CN1234074A - 用腈水解酶制备2－羟基－4－甲硫基丁酸的方法 - Google Patents

用腈水解酶制备2－羟基－4－甲硫基丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明的主题是一种通过酶水解2－羟基－4－甲硫基丁腈制备2－羟基－4－甲硫基丁酸和/或其铵盐的方法,其特征在于:a)第一步,制备具有腈水解酶活性的生物材料,b)第二步,将其固定化,c)第三步,将2－羟基－4－甲硫基丁腈与如此固定化的生物材料接触,以获得2－羟基－4－甲硫基丁酸的铵盐,d)第四步,必要时将c)步所得盐转变成相应的酸,及e)第五步,浓缩c)或d)步中所得产物。

Description

用腈水解酶制备2-羟基-4-甲硫基丁酸的方法
本发明涉及2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMTBA)和/或其铵盐(HMTBS)的一种新制备方法。
长期以来2-羟基-4-(甲硫基)丁酸和其盐已代替甲硫氨酸用于动物饲料。与甲硫氨酸相比，其优点是呈液态，便于食品生产商的利用。
通过化学途径制备2-羟基-4-(甲硫基)丁酸是人们长久以来已知的。例如可举出专利EP142488、EP-143000，其中描述了一种水解2-羟基-4-甲硫基羟丁腈(HMTBN)的两步法。第一步是将2-羟基-4-甲硫基丁腈与强无机酸如盐酸或硫酸接触。第二步，用水稀释后，升温完全水解。然后用与水溶混性差的有机溶剂如酮(优选甲基异丁基酮)萃取2-羟基-4-(甲硫基)丁酸，再蒸发除去溶剂。但此类方法用于工业规模存在一些缺陷。其中产生至少与所引入腈的摩尔量相等的硫酸铵，后者要被除去，这产生了与环境保护政策相违背的工业消耗。该方法还需要使用大量绝对需要回收再利用的溶剂。
如在专利US3773927和4353924中描述的其他方法是用盐酸水解2-羟基-4-甲硫基丁腈，然后浓缩介质，分离所形成的氯化铵。所得的盐与前述盐一样难以除去，另外所得的酸具有强着色现象。
专利EP330521中也描述了甲硫基羟基丁腈的一种化学水解方法，如前述方法，该水解是在硫酸介质中进行。用氨部分中和反应混合物，两相分离。有机相含有大部分2-羟基-4-甲硫基丁酸，水相含有大部分所产生的硫酸铵。蒸发所含的水后，过滤有机溶液以回收溶解的硫酸铵。然后用少量水稀释2-羟基-4-甲硫基丁酸，用少量硫酸稳定化。除去水后，从水溶液可获得可以直接出售的硫酸铵。该方法部分解决了现有技术关于使用有机溶剂的缺点，但没有解决与丢弃无机盐有关的任何问题。
在与2-羟基-4-甲硫基丁酸盐相关的专利中，可举出涉及其钙盐和/或铵盐的专利US2745745、2938053和3175000。2-羟基-4-甲硫基丁腈水解得到的混合物用氢氧化钙或碳酸钙处理。然后硫酸钙沉淀并释放出氨，后者形成2-羟基-4-甲硫基丁酸的铵盐。这里同样有要除去生成的硫酸钙的问题。
在专利申请WO96/01808中也描述了一种方法，同所引的第一篇现有技术文件中那样进行水解和有机溶剂萃取，然后用氨中和有机溶液。与前述大部分方法一样，该方法导致每摩尔引入的腈形成至少一摩尔的硫酸铵或氯化铵，并且必须回收大量的有机溶剂。该方法不能以有利的工业价格获得2-羟基-4-甲硫基丁酸的铵盐溶液。
另外还在WO96/09403中描述了一种腈水解酶作为催化剂用于将腈基团水解成羧基。但在该文献中描述的方法不能用于工业规模，因为合成这些腈水解酶的微生物活性不足。
现发现，由于本发明的可实施多个特异步骤的方法，可以在工业规模上通过酶途径以高收率获得2-羟基-4-甲硫基丁酸和/或其铵盐，而不使用溶剂且不同时产生无机盐。
本发明的主题是一种通过酶水解2-羟基-4-甲硫基丁腈制备2-羟基-4-甲硫基丁酸和/或其铵盐的方法，其特征在于：
a)第一步，制备具有腈水解酶活性的生物材料，
b)第二步，将其固定化，
c)第三步，将2-羟基-4-甲硫基丁腈与如此固定化的生物材料接触，以获得2-羟基-4-甲硫基丁酸的铵盐，
d)第四步，必要时将c)步所得盐转变成相应的酸，及
e)第五步，浓缩c)或d)步中所得产物。
在以下的说明中将详细解释本发明，其中将参照附图：
-图1是用于非必需步骤d)的电透析池的示意图；图1A是有双极膜和三个室的电透析池；图1B是有双极膜和两个室的电透析池。
-图2是用于实施本发明方法的一种设备的示意图。
-图3是质粒pRPA-BCAT1至5的限制性酶切图谱。
-图4是含编码本发明腈水解酶活性多肽的DNA序列(图中称为nitB)的1130pb片段的测序策略。图中数字及M13FWD和M13REV代表用于测序的引物。
-图5是质粒pRPA-BCAT12和pRPA-BCAT13的限制性酶切图谱。
-图6表示在10％SDS-PAGE凝胶上的电泳，表明本发明DNA序列在菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pRPA-BCAT12、BL21(DE3)/pRPA-BCTA13、BL21(DE3)/pRPA-BCAT12+pXL2231、BL21(DE3)/pRPA-BCAT13+pXL2231中的表达。每个泳道相应于10μg量的可溶性蛋白和相当体积的粗提物和不溶物。
-图7表示在10％SDS-PAGE凝胶上的电泳，表明本发明DNA序列在菌株大肠杆菌DH5α/pRPA-BCAT3、DH5α/pRPA-BCAT6、DH5α/pRPA-BCAT6+pXL2035、RPA-BIOCAT76中的表达。每个泳道相应于10μg量的可溶性蛋白和相当体积的粗提物和不溶物。
-图8是质粒pRPA-BCAT14的限制性酶切图谱。
-图9表示在10％SDS-PA凝胶上的电泳，表明本发明DNA序列在菌株恶臭假单胞菌G2081(pRPA-BCAT14)、G2081(pRPA-BCAT23)、G2081(pRPA-BCAT24)、粪产碱菌ATCC8750(pRPA-BCAT14)、粪产碱菌ATCC8750(pRPA-BCAT23)、粪产碱菌ATCC8750(pRPA-BCAT24)中的表达。每个泳道相应于10μg量的可溶性蛋白和相当体积的粗提物和不溶物。
-图10是质粒pCGL1087的限制性酶切图谱。
-图11是质粒pOS48.7的限制性酶切图谱。
第一步是制备具有腈水解酶活性的生物材料。
这种生物材料可以是酶本身的溶液或具有腈水解酶活性的完整或破碎的细胞。
有利的是使用表达一种腈水解酶的微生物。
这种腈水解酶特别来自一种微生物，尤其是产碱菌属(Alcaligenes)、红球菌属(Rhodococcus)、或Gordona属的微生物，特别是粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、红球菌HT 29-7、Gordonaterre，优选WO96/09403中描述的菌株。
有利的是使用如下获得的表达腈水解酶活性的微生物：将亲代微生物编码腈水解酶的遗传信息转移至宿主微生物中。特别在大肠杆菌中，可以利用陪伴蛋白Gro ESL的共表达来改善重组菌株的性能。
为此，可以使用任何适当的表达载体，特别是质粒载体。
此时所使用的核苷酸序列将被置于允许其在细胞宿主中表达的信号控制之下。所用的细胞宿主可选自原核系统，如革兰氏阳性或阴性菌，或真核系统，如酵母、真菌，或其他系统。控制多肽表达的信号根据所用的细胞宿主选择。为此，编码腈水解酶的DNA可插入在所选宿主中自主复制的载体中，或所选宿主的整合性载体中。这些载体按本领域技术人员常用的方法制备，并用标准方法如电穿孔将生成的构建体引入适当的宿主中。
