳，所述核心为交联β-葡萄糖苷酶聚集体，所述外壳为交联的高分子聚合物，所述核心位于外壳内部,所述核心与所述外壳之间通过化学键链接；固定化β-葡萄糖苷酶颗粒的制备方法，包括以下步骤：（1）将沉淀剂加入到蛋白浓度为10～50g/L的β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡搅拌得到混合液；
（2）向步骤（1）所得混合液中依次加入油相和乳化剂，磁力搅拌乳化1～3min，形成油包水体系后，在4～25℃下沉淀反应0.5～1h；
（3）向步骤（2）所得产物中加入交联剂，磁力搅拌乳化1～3min，在4～25℃下交联反应1～3h，将反应得到的产物离心，洗涤，过滤，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体；
（4）将步骤（3）得到的交联β-葡萄糖苷酶聚集体和能与β-葡萄糖苷酶表面氨基发生反应的且含有碳碳不饱和双键的酶修饰剂依次加入到pH值为4.0～7.0的缓冲溶液中，振荡搅拌，形成聚集体悬液，在4～25℃下反应0.5～6h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h；
（5）向步骤（4）透析后的反应液中依次加入乙烯基单体和引发剂，在4～25℃下反应3～10h后，置于截留分子量为12KDa的透析袋中透析12～24h，离心收集沉淀，冷冻干燥，即得组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒。
2.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（1）中沉淀剂为(NH4)2SO4、PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000中的一种；所述(NH4)2SO4的加入量为30～80％w/v，所述PEG400、PEG1000、PEG6000、PEG8000的加入量分别为10～30％w/v。
3.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（2）中油相为大豆油、橄榄油、花生油、液体石蜡、菜籽油、色拉油、蓖麻油、丁酸乙酯、辛癸酸甘油酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、油酸聚乙二醇甘油酯中的一种；所述步骤(2)中的油相与步骤(1)制备出的混合液的体积比为5～50:1。
4.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（2）中的乳化剂为Tween60、Tween80、span40、span60、span80、AOT、SDS中的一种；所述乳化剂的加入量为0.2～3％w/v。
5.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（3）中交联剂为戊二醛或葡聚糖聚醛；所述交联剂的加入量为0.5～5％v/v。
6.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（4）中酶修饰剂为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与二甲基亚砜组成的混合物A、丙烯酰氯与二甲基亚砜组成的混合物B、甲基丙烯酸缩水甘油酯与二甲基亚砜组成的混合物C中的一种或几种，所述酶修饰剂的加入量为0.2～1％w/v。
7.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（4）中缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中的一种。
8.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（5）中乙烯基单体为丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基炳烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、N-异丙基丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯中的一种或几种，所述乙烯基单体的加入量为2～5％w/v。
9.根据权利要求1所述的组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒，其特征在于：所述步骤（5）中引发剂为a和b组成的混合物，所述a为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化氢、过氧化苯二甲酰中的一种或几种，所述b为N,N'-二甲基苯胺、氨水、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、N-甲基吗啉和哌啶中的一种或几种。
CN201710579688.7A 2017-07-17 2017-07-17 一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法 Active CN107312767B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710579688.7A CN107312767B (zh) 2017-07-17 2017-07-17 一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710579688.7A CN107312767B (zh) 2017-07-17 2017-07-17 一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107312767A CN107312767A (zh) 2017-11-03
CN107312767B true CN107312767B (zh) 2020-11-06

Family

ID=60178795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710579688.7A Active CN107312767B (zh) 2017-07-17 2017-07-17 一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107312767B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182324B (zh) * 2018-08-27 2021-07-27 华南协同创新研究院 一种壳-核结构固定化酶及其制备方法和应用
CN109536479B (zh) * 2018-12-05 2019-11-08 清华大学 一种交联固定化双酶-表面活性剂复合物及其制备方法
CN113151225B (zh) * 2021-04-09 2023-06-20 华南理工大学 聚合物改性β-葡萄糖苷酶及其制备与在木质纤维素酶解中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1888060A (zh) * 2006-07-14 2007-01-03 清华大学 碳酸酐酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法
CN102229923A (zh) * 2011-04-27 2011-11-02 清华大学 一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法
CN102604925A (zh) * 2012-03-16 2012-07-25 清华大学 一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1888060A (zh) * 2006-07-14 2007-01-03 清华大学 碳酸酐酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法
CN102229923A (zh) * 2011-04-27 2011-11-02 清华大学 一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法
CN102604925A (zh) * 2012-03-16 2012-07-25 清华大学 一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
乳化法制备交联海藻糖合酶聚集体的研究;陈晓云等;《南开大学学报》;20130430;第46卷(第2期);第107-112页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107312767A (zh) 2017-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US3802997A (en) Method of stabilizing enzymes
CN107312767B (zh) 一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法
Johansson et al. Acrylic copolymers as matrices for the immobilization of enzymes: I. Covalent binding or entrapping of various enzymes to bead-formed acrylic copolymers
CA2833695C (en) Cross-linked poly-e-lysine particles
CN103343117B (zh) 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法
US4978619A (en) Enzyme immobilization by entrapment in a polymer gel matrix
US4194066A (en) Immobilization of enzymes or bacteria cells
Fujii et al. Application of reversibly soluble polymers in bioprocessing
CN109266639A (zh) 一种双重固定化酶及其制备方法和应用
Ramalho et al. Covalent bonding immobilization of a Bacillus licheniformis protease on chitosan and its application in protein hydrolysis
CN109182324B (zh) 一种壳-核结构固定化酶及其制备方法和应用
JPH0787974A (ja) 固定化リパーゼ
CN104480096B (zh) 交联聚合固载β-葡萄糖苷酶的方法
CN108588153A (zh) 一种氨基酸型表面活性剂的酶催化制备方法
EP2316932A1 (en) Enzyme-functionalized supports
CN114875015A (zh) 一种脂肪酶-聚合物偶联物的制备方法及其在结构脂质转酯化上的应用
CN105969826B (zh) 一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法
CN102517274B (zh) 一种制备固定化腈水解酶的方法
RO122364B1 (ro) Procedeu de imobilizare a tripsinei pe suport biopolimeric
US3969436A (en) Carriers for biologically active compounds and methods for the production thereof
Bahar et al. Concanavalin A carrying reactive beads for yeast invertase purification
JP3025947B2 (ja) 乾燥固定化リパーゼ担体の製造方法
CN107224970A (zh) 一种医用临床免疫分析用的分子印迹聚合物微球的制备方法
Rehman et al. Immobilization of Bacillus-Derived Pectinase on Agarose Beads for Improved Catalytic Performance
CN107460186B (zh) 一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant