CZ298403B6

CZ298403B6 - Zpusob kontinuální prípravy 2-hydroxy-4-metylmáselné kyseliny pomocí nitrilázy a zarízení k príprave této kyseliny

Info

Publication number: CZ298403B6
Application number: CZ0145499A
Authority: CZ
Inventors: Favre-Bulle@Olivier; Pierrard@Jérôme; David@Christophe; Morel@Philippe; Horbez@Dominique
Original assignee: Adisseo Ireland Limited
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2007-09-19
Also published as: AU4951397A; HU226148B1; EP1411126B1; JP4350801B2; JP2001502908A; HUP9904513A3; ES2277027T3; US6180359B1; WO1998018941A1; DE69725999T2; DE69725999D1; CN1234074A; FR2755143B1; CZ145499A3; CN1181204C; IL129395A0; DK1411126T3; AU738160B2; ATE345384T1; FR2755143A1

Abstract

Rešení poskytuje zpusob kontinuální prípravy kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné (HMTBA) nebo amonné soli kyseliny 2-hydroxy-4-metylhtiomáselné (HMTBS) enzymatickou hydrolýzou 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitrilu, spocívající v tom, že a) se pripraví biologický materiál, který má nitrilázovou aktivitu, b) uvedený biologický materiál se imobilizuje, c) 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitril se vystaví pusobení takto imobilizovaného biologického materiálu, aby se získala amonná sul kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné, a d) prípadne se takto získaná sul premení na odpovídající kyselinu.

Description

Vynález se týká nového způsobu kontinuální přípravy kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiobutanové (HMTBA) ažnebo jejích amonných solí (HMTBS).

Dosavadní stav techniky

Kyselina 2-hydroxy-4-metylthiomáselná a její soli se užívají již dlouho pro výživu zvířat jako náhražka za methionin. neboť jsou výhodně v kapalné formě, což usnadňuje využití ve firmách vyrábějících krmivá.

Příprava kyseliny 2 hydroxy-4-methylthiobutanové chemickou cestou je známa již dávno. Evropské patenty EP 142 488 a EP 143 000 popisují hydrolýzu 2-hydroxy-4 -metylthiohydroxybutyronitrilu (HMTBN) ve dvoufázovém procesu. První fáze spočívá v tom. že se působí na 2-hydroxy -4—metylthiobutyronitril silnou anorganickou kyselinou jako je např. kyselina chlorovodíková nebo kyselina sírová. V následující fázi, po naředční vodou, se dokončí hydrolýza při zvýšené teplotě. Kyselina 2-hydroxy-4-metylthiobutanová se pak extrahuje organickým rozpouštědlem, které není dobře mísitelné s vodou, jako je např. keton, výhodně metylízobutylketon, a rozpouštědlo se pak odstraní odpařením. Avšak tento způsob výroby, který se využívá v průmyslu, má některé nevýhody. Zvláště tu, Že je produkováno značné množství síranu amonného, přinejmenším odpovídající látkovému množství vneseného nitrilu, který se musí odstraňovat, a tak se vytváří průmyslový odpad, což není v souladu s politikou ochrany životního prostředí, fento způsob výroby navíc vyžaduje velké množství rozpouštědla, které se musí recyklovat.

Jiné způsoby, např. popsané v patentech US 3 773 927 a US 4 353 924. spočívají v hydrolýze 2-Indrovy ·4-metylthiobutyronitrilu kyselinou chlorovodíkovou a pak koncentraci media a separaci vytvořeného chloridu amonného. Jc obtížné odstranit sůl stejně jako v předchozím zmíněném případě a navíc vzniká kyselina má silné zabarvení.

Způsob přípravy chemickou hydrolýzou metylthiohydroxypropionitrilu, který spočívá, podobně jako předchozí způsoby, v provedení hydrolýzy v prostředí se sírou, je popsán v evropském patentu 330 521: Směs se částečně neutralizuje hydroxidem amonným a pak následuje dvoufázová separace. Organická fáze obsahuje většinu kyseliny 2- hydroxy-4-metylthiomáselné a vodná fáze obsahuje většinu vzniklého síranu amonného. Organický roztok se, po odpaření vody, kterou také obsahuje, filtruje, aby se odstranil rozpuštěný síran amonný. Kyselina 2-hydroxyM-metylthiobutanová se pak narodí malým množstvím vody a stabilizuje malým množstvím kyseliny sírové. Vodný roztok, po eliminaci vody, umožňuje získat síran amonný, který lze přímo uplatnit na trhu. Takže tento způsob částečně odstraňuje nevýhody způsobů podle předchozího stavu techniky, alespoň co se týče použití organických rozpouštědel, ale neřeší vůbec problém spojený s odstraněním anorganických solí.

Mezi patenty týkajícími se solí kyseliny 2-hydroxy--4-mety Ithiomáselnc jc třeba uvést patenty US 2 745 745, US 2 938 053 a US 3 175 000, které se týkají vápenatých a amonných solí. Na směs získanou hydrolýzou 2 hydroxyM-•metylthiobutyronítrilu se působí hydroxidem vápenatým nebo uhličitanem vápenatým. Síran vápenatý' se pak vysráží, což vede k uvolnění hydroxidu amonného, který' vytvoří amonnou sůl kyseliny 2 hydroxy-4 metylthiomáselné. Ale opět zde je problém odstranit síran vápenatý, který zůstává.

Způsob, jak je popsán v prvním výše citovaném patentovém dokumentu, spočívající v provedení hydrolýzy a extrakce organickým rozpouštědlem a pak neutralizaci organického rozpouštědla

- I hydroxidem amonným, je také popsán v mezinárodní patentové přihlášce WO 96/01808. Tento způsob, tak jako většina způsobů dříve popsaných, vede ke vzniku látkového množství 1 mol síranu amonného na každý i mol do reakce vstupujícího nitrilu a navíc vyžaduje recyklování velkého množství organického rozpouštědla. Takže není možné tímto způsobem získat roztok amonné soli kyseliny 2-hydroxy 4-metylthiomáselné při vynaložení průmyslově výhodných nákladů.

Použití nitrilázy jako katalyzátoru hydro lýzy nitrilové skupiny na karboxylovou skupinu je poprvé popsáno jako vynález v patentové přihlášce US 08/809 184, podané 20. března 1997. Tento proces však není vhodný pro využití v průmyslovém měřítku vzhledem k nedostatečné aktivitě mikroorganismů, které syntetizují nitrilázu.

Podstata vynálezu

V současnosti bylo zjištěno, jak popisuje předkládaný vynález, že je možné získat kyselinu 2-hydroxy-4--metyRhiobutanovou a/nebo její amonnou sůl enzymatickou cestou v průmyslovém měřítku, s vysokým výtěžkem, bez použití rozpouštědel a bez průvodní produkce anorganických solí.

Předmětem předkládaného vynálezu jc proto způsob přípravy kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné (HMTBA) a/nebo amonné soli kyseliny 2-hydroxy-4-mctylthiomásclné (11MTBS) enzymatickou hydrolýzeu 2 hydroxy-4 metylthiobutyronitrilu, spočívající v tom, že

a) v prvním kroku se připraví biologický materiál, který má nitrilázovou aktivitu,

b) v druhém kroku se zmobilizuje uvedený biologický materiál,

c) ve třetím kroku se 2-hydroxy-4S-metylthiobutyronitril vystaví působení i mobilizovaného biologického materiálu, aby se získala amonná sůl kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné,

d) ve čtvrtém kroku sc sůl získaná podle bodu c) volitelně přemění na odpovídající kyselinu a

e) v pátém kroku se produkt získaný podle odstavce c) nebo d) koncentruje.

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázky, které jsou v následující části popsány, se odkazuje v průběhu podrobného popisu předkládaného vynálezu.

Obr. 1 představuje schematické znázornění elektrodialyzační buňky použité ve volitelné fází d). přičemž obr. 1A je elektrodialyzační buňka s bipolární membránou, která má tři oddíly a obr. IB představuje elektrodialyzační buňku s bipolární membránou a dvěma oddíly.