作为微生物宿主，特别可以举出粪产碱菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、大肠杆菌(Escherichia coli)或芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)的微生物。
用于大肠杆菌中表达的优选载体是质粒pRPA-BCAT6。
本方法的第二步是将生物材料固定化。这种固定化有利地在一种固体载体存在下进行，使得能够得到其大小、形状和机械抗性可控制的颗粒。该步中还可以同时使用聚氮杂环丁烷聚合物和其他交联剂。
该固定化方法可以使用完整的或通透化的细胞。还可以应用无细胞的酶溶液。
用于固定化的酶是腈水解酶。
固定化方法是通过化学试剂与生物材料和载体的胺官能团(NH2,NH)、羧基(COOH)、羟基(OH)、巯基(SH)或酰胺(CONH2)反应将活性生物材料固定在固体载体上，固体载体的粒度特别为1μM-3mm，优选10μM-2mm。这些化学试剂还可以使生物材料和载体变得在水中不溶。所得的物团很有可塑性(maleable)，可成形以获得具有理想形状和大小的颗粒。然后通过干燥获得这些颗粒的内聚力和硬度。
待固定的生物材料可以任选性地另外含有0～200％(重量)的无活性生物材料。这些无活性的生物材料可以是蛋白质(白蛋白、明胶)或多糖(脱乙酰壳多糖、k-角叉菜胶、藻酸)。
用于在其上沉集生物材料和聚合物的隋性载体可以是有机或无机的、多孔或无孔的、亲水或疏水的颗粒。在这些颗粒中，可以非限制性地举出：
-离子交换树脂，
-氧化铝，
-合成二氧化硅或硅藻类及硅胶，
-沸石，
-炭，
-在水中不溶的蛋白质，如谷蛋白，
-多糖，如淀粉。
隋性载体可以以生物材料的0.01～500％(重量)，优选10～200％的比例加入。
用于固定生物材料的化学试剂可以是与官能团胺(NH2,NH)、羧基(COOH)、羟基(OH)、巯基(SH)、酰胺(CONH2)反应的双官能团聚合物或分子。可举出：
-聚氮杂环丁烷聚合物，
-聚乙烯亚胺聚合物，
-异氰酸酯聚合物，
-藻酸盐胶体，
-k-角叉菜胶，
-诸如六亚甲基二胺的胺，
-诸如戊二醛的醛，
-诸如己二酸的羧酸，及
-异氰酸酯。
固定化方法可以使用这些化学试剂中的一种或多种。化学试剂按生物材料和载体的1～50％(重量)的浓度加入。优选的是在5～30％(重量)之间，以获得足够坚固、保留大部分活性并且不带来太多内部扩散问题的颗粒。
交联处理的持续时间为0.5～24小时。
该方法的温度一般在4～65℃。优选的温度在20～40℃。所采用的固定化温度很大程度上还取决于所用生物材料的稳定性。
固定化期间的pH保持在5～11。优选的pH在6～10，更优选偏碱的pH。还要根据生物材料的耐受性选择pH值，本领域技术人员易于确定这种pH。
这种生物催化剂的成形应适于其在任何系统中的应用，如在固定床中。
一种成形方法是挤出。为此，加入一种或多种化学试剂交联生物材料和载体。处理后，过滤回收不溶性物质，或絮凝后过滤收集。优选干物质的百分率为至少10％。然后将该物团挤出。通过这种方法，优选得到直径0.3～0.5mm，长1～10mm的细长丝。这些细长丝然后可制成球状。然后干燥所得颗粒。
成形的另一方法是喷雾包衣。为此，将生物材料与一种或多种化学试剂混合。反应后，将混合物喷雾于载体上形成一薄层。通过这种方法，可得到平均直径0.1～2mm的颗粒。
所得的颗粒然后可视情况浸入还原剂的溶液中，如硼氢化钠，以还原在交联中形成的亚胺官能团。
所得的颗粒足够坚固并耐磨耗，以便用于固定床、流化床或带搅拌的反应器中。
本发明方法的第三步是在一个或多个柱或反应器中使用固定化的生物材料。该步骤的目的是从2-羟基-4-甲硫基丁腈连续地产生2-羟基-4-甲硫基丁酸的铵盐。
向该柱或反应器中提供2-羟基-4-甲硫基丁腈的纯溶液或稀释溶液，或含有2-羟基-4-甲硫基丁腈和2-羟基-4-甲硫基丁酸铵盐的混合物。
该柱或反应器优选在10-60℃间的温度和pH5-9下进行反应。
按本发明的第一种实施方式，实施系统可由两个或多个相互串联的柱组成，在第一个柱的柱头上提供2-羟基-4-甲硫基丁腈的水溶液，而同时对其他柱供给其量以在反应混合物中的溶解度为限的2-羟基-4-甲硫基丁腈的溶液；该系统称为多级系统。按本发明的第二种实施方式，使用在一循环环路中的一个或相互并联的多个柱。按此系统，2-羟基-4-甲硫基丁腈水溶液被连续供给该回路，以保持回路中体积恒定的方式连续泵入反应介质；该系统称为环形系统。
本发明中所用反应器的类型可以是固定床型、流动床型或连续的搅拌型。优选使用固定床型反应器，因为它减少了固定化细胞可能遇到的磨耗问题。如果使用微生物本身，优选使用与超滤组件偶联的搅拌型反应器，以便以连续方式将微生物与目标产物分离。
第四步是一个非强制性步骤，为2-羟基-4-甲硫基丁酸的铵盐转变成相应的酸。该步可按下列两种方法实施：
-用具有两个或三个室的电透析器进行电透析，
-或加热该水溶液，然后可进行液/液萃取。
按电透析法，其中使用具有两个或三个室的电透析器。
“室”指两个膜之间的空间，即一个双极膜和一个无极膜之间或两个相邻的无极膜之间的空间。“池”指两个或三个室的总和。一“堆”包含5～300个池。“电透析器”由一个堆组成，当然包括一个阴极和一个阳极。
可用于本发明的无极膜根据其制造方式分成两大类。
例如，可使用那些从离子交换树脂制得的非均一性膜，与诸如聚氯乙烯、聚乙烯等的粘合剂混合。所形成的混合物可搽在诸如聚酯或聚丙烯腈织物的纬纱上。
也可以使用通过化学或放射化学接枝将功能团引入惰性载体上而获得的均一性膜。最常用的化学方法一般是将含有芳核(如苯乙烯/二乙烯苯或苯乙烯/丁二烯)的聚合物乳胶官能化。如此官能化的乳胶随后可用于搽在如非均一性膜所用的纬纱上。放射化学方法一般包括在一种射线影响下将一种芳香化合物如苯乙烯接枝在惰性载体上，如聚乙烯或聚四氟乙烯膜上。然后，将芳核如在化学方法中那样官能化。
阳离子交换膜包含强酸基团(最常见的是磺酸基团)或弱酸基团(常为羧酸基团)。比较少见的是，以PO3 2-、HPO2 -、AsO3 2-、SeO3 -作为酸基团。
阴离子交换膜包含强碱基团(最常见的是季铵基团)或弱碱基团(最常见的是胺基团)。比较少见的可用季鏻基团或锍基团作为碱性基团。
在本发明的方法中，阳离子膜优选含有强酸基团，其中优选磺酸基团；阴离子膜优选包含强碱性基团，其中有季铵基团。
双极膜是两种膜(一个阳离子膜，一个阴离子膜)的组合。当该膜被置于足够的电场中时，膜介面的溶剂化水解离成H+和OH-离子，它们分别穿过阳离子面向阴极迁移，穿过阴离子面向阳极迁移。作为双极膜的实例，可举出由Aqualytics、Tokuyama Soda或FuMaTech公司出售的膜。
电透析器的阳极可由常规用于电透析的材料构成，例如包覆有贵金属或贵金属氧化物的石墨、镍或钛，特别是镀铂的钛。阴极也可以由常规用于电透析的材料构成，例如石墨、不锈钢或镍。
向电透析器中供入待处理的水溶液。还需要向阳极循环阳极电解液、向阴极循环阴极电解液。还可以使用单一电解质溶液。在本方法中，电解质的单一环路特别适合。电解质溶液的作用是保证足够的电导率。优选，该电导率等于或大于20毫西门子/厘米(mS/cm)，但该上限不应认为对实施本方法是关键的。
所用的电解质是可电离的化合物，如盐、酸或碱。电解质优选选自非电解活性的化合物。例如，优选使用中性盐如硫酸盐、酸如硫酸、碱如氢氧化钠。
施加的电流密度一般在0.2～1.5kA/m2，优选在0.4～1kA/m2。
实施本发明方法的温度位于与膜稳定性相适应的范围内。优选在30～60℃间的温度下操作。
电透析器可以按不同的方式运行。首先可以连续运行，待处理的溶液连续穿过“堆”；如果由于所达到处理率的需要，可以串联设置多个阶段。也可以不连续地运行，待处理的溶液在一容器中循环直到获得所希望的处理率。最后还可以用直接通道加上部分循环来运行。
按照本发明的第一种方案，可以在如图1A所示的具有双极膜和三个室的电透析池中进行铵盐向2-羟基-4-(甲硫基)丁酸和氨的解离。
适于实施本发明方法的电透析器由不同的室构成，这些室分别由阳离子膜(MC)、双极膜(MB)和阴离子膜(MA)间隔而成。这些室分成盐室(S)、碱(B)和酸(A)室，盐室中待分离化合物逐渐减少，碱和酸室中分别浓集从盐生成的酸和碱。
铵盐被引入在盐室中。在电场的作用下，铵离子从其所在的室(S)出发穿过阳离子交换膜(阳离子膜)向阴极迁移，并与来自双极膜阴离子面的OH-结合，在双极膜中在电场的作用下进行水的解离。
同时，2-羟基-4-甲硫基丁酸根离子从其所在的室(S)出发穿过阴离子交换摸(阴离子膜)向阳极迁移。在经过下一个室(A)后，它们被来自双极膜阳离子面的H+离子质子化。相邻的三个室(B)、(A)、(S)形成了一个电透析池。
在本发明的第二个实施方案中，2-羟基-4-甲硫基丁酸的再生可以在如图1B所示的具有双极膜和两个室的电透析池中进行。这两个室分别由阳离子膜和双极膜间隔而成。这些室分成盐/酸室(S/A)和碱室(B)。
将铵盐引入在盐/酸室中。在电场的作用下，铵离子从其所在的室(S/A)出发穿过阳离子交换膜(阳离子膜)向阴极迁移，并与来自双极膜阴离子面的OH-离子结合，在双极膜中在电场的作用下进行水的解离。
同时，S/A室被来自双极膜阳离子面的H+离子酸化。相邻的两个室(B)和(S/A)形成一个电透析池。
这种形式具有耗能少和能改变所希望的盐/酸比例的优点。
为了很好地发挥电透析器的功能，碱室(及三室形式中的酸室)的电导率应足够，并可通过加入支持电解质来调节。例如，氨溶液的电导率可通过加入铵盐(如硫酸铵)来提高。
在本发明的一个优选实施方案中，使用2-羟基-4-甲硫基丁酸铵。
本发明的一种可预见的具体实施方案是，在三室电透析池的盐室中加入2-羟基-4-甲硫基丁酸铵盐和2-羟基-4-甲硫基丁腈的混合物。盐将如前所述被解离成2-羟基-4-甲硫基丁酸根和铵离子，前者向阳极迁移并被转变成2-羟基-4-甲硫基丁酸，后者向阴极迁移并被转变成氨，在盐室中有水和未转化的2-羟基-4-甲硫基丁腈继续存在，并被再循环至水解柱。
按照加热方法，通过加热富含HMTBS的水溶液使铵盐-游离酸的平衡迁移并放出所释放的氨，从而回收酸。这可以通过在真空下或大气压下加热并加或不加汽提处理来实现。为了有利于平衡的迁移，可预见使用一定压力的CO2。这样得到HMTBA和HMTBS的混合物，按HMTBA和HMTBS的总量计，其中有5～99％的HMTBA，优选10～50％的HMTBA。这些溶液25℃的粘度为1200～30mm2/s(1200～30cSt)，优选为200～50mm2/s(200～50cSt)。
这些水溶液可以通过用与水部分溶混或不溶混的溶剂萃取酸而被分解。存在大量的可用于这种分离的溶剂。优选的溶剂中C5-C8的酮，特别是甲基异丁基酮；醚如异丙基醚；醇如异丙醇；酯；叔胺如三辛胺。在本发明中，优选的溶剂是：丙酮、MIBK、异丙醇、乙酸异丙酯、异丙基醚或丙基醚或THF、三辛胺。水相和有机相的比例不是关键。但出于效率的原因，不应低于1/1的最低比，为了收率的原因，不应超过1/3的比例。优选为1/1.5-2.0的比例。
这种萃取可以在任何类型的液/液萃取工艺中分批或连续进行。例如可以举出共流或逆流的混合器一倾析器级联、离心萃取器、装填柱或塔板柱等。
已减少了游离酸的水溶液可重新处理，可重复任何次，如果希望可直到彻底耗尽氨。
处理有机相以分离HMTBA。这优选经溶剂蒸发或热水萃取来实现。为避免对HMTBA可能的破坏，可以通过施加真空将热刺激保持在最低。
在这两种铵盐的解离方法中，都生产了一种氨水溶液。可处理后者以便浓缩氨。优选用蒸馏法，经一步或多步在加压或不加压下浓缩氨。可预见一种汽提的预处理步骤。浓缩的氨溶液可以返回到氢氰酸的合成中，后者重新在2-羟基-4-甲硫基丁腈的合成中起作用。
第五步，浓缩HMTBS和/或游离酸的水溶液。这优选通过蒸发水来实现。
本发明还涉及用于实施本发明方法的设备。在图2中描绘了一种这样的设备，其包括用于向反应器3中分别导入羟基腈AMTP和水的导管1、2。反应器3是一个装有固定化菌株或酶的循环固定床。部分溶液从反应器3中放出，并被运送至第二反应器4中。第二反应器4是装有固定化菌株或酶的固定床。通过导管5从反应器4的出口回收富含HMTBS的溶液。
该富含HMTBS的溶液根据所希望的终产物类型可接受两种完全独立的处理。
如果想回收含有高比例HMTBS的产物，将来自导管5的溶液引入蒸发器6中，它能浓缩该产物并在导管8中回收一种主要由HMTBS组成并含少量游离酸的浓缩溶液。多余的水及部分氨通过导管7排出。
如果想回收含有高比例游离酸的产物，将来自导管5的富含HMTBS的溶液引入双极电透析系统9中。在此仪器中，通过电透析氨或多或少与酸分离。减少了铵的混合物收集在导管11中，然后在蒸发器12中浓缩，以获得主要由游离酸组成并含少量或不含HMTBS的浓缩溶液。富含氨的溶液通过导管10排出。通过汽提器15回收氨。
这种氨流出液可经蒸馏器16浓缩，水收集在18中。浓缩的氨溶液17可返回HCN的合成中。
下列实施例说明本发明。
实施例
实施例1：腈水解酶的纯化和氨基末端测序
用四步纯化了腈水解酶。纯化概要示于下表1中。
30℃下在含苄腈(0.5g/l)的基本培养基中将粪产碱菌细胞培养24小时。离心培养物后，将沉淀重悬在TG缓冲液(25mM Tris-HCl,10％(w/v)甘油，pH7.5)中。将细胞悬液超声处理，然后离心，以获得粗提物。然后粗提物用硫酸铵处理直到30％的饱和度。所得沉淀重悬在TG缓冲液中，然后对2升相同缓冲液透析过夜。然后将所得溶液上样于用TG缓冲液预平衡的Q Sepharose Fast Flow HR 26/10阴离子交换柱上。然后用0-1M NaCl的梯度洗脱活性成分。将活性流份上样于用TG缓冲液预平衡的Mono Q HR5/5阴离子交换柱上。用0～1M NaCl的梯度洗脱腈水解酶。最后，合并含有活性的流份，将硫酸铵的浓度调至1M。然后将该溶液上样于用加有1M硫酸铵的TG缓冲液预平衡的Phenyl Superose HR 5/5疏水作用柱上。用1M-0M的硫酸铵梯度洗脱活性成分。表1：腈水解酶纯化的概要
       流份   总蛋白(Mg)    总活性(μmol/h.mg)     比活性(μmol/h.mg)  蛋白收率(％)  纯化倍数
      全细胞    955     4300       4.5     100   1
      粗提物     2400
      硫酸铵     650
    QSHL26/10      3     360       120     0.3   27
   Mono Q HR5/5     1.5     240       160     0.15   35
 Phenyl Sepharose      1     120       110     0.1   24
操作条件：[腈]=50mM；100mM磷酸缓冲液，pH7.0；30℃。
通过凝胶过滤测定蛋白质的分子量，其为约260kDa。在SDS-PAGE凝胶上，观察到43kDa的单一带(纯度为95％)。这可能是一种重43kDa的具有α6结构的蛋白质。实施例2：粪产碱菌ATCC8750腈水解酶的克隆
实施例1中给出的氨基末端序列与粪产碱菌JM3腈水解酶的N-末端序列(Kobayashi等，1993，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:247-251)完全一致，而细菌腈水解酶的N-末端在14个残基上有35-57％的一致性。发明人提出了这样的假定：从ATCC8750菌株纯化的本发明腈水解酶与Kobayashi等(前文引述)描述的酶相同。因而克隆策略是在ATCC8750菌株的DNA基因组上用两个按Kobayashi等(前文引述)给出的序列确定的核苷酸探针进行PCR反应，扩增该腈水解酶的基因。
