CN107460186B - 一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用，以糜蛋白酶为模型酶，用十一烯酰氯在磷酸缓冲液中修饰糜蛋白酶，利用硫‑烯点击化学的方法，将聚[3‑巯丙基甲基硅氧烷]、烯烃交联剂、经修饰的糜蛋白酶、光引发剂均匀混合，在紫外环境下光致交联固载化。本发明中固载化催化剂可以通过离心或者过滤的方法回收利用，耐高温性能较好，促多肽合成产率高，相比于原酶，重复利用稳定性有着显著提高。本发明制备方法简单，高效，成本廉价，利于工业上利用酶催化合成。

Description

一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用，属于蛋白酶领域。
技术背景
多肽合成对于医疗、食品行业、科学研究有着至关重要的影响。蛋白酶催化合成多肽，相比于化学法合成多肽有着较多优点，比如高效性、立体专一性、条件温和易控等。原酶催化合成多肽有着诸多限制：(1)在水溶液中有着很高的催化活性，但难于回收利用，酶损失严重；(2)在有机溶剂中，酶的活性会大大降低，甚至于失活，没有实用价值；(3)酶浓度过高时会发生自溶现象。固载化酶不仅易回收利用，并且还能在有机溶剂中保持催化性能，大大简化提纯简化工艺，为大规模连续化生产提供了可能。因此，固载化酶技术的研究成为多肽工业中的研究热点。
利用化学法固载蛋白酶是近些年出现的一种新兴技术，它的主要优点在于固载化酶稳定性好、保持相对活性、固载效率高、易回收利用，适应了未来绿色化学的发展需要，引起了学术界和工业界的广泛关注。
文献(Journal of American Chemical Society,1995,117,4843-4850)报道了一种含有枯草杆菌蛋白酶的聚合物，其制备方法是将含有碳碳双键化合物修饰过后的聚乙二醇衍生物(PEG-A)接到枯草杆菌蛋白酶表面，然后利用热引发剂，在甲苯体系下将修饰后的枯草杆菌蛋白与含有末端烯烃的交联剂(MMA,TMA)发生聚合。含酶聚合物不仅在有机环境下保持高活性，并且在130℃处理后仍保持一定活性。其缺陷在于制备过程难度大，耗时长，原料损耗大。
文献(Chemical Reviews,2004,104,9)报道了交联的酶晶体(CLEC)的制备方法，比如利用丙二醛作为交联剂，利用蛋白酶表面的氨基进行交联制备得到交联酶晶体，其优点在于保持高活性，对pH和温度有着较好的稳定性，易回收，在有机溶剂中稳定等，而其制备过程比较复杂，并且原料耗费高，难以符合工业化要求。
文献(Chemical Communications,2010,46,2256-2258)报道了一种固载了CuCl催化剂的硅橡胶催化剂，其特征制备方法在于将含有末端双键的联吡啶加入聚甲基氢硅氧烷(PMHS)溶液中，通过铂催化的硅氢化反应交联形成硅橡胶，然后溶胀-化学吸附CuCl，实现固载化催化剂的目的。文献(RSC Advances,2015,5,7304)报道了一种固载有机催化剂的聚硅氧烷催化剂，其制备方法是将有机催化剂修饰为带末端双键，然后加入到含有交联剂、光引发剂(DMPA)、硅甲基硅烷(PMMS)混合溶液中，通过紫外引发反应交联形成橡胶，实现了对有机催化剂的固载。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于提供一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用，克服传统固载化酶工艺中固载方法复杂、成本较高、固载效率不好、重复利用率不高等缺点。
技术方案：本发明提供了一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料，该硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的化学通式为：
Figure BDA0001366795050000021
A是糜蛋白酶，B是烯烃交联剂，x:y＝3：7～19。
其中：
所述的烯烃交联剂B的分子结构式为以下任意一种：
Figure BDA0001366795050000022
本发明还提供了一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的制备方法，该方法通过硫-烯点击化学将糜蛋白酶单体用化学键合的方式接硅橡胶上，具体步骤如下：
1)修饰糜蛋白酶：以物质的量计，将1～2份的糜蛋白酶溶于pH为7.5～8.0的磷酸缓冲液中，之后加入含有150～200份十一烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应后经透析、冷冻干燥得到经修饰的糜蛋白酶；