Obr. 2 je schéma průmyslového zařízení k provádění způsobu podle předkládaného vynálezu.

Obr. 3 je restrikční mapa plazmidů pRPA-BCAT I až 5.

Obr. 4 znázorňuje strategii sekvencování fragmentu velikosti 1130 bp obsahujícího sekvenci DNA (na obrázku značena w/7B) kódující polypeptid, který má nitrilázovou aktivitu podle předkládaného vynálezu. Čísla se týkají identifikace primerů použitých pro sekvencování a také označení M13EWD a M13REV.

Obr. 5 je restrikční mapa plazmidů pRPA-BCA l 12 a pRPA-BCAT13.

Obr. 6 ukazuje výsledky elektroforézy na 10% SDS-PAGE gelu: exprese sekvencí DNA podle předkládaného vynálezu ve kmenech E. coli BL21(DE3)/pRPA-BCAT12, BI2l(DE3)/pRPABCAT12+pXL223l a BE21(DE3)/pRPA-BCATI3+pXL223 1. Každá dráha odpovídá množství 10 pg rozpustných proteinů a případně ekvivalentnímu objemu hrubé a nerozpustné frakce.

UL 47O1UJ DO

Obr. 7 ukazuje výsledky elektroforézy na 10% SDS-PAGE gelu: exprese sekvencí DNA podle předkládaného vynálezu ve kmenech E. coli DH5a/pRPA-BC’AT3, DH5a/pRPA-BCAT6.

DH5u/pRPA-BCAT6+pXL2035. RPA-B1OCAT76. Každá dráha odpovídá množství 10 pg rozpustných proteinů a případně ekvivalentnímu objemu hrubé a nerozpustné frakce.

Obr. 8 je restrikční mapa plazmidu pRPA-BCAT14,

Obr. 9 ukazuje výsledky elektroforézy na 10% SDS-PAGE gelu: exprese sekvencí DNA podle předkládaného vynálezu ve kmenech. P. pulida G2081 (pRPA-BCAT14), G2081(pRPABCAT23), G2081(pRPA-BCAT24). kmenech A. faecalis ATC'C875O(RPA-BCAT14). ATCC8750 (RPA-BCAT23). ATCC8750(RPA BCAT24). Každá dráha odpovídá množství ίο 10 Lig rozpustných proteinů a případně ekvivalentnímu objemu hrubé a nerozpustné frakce.

Obr. 10 představuje restrikční mapu plazmidu pCGLl()87.

Obr. 11 je restrikční mapa plazmidu p0S48.7.

Podrobný popis vynálezu

První krok způsobu přípravy kyseliny 2-hydroxy-4-melylthioniásehic je příprava biologického materiálu, který má nitrilázovou aktivitu. Biologický materiál může obsahovat vlastní enzyma20 tický roztok jako takový anebo celé buňky nebo částí buněk mající nitrilázovou aktivitu.

Výhodně se použije mikroorganismus exprimující nitrilázu. Nitriláza může být z mikroorganismu, zvláště pak z mikroorganismu rodu Alcaligenes, Rhodococeus nebo Gordona, výhodně sc jedná o Alcaligenes faecalis, Rhodococeus sp. IIT 29-7 a Gordona íerrae, a výhodněji jde o 25 kmeny popsané v patentové přihlášce US 08/809 184.

Výhodně se použije mikroorganismus, který exprimuje nitrilázovou aktivitu, získaný přenosem genetické informace kódující nitrilázu rodičovského organismu do hostitelského mikroorganismu. Konkrétně je možné užít kmeny E. coli, který koexprimuje chapcronový protein GroESL, ke 30 zvýšeni výkonnosti rekombinantního kmene. Ktomu účelu je možné použít jakýkoliv vhodný vektor, zvláště pak plaztnidový vektor.

Nukleotidová sekvence použitá v tomto příkladě sc umístí pod kontrolu signálů, které umožňují její expresi v hostitelské buňce. Hostitelské buňky sc mohou vybrat bud'to z prokaryotických 35 systémů jako jsou např. Gram-pozitivní nebo gram-negativní bakterie, nebo eukaryotických systémech jako jsou např. kvasinky, houby, nebo i jakékoliv další systémy. Signály pro řízení exprese se vyberou v závislosti na použitém hostiteli. Pro tento účel sc DNA kódující nitrilázu vloží do vektorů autonomně se replikujících uvnitř vybrané hostitelské buňky nebo do integrativních vektorů vybraného hostitele. Takové vektory je možné překvapit metodami, které jsou 40 odborníkovi obecně známé a výsledné konstrukty se vloží do vhodného hostitele standardními metodami jako je např, elektroporacc.

Jako hostitelské mikroorganismy je třeba zmínit zejména Alcaligenes faecalis, Pseudomonad pulida, E. coli. nebo mikroorganismy rodu Bacillus, Corynebacterium. Síreplomyces a 45 Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillium a Aspergillus.

Výhodným vektorem pro expresi v E. colije plazmid pRPA-BCAT6.

Druhý krok způsobu podle předkládaného vynálezu spočívá v imobilizaci biologického materiá50 lu. Tato imobilizace se výhodně provede v přítomnosti pevné matrice, a umožní získat pevné částice, jejichž velikost, tvar a mechanický odpor je možné kontrolovat. Do dovoluje součastně použít polyazetidinového polymeru nebo j iných zesíťovacích činidel.

- j f' -r 4 111 ΓΛ /í/cmuj ου [mobilizace se muže týkat buď celých buněk, nebo buněk, které byly pcrmeabilizovány. Také se může týkat enzymového roztoku zcela bez buněk. Enzymy použité pro imobilizaci jsou nitrilázy.

Způsob imobilizace spočívá v imobilizaci aktivního biologického materiálu v pevné matrici.

zejména s částicemi velikosti od 1 do 500 pm. výhodně velikosti od 10 do 200 pm. a sice působením chemického činidla, které reaguje s aminovými (NH₂, NH). karboxylovými (COOH). hydroxylovými (OH), thiolovými (SH) nebo amidovými (CONIB) skupinami biologického materiálu a nosiče (matrice). Taková chemická činidla také činí biologický materiál a materiál nosiče nerozpustným (insolubilizují) vc vodě. Získaná hmota je velmi tvárná a umožňuje vytvářet io částice požadovaného tvaru a velikosti. Soudržnost a tvrdost těchto částic jc zvýšena usušením.

Biologický materiál pro imobilizaci může volitelně také obsahovat inaktivní biologický materiál přítomný v množství 0 až 200 % hmotnostních. Tímto inaktivním biologickým materiálem mohou být proteiny (albumin nebo želatina) nebo polysacharidy (ehitosan, k-karagen nebo i? alginát).

Inertní nosič (matrice), do kterého jc biologický materiál vložen, je polyinerní a může být složen z hydrofóbnícli nebo hydrofiIních, porézních nebo neporczníeh organických nebo anorganických částic. Vhodný materiál částic je. aniž by tento výčet vynález nějak omezoval, např, iontoměničo20 vc pryskyřice, oxid hlinitý, syntetické oxidy křemičité, křemelina a silikagely. zeolity, dřevěné ulili, vc vodě nerozpustné proteiny jako gluten a polysacharidy jako např. škrob.

Inertní materiál matrice se může přidat v množství 0,01 až 200 % hmotnostních vzhledem k množství biologického materiálu, výhodně v množství 10 až 100 %.

Chemická činidla, použitá k odstranění rozpustnosti (insolubiIizaci) biologického materiálu mohou být polymery bifunkčních molekul, které reagují s aminovými (NI E. NH), karboxylovými (COOII), hydroxylovými (OH), thiolovými (SH) nebo amidovými (CONH₂) funkčními skupinami. K těmto polymerům patří např. poly mery azetidinu, pólyetylením inu, polyamidu, a izokyaná30 tu, alginátové gely, gely k-karagenu, aminy jako např. hexametylendiamin, aldehydy jako např.

glutaraldehyd. karboxylové kyseliny jako např. kyselina adipová a izokyanály.