合成了这两个探针，一个可与Kobayashi等(前文引述)所给序列的5’部分杂交，另一个与3’部分杂交：5’部分(PCRAF1):CCGGGAATTCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCC3’部分(PCRAF2):TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT
引物PCRAF1含有能在起始密码子ATG上游引入EcoRⅠ和NdeⅠ限制酶切位点的5’端12个核苷酸。引物PCRAF2能引入BamHⅠ酶切位点。按Ausubel等(分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology),John & Sons Inc.Ed.2.4.1-2.4.5)描述的CTAB方法提取了粪产碱菌ATCC8750菌株的基因组DNA，每个PCR反应使用100ng。为了调节扩增的特异性，如Ausubel等(如上引述)所示在样品总体积100μl中利用2.5单位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)试验了不同的MgCl2浓度。在1.5mM MgCl2和5％DMSO或5％甲酰胺中进行了两个额外的反应。设定Perkin Elmer 9600热循环仪的程序如下：95℃5分钟，30个循环的(95℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)和72℃4分钟。在0.8％琼脂糖凝胶上分析各种扩增产物。在所有反应中都扩增出了具有预期大小1.15kb的主带，但用1.5mM MgCl2和5％DMSO时特异性更高。这些条件下的反应产物用于下步。已用蛋白酶K处理了样品，用苯酚-氯仿萃取后用乙醇沉淀。将沉淀重悬，在37℃与40单位EcoRⅠ酶和40单位BamHⅠ酶培养2小时。在0.7％琼脂糖凝胶上迁移后，切下1.15kb的带并提取，以按常规方法克隆在用EcoRⅠ-BamHⅠ打开的载体pBSK-(Stratagene,La Jolla，美国)中。称为pRPA-BCAT1至5的5个独立克隆通过质粒DNA用NdeⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、BspMⅠ和BglⅡ酶消化进行分析(图3)。所得图谱与用该方法得到的具有Kobayashi等(前文引述)所述序列的质粒的理论限制图谱相符。XL1Blue菌株(pRPA-BCAT3)已以CBS998-96保藏在CBS。实施例3：含腈水解酶活性多肽编码DNA的1130pb片段的测序
Genome Express S.A.公司(Grenoble，法国)已用实验室制备的DNA制剂(kit Wizzard Midi-prep,Promega)对克隆在质粒pRPA-BCAT3中的插入片段进行了测序。该片段的测序策略示于图4中，并按本领域技术人员已知的常规方法实现。根据粪产碱菌JM3的腈水解酶序列(Kobayashi等，前文引述)合成了10个内部核苷酸引物(在图4中标为623-629和681-682的标号)。全长序列用通用引物“反向”(Reverse)和“M13正向”(M13 Forward)完成。每个区在每条DNA上至少被读一次。
所得序列与已公开的序列有两处差异：一个在作为转录终止子的假定结构中，另一个在腈水解酶的基因(称为nitB)中，导致Asn279→Asp的替换。因而在质粒pRPA-BCAT1、2、4、5上对这两个区域用两个特异性引物710和682(参见图4)进行了实验室测序。在所有这几个克隆中都找到了终止子中1412位(根据Kobayashi的编号，如上引述)C→T的改变。这是一种区别这两个粪产碱菌菌株的突变。1138位A→G的改变只在质粒pRPA-BCAT3中存在。因而它是用Taq DNA聚合酶进行PCR反应时引入的一个突变。实施例4：腈水解酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
为了证实带有纯化腈水解酶基因的已克隆DNA序列的正确性，按下述操作方法将nitB基因置于φ10噬菌体T7(PT7)基因的启动子的控制之下：将pRPA-BCAT3和pRPA-BCAT4的1.13kb的NdeⅠ-BamHⅠ插入片段克隆在载体pXL2432中，分别得到图5中所示的载体pRPA-BCAT12和pRPA-BCAT13。亲本载体pXL2432是质粒pET9(Studier等，1990，酶学方法(Methods In Enzymol.)185,60-89)AccⅠ和EcoRⅠ位点间的区域与质粒pET11a(Novagen Inc.,Madison WI，美国)EcoRⅠ和AccⅠ位点间的区域的杂合体，前者包括复制起始区(ORI)和带有卡那霉素抗性(Kan)的选择标志，后者包括表达盒、抑制子lacⅠ基因和拷贝数调节子ROP基因。
按以下操作方法在诱导条件下进行了培养：在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中(Milller,1972，分子遗传学实验(Experiments inMolecular Genetics)-冷泉港实验室，纽约冷泉港)将含有质粒pRPA-BCAT12的菌株BL21(DE3)(Novagen Inc.,Madison WI，美国)、含有质粒pRPA-BCAT13的菌株BL21(DE3)及含有质粒pXL2432的菌株BL21(DE3)于37℃培养16小时。然后用相同培养基在相同温度下稀释100倍。当培养物的OD600达到0.5～1时，加入了终浓度1mM的IPTG。培养6小时后收集细菌。采用相似的操作方法，在培养基中加入12μg/ml四环素，培养了含有质粒pRPA-BCAT12和pXL2231的菌株BL21(DE3)、含有质粒pRPA-BCAT13和pXL2231的菌株BL21(DE3)及含有质粒pXL2432和pXL2231的菌株BL21(DE3)。从载体pXL1635(1990年4月24日的专利申请FR90/05185)衍生的质粒pXL2231属于IncP不相容组，因而与质粒pRPA-BCAT12和13相容，后两者具有质粒ColE1的复制起始区。该质粒的选择标志是四环素抗性，其带有一个2.2kb的EcoRⅠ-HindⅢ片段，该片段中含有编码大肠杆菌陪伴分子的基因GroES和Gro EL(Fayet等，1986，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)202:435-445)。
对细胞超声处理后的粗提物、离心后的沉淀和上清液在10％SDS-PA中分析了腈水解酶的表达。结果示于图6中，结果显示其质粒至少PA中分析了腈水解酶的表达。结果示于图6中，结果显示其质粒至少含有nitB插入片段的细胞，在提取物中有高水平的腈水解酶(NitB)表达；但该蛋白基本以不溶的形式存在，尽管质粒pXL2231的存在可提高可溶级分中腈水解酶多肽的量。
在图6中，M代表分子量标志；它们以kDa表示。另外，各泳道的意义如下：
-A、D、G分别代表BL21(DE3)+p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL2432的粗提物；
-B、E、H代表分别获自上述相同菌株的上清液；
-C、F、I代表分别获自上述相同菌株的离心沉淀；