2)将经修饰的糜蛋白酶、烯烃交联剂B、聚[3-巯丙基甲基硅氧烷]和光引发剂均匀混合后，在紫外环境下光致交联固载化，形成含有糜蛋白酶的硅橡胶，之后将该硅橡胶分割成颗粒状，干燥后得到硅橡胶固载化糜蛋白酶材料。
其中：
步骤1)所述反应的时长为12～24h，且用0.1～0.5mol/L的氢氧化钠溶液维持反应过程中溶液的pH在7.5～8.0之间。
步骤1)所述透析是指将反应后的溶液置于分子截留量为8000～12000的透析袋中，在去离子水中透析为12～24h，所述得冷冻干燥条件为-78～-60℃温度下，干燥24～48h。
步骤2)所述紫外环境下光致交联固载化的条件为在350～370nm紫外环境下光照3～5分钟。
步骤2)所述经修饰的糜蛋白酶、烯烃交联剂B、聚[3-巯丙基甲基硅氧烷]和光引发剂之间的质量比为(0.8～1):(2.0～2.5):(0.8～1.2)。
所述的光引发剂为光致自由基引发剂，其分子结构为以下任意一种：
Figure BDA0001366795050000031
步骤2)所述干燥后得到硅橡胶固载化糜蛋白酶材料过程中干燥的温度为20～30℃，时长为6～12h。
本发明还提供了一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的应用，该材料作为催化剂用于催化动力学控制多肽合成。
其中：
所述动力学控制多肽合成过程中，酰基供体为以下任意一种：
Figure BDA0001366795050000032
所述动力学控制多肽合成过程中，亲核试剂为以下任意一种：
Figure BDA0001366795050000041
有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：
①基于硫-烯点击化学的硅橡胶固载化酶，克服了传统化学方法固载化酶工艺中固载效率不高，耗时长，过程复杂，重复利用率低等缺陷。
②相比于游离原酶，本发明的聚硅氧烷固载化酶在常见的有机溶剂保持一定活性，特别在四氢呋喃和正己烷的混合溶剂中可以重复循环利用，客服了原酶有机溶剂中失活的缺陷。
③本发明的聚硅氧烷固载化酶能较为广泛的应用于其他多肽合成体系中，并且有着较高的产率。
④成本低廉，便于工业化生产；而且橡胶酶可以通过离心或者过滤的方法分离，大大便利了工业上促合成多肽。
附图说明
图1是使用固载化酶促合成多肽Bz-Tyr-Phe-NH2的质谱图；
图2是使用固载化酶促合成多肽Bz-Tyr-Tyr-NH2的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明做进一步说明：
实施例1硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的合成
1)以物质的量计，将1份的糜蛋白酶溶于pH为7.5的磷酸缓冲液中。将含有200份十一烯酰氯的二氯甲烷缓慢加入原酶溶液中，反应过程中用0.1mol/L的氢氧化钠溶液维持反应pH在7.5左右，反应24h后透析12h，之后在-78℃冷冻干燥24小时后得到经修饰的糜蛋白酶。
2)以毫克计，将经100毫克修饰的糜蛋白酶、200毫克烯烃交联剂B、100毫克聚[3-巯丙基甲基硅氧烷]和2毫克光引发剂均匀混合后，在在365nm紫外环境下光照3分钟，交联形成含有糜蛋白酶的硅橡胶，将块状硅橡胶分割成颗粒状，在温度为20℃条件下干燥12h，即可获得聚硅氧烷固载化酶颗粒。
实施例2硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的合成
1)以物质的量计，将2份的糜蛋白酶溶于pH为8.0的磷酸缓冲液中。将含有150份十一烯酰氯的二氯甲烷缓慢加入原酶溶液中，反应过程中用0.2mol/L的氢氧化钠溶液维持反应pH在8.0左右，反应12h后透析24h，之后在-60℃冷冻干燥48小时后得到经修饰的糜蛋白酶。
2)以毫克计，将经80毫克修饰的糜蛋白酶、250毫克烯烃交联剂B、80毫克聚[3-巯丙基甲基硅氧烷]和4毫克光引发剂均匀混合后，在350nm紫外环境下光照5分钟，交联形成含有糜蛋白酶的硅橡胶，将块状硅橡胶分割成颗粒状，在温度为30℃条件下干燥6h，即可获得聚硅氧烷固载化酶颗粒。
实施例3硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的合成