Imobilizace může být provedena s využitím jednoho nebo několika těchto chemických činidel. Chemické činidlo se přidá k takové koncentraci, že představuje 1 až 50 % hmotnostních vzhle3? dent k množství biologického materiálu a nosné matrice. Množství odpovídající 5 až 30 % jc výhodné, aby se získaly dostatečně pevné částice, které si udrží vysoký aktivitu a u kterých nejsou problémy s vnitřní difúzí.

Trvání zesil ovacího ošetření je mezí 0,5 a 24 hodinami,

Teplota Je při procesu imobilizace obvykle v rozmezí 4 až 65 °C. výhodná je teplota 20 až 40 °C.

Teplota jc při procesu imobilizace velmi závislá na stabilitě použitého biologického materiálu.

Hodnota pH je při procesu imobilizace obvykle v rozmezí 5 až 11, výhodné je pH 6 až 10. 45 výhodnější jc směrem k alkalickému pil. Volba pH je také závislá na rezistenci biologického materiálu a vhodné pH odborník snadno určí.

Vytvoření biokatalyzátoru by mělo umožnit jeho využití v libovolném systému, zejména na pevném loži.

Jedním ze způsobů přípravy může být extruze. Pro tento účel jsou biologický materiál a nosičovy materiál zesíťovány přidáním jednoho nebo několika zesilovacích činidel. Po tomto ošetření je nerozpustná hmota získána odstředěním nebo vy vločkováním (flokulací) a filtrací. Sušina ve výší alespoň 10% je výhodou. Tato hmota je potom extrudována. K extruderu se získají tenké

-4 r i f 4ΛΊ r-. ,

CC C7fWUJ DO válečky (..vermicelli“) výhodně s průměrem mezi 0.3 až 0,5 mm a délkou mezi 1 až 10 mm. Tyto válečky se pak mohou sférouizovat (upravit na kulovité částice). Poté se získané částice suší.

Dalším způsobem přípravy může být obalování rozprašováním. Při tomto způsobu se biologický 5 materiál smíchá s jedním nebo několika chemickými činidly. Po /reagování je směs rozprašována na nosičový materiál v podobě tenké vrstvy. Tímto způsobem se získají granule s průměrnou hodnotou průměru mezi 0,1 až 0.2 mm. Volitelně se takto získané částice mohou ponořit do roztoku redukčního činidla, např. borohydridu sodného, aby sc redukovaly iminové funkční skupiny vytvořené během zesítění.

Částice získané tímto způsobem jsou dostatečně odolné k oděru, aby je bylo možno využit v pevném loži, fluidním loži nebo v míchaném reaktoru.

Třetí krok způsobu podle předkládaného vynálezu znamená použít imobilizovaný biologický 15 materiál v koloně nebo v reaktoru. Cílem tohoto kroku je kontinuálně produkovat amonnou sůl kyseliny 2-hydroxy^-metylthiomáselné z 2-hydroxy-4-mctylthobutyronítriIu. Kolony nebo reaktory jsou naplněny čistým nebo naředěným roztokem 2-hydroxyM-methylthiobutyronitrilu nebo směsí obsahující 2-hydroxyM-metyl-thiobutyronitril a amonnou sůl kyseliny 2-hydroxy 4-metyl- thiomásclnc.

Kolony nebo reaktory jsou výhodně používány při teplotě mezi 10 až 60 °C a hodnotě pil mezi 5 až 9.

První systém použitý pro výrobu podle předkládaného vynálezu může sestávat ze dvou nebo více 25 kolon navzájem spojených do série s náplní, vodného roztoku 2-hydroxyM-mctylthiobutyronitrilu na vrcholu prvního sloupce a současně s doplňováním 2-hydroxy-4-mety!thiobutyronitrilu do ostatních kolon v množství, které je omezeno rozpustností této sloučeniny v reakční směsi. Tento systém se nazývá stupňový systém.

3o V systému podle druhého provedení předkládaného vynálezu sc použije jedna kolona nebo několik kolon spojených navzájem paralelně do uzavřeného okruhu. V tomto systému se nepřetržitě dodává 2-hydroxy^-metylthiobutyronitril do okruhu a reakční médium se nepřetržíte dodává pomocí pumpy, takže sc udržuje konstantní objem v okruhu. len to systém se nazývá okruhový.

Typ reaktoru použitý vc způsobu podle předkládaného vynálezu může být reaktor s pevným ložem, fluidním ložem nebo s kontinuálně míchaným ložem. Výhodně jsou reaktory s pevným ložem, neboť jejich použití zmenšuje problémy s oděrem, které mohou nastat u i mobilizovaných buněčných částic. Pokud se užije mikroorganismus jako takový, pak je výhodné použít míchaný 40 reaktor spojený s ultrafiltrační jednotkou pro kontinuální separaci mikroorganismu od požadovaného produktu.

Čtvrtý stupeň, který' jc volitelný, spočívá v konverzi amonné soli kyseliny 2-hydroxy-4-metyl· thiomáselnc na příslušnou kyselinu. T ento krok je možné provést jedním ze dvou způsobů: buď 45 elcktrodialýzou pomocí dvou- nebo tříkompartmentového clcktrodialyzačního zařízení, nebo zahříváním vodného roztoku následovaným extrakcí typu kapalina/kapalina.

V závislosti na použité elektrodialyzační metodě je možné použít budůo dvou- nebo tříkompartmentové elektrodialyzačni zařízení.

Termín „kompartment“ se rozumí prostor, který jc mezi dvěma membránami, tj. mezi bipolámí a homopolární membránou nebo dvěma přilehlými hornopolárními membránami. Termín „buňka“ v souvislosti s clektrodialyzačním zařízením označuje sadu dvou nebo tří kompartmentů. Termín „zásobník“ označuje útvar složený z 5 až 300 takových buněk. Elektrodialyzační zařízení 55 (elektrodialyzér) se skládá ze zásobníku a samozřejmě z anody a katody.

- 5 f -no o a o n Á7O4UJ DO

Homopolární membrány, které se mohou využít vc způsobu podle předkládaného vynálezu, sc dělí na dvě velké skupiny podle způsobu výroby.

Heterogenní membrány jsou vyrobeny z íontoměničových pry skyřic smíchaných s pojivém jako je např. polyvinylchlorid. polyety lén apod. Takže se mohou vytvořit potažením např. tkaniny z polyesteru nebo polyakrylonitrílu.

Je také možné užít homogenní membrány získané zavedením funkčních skupin do inertního nosiče chemickým nebo radiochcmickým roubováním. Nejčastěji užívaná chemická metoda zahrnuje zavedení funkčních skupin do latexu poly meru obsahujícího aromatické kruhy; jako je např. styren/divinylbenzen nebo styren/butadien. Takto funkcionalizovaný latex může sloužit k nanesení na tkaninu, podobně jako u heterogenních membrán. Radiochemická metoda obecně spočívá v tom, že se působením záření roubuje aromatická sloučenina, jako např. styrén, na inertní nosič jako např. polyetylénový nebo polytetrafluoroetylénový list. Funkční skupiny jsou pak vneseny na aromatické kruhy stejně jako v chemické metodě.

Kationtové výměnné membrány obsahují silné kyselé skupiny, většinou sulfonátové skupiny, nebo slabé kyselé skupiny, často karboxylové skupin v. Méně často obsahují kyselé skupiny jako 20 POf. HPOý, AsO? aSeOG

Aniontové výměnné membrány obsahují silné bazické skupiny, často kvartemí amoniovc skupiny; nebo slabé bazické skupiny, často aminové skupiny. Zřídka obsahují bazické skupiny jako kvartemí fosfoniové skupiny nebo sulfoniové skupiny.

Ve způsobu podle předkládaného vynálezu kationtové membrány výhodně obsahují silné kyselé skupiny a z nich výhodně sulfonátové skupiny. Aniontové membrány výhodně obsahují silně bazické skupiny, a z nich výhodně kvarterní amoniové skupiny.