-J、N、Q代表分别获自BL21(DE3)+pXL2231+p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL2432的粗提物；
-K、O、R代表分别从这些菌株获得的上清液；
-L、P、S代表分别从这些菌株获得的离心沉淀。
菌株BL21(DE3)/pRPA-BCAT12+pXL2231被称为RPA-BIOCAT126。菌株BL21(DE3)/pRPA-BCAT13+pXL2231被称为RPA-BIOCAT127。按如下测定了RPA-BIOCAT126、RPA-BIOCAT127和RPA-BIOCAT66(相当于BL21(DE3)/pXL2432)的培养物的腈水解酶活性：按上述方法进行培养，只是培养体积改为50ml,IPTG终浓度改为0.1mM。将培养物离心，将细胞沉淀重悬于10ml pH7的100mM磷酸钾缓冲液中。用500μl的该悬液进行HMTBN的水解，其中加入500μlpH7 200mM的HMTBN溶液。将100μl的该混合物与900μl 0.1N磷酸混合，在1-4小时内以规则的间隔测定了水解的动力学。如专利申请WO96/09403中所述用HPLC分析产生的HMTBA的量。结果综合在下表2中。表2：菌株RPA-BIOCAT66、126和127的活性
 RPA-BIOCAT   培养基      诱导  培养时间   OD660   活性(U)
     66  LB Km   0.1mM IPTG     24h     2.5     0
    126  LB Km Tc   0.1mM IPTG     24h     2.4    15
    127  LB Km Tc   0.1mM IPTG     24h     1.9    10
缩写：Km:500μg/ml卡那霉素；Tc:12μg/ml四环素；h：小时；U：每小时每公斤干重形成的HMTBA的公斤数。
为了改善所表达腈水解酶多肽的溶解性，按如下方法构建了质粒pRPA-BCAT37。通过连接用klenow聚合酶处理的质粒pDSK519(Keen等，1988，基因70:191-197)的5.9kb EcoRⅠ-PvuⅡ片段和来自质粒pHP45ΩSp(Prentki和Krisch,1984，基因29:303-313)用MungBean核酸酶处理的2056 bp HindⅢ片段，得到质粒pXL2391。该质粒然后用SmaⅠ和SacⅠ消化，得自HindⅢ消化的质粒pXL2231并用Klenow处理及SacⅠ消化的含GroESL操纵子的2.3kb的插入片段被引入其中。质粒pRPA-BCAT37因而是比质粒pXL2231有更多拷贝数的质粒RSF1010的一种衍生物，与携带ColE1起始区的质粒相容并带有抗链霉素的抗性标志。已将该质粒引入菌株BL21(DE3)/pRPA-BCAT12中，得到菌株RPA-BIOCAT171。按与上所述相似的操作方法进行培养，但用100μg/ml链霉素代替四环素，测定了培养物的活性并报告在下表3中。表3：菌株RPA-BIOCAT171的活性
  RPA-BIOCAT    培养基  诱导物  培养时间   OD660 活性(U)
     171   LB Km Sm   0.1mMIPTG    24h    3.2    14
简写：Km:50μg/ml卡那霉素；Sm:100μg/ml链霉素；h：小时；U：每小时每公斤干重所形成的HMTBA的公斤数。实施例5：腈水解酶在大肠杆菌DH5α中的表达
将含有Ptrp启动子和RBScⅡ核糖体固定位点(Levy-Schill等，1995，基因161:15-20)的pXL2158的0.6kb ScaⅠ-NdeⅠ片段克隆在pBCAT3(参见图3)中，构建了质粒pRPA-BCAT6。按如下操作方法用含有质粒pRPA-BCAT6和/或质粒pXL2035(Levy-Schill等，同前)的菌株DH5α进行了表达：在含有0.4％酪蛋白氨基酸、100μg/ml色氨酸、100μg/ml羧苄青霉素的M9葡萄糖培养基(Miller,J.H.1972，分子遗传学实验(Experiments in Molecular Genetics),Cold SpringHabor Laboratory，纽约冷泉港)中37℃下预培养16小时。对于含pXL2035的菌株，加入50mg/l的卡那霉素。用不含色氨酸的相同培养基将饱和培养物稀释至1/100后进行表达，37℃下培养8-16小时。
按上一个实施例中所述方法对不同菌株的提取物进行SDS-PAGE分析，并报告在图7中。
在该图中，M代表分子量标记，它们以kDa表示。另外，这些泳道具有如下含义：-L、I、F、C代表分别得自菌株DH5α+pRPA-BCAT/3、/6、/6+pXL2035、RPA-BIOCAT76的粗提物；-K、H、E、B代表分别得自上述菌株的上清液；-J、G、D、A代表分别得自上述菌株的沉淀物。
以质粒pRPA-BCAT6得到的43kDa多肽的积累少，主要为不溶物。用质粒pXL2035共表达GroE减少了过量表达，但在菌株DH5α(pRPA-BCAT6+pXL2035)的三次连续传代后，挑选的菌株RPA-BIOCAT76重新恢复腈水解酶多肽的起始表达水平，该多肽几乎是完全溶解的。按上文及上一实施例中所述相似的操作方法进行培养物的活性测定，并示于下表4中。表4：菌株DH5α(pRPA-BCAT3)、DH5α(pRPA-BCAT6)、DH5α(pRPA-BCAT6+pXL2035)、RPA-BIOCAT76的活性
菌株 培养基 培养时间 OD660 活性(U)
DH5α(pRPA-BCAT3) M9Cb 24h 4 0
DH5α(pRPA-BCAT6) M9Cb 24h 4 0.6
DH5α(pRPA-BCAT6+pXL2035) M9Cb Km 24h 3 1.6
RPA-BIOCAT76 M9Cb Km 24h 3.8 5
简写：Km:50μg/ml卡那霉素；Cb:100μg/ml羧苄青霉素；h：小时；U：每小时每公斤干重所形成的HMTBA的公斤数。
这些数据显示，与GroE共表达能够改善腈水解酶的表达，连续传代的常规菌株筛选也有助于改善重组活动。实施例6：腈水解酶在恶臭假单胞菌和粪产碱菌中的表达
利用实施例5中描述的表达系统来在恶臭假单胞菌和粪产碱菌中产生腈水解酶。含nitB基因的pRPA-BCAT6的1.14kb NdeⅠ-XbaⅠ片段被引入了载体pXL1289的NdeⅠ-XbaⅠ位点中。载体pXL1289是pKT230(Bagdasarian等，1981，基因15:237-247)的一种衍生物，其带有革兰氏阴性细菌多宿主的复制起始区(oriV)，含有携Ptrp启动子和RBScⅡ的pXL534的120bp EcoRⅠ-NdeⅠ片段(Latta等，1990,DNA和细胞生物学(DNA and Cell Biology),9:129-137)、编码cobA基因的NdeⅠ-XbaⅠ插入片段(Crouzet等，1990，细菌学杂志(J.Bacteriol.)172:5968-5979)和pXL534的含TrrnB终止子的550bpXbaⅠ-BamHⅠ插入片段(Latta等，1990,DNA和细胞生物学，9:129-137)。因而所得质粒pRPA-BCAT14是pKT230的一种衍生物，含有产生卡那霉素(Km)抗性的基因和Ptrp:RBScⅡ控制下的nitB基因(图8)。
当将该质粒引入大肠杆菌菌株DH5α中时，筛到了一个特别的克隆：它表达一种腈水解酶，该酶在SDS-PA凝胶上的分子量为44kDa，而不是43kDa。该克隆所含质粒具有与pRPA-BCAT14相同的限制酶谱，被称为pRPA-BCAT24。最后，按照与pRPA-BCAT14相同的操作方法构建了质粒pRPA-BCAT23，但有如下修改：pRPA-BCAT6的136bpStuⅠ-BsmⅠ片段用pRPA-BCAT4的StuⅠ-BsmⅠ片段代替。因而质粒pRPA-BCAT23表达的腈水解酶NitB在279位有Asn残基。