1)以物质的量计，将2份的糜蛋白酶溶于pH为7.7的磷酸缓冲液中。将含有200份十一烯酰氯的二氯甲烷缓慢加入原酶溶液中，反应过程中用0.3mol/L的氢氧化钠溶液维持反应pH在7.7左右，反应16h后透析20h，之后在-70℃冷冻干燥36小时后得到经修饰的糜蛋白酶。
2)以毫克计，将经90毫克修饰的糜蛋白酶、230毫克烯烃交联剂B、100毫克聚[3-巯丙基甲基硅氧烷]和9毫克光引发剂均匀混合后，在360nm紫外环境下光照4分钟，交联形成含有糜蛋白酶的硅橡胶，将块状硅橡胶分割成颗粒状，在温度为25℃条件下干燥8h，即可获得聚硅氧烷固载化酶颗粒。
实施例4硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的合成
1)以物质的量计，将2份的糜蛋白酶溶于pH为7.9的磷酸缓冲液中。将含有200份十一烯酰氯的二氯甲烷缓慢加入原酶溶液中，反应过程中用0.5mol/L的氢氧化钠溶液维持反应pH在7.9左右，反应20h后透析16h，之后在-75℃冷冻干燥30小时后得到经修饰的糜蛋白酶。
2)以毫克计，将经100毫克修饰的糜蛋白酶、250毫克烯烃交联剂B、120毫克聚[3-巯丙基甲基硅氧烷]和1毫克光引发剂均匀混合后，在370nm紫外环境下光照4.5分钟，交联形成含有糜蛋白酶的硅橡胶，将块状硅橡胶分割成颗粒状，在温度为28℃条件下干燥10h，即可获得聚硅氧烷固载化酶颗粒。
实施例5硅橡胶固载化糜蛋白酶促合成多肽
硅橡胶固载化糜蛋白酶促合成多肽Bz-Tyr-Phe-NH2的活性以及重复利用性
在10ml的圆底烧瓶中，将0.0315克的
Figure BDA0001366795050000051
0.0656克的
Figure BDA0001366795050000052
溶于正己烷和四氢呋喃的混合溶剂中(体积比为1:1)，然后在反应容器中投入50mg的硅橡胶固载化糜蛋白酶颗粒和磁力搅拌子，充分反应3h。反应结束后将聚硅氧烷固载化酶通过过滤或者离心的方式从反应体系中脱离出来，放置通风厨内干燥。将过滤后的滤液悬干，用甲苯洗2次，再用水洗3次，所得白色固体为多肽Bz-Tyr-Phe-NH2，称量粗产品为420毫克，产率为98％。此过程视为聚硅氧烷固载化酶重复利用一次。重复利用硅橡胶固载化糜蛋白酶4次，得到的产率分别为97％、92％、90％、85％。
实例6：硅橡胶固载化糜蛋白酶促合成多肽
在10毫升的圆底烧瓶中，将0.0315克的
Figure BDA0001366795050000061
0.0724克的
Figure BDA0001366795050000062
溶于甲苯和甲醇的混合溶剂中(体积比为2:1)，然后在反应容器中投入0.05克的硅橡胶固载化糜蛋白酶颗粒和磁力搅拌子，充分反应3小时。反应结束后利用过滤或者离心的方法将聚硅氧烷固载化酶从反映体系分离出来，将滤液用1mmol/L盐酸溶液洗3次，接着利用甲醇和乙酸乙酯重结晶出多肽产品，称量得产率为84％。
实例7：硅橡胶固载化糜蛋白酶促合成多肽
在10毫升的圆底烧瓶中，将0.0235克的
Figure BDA0001366795050000063
0.0565克的
Figure BDA0001366795050000064
溶于甲苯和甲醇的混合溶剂中(体积比为2:1)，然后在反应容器中投入0.05克的硅橡胶固载化糜蛋白酶颗粒和磁力搅拌子，充分反应3小时。反应结束后利用过滤或者离心的方法将聚硅氧烷固载化酶从反映体系分离出来，用层析色谱柱法将产物分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(体积比为2:1)，分离产物为81％。
实例8：硅橡胶固载化糜蛋白酶促合成多肽
在10毫升的圆底烧瓶中，将0.0235克的
Figure BDA0001366795050000065
0.0724克的
Figure BDA0001366795050000066
溶于甲苯和甲醇的混合溶剂中(体积比为2:1)，然后在反应容器中投入0.05克的硅橡胶固载化糜蛋白酶颗粒和磁力搅拌子，充分反应3小时。反应结束后利用过滤或者离心的方法将聚硅氧烷固载化酶从反映体系分离出来，用层析色谱柱法将产物分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(体积比为2:1)，分离产物为81％。
实例9：硅橡胶固载化糜蛋白酶促合成多肽
在10毫升的圆底烧瓶中，将0.0274克的
Figure BDA0001366795050000067
0.0724克的
Figure BDA0001366795050000068