Bípolární membrány jsou souborem dvou membrán, jedné kationtové a druhé aniontové. Když je takováto membrána vystavena působení odpovídajícího elektrického pole, solvatační voda v mezi membránovém prostoru disociuje na ionty H a OH’, které migrují směrem ke katodě průchodem skrz kat iontovou stranu a směrem k anodě průchodem skrz aniontovou stranu membrány. Jako příklady takových membrán mohou být uvedeny bipolární membrány, kterc prodávají firmy Aqualytics. Touyama Soda nebo FuMaTech.

Anoda elektrodialyzéru je tvořena materiály obvykle užívanými pro elektrodialýzu jako je např. grafit, nikl nebo titan pokrytý vrstvou vzácných kovů nebo jejich oxidů, zejména platinou. Katoda elektrodialyzéru jc také tvořena materiály obvykle užívanými pro elektrodialýzu jako jc 40 např. grafit, nerezová ocel nebo nikl.

Elektrodíalyzér je naplněn vodným roztokem, který se má zpracovat. Jc také nezbytné cirkulovat roztok anolytu k anodě a roztok katolytu ke katodě. Může se také užít roztok jediného elektrolytu. Ve způsobu podle předkládaného vynálezu je okruh s jediným elektrolytem zcela postaču45 jící. Úlohou elektrolytu je zajistit dostatečnou vodivost. Výhodně je tato vodivost rovna nebo větší než 20 mi li siemens na 1 centimetr (mS/cm), aniž by však spodní hranice této hodnoty byla kritická pro provádění způsobu podle předkládaného vynálezu.

Použitý elektrolyt je ionizovatelná sloučenina jako např. sůl, ky selina nebo báze. Elektrolytem je 50 výhodně neelektroaktivní sloučenina. Výhodné jc použití neutrálních solí jako jsou sírany, kyselin jako jc kyselina sírová nebo bází jak oje např. hydroxid sodný .

Použitá proudová hustota je obecně v rozmezí od 0,2 do 1,5 kA/nr a výhodně je v rozmezí od 0,4 do 1 kA/m².

-6C7 298403 B6

Vhodná teplota pro provádění způsobu podle předkládaného vynález musí být v rozsahu kompatibilním se stabilitou membrán. Výhodné jc způsob prováděn při teplotě v rozmezí od 30 do °C.

Elektrodialyzér může pracovat různými způsoby. Může pracovat kontinuálně, tj. roztok kontinuálně protéká zásobníkem, čili několik stupňů muže být umístěno v sérii, pokud to vyžaduje úroveň zpracováni, které má být dosaženo. Elektrodialyzér může také pracovat dávkově, zpracovávaný roztok cirkuluje v zásobníku dokud není dosaženo požadované úrovně zpracování. A nakonec může elektrodialyzér pracovat i v přímém průtokovém režimu s částečnou recirkulací.

Podle první varianty provedení předkládaného vynálezu disociace amonné soli na kyselinu 2-hydroxy 4-metylthiobutanovou a hydroxid amonný se uskutečňuje v elektrodialyzační buňce s bipolárnimi membránami, která má tři kompartmenty. jak je schematicky znázorněno na obr. 1.

Elektrodialyzační zařízení vhodné k provádění způsobu podle předkládaného vynálezu sc skládá z různých kompartmentu, vymezených kationtovými membránami (MC), bipolárnimi membránami (MB), a aniontovými membránami (MA). Tylo kompartmenty se děli na solný kompartment (S), ze kterého se čerpá sloučenina pro separaci, bazický kompartment (B) a kyselinový kompartment (A), kde se báze a kyselina regenerovaná ze soli koncentrují.

Soli amoniaku jsou vneseny do solného kompartmentu. Působením elektrického pole amonné ionty migrují směrem kc katodě a opouštějí kompartment Sa procházejí skrz kationtovou výměnnou membránu (kationtovou membránu) a kombinují sc s ionty OH- z aniontové strany bipolární membrány, kde dochází k disociaci vody vlivem elektrického pole.

Současně karboxylátové ionty (2-hydroxv^-mctylthiobutanoát) migrují směrem k anodě, opouštějí kompartment S průchodem přes aniontovou výměnou membránu (aniontovou membránu). Po průchodu dalším kompartmentem (A) se protonu]i přebytkem H iontů z kationtové strany bipolární membrány. Tři sousedící kompartmenty' (Β). (A) a (s) tvoří elektrodialyzační buňku.

Ve druhé variantě provedení podle předkládaného vynálezu dochází k regeneraci kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiobutaiK)vé v elektrodialyzační buňce s bipolárnimi membránami se dvěma kompartmenty. jako jsou znázorněny na obr. 1B. Tyto dva kompartmenty jsou vymezeny kationtovými membránami a případně bipolárnimi membránami. Tyto kompartmenty tvoří sohiv/kyselinový kompartment (S/A) a bazický kompartment (B).

Amonné soli sc vnesou do kompartmentu S/Λ. Působením elektrického pole amonné ionty migrují směrem kc katodě a opouštějí kompartment S/A a procházejí skrz kationtovou výměnou membránu (kationtovou membránu) a kombinují se s ionty OH z aniontové strany bipolární membrány, kde dochází k disociaci vody vlivem elektrického pole.

Současně se kompartment S/A okyseluje (acidifikuje) v důsledku vzniku H iontů z kationtové strany bipolární membrány. Dva sousedící kompartmenty (B) a (S/A) tvoří elektrodialyzační buňku.

Toto uspořádání má výhodu v nízké spotřebě energie a navíc umožňuje měnit požadovaný poměr sůl/kyselina.

Aby elekrodialvzér dobře pracoval, měla by být dostatečná elektrická vodivost bazického kompartmentu (stejně tak jako kyselinového kompartmentu v případě tříkompartmentového uspořádání) a je možno ji případně upravit podpůrným elektrolytem. Tedy vodivost roztoku hydroxidu amonného se může zvýšit přídavkem amonné soli jako je např. síran amonný.

Vc výhodné variantě předkládaného vynálezu se používá 2-hydroxy-4-(metliylthio)bulanoát amonný.

-7Ve výhodném provedení podle předkládaného vynálezu sc do solného kompartmentu tříkompartmentové elcktrodialyzační buňky vnese směs kyseliny 2-hydroxy4-metylthiomáselné a 2hydroxy-4 metylthiobutyronitrilu. Sůl se disociuje jak bylo uvedeno výše na 2-hydroxy-4 metylthiobutyrát a migruje směrem k anodě, kde konvertuje na kyselinu 2-hydroxy 4-metylthiomáselnou, amonné ionty migrují směrem ke katodě, kde se přeměňují na hydroxid amonný, a v solném kompartmentu zůstává voda a nepřeměněný 2-hydroxy-4-nictylthiobutyronitril. který' je recyklován v hydrolyzační koloně.

io Pomocí tepelné metody jc kyselina přeměněna tím že sc posune rovnováha mezi amonnou solí a volnou kyselinou zahrátím vodného roztoku obohaceného HMTBS a odstraněním uvolňovaného hydroxidu amonného. Toho lze dosáhnout zahříváním ve vakuu nebo při atmosférickém tlaku buďto s, anebo bez vytěsňování. Použití CCT pod tlakem jc výhodné k usnadnění posunu rovnováhy. Směs HMTBS a HMTB se získá s množstvím 5 až 99,9 % HMTBA. výhodně s 10 až 50 % 15 HMTBA vzhledem k celkovému součtu množství HMTBA a HMTBS. Viskozita těchto roztoku jc mezi 1200 a 30 mm²s ' (1200 až 30 cSt) a výhodně mezi 200 a 50 mni s¹ (200 až 50 cSt) při 25 °C.