通过电穿孔将质粒pRPA-BCAT14、23和24引入了菌株恶臭假单胞菌G2081中。同时用对萘啶酸和利福平的抗性筛选，从菌株KT2440(Bagdasarian和Timmis,1981，见Hofschneid和Goebel的“微生物和免疫学论题”(Topics in Microbiology and Immunology),47,Springer Verlag,Berlin)衍生得到菌株G2081。载体pKT230用作对照质粒。
然后从菌株恶臭假单胞菌提取了质粒pRPA-BCAT14、pRPA-BCAT23、pRPA-BCAT24和pKT230，以通过电穿孔引入菌株粪产碱菌ATCC8750(=PRA-BIOCAT1)中。
在含50mg/l卡那霉素的LB培养基中于30℃将菌株G2081(pRPA-BCAT14)、G2081(pRPA-BCAT23)、G2081(pRPA-BCAT24)、G2081(pKT230)和RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT14)、RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT23)、RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT24)、RPA-BIOCAT1(pKT230)培养过夜。将这些预培养物以1/100稀释在含50mg/l卡那霉素的M9培养基中，30℃下培养20小时。
对细胞超声处理后，细胞超声处理后的粗提物、离心后的沉淀和上清液在10％SDS-PA凝胶上测定腈水解酶的表达。结果示于图9中。对于菌株RPA-BIOCAT1(pKT230)和G2081(pKT230)，只用粗提物点样(分别为泳道A和I)。在该图中，M代表分子量标记，分子量以KDa表示。另外，其中泳道具有如下含义：-B、D、F代表分别从菌株RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT14)、RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT23)、RPA-BIOCAT(pRPA-BCAT24)的粗提物；-C、E、G代表分别从这些菌株得到的上清液；-H代表从RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT24)获得的沉淀；-J、L、O代表分别从菌株G2081(pRPA-BCAT14)、G2081(pRPA-BCAT23)、G2081(pRPA-BCAT24)获得的粗提物；-K、N、P代表分别从上述相同菌株获得的上清液；-Q代表从G2081(pRPA-BCAT24)得到的沉淀。
该实验表明，菌株恶臭假单胞菌表达显著量的三种可溶性腈水解酶多肽，而菌株粪产碱菌只过量表达44kDa的腈水解酶多肽。按如实施例4中所述方法进行的这些培养物的活性测定表明，菌株G2081(pRPA-BCAT23)、G2081(pRPA-BCAT24)和RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT24)对HMTBN具有腈水解酶活性。实施例7：腈水解酶在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的表达
借助于Pcsp B启动子(Peyret等，1993，分子生物学(MolecularMicrobiol.9:97-109)进行腈水解酶在菌株CGL1010(=ATCC14752)中的表达。用如下引物KS1和KS2从质粒pCGL815(Peyret等，同上)扩增了含PcspB启动子的530bp的片段：
KS1:5′-ACGCGTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3′
KS2:5′-CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3′
用SalⅠ消化后，将扩增的530bp片段克隆在用SalⅠ和EcoRⅤ打开的质粒pBSK(Statagene,La Jolla USA)中，得到质粒pCGL1084。通过将如下两个寡核苷酸KS8和KS9杂交，制得一个EcoNⅠ/NdeⅠ接头：
KS8:5′-TCAAGGAGCCTTCGCCTCA-3′
KS9:5′-TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3′
从质粒pRPA-BCAT6中以1.1kb NdeⅠ-XbaⅠ片段的形式提取了腈水解酶的基因。利用上述接头EcoNⅠ/NdeⅠ，将该基因引入用EcoNⅠ和XbaⅠ打开的pCGL1084中，得到质粒pCGL1086。然后将pCGL1086含有PcspB::nitB的SalⅠ-BamHⅠ片段克隆在载体pCGL482(Peyret等，同前)的SalⅠ和BamHⅠ位点上，产生了质粒pCGL1087。因而质粒pCGL1087(图10)是一种基于pBl1(Santamaria等，1984，普通微生物学(J.Gen.Microbiol.)130:2237-2246)的穿梭载体，含有在大肠杆菌中可被识别的pACYC184的复制起始区、产生氯霉素(Cm)抗性的基因和PcspB::nitB融合基团。
按Bonnamy等，1990(FEMS Microbiol.Lett.66:263-270)所述，用电穿孔法将质粒pCGL1087和pCGL482引入了CGL1010中。在加有5mg/l氯霉素的3.7％脑心浸液培养基(Difco Laboratories,Detroit,USA)中30℃培养20小时后，如实施例4所述在培养物样品中进行腈水解酶活性的测定。结果显示，菌株CGL1010(pCGL1087)具有腈水解酶活性，而菌株CGL1010(pCGL482)则没有。实施例8：腈水解酶在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的表达
利用质粒plJ6021(Takano等，1995，基因166:133-137)用PtipA启动子(Holmes等，1993,EMBO J.12:3183-3191)在变铅青链霉菌TK24菌株(Hopwood等，1985，链霉菌的遗传操作实验室手册(Genetic Manipulation of Streptomyces:A Laboratory Manual)，The John Innes Foundation,Norwich)中进行了腈水解酶的表达。