溶于甲苯和甲醇的混合溶剂中(体积比为2:1)，然后在反应容器中投入0.05克的硅橡胶固载化糜蛋白酶颗粒和磁力搅拌子，充分反应3小时。反应结束后利用过滤或者离心的方法将聚硅氧烷固载化酶从反映体系分离出来，用层析色谱柱法将产物分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(体积比为2:1)，分离产物为79％。
实例10硅橡胶固载化糜蛋白酶促合成多肽
在10毫升的圆底烧瓶中，将0.0274克的
Figure BDA0001366795050000071
0.0656克的
Figure BDA0001366795050000072
溶于甲苯和甲醇的混合溶剂中(体积比为2:1)，然后在反应容器中投入0.05克的硅橡胶固载化糜蛋白酶颗粒和磁力搅拌子，充分反应3小时。反应结束后利用过滤或者离心的方法将聚硅氧烷固载化酶从反映体系分离出来，用层析色谱柱法将产物分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(体积比为2:1)，分离产物为84％。

Claims (6)

1.一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料，其特征在于：该硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的化学通式为：
Figure FDA0002545221060000011
其中，A是糜蛋白酶，B是烯烃交联剂，x:y＝3：(7～19)；
其中：所述的烯烃交联剂B的分子结构式为以下任意一种：
Figure FDA0002545221060000012
其中n＝10～20。
2.一种如权利要求1所述的硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的制备方法，其特征在于：该方法通过硫-烯点击化学将糜蛋白酶单体用化学键合的方式连接在硅橡胶上，具体步骤如下：
1)修饰糜蛋白酶：以物质的量计，将1～2份的糜蛋白酶溶于pH为7.5～8.0的磷酸缓冲液中，之后加入含有150～200份十一烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应后经透析、冷冻干燥得到经修饰的糜蛋白酶；
2)将经修饰的糜蛋白酶、烯烃交联剂、聚[3-巯丙基甲基硅氧烷]和光引发剂均匀混合后，在紫外环境下光致交联固载化，形成含有糜蛋白酶的硅橡胶，之后将该硅橡胶分割成颗粒状，干燥后得到硅橡胶固载化糜蛋白酶材料；
其中步骤1)所述反应的时长为12～24h，且用0.1～0.5mol/L的氢氧化钠溶液维持反应过程中溶液的pH在7.5～8.0之间；
步骤2)所述经修饰的糜蛋白酶、烯烃交联剂、聚[3-巯丙基甲基硅氧烷]和光引发剂之间的质量比为(0.8～1):(2.0～2.5):(0.8～1.2)；
步骤2)所述干燥后得到硅橡胶固载化糜蛋白酶材料过程中干燥的温度为20～30℃，时长为6～12h。
3.如权利要求2所述的一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的制备方法，其特征在于：步骤1)所述透析是指将反应后的溶液置于分子截留量为8000～12000的透析袋中，在去离子水中透析为12～24h，所述得冷冻干燥条件为-78～-60℃温度下，干燥24～48h。
4.如权利要求2所述的一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的制备方法，其特征在于：步骤2)所述紫外环境下光致交联固载化的条件为在350～370nm紫外环境下光照3～5分钟。
5.如权利要求2所述的一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的制备方法，其特征在于：所述的光引发剂为光致自由基引发剂，其分子结构为以下任意一种：
Figure FDA0002545221060000021
6.一种如权利要求1所述的硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的应用，其特征在于：该材料作为催化剂用于催化动力学控制多肽合成。
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CN105312039A (zh) * 2014-07-17 2016-02-10 中国科学院大连化学物理研究所 一种β-环糊精功能化手性固定相及其制备和应用

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