Vodné roztoky se mohou rozložit extrakcí kyseliny pomocí částečně s vodou mísitelného nebo 2o s vodou nemísitelucho rozpouštědla. Existuje velký počet rozpouštědel pro tento účel. Výhodným rozpouštědlem jsou C? až C₈ ketony (obsahující 5 až 8 atomů uhlíku), zvláště metylizobutylketon, étery jako např. izopropyléter, alkoholy jako např. izopropanol. estery, terciální aminy jako např. trioktylamin. Výhodná rozpouštědla ve způsobu podle předkládaného vynálezu jsou aceton, M1BK, izopropanol, izopropylacetát. izobutyléter nebo propyléter, THE nebo trioktylamin. 25 Poměr vodné fáze k organické fázi není kritický. Avšak z hlediska účinnosti by neměl být nižší než minimální poměr 1:1 a z hlediska finanční výhodnosti by neměl přesáhnout poměr 1:3. Výhodný podle předkládaného vynálezu jc poměr 1:1,5 až 1:2.

Extrakci je možné provádět kontinuálně nebo dávkově, jakýmkoliv technologickým extrakčním 30 postupem typu kapalina/kapalina. Kaskádová nebo protiproudová míchací/dekantační zařízení, odstředivé exlraktorv nebo náplňové či patrové kolony jsou příklady vhodných zařízení.

Vodný roztok zbavený volné kyseliny se může znovu zpracovávat, tolikrát kolikrát je potřeba, dokud je to žádoucí.

Organická fáze se zpracovává tak, aby se izolovala HTMBS. To sc provádí výhodně odpařením rozpouštědla nebo extrakcí horkou vodou. Aby se zabránilo případnému poškození HMTBA, ošetření horkou vodou sc může za pomoci vakua udržet tak nízko, jak je to jen možné.

V obou těchto způsobech disociace amonné soli vzniká vodný roztok hydroxidu amonného, l en se může zpracovat tak, aby se hydroxid amonný koncentroval. Destilace a koncentrace hydroxidu amonného v jednom nebo několika stupních silákem nebo bez tlaku je výhodná. Předběžný vytésňovací stupeň by mohl být výhodný. Koncentrovaný roztok hydroxidu amonného sc může vracet pro syntézu kyseliny kyanovodíkové, která jc součástí syntézy 2-hydroxv-4 metylthio15 butyronitrilu.

V pátém stupni se koncentruje vodný roztok HMTBS a/nebo volné kyseliny. To se výhodně provádí odpařením vody.

Předmětem vynálezu je také výrobní zařízení pro provádění způsobu podle předkládaného vynálezu. Takové zařízení je schematicky znázorněno na obr. 2 a skládá se z přívodů 1 a 2, určených pro vnášení MTPA kyanhydrídu a vody do reaktoru 3. Reaktor 3 má fixní lože s recirkulací, které je naplněno i mobilizovaným i enzymy nebo bakteriálními kmeny. Část roztoku se odvádí z reaktoru 3 do koncového rektoru 4, Ukončovací reaktor 4 jc opět typ s pevným ložem s imobilizova-8ΜΪΟ <n-l '

V/. A.7O*tVJ DU nými enzymy nebo bakteriálními kmeny. Koncentrovaný roztok HMTBS se získává na výstupu z rektoru 4 prostřednictvím výtoku 5.

Koncentrovaný roztok HMTBS je možné dále zpracovat dvěma zcela odlišnými způsoby 5 v závislosti na požadovaném konečném produktu.

Pokud je požadavkem získat produkt obsahující vysoký podíl HMTBS, pak je produkt z výtoku 5 veden do odpařovače 6. který umožňuje koncentrovaný roztok obsahující zejména HMTBS a malé množství volné kyseliny. Přebytečná voda a také frakce hydroxidu amonného jsou 10 odváděny výtokem 7.

Pokud se požaduje získat produkt obsahující vysoký podíl volné kyseliny, koncentrovaný roztok HMTBS z výtoku 5 jc veden do bipolárního dialyzačního systému 9. V tomto systému jc do větší či menší míry' hydroxid amonný oddělen od kyseliny elektridialýzou. Směs zbavená amoniaku sc i? pak získá na výtoku 11 a pak se koncentruje odpařovačem 12, aby sc získal koncentrovaný roztok obsahující především volnou kyselinu a jen velmi málo nebo vůbec žádnou HMTBS. Roztok obohacený hydroxidem amonným se odvádí výtokem JO. Hydroxid amonný se pak získá vytěsněním v 15. Vytékající hydroxid amonný se může koncentrovat destilací v 16, voda se pak získává v 18. Koncentrovaný roztok hydroxidu amonného sc pak může vracet pro syntézu i ICN.

Následující příklady předkládaného vynálezu složí k ilustraci vynálezu aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Puriflkace a sekvencování N-koncc nitrilázy

Nitriláza byla purifikována ve čtyřech stupních. Souhrnný přehled puriflkace je uveden v tabulce I.

Buňky Alcaligenes faecalis byly kultivovány 24 hodin ve 30 °C v minimálním médiu v pří35 tomnosti bcnzonitrilu (0,5 g/l). Po odstředění kultury byl pelet přenesen do pufru TG (25mM tris-HCl. 10 % (hmotn./objem) glycerol, pH 7,5) a buněčná suspenze byla ošetřena ultrazvukem, aby se získal hrubý extrakt. Hrubý extrakt byl pak ošetřen síranem amonným až do 30% saturace. Získaná sraženina sc resuspendovala v pufru TG a pak dialyzovala proti 2 litrům stejného pufru přes noc. Získaný roztok sc pak nanesl iontoměničovou kolonu Q Saepharose Fast 40 Flow HR 26/10 předem ekvilibrovanou TG pufrem. Nitriláza pak byla eluována pomocí gradientu NaCI od 0 do 1 M. Frakce obsahující aktivitu byly smíchány a koncentrace síranu amonného byla upravena na 1 M. Roztok byl pak nanesen na hydro lobu í interakční kolonu ťcnylsefarózy HR5/5 předem ekvilibrovanou TG pufrem s přídavkem IM (NHjhSOj. Aktivita byla eluována gradientem síranu amonného od 1 M do 0 M.

Molekulová hmotnost proteinu byla zjišťována gelovou filtrací a byla určena na asi 260 kDa. Na gelu SDS-PAGE byla pozorován jediný pás velikosti 43 kDa (95% čistota). Jedná sc tedy pravděpodobně o protein se strukturou ct6. kde hmotnost a je 43 kDa.

um η. r izowj γ>ό

Tabulka 1

Souhrnný přehled purifíkace nitrilázy

Frakce	Celkový přete i.”. (nq)	Celková aktiv! r.a (grr.o 1 / h)	Specifická aktivita í. Lunol/c .mc)	Výrěžck proteinu % /	PurLftk. faktor
Celé buňky	955	4 300	4/5	íoo	1
hrubý extrakt		2 4 00
síran amonný		650	i
QHSL 26/10	3	360	120	0/ 3	27
íčcnuQ HR 5/5	c - f '-j	240	150	0,15	35
Fenvlsefaróza	1	120 1	110	0/ i	24

Podmínky: Koncentrace nitrilu 50 mM, fosfátový pufru lOOmM pH 7,0, 30 °C.

Příklad 2

Klonování nitrilázy z Alculigwesfaccalis ATCC8750

Sekvence NH? konce nitrilázy z příkladu 1 vykazuje úplnou identitu sc* sekvencí N-konce nitrilázy z Alealigenesfaecalilx JM3 (Kobayashi et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:247—251. 1993). přičemž N-konce bakteriálních nitriláz vykazují 35 až 57% identitu vc 14 zbytcích. Původce sc proto domnívá, že nitriláza podle předkládaného vynálezu purifikovaná z kmene ATCC 8750 je podobná té. kterou popsali Kobayashi et al.

Klonovací strategie zahrnovala amplifikaci genu pro tuto nitrilázu pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) na genomové DNA kmene ATCC8750 pomocí dvou oligonukleotidových primerů odvozených na základě sekvence, kterou publikovali Kobayashi et al.

Oligonukleotidové primery byly syntetizovány tak, že jeden hybridizoval s 5-koncem a druhý s 3-koncem sekvence, kterou publikovali Kobayashi et al.