对质粒pUC19(Yanisch-Perron等，基因，33:103-119)进行了如下修饰：用TfiⅠ消化删除140bp的TfiⅠ片段、用Klenow处理及载体自身连接。所得质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ打开，以克隆pRPA-BCAT3含有nitB基因的1.15kb EcoRⅠ-BamHⅠ片段。所得的质粒pOS48.4具有位于nitB基因和BamHⅠ位点间的单一TfiⅠ位点。在用BamHⅠ消化和Klenow处理后，该TfiⅠ位点用于插入取自质粒pHP45Ωhyg(Blondelet-Rouault等，基因，已交稿)的2.3kbΩhyg片段。Ωhyg片段含有吸水链霉菌(S.hygroscopicus)的潮霉素磷酸转移酶(hyg)基因(Zalacain等，1986，核酸研究(Nucl.Acids Res.,14:1565-1581)，能使变铅青链霉菌具有潮霉素抗性。如此获得的质粒pOS48.5用于分离含有腈水解酶基因和随后的hyg基因的3.45kb NdeⅠ-BamHⅠ片段，将该片段克隆在用NdeⅠ和BamHⅠ打开的质粒plJ6021(Takano等，同前)中。质粒plJ6021只在链霉菌中复制，用常规方法(Hopwood等，同上)将连接混合物转化在变铅青链霉菌TK24中，挑选对200mg/l潮霉素(Boehringer Manheim)有抗性的克隆。用常规方法(Hopwood等，同上)提取了这些克隆的质粒DNA，它们的限制酶谱与目标结构相符良好，并被称为pOS48.7(图11)。
在5mg/l卡那霉素存在下在50ml TSB培养基(Tryptic Soy Broth,Difco)中将含pOS48.7的两个变铅青链霉菌克隆于30℃培养72小时，然后以5mg/l的浓度加入藓霉素，在已述条件(Hopwood等，同上)下继续培养18小时。收集培养物，在实施例4中所述的条件下进行活性测定，结果表明，变铝青链霉菌TK24(pOS48.7)菌株表达腈水解酶活性，而TK24(plJ6021)不表达。实施例9：用其他腈水解酶水解HMTBN
在Levy-Schil等，1995(同上)中描述的Comamonastestosteroni sp.的腈水解酶一级序列与本发明中描述的腈水解酶一级序列具有31％的一致性。在Levy-Schil等(同上)描述的条件下培养了表达C.testosteroni腈水解酶的重组菌株大肠杆菌TG1(pXL2158,pXL2035)，将细胞沉淀在pH7的100mM磷酸盐缓冲液中30℃下与50mM HMTBN保温。测得活性为2.3kg/h.kg CS。与本发明的腈水解酶一样，C.testosteroni的腈水解酶能够水解HMTBN。
另外，实施例4中给出的关于质粒pBCAT12和pBCAT13的资料显示，粪产碱菌ATCC8750的腈水解酶中发生Asn279→Asp279的替换仍能保留对HMTBN的活性。实施例10：提供载体
将5g干细胞加入到调至pH7.0的20g水中。然后加入所示量的载体(CELITE545,Prolabo，法国)，完全均化后向悬液中加入总干重15％的戊二醛，继而10％聚乙烯亚胺(SEDIPUR,BASF，德国)进行交联。在室温下搅拌该悬液1小时。
然后加入0.001％阴离子絮凝剂Superfloc A100使悬液絮凝。过滤收集交联物。
加入总干重10％的聚氮杂环丁烷(KYMENE557,Hercules，美国)对该物重新交联。将该湿物团挤过0.5mm直径的孔并干燥。
按专利WO96/09403中描述的方法测定所得颗粒的活性。
   载体(g)    活性(％)
     0      100
    2.5g      215
     5g      250
为细胞提供载体后显著改善了其活性。
用部分溶于水的小麦谷蛋白(Roquette，法国)或完全溶于水的明胶(SBI，法国)代替CELITE，重复了该实验。
     载体    ％活性
      0     100
   5g谷蛋白     160
    5g明胶      nd*
*该细胞悬液不絮凝，不能过滤。
本实施例说明可用谷蛋白代替代替CELITE。但如果加入的是明胶(完全可溶)则不可能用前述技术(挤出)制备催化剂。实施例11
将在LB培养基中有氧培养制得的10g实施例4的大肠杆菌BIOCAT171在500g pH7.0的100mM磷酸盐缓冲液中与10gCLARCEC78(CECA，法国)混合。均化后，加入6g25％的戊二醛，室温下搅拌该悬液15分钟。然后加入2g聚乙烯亚胺和6g 25％的戊二烯。室温下搅拌整个混合物1小时，加入5ml 0.2％的SUPERFLOC A100溶液(CYTEC，法国)使悬液絮凝。过滤，将所得糊状物与16g 12.5％的聚氮杂环丁烷(KYMENE 557,Hercules)混合，然后被挤压通过0.5mm直径的孔。将后得长条物在烘箱中35℃下干燥，然后在含1％NaBH4的pH10.0的50mM硼酸缓冲液中浸泡30分钟。然后该生物催化剂用蒸馏水洗涤。将该催化剂在5℃或室温下于pH8.0的500mM磷酸盐缓冲液中保存。
用100g生物催化剂填充高45cm内径3cm的恒温柱。该柱通过一个再循环环路与一个泵相连。反应器总体积为430ml。环路中充满25％的羟基甲硫基丁酸铵盐的溶液。溶液从上向下的时间流量为20升/小时。水在柱的双层外壳间和在热交换器中循环，使温度保持在35℃。向环路中以80g/h的流速加入去离子水。以20g/h的流速加入2-羟基-4-甲硫基丁腈。多余的反应介质从柱的底部排出以保持环路中的体积恒定。这样，得到了连续的液流，和95％的腈转化率。另外，在反应器出口处所得的2-羟基-4-甲硫基丁酸铵水溶液的浓度为25％。实施例12
所用的电透析器由9个2dm2活性表面的池集合而成，每个池由如下所述的两个室构成：
-盐/酸室：阴极侧以阳离子交换膜Tokuyama Soda的NeoseptaCMB为限，阳极侧以双极膜Aqualytics的阳离子面为限，
-碱室：阳极侧以阳离子膜为限，阴极侧以双极膜的阴离子面为限。
阳极由镀铂钛构成。阴极由不锈钢制成。
电解质是在40℃下电导率为100mS/cm的硫酸钠水溶液。向各电极的循环流速为2×100升/小时。体积为5升。
“碱”室中开始时充以5升1％的硫酸铵溶液。
“盐/酸”室中开始时充以5升1.44mol/l的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸铵溶液。
起始时的溶液再循环流速，对盐/酸室固定在130升/小时，对碱室固定在190升/小时。
在平均40℃下以不连续方式(根据再循环情况)进行电透析。强度设在9A，即电流密度为0.45kA/m2。
运行155分钟后，盐/酸室的电导率由59变为7.8mS/cm。
盐/酸室含有1.35mol/l的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸，为100％的酸形式。
法拉第产率约为71％，能耗为每形成一公斤酸0.53kWh。实施例13
所用的电透析器由8个结构与实施例12中相同的池集合构成。
“碱”室开始时充以5.27升0.1％的硫酸铵溶液。
“盐/酸”室开始时充以4.85升1.39mol/l的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸铵溶液。
各溶液再循环的起始流速，对盐/酸室固定在60升/小时，对碱室固定在150升/小时。
在40℃的平均温度下以不连续方式(根据再循环的情况)进行电透析。强度设在9A，即电流密度为0.45kA/m2。
运行172分钟后，盐/酸室的电导率由59变为9.5mS/cm。
盐/酸室的终体积为4.67升。
组成如下：
2-羟基-4-(甲硫基)丁酸：      1.24mol/l
2-羟基-4-(甲硫基)丁酸铵：    0.148mol/l
转化率为86％终产物为89％的酸形式。
法拉弟产率为74％。能耗约为形成每公斤酸0.58kWh。实施例14
使用类似于实施例13的设备。
开始时“碱”室中充以5.46升1％的硫酸铵。
开始时“盐/酸”室中充以5.23升1.24mol/l的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸铵溶液。
各溶液的再循环起始流量，对盐/酸室设在90升/小时，对碱室设在150升/小时。
在40℃的平均温度下以不连续方式(根据再循环的情况)进行电透析。强度设在14A，即电流密度为0.7kA/m2。
运行105分钟后，盐/酸室的电导率从57.6变为9.8mS/cm。
盐/酸室的最终组成如下：
2-羟基-4-(甲硫基)丁酸      1.28mol/l
2-羟基-4-(甲硫基)丁酸铵    0.14mol/l
因而产物为90％的酸形式。实施例15
使用与实施例13相似的设备。
用从实施例14产生的碱室中的内容物进行本实验。
开始时“盐/酸”室中充以5.2升1.44mol/l的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸铵的溶液。
各溶液的再循环起始流速，对于盐/酸室设为50升/小时，对于碱室设在150升/小时。
在40℃的平均温度下以不连续方式(根据再循环的情况)进行电透析。强度设在19A，即电流密度为0.95kA/m2。
运行53分钟后，盐/酸室的电导率从59变为27mS/cm。
盐/酸室的终浓度为4.85升。
组成如下：
2-羟基-4-(甲硫基)丁酸：      0.87mol/l
2-羟基-4-(甲硫基)丁酸铵：    0.56mol/l
转化率为50％。终产物为61％的酸形式。
法拉弟产率为83％。能耗为形成每公斤酸0.7kWh。实施例16
以每批200.1g约1.5M HMTBS溶液的量在旋转蒸发器中浓缩。水浴温度为45±5℃。压力调在约2.5×103Pa(25毫巴)。沸腾器中的温度从开始蒸馏的25℃变为最后的40℃。3小时末时，回收得到41.9g黄色粘性液，其特征如下：
25℃下的粘度(mm2·s-1) 1150
％HMTBA(Br-/BrO3 -) 83.3
调节浓度后(用水稀释)，得到特征如下的产物：
25℃下的粘度(mm2·s-1) 396
％HMTBA(Br-/BrO3 -) 79.5
通过电势测定，得出其质量分配如下：
％HMTBS 81.6
％HMTBA 6.0
通过HPLC，测定单体或二聚体与(单体+二聚体)的面积比。
单体/(单体+二聚体)       100
二聚体(单体+二聚体)(*)    0
(*)没有检测到二聚体。实施例17
以每批200.0g约1.5M HMTBS溶液的量在旋转蒸发器中浓缩。水浴温度为121±5℃。压力调在约9.5×104Pa。沸腾器中的温度从开始蒸馏的100℃变为最后的113℃。3小时末时，回收得到41.5g黄色粘性液，其特征如下：
25℃下的粘度(mm2·s-1) -
％HMTBA(Br-/BrO3 -) 90.7
调节浓度后(用水稀释)，得到特征如下的产物：
25℃下的粘度(mm2·s-1) 117
％HMTBA(Br-/BrO3 -) 78.8
通过电势测定，得出其质量分配如下：
％HMTBS 57.2
％HMTBA 28.7
通过HPLC，测定单体或二聚体与(单体+二聚体)的面积比。
单位/(单体+二聚体)         95.0
二聚体/(单体+二聚体)(*)    5.0实施例18
向实施例17中描述的100.0g液体中加入40.0g水。用75.0g异丙基醚萃取。分层后，收集有机相，蒸发后得到25.6g HMTBA，其特征如下：
            测定
  单体/(单体+二聚体)(％面积)    97.0
 二聚体/(单体+二聚体)(％面积)     3.0
    25℃下的粘度(mm2·s-1)     55
实施例19
上述实施例中所述溶液的老化
 实施例16  实施例17  实施例18
     25℃存储时间    40天    40天    100天
    粘度(mm2·s-1)     387     116     66
  单体/(单体+二聚体)     100     95.0     82
 二聚体/(单体+二聚体)     0.0     5.0     18
没有评价存储40天以后实施例16和17溶液中的二聚体含量。

Claims (23)

1．通过酶水解从2-羟基-4-甲硫基丁腈制备2-羟基-4-甲硫基丁酸和/或2-羟基-4-甲硫基丁酸铵盐的方法，其特征在于：
a)第一步，制备具有腈水解酶活性的生物材料，
b)第二步，将其固定化，
c)第三步，将2-羟基-4-甲硫基丁腈与如此固定化的生物材料接触，以获得2-羟基-4-甲硫基丁酸铵盐，
d)第四步，必要时将c)步所得盐转变成相应的酸，及
e)第五步，浓缩c)或d)步中所得产物。
2．根据权利要求1的方法，其特征在于腈水解酶活性从产碱菌属，优选粪产碱菌的腈水解酶获得。
3．根据权利要求1或2的方法，其特征在于使用编码一种腈水解酶的遗传信息，在一种微生物宿主中表达。
4．根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于微生物宿主选自大肠杆菌或芽孢杆菌属、棒杆菌属、链霉菌属、酵母属、克鲁维酵母属、青霉属和曲霉属的成员。
5．根据权利要求1的方法，其特征在于腈水解酶活性获自克隆在质粒pRPA-BCAT3中的基团所编码的腈水解酶，所述质粒以保藏号CBS998-96保藏在CBS。
6．根据权利要求1-5任一项的方法，其特征在于腈水解酶与一种伴侣蛋白共表达。
7．根据权利要求5的方法，其特征在于伴侣蛋白为大肠杆菌的GroESL。
8．根据上述权利要求中任一项的方法，其特征在于a)步的生物材料被固定在固体载体上。
9．根据权利要求8的方法，其特征在于固体载体具有1μm-3mm，优选10μM-2mm的粒度，还在于以生物材料重量的0.01-500％，优选10-200％的比例加入该载体。
10．根据权利要求9的方法，其特征在于固体载体选自：
-离子交换树脂，
-氧化铝，
-合成二氧化硅或硅藻类及硅胶，
-沸石，
-炭，
-在水中部分溶解的蛋白，和
-多糖。
11．根据权利要求10的方法，其特征在于固体载体是谷蛋白。
12．根据权利要求8的方法，其特征在于使用一种或多种化学试剂以使生物材料和载体交联和/或不溶化。
13．根据权利要求12的方法，其特征在于化学试剂选自，
-聚氮杂环丁烷聚合物，
-聚乙烯亚胺聚合物，
-聚酰胺聚合物，
-异氰酸酯聚合物，
-藻酸盐胶体，
-k-角叉菜胶，
-胺类，
-醛类，
-羧酸，及
-异氰酸酯。
14．根据权利要求10-13的方法，其特征在于生物材料和载体在化学试剂存在下混合，以获得一糊状物，后者被挤出并干燥。
15．根据权利要求10-13的方法，其特征在于生物材料和化学试剂混合，然后以薄层的形式沉积在载体上。
16．根据以上权利要求任一项的方法，其特征在于通过电透析解离相应的铵盐，得到含至少60％HMTBA，优选至少80％HMTBA的HMTBA和HMTBS的混合物，混合物其余部分为HMTBS。
17．根据权利要求16的方法，其特征在于在具有双极膜及三个室的电透析器中进行解离。
18．根据权利要求16的方法，其特征在于在具有双极膜及两个室的电透析器中进行解离。
19．根据权利要求1-15任一项的方法，其特征在于通过加热铵盐溶液得到HMTBS和HMTBA的混合物。
20．根据权利要求16-19的方法，其特征在于释放出的氨被蒸馏，浓缩并再循环回HCN的合成。
21．根据权利要求16-19获得的水溶液，其由HMTBA和HMTBS的混合物构成，其重量比HMTBA/(HMTBA+HMTBS)为5-99.9％，优选10-50％。
22．用于实施本发明方法的设备，包括：
-装有具腈水解酶活性的固定化酶，或表达具有腈水解酶活性的酶的固定化微生物宿主的一个或多个反应器(3,4)，
-必要时，一个或多个电透析装置(9)，
-终产物的浓缩装置(6,12)。
23．质粒pRPA-BCAT3，其以CBS998-96号保藏在CBS。
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