CN102517274B - 一种制备固定化腈水解酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备固定化腈水解酶的方法，属于固定化酶技术领域。本发明以市售腈水解酶为原料，市售赖氨酸-大孔离子交换树脂为载体，经固定、抽滤、洗涤的简单工艺制得成品。本发明方法简单易行，反应条件温和，设备简单易得，无“三废”排放，充分利用物质资源，生产成本低，便于推广应用；本产品空间位阻效应小，热稳定性高，使用范围广，使用寿命长。本发明可广泛应用于制备固定化酶，采用本发明方法制备出的产品，可广泛应用于生物降解、生物修复、医药、化工、农业等行业中。
Description
一、技术领域
本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及以市售赖氨酸-大孔离子交换树脂为载体，制备固定化腈水解酶的方法。
二、背景技术
固定化酶是一种新型生物催化剂，是水溶性酶经物理或化学方法处理后，束缚于水不溶性载体的、具有酶催化特性的酶衍生物。与只能使用一次的游离酶相比较，固定化酶既具有游离酶的催化特性，又具有稳定性好、可反复利用等优点，还可实现生产工艺的连续化、自动化，是生物催化剂的主要发展方向。腈水解酶是一种具有广泛底物适应性的生物催化剂，可催化腈水解生成相应的羧基酸，实现一般化学反应不具备的化学、区域和立体选择性，用于制备手性化合物产品；也用于纺织品整理工艺，能改善织物的外观与手感；此外，在降解腈类农药方面的应用相当广泛。
现有的制备固定化腈水解酶的工艺，例如2011年7月13号公开的公开号为CN102120994的“一种腈水解酶产生菌的细胞固定化方法”专利，公开的方法是：先制备出腈水解酶产生菌菌液，再经离心、洗涤、灭菌、固定化而制备出产品。该方法的主要缺点是：以细胞作为固定化载体，固定化腈水解酶分布于细胞内，由于死亡细胞没有发达的孔穴，物质传递阻力大，酶反应速度低；细胞的刚性也差，易破碎，半衰期短；加之细胞体积小，难与溶液分离。因此，该固定化酶的应用效果差、成本高，不利于可持续发展。
三、发明内容
本发明的目的是针对现有制备固定化腈水解酶工艺的不足之处，提供一种制备固定化腈水解酶的方法，该方法具有反应条件温和，酶活力回收较高，固定化酶半衰期长，操作简单，成本较低，清洁安全，保护环境等特点。
本发明的原理是：经赖氨酸修饰的大孔离子交换树脂，通过交联剂戊二醛分别与赖氨酸残基及酶表面的氨基反应，形成固定化酶。
实现本发明的目的技术方案是：一种制备固定化腈水解酶的方法，以市售腈水解酶为原料，以市售赖氨酸-大孔离子交换树脂为载体，经固定、抽滤、洗涤的简单工艺，制备出固定化腈水解酶产品。其具体的方法步骤如下：
(1)腈水解酶的预处理
以市售腈水解酶为原料，按照市售腈水解酶的质量(g)：缓冲溶液的体积(mL)比为1∶8～10的比例，将市售腈水解酶加入到缓冲溶液中，搅拌溶解30～40分钟后再泵入抽滤机中，进行抽滤，分别收集抽滤液和抽滤渣。对于收集的抽滤液，用于制备固定化腈水解酶；对于收集的抽滤渣，烘干后用做添加动物饲料。其中，所述的缓冲溶液为pH8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液或pH9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液或pH10.8的硼砂-碳酸钙缓冲溶液。
(2)制备固定化腈水解酶粗品
第(1)步完成后，按照市售赖氨酸-大孔离子交换树脂载体的质量(g)：第(1)步收集的抽滤液的体积(mL)：戊二醛质量浓度为25％的戊二醛溶液的体积(mL)比为1∶2～3∶0.5～0.8的比例，先将赖氨酸-大孔离子交换树脂载体加入缓冲溶液中，浸泡2～3小时，再加入第(1)步收集抽滤液和戊二醛溶液，搅拌均匀后，升温至30～45℃，恒温反应6～7小时，进行固定化酶反应。反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液。对于收集的抽滤渣，即为制备固定化腈水解酶粗品，用于下一步制备固定化腈水解酶；对于收集的抽滤液，用于再生处理。其中，所述的缓冲溶液为pH8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液或pH9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液或pH10.8的硼砂-碳酸钙缓冲溶液。
(3)制备固定化腈水解酶
第(2)步完成后，按照第(2)步收集的抽滤渣的质量(g)：蒸馏水的体积(mL)之比为1∶4～5的比例，用蒸馏水对抽滤渣进行洗涤，除去夹杂的游离腈水解酶和戊二醛，分别收集洗涤渣和洗涤液。对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化腈水解酶，放置于4～6℃下保存备用；对于收集的洗涤液，泵入生化处理池、进行生化处理，达标后排放。
(4)再生处理
第(3)步完成后，将第(2)步收集的抽滤液，泵入截留分子量为1000～5000Da的纳滤器中，在压力为0.1～0.4MPa的条件下，进行纳滤，除去腈水解酶的硼砂缓冲溶液，直至纳滤截留液体积减少至原体积的10～30％时寸止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液。对于收集的纳滤滤过液即为回收的缓冲溶液，经调节pH值后可再次用于第(1)步溶解市售腈水解酶；对于收集的纳滤截留液，泵入生化处理池、进行生化处理，达标后排放。
本发明主要有以下效果：
(1)本发明方法充分利用了赖氨酸修饰的大孔离子交换树脂上修饰的赖氨酸作为“柔性手臂”，实现了在“柔性手臂”上固定化腈水解酶，削弱了大孔离子交换树脂疏水骨架对腈水解酶构象的扰动，也消除了树脂微孔壁直接固定化酶产生的空间位阻效应，还扩大了固定化腈水解酶催化的空间范围。
(2)本发明制备的固定化腈水解酶热稳定性高，使用范围广，连续使用5次后还保持高达85％的活力，显著延长了腈水解酶的使用寿命，生产成本低，有利于可持续发展。
(3)本发明具有方法操作简单易行、反应条件温和、设备通用易得、无“三废”排放、物料能循环回收利用，资源利用率高等特点，进一步降低生产成本，便于推广应用，是一种绿色环保、安全无毒的生产方法。
本发明可广泛应用于制备固定化腈水解酶，采用本发明方法制备出的产品，可广泛应用于手性或化学化学品制备、生物修复、医药、化工、农业等行业中。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种制备固定化腈水解酶的方法，具体方法步骤如下：
(1)腈水解酶的预处理
以市售腈水解酶为原料，按照市售腈水解酶的质量(g)：缓冲溶液的体积(mL)比为1∶10的比例，将市售腈水解酶加入到缓冲溶液中，搅拌溶解40分钟后再泵入抽滤机中，进行抽滤，分别收集抽滤液和抽滤渣。对于收集的抽滤液，用于制备固定化腈水解酶处理；对于收集的抽滤渣，烘干后用做添加动物饲料。其中，所述的缓冲溶液为pH值为8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液。
(2)制备固定化腈水解酶粗品
第(1)步完成后，按照市售赖氨酸-大孔离子交换树脂载体的质量(g)：第(1)步收集的抽滤液的体积(mL)：戊二醛质量浓度为25％的戊二醛溶液的体积(mL)比为1∶2∶0.5的比例，先将赖氨酸-大孔离子交换树脂载体加入缓冲溶液中，浸泡2小时，再加入第(1)步收集抽滤液和戊二醛溶液，搅拌均匀后，升温至30℃，恒温反应6小时，进行固定化酶反应。反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液。对于收集的抽滤渣，即为制备固定化腈水解酶粗品，用于下一步制备固定化腈水解酶；对于收集的抽滤液，用于再生处理。其中，所述的缓冲溶液为pH值为8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液。
(3)制备固定化腈水解酶
第(2)步完成后，按照第(2)步收集的抽滤渣的质量(g)：蒸馏水的体积(mL)之比为1∶4的比例，用蒸馏水对抽滤渣进行洗涤，除去夹杂的游离腈水解酶和戊二醛，分别收集洗涤渣和洗涤液。对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化腈水解酶，放置于4℃下保存备用；对于收集的洗涤液，泵入生化处理池、进行生化处理，达标后排放。
(4)再生处理
第(3)步完成后，将第(2)步收集的抽滤液，泵入截留分子量为1000Da的纳滤器中，在压力为0.1MPa的条件下，进行纳滤，除去腈水解酶的硼砂缓冲溶液，直至纳滤截留液体积减少至原体积的10％时止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液。对于收集的纳滤滤过液，即为回收的缓冲溶液，经调节pH值后可再次用于第(1)步溶解市售腈水解酶；对于收集的纳滤截留液，泵入生化处理池、进行生化处理，达标后排放。
实施例2
一种制备固定化腈水解酶的方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，市售腈水解酶的质量：缓冲溶液的体积比为1g∶9mL，搅拌溶解35分钟，其中，所述的缓冲溶液为pH值为9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液。
第(2)步中，市售赖氨酸-大孔离子交换树脂载体的质量：第(1)步收集的抽滤液的体积：戊二醛质量浓度为25％的戊二醛溶液的体积比为1g∶2.5mL∶0.7mL，在缓冲溶液浸泡2.5小时，升温至35℃，恒温反应6.5小时，其中，所述的缓冲溶液为pH值为9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液。
第(3)步中，第(2)步收集的抽滤渣的质量：蒸馏水的体积之比为1g∶4.5mL，收集的洗涤渣，置于5℃下保存。
第(4)步中，纳滤器的截留分子量为3000Da、压力为0.3MPa，直至纳滤截留液体积减少至原体积的20％时止。
实施例3
一种制备固定化腈水解酶的方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，市售腈水解酶的质量：缓冲溶液的体积比为1g∶8mL，搅拌溶解30分钟，其中，所述的缓冲溶液为pH值为10.8的硼砂-碳酸钙缓冲溶液。
第(2)步中，市售赖氨酸-大孔离子交换树脂载体的质量：第(1)步收集的抽滤液的体积：戊二醛质量浓度为25％的戊二醛溶液的体积比为1g∶3mL∶0.8mL，在缓冲溶液浸泡3小时，升温至45℃，恒温反应7小时，其中，所述的缓冲溶液为pH值为10.8的硼砂-碳酸钙缓冲溶液。
第(3)步中，第(2)步收集的抽滤渣的质量：蒸馏水的体积之比为1g∶5mL，收集的洗涤渣，置于6℃下保存。
第(4)步中，纳滤器的截留分子量为5000Da、压力为0.4MPa，直至纳滤截留液体积减少至原体积的30％时止。
五、实验结果
用实施例2制备出的固定化腈水解酶和市售的游离腈水解酶进行对比实验，即进行了酶的最适催化温度、最适催化pH值、使用次数实验，其结果如下：
根据上述试验结果知：
①采用本发明方法制备出的固定化腈水解酶的最适催化温度为45℃，比游离腈水解酶提高5℃，热稳定性比游离腈水解酶高。
②采用本发明方法制备出的固定化腈水解酶的最适催化pH值为5.25，比游离腈水解酶降低了4.35，扩大了固定化腈水解酶的使用范围。
③采用本发明方法制备出的固定化腈水解酶使用次数的大大增加，使固定化腈水解酶的利用效率得到了提高，降低了污染，充分利用资源。
Claims (1)
1.一种制备固定化腈水解酶的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：
(1)腈水解酶的预处理
以市售腈水解酶为原料，按照市售腈水解酶的质量：缓冲溶液的体积比为1g∶8～10mL的比例，将市售腈水解酶加入到缓冲溶液中，搅拌溶解30～40分钟后再泵入抽滤机中，进行抽滤，分别收集抽滤液和抽滤渣，其中，所述的缓冲溶液为pH8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液或pH9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液或pH10.8的硼砂-碳酸钙缓冲溶液；
(2)制备固定化腈水解酶粗品
第(1)步完成后，按照市售赖氨酸-大孔离子交换树脂载体的质量：第(1)步的收集抽滤液的体积：戊二醛质量浓度为25％的戊二醛溶液的体积比为1g∶2～3mL∶0.5～0.8mL的比例，先将赖氨酸-大孔离子交换树脂载体加入缓冲溶液中，浸泡2～3小时，再加入第(1)步收集抽滤液和戊二醛溶液，搅拌均匀后，升温至30～45℃，恒温反应6～7小时，进行固定化酶反应，反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液，其中，所述的缓冲溶液为pH8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液或pH9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液或-pH10.8的硼砂-碳酸钙缓冲溶液；
(3)制备固定化腈水解酶
第(2)步完成后，将第(2)步收集的抽滤渣，按照抽滤渣的质量：蒸馏水的体积之比为1g∶4～5mL的比例，用蒸馏水对抽滤渣进行洗涤，分别收集洗涤渣和洗涤液，对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化腈水解酶，放置于4～6℃下保存；
(4)再生处理
第(3)步完成后，将第(2)步收集的抽滤液，泵入截留分子量为1000～5000Da的纳滤器中，在压力为0.1～0.4MPa的条件下，进行纳滤，直至纳滤截留液体积减少至原体积的10～30％时止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液。
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