5'(PCRAF1): CCGGGATTCATATGCAGACAAGAAAAAICGTCC (Sek id. č, 1)

3'(PCRAF2): TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT (Sekvence id. č. 2)

Primer PCRAF1 obsahuje 12 nukleotidů na 5'-konci, které umožnily vnesení restrikčního místa pro enzymy EcoRI a Ndel proti směru (normální transkripce) od počátečního kodonů ATG. Primer PCRAF2 umožnil vnesení restrikčního místa pro enzym BamHI. Genomová DNA Alealigenes faecalis kmene ATCC8750 byla extrahována postupem s použitím CTAB, který publikoval Asubel et al„ Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, lne.

2.4.1 - 2.4.5). 100 ng DNA bylo použito pro PCR. Aby se měnila specifičnost reakce, byly testovány různé koncentrace MgCIj dle Asubela et al., v celkovém objemu reakce 100 μΙ a s 2,5 jednotkami Taq DNA polymerázy (Perkin Elmcr). Dvě další reakce PCR byly provedeny s

1.5 mM MgCE a 5% DMSO nebo 5% forniamidcm. Termocyklcr Perkin Elmer 9600 byl naprogramován pronásledující posloupnost: 5 minut 95 °C, pak 30 cyklů (30 sekund 95 °C, 30 sekund 55 °C, 45 sekund 72 °C) a nakonec 4 minuty 72 °C. Produkty amplifikace byly analyzovány elektroforezou na 0.8% agarózovém gelu. Hlavní pás, jehož velikost odpovídala očekávané velikosti 1,15 kb, byl ampliflkován ve všech reakcích, ale s největší specifičností v reakci s 1,5 mM MgCE a 5% DMSO. Reakční produkt získaný v těchto podmínkách byl ponechán pro další kroky. Vzorek byl ošetřen protci názou K. extrahován fenolem/chloroformern a pak precipitován ethanolem. Pelet byl resuspendován a inkubován 2 hodiny vc 37 °C se 40 jednotkami enzymu EcoRl a 40 jednotkami enzymu BamHI. Po rozdělení cleklroforézou na 0,7% agarózovem gelu byl vyříznut pás velikosti 1,15 kb a extrahován, Takže DNA mohla být klonována do vektoru pBSK (Stratagene. La Jolla. USA) otevřeného pomocí EcoRI-BamHI 5 obvyklým způsobem. 5 nezávislých klonů nazvaných pRPA-BCAT 1 až 5 bylo pak analyzováno enzymatickým štěpením plazmidu enzymy Ndcl. EcoRL BamZI, BspMI a Bglll (viz obr. 3). Získaný vzorce odpovídal teoretickému restrikčnímu vzorci plazmidu získaného stejným způsobem se sekvencí, kterou publikovali Kobayashi et al. Kmen XLIBlue (pRPA-BCAT3) byl uložen v Holandské sbírce mikroorganismů Centraalbureau Voor Schimmclcultures (CB$) pod io číslem CBS 998-96.

Příklad 3

Sek věncování fragmentu 1130 bp obsahujícího DNA kódující polypeptid s nitrilázovou aktivitou 15

Inzert klonovaný do plazmidu pRPA-BCAT3 byl sekvencován firmou Gcnome Expres S.A. (Grenoble. Francie) z DNA připravené v laboratoři minipreparací (pomocí soupravy Wizard mini-prep. Promega). Strategie sekvencování tohoto fragmentu, provedeného obvyklým způsobem odborníkovi známým, je znázorněna na obr. 4. Deset vnitřních ol i gonukleot klových primerů 20 (označených čísly 623 až 629 a 681 až 682 na obr. 4) bylo syntetizováno na základě sekvence nitrilázy 7.Alcaligenes faecalis JM3 (Kobayashi et zal). Tato sada primerů byla doplněna univerzálními primery „reverse“ a ..Ml2 forvvard“. Každý úsek byl sekvencován nejméně jednou na každém řetězci DNA.

Získaná DNA sekvence vykazuje dvě odlišnosti vc srovnání s publikovanou sekvencí: jedna odlišnost je ve struktuře, která je předpokládaným terminátorem transkripce, a druhá je v nitrilázovém genu, zvaném w/7B, a sice substituce Asn²⁷⁹ -> Asp. tyto dva úseky byly znovu sekvencovány v laboratoři na plazmídcch pRPA-BCATI, 2, 4 a 5 se dvěma specifickými primery 710 a 682 (viz obr. 4). Záměna C -> T v pozici 1412 (ve smyslu číslování genu jak ho publikovali 30 Kobayashi et al.) v úseku terminátoru byla nalezena ve všech klonech. Je to tedy mutace, která odlišuje dva kmeny Alcaligenes faecalix. Změna A > G v pozici 1138 jc přítomna pouze v plazmidu pRPA BC \13. Jde tedy o mutaci vnesenou Taq DNA polymerázou v průběhu PCR.

Příklad 4

Exprese nitrilázy v £’. coli BL21 (DE3)

Pro potvrzení identifikace klonované sekvence DNA s nitrilázovým genem, byl gen ///7B umístěn pod kontrolu genového promotoru Φ10 laga T7 (PT7) následujícím postupem. Inzerty •io Ndel-BamHI velikosti 1,13 kb z plazmidú pRPA BCAT3 a pRPA-BCAT4 by ly klonovány do vektoru pXI.2432, čímž vznikly vektory pRPA-BCAT12 a pRPA-BCAT13 znázorněné na obr. 5. Rodičovský vektor pXL2432 je hybrid úseku plazmidu pET9 (Studie et al.. Methods in Enzymol. 185: 60-89, 1990) mezi místy Accl a EcoRl. který' obsahuje replikační počátek (ORI) a selektovatelný markér kódující rezistenci ke kanamycinu (Kan), a úseku mezi místy EcoRl a 45 Accl plazmidu pETlla (Novagen lne., Madison, WL USA), který obsahuje expresní kazetu, represerové gen lad a gen regulující počet kopií ROP.

Kultivace bakterií byla prováděna v indukčních podmínkách. Kmen (Novagen lne., Madison, Wl, USA) obsahující plazmid pRPA-BCAT12, kmen BL21 (DE3) obsahující plazmid 50 pRPA-BCAT13 a také kmen BL2I (DE3) obsahující plazmid pX 1.2432 byly kultivovány hodin v médiu LB při 37 °C (Miller, 1972, Expcriments in Molecular Genelics. Cold Sprong Harbor Laboratory', Cold Spring Harbor. N.Y.) obsahujícím 50 pg/ml kanamycinu a pak bylo inokulováno stejné médium 1/100 objemu pří stejné teplotě. Když kultury dosáhly OD₆₀o mezi 0,5 a 1. byl přidán IPTG ve výsledné IM koncentraci. Po další óhodinové kultivaci byly bakterie 55 odebrány. Stejný postup byl aplikován pří kultivaci kmenu BE21 (DE3) obsahujícího plazmidy \ / izo-tuj ηυ pRPA-BCAT12 a pXL2231. kmenu BE21(DE3) obsahujícího plazmidy pRPA-BCAT13 a pXE2231 a také kmenu BI221 (DE3) obsahujícího plazmidy pXL2432 a pXL2231 stíní, že byl do kultivačního média přidán tetracykliň v množství 12 pg/ml. Plazmid pXL223 I. který je odvozený z vektoru pXL 1635 (viz patentová přihláška FR 90/05185 z 24.04. 1990) patří do inkompatibilní skupiny IncP a je proto kompatibilní s plazmidy pRPA-BCAT12 a pRPA-BCAI 13, která mají replikační počátek plazmidu ColEI. Jeho selektovalelnv markér je rezistance k tetracy klinu a nese fragment EcoRl-HindllI velikosti 2,2 kb obsahující geny GroES a GroEE kódující molekulární chaperonv E. coli (Favet et al.. 1986. Mol. Gen. Genet. 202,: 435-445). Exprese nitrilázy byly analyzovány na 10% SDA-PA gelu v hrubé frakci po sonikaci buněk anebo po odstředění v peletu a supernatantu. Výsledky jsou znázorněny na obr. 6 a ukazuji úroveň exprese nitrilázy (nilB) v extraktech buněk, ve kterých alespoň jeden plazmid obsahuje inzert s /?/7B. avšak protein je v podstatě v nerozpustné formě ačkoliv přítomnost plazmidu pXE2231 umožňuje zvýšit rozpustnou frakci nitrilázy.

Obr. 6 znázorňuje výsledek na gelu, kde M představuje molekulový markér s velikostmi uvedenými v kDa a jednotlivé dráhy jsou:

- A. D a G představují hrubé frakce BL21(DE3) +pRPA-BCATI2. BL21(DE3) + pRPA-BCAT13 a BE2I (DE3) + XL2432,

Β, E a H představují supernatanty získané ze stejných kmenů,

C, F, a I představují pelety získané ze stejných kmenů,

- J. N a Q jsou hrubé frakce získané z BE2I (DE3) 4 pXE2231 + pRPA BCAT12. BU21 (DE3) + pXl.2231 + pRPA-BCAT13 a BL21(DE3) + pXL223l + XL2432,

K,Oa R jsou supernatanty získané zc stejných kmenů a

E, P a S jsou pelety získané ze stejných kmenů.

Kmen BL21(DE3)/pRPA-BCAT12 + pXL2231 byl nazván RPA-B1OCAH26, kmen BL21(DE3)/pRPA-BCAT13 + pXL2231 byl nazván RPA B1OCATI27. Aktivita nitrilázy v kulturách RPA-B1OCATI26 RPA-B1OCAT127 a v kultuře RPA-BIOCAT66. která odpovídala BL21 (DE3)/pXL2432, byla stanovena následujícím způsobem. Bakterie byly kultivovány stejně, jak bylo popsáno v předchozím textu, až na to, žc byl změněn celkový objem kultury (50 ml) a výsledná koncentrace 1PTG (0,1 mM). Kultury byly odstředěny a pak pelet nasát do 10 ml lOOmM kaliumfosfátového pufru pil 7,0. hydrolýza HMTBN byla provedena s 500 μΐ této suspenze, která se přidala k 500 μΙ 200mM roztoku HMTBN pH 7,0. Kinetika hydrolýzy byly získány smícháním 100 μ! této směsi s 900 μΙ 0,1Ν kyseliny fosforečné v pravidelných intervalech od 1 do 4 hodin. Množství vznikle IIMTBA bylo analyzováno pomocí UPEC jak je popsáno v patentové přihlášce USA 98/809 184. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2.

Tabulka 2

Aktivity kmenů RPA-B1OCAT66, RPA-B1OCΑΊΊ26 a RPA-B1OCAT127

á y ⁱ	Mé cl ion	1 r.dukce	Doba	OD^	Aktivita
ΒI3 ~ A5			kult, i vace		(U)
Ó 6	LB Km	0,1 mM IPTG	2 4 hod i o.	2, 5	0
2 2 6	L.B Km Tc	0,1 r.iM i?TG	24 hodin	2,4	15
J. / /'	L3 Km Tc	0/1 mM IPTG	24 hodin	U9	10 - —.

Zkratky: Km: kanamycin 50 gg/ml. Tc: tetracykliň 12 gg/ml, U: kg HMTBA vytvořené za 1 hodinu na 1 kg suché hmotnosti ř < jiiv in * <

uv

Pro zvýšení rozpustnosti exprimovaného polypeptidu nitrilázy byl zkonstruován plazmid pRPA-BCAT37. Nejdříve byl připraven plazmid pXL230l ligací fragmentu EcoRl-PvuII velikosti 5,9 kb z plazmidu pD$K519 (Keen et al.. 1988. Gene 70; 191-197) ošetřeného polynierázou Klcnowa s fragmentem Hindlll velikosti 2056 bp plazmidu pHP45QSp (Prentki a

Krísch. 1984. Gene 29: 303—313) ošetřeného nukleázou z fazolu [Phuseo/us Aureusj. Plazmid pXL239l byl pak štěpen enzymy Smál a Sací a byl do něho vložen inzert velikosti 2,3 kb nesoucí operou GroESL z plazmidu pXL2231 naštépeného Hindlll a ošetřeného Klenowem a pak štěpeného Sací. Plazmid pRPA-BCAT37 jc tedy derivátem plazmidu RSF10I0 s vyšším číslem ίο počtu kopií než plazmid pXL2231 a kompatibilní splazmidy nesoucími počátek colEl a rezistenci ke streptomycinu jako markér. Tento plazmid byl vložen do kmenu BL21(DE3)/pRPA-BCATI2, čímž vznikl kmen RPA-BIOCAT171. Aktivita, uvedená v tab. 3. byla měřena na kultuře odborné tomu, co již bylo popsáno s tím rozdílem, že tetracyklin byl nahrazen streptomycinem v koncentraci 100 ng/ml.

Tabulka 3

Aktivita kmenu RPA-B1OCAT171

R ΡΑ- ΒΙ OCAT	Médium	Indukce	Doba kultivace		Aktivita (U)
171	LB Km Sm	0/1 mM 1'PTG	24 hodin	3,2	14

Zkratky: Km: kanamycin 50 ng/ml. Sm: streptomycin 100 ng/ml U: kg ΠΜΤΒΛ vytvořené za 1 hodinu na I kg suché hmotnosti

Příklad 5

Exprese nitrilázy v buňkách £. co/i DH5a

Pro tento účel byl zkonstruován plazmid pRPA-BCA16 klonováním fragmentu Scal Ndel velikosti 0,6 kb zpXL2158 obsahujícího promotor Ptrp a vazebné místo pro ribozom RBScll (Levý-Schill ct al., 1995, Gene 161: 15-20) do plazmidu pBCA Γ3 (viz obr. 3). Exprese bylo 3d dosaženo v bakteriích kmene DH5a obsahujících plazmid pRPA-BCAT6 a/nebo plazmid pXL2035 (Lcvy Schill et al.) následujícím postupem. Prekultiva byla inkubována 16 hodin vc 37 °C v médiu M9 s glukózou ((Miller, 1972, Experiments in Molccular Genctics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). obsahujícím 0m4% kaseinovým aminokyselin, 100 ng/ml tryptofanu a 100 ng/ml karbenicilinu. Po kmeny obsahující pXL2035 byl přidán 35 kanamycin v množství 50 ng/l. Exprese se začala projevovat po naředění saturované kultuiy' 1/100 stejným médiem ale bez tryptofanu při inkubaci 8 až. 16 hodin ve 37 °C.

Analýza SDS-PAGE extraktu z různých kmenů by la provedena stejně jak bylo popsáno v předchozím příkladu a jc znázorněno na obr. 7.

Na obr. 7 M představuje molekulový markér s velikostmi uvedenými v kDA a jednotlivé dráhy jsou:

L. L F a C představují hrubé frakce DHSa+pRPA BCAT/3 ,/6,/6 + pXL2035, RPA-BIOCAT76,

- K, 11. E a B představují supematanty získané ze stejných kmenů a

J, G, D a A představují pelety získané ze stejných kmenů.

ι t ·ΜIV ,(( 1 >1 r

·..-d- Á.ZVTVv’ U’J

Plazmid pRPA BCAT6 umožnil získat malé množství převážně nerozpustného polypeptidu velikosti 43 kDa. Koexprese GroE z plazmidu pXL2O35 snížila expresi, ale po třech následných subkulturách kmenu DH5a(pRPA-BCAT6+pXL2035) se vybraný kmen RPA-BIOCAT76 vrátil k původní hodnotě exprese polypeptidu nitrilázy, který byl prakticky zcela rozpustný. Testy aktivity byly provedeny stejným způsobem jaký byl jíž popsán v předchozím příkladu a jejich výsledky jsou uvedeny \ tab. 4.

Tabulka 4

Aktivita kmenů Dl L5a(pRPA-BCAT3), DH5a(pRPA-BCAT6). DH5a(pRPA-BCAT6+ pXL2035)aRPA -BIOCAT76

Km.sn	Médium	Doba	GD₆._o	Aktivita
		kultivace		(U)
DH5a(pRPA-BCAT3)	M9 Cb	24 hodin	Δ	Γ¹,
0H5a(pRPA-BCAT6)	M9 Cb	24 hodin	4	0/6
Dti5a(pRPA-BCAT6+ pXL2035)	M9 Cb Km	24 hodin	3	1,6
RPA-BIOCAT76	M9 Cb Km	24 hodin	3/8	5

Zkratky. Km: kanamycín 50 μ§/ηιΙ, Cb: karbenycilin 100gg/ml. II: kg HMTBA vytvořené za 1 hodinu na I kg suché hmotnosti

Tato data ukazují, žc koexprese GroE umožňuje zvýšit expresi nitrilázy a že konvenční selekce kmenů v následných subkulturách také přispívá kc zvýšení aktivity rckombinant.

Příklad 6

Exprese nitrilázy v Pseudomonaspurida a Alcaligencs faecalis

Expresní systém popsaný v příkladu 5 byl použit pro přípravu nitrilázy v Pseudomonas putida a Alcaligenes faecalis. Fragment Ndel-Xbal velikosti 1,14 kb z pRPA-BCA16 obsahující gen ///VB byl vložen do míst Ndel-Xbal vektoru pXEI289. vektor pXLI289 je derivát pKT230 (Bagdasarian et al.. 1981, gene 15: 237-247) nesoucí mult i hostitelský replikační počátek (oriV) pro Gram-negalivni bakterie a obsahující fragment EcoRi-Ndel velikosti 120 bp nesoucí Vtrp promotor a RBScIl zpXL534 (Eatta et al., 1990, DNA And CE11 Biol. 9; 129-137) a inzert Ndel-Xbal kódující gen cobh (Crouzet et al. 1990, .1. Bactcriol. 172. 5968-5979) a inzert Xbal-bamHI obsahující terminátor 'VrrmB zpXL534 (Eatta et al., 1990, DNA And Cell Biol, 9: 129 137). Získaný plazmid pRPA-Bcat!4 je tedy derivát pKT230 obsahujícím gen rezistence ke kanamycinu (Kan) a gen ///VB pod kontrolou Ρ/ζγ?: RBScll (viz. obr. 8).

V průběhu vnášení plazmidu do E. coli kmene DH5a byl selektován specifický klon, který' exprimuje nitrilázu, jejíž molekulová hmotnost na SDS-PA gelu byla 44 kDa místo 43 kDa. Plazmid nesený tímto klonem přitom vykazuje stejný restrikční vzorec jako plazmid pRPABCAT14 a byl proto nazván pRPA-BCAT24, Nakonec byl zkonstruován ještč plazmid pRPABCAT23 stejným způsobem jako plazmid pRPA-BCAT14 až na následující modifikace: Fragment Slul-Bsml velikosti 136 bp zpRPA-BCATó byl nahrazen fragmentem Stul-Bsml pRPABCAT4. Plazmid pRPA-BCAT23 proto exprimuje nitrilázu ///VB se zbytkem Asn v pozici 279,

Plazmidy pRPA-BCAT14, 23 a 24 byly vneseny elektroporací do Pseudomonas putida kmene G208I. Kmen G2081 je odvozen od kmene kT2440 (Bagdasaria a Timmis 1981. v 1 lofsclineid a Goebel, Topies in Mic rob io logy and 1 mm u no logy. 47, Springer Verlag. Berlin) selekcí na

- 14spontánní rezistenci ke kyselině nalidixové a rifampycinu. Vektor pKT230 byl užit jako kontrolní plazmid.

Plazmidy pRPA-BCATI4, pRPA-BCAT23. pRPA-BCA124 a pKT230 pak byla extrahovány z kmenů Pseudonionas pulida. aby mohly být novu vneseny do kmene ATCC8750 A/caligenes faecalis (- RPA-B1OCAT1). Kmeny G2081 (pRPA-BCAT14). B2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24) a G2081 (pKT230) byly společně s kmeny RPA -B1OCAT1 (pRPABCAT14), RPA-BIOCATI(pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24) a G2081(pKT23) kultivovány přes noc při 30 °C v LB médiu obsahujícím 50 mg/1 kanamycinu. Prckultury byly naředěny 1/100 do nového média M9 obsahujícího 50 mg/1 kanamvcinu a inkubovány 20 hodin při 30 °Č.

Exprese nitrilázy byla hodnocena na SDS PA gelu v hrubé frakci po sonikaci buněk, v peletu po odstředění a v supernatantu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. V případě kmenů RPA -BIOCAT1 (pK 1230) a G2081 (pKT230) byl nanesen na gel pouze hrubý extrakt (dráhy A a I).

Na obr. 9M představuje molekulový markér s velikostmi uvedenými v kDa a jednotlivé dráhy jsou:

B. D a F představují hrubé frakce RPA ΒΙΟΟΑΊΊΊ (pRPA-BCA 114), RPA-BIOCATT1 (pRPA BCAT23) a RPA-B1OCATT1 (pRPA-BCWl 24)

C. E, a G představují supernatanty získané zc stejných kmenů, představuje pelet získaný z kmene RPA-BIOCATTl (pRPA-BCAT24).

J. L a O jsou hrubé frakce získané z kmenů G208I (pRPA-BCAΊΊ4), G2081 (pRPA-BCAT23) a G2081 (pRPA-BCA 1 24),

K, N, a P jsou supernatanty získané ze stejných kmenu a

Q je pelet získaný z kmene G2081 (pRPA-BCAT24).

Tento experiment ukázal, že kmeny Pseudomonux pulida exprimují velká množství třech rozpustných polypeptidů - nitriláz a kmen Alcaligenes faecalis exprimuje pouze jediný polypeptid nitrilázy. a sice o velikosti 44 kDa. festy aktivity, provedené stejným způsobem jak bylo již popsáno v předchozím příkladu 4, ukázaly že kmene G2081 (pRPA-BCAT23). G208I (pRPABCAT24) a RPA-BI()CATl(pRPA-BCAT24) projevují na HMTBN nitrilázovou aktivitu.

Příklad 7

Exprese nitrilázy v Corynebacterium glulamicuni

Nitriláza byla exprimována v kmeni CGL1010 (“ ATCC 14752) pomocí plazmidu VspB. (Pevret et al„ 1993, Molecular Microbiol. 9: 97-109). Fragment velikosti 530 bp obsahující promotor Pc.s/?/? byl aniplifikován zplazmidu pCGLSIS (Peyret et al.) pomocí oligonukleotidovýeh primerů KSI a KS2.

KS1: 5'-ACGCGTTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3'(Sekvence id. č. 4)

KS2; 5'-CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'(Sekvecne id. č. 4)

Po naštěpení Sall byl fragment velikosti 530bp klonován do plazmidu pBSK (Stratgene, La Jolla, USA) otevřeného naštěpením Sall a EcoRV, čímž vznikl plazmid pCGl.1084. Adaptér EcoNI/Ndel byl připraven hybridizací oligonukleotidů KS8 a KS9:

KS8: 5'-TCAACGAGCCTTCGCCTCA-3' (Sekvence id. č. 5)

KS9: 5'-TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3' (Sekvence id. . 6)

- 15 Nitrilázový gen byl extrahován z plazmidu pRPA-BC’AT6 ve formě fragmentu Ndel-Xbal velikosti 1.1 kb. Tento fragment byl pomocí adaptéru EcoNI/Ndel vložen do pCGL 1084 naštěpcncho EcoNl a Xbal. čímž vznikl plazmid pCGL 1086. Fragment Sall/BamHI z pCGL 1086 obsahující PcspR-.-.nitB byl pak klonován do plazmidu pCGL482 (Pcyrct et al.) do míst Sáli a BamHI. což dalo vzniknout plazmidu pCGL 1087. Plazmid pCGL 1087 (viz obr. 10) je kyvadlový (..shuttle'4 vektor založený na vektoru pBI 1 (Santamaria et al.. 1984, J. gen. Microbiol, 130: 2237-2246. který obsahuje replikační počátek zpACYC 184 rozpoznávaný v E. coli, gen kódující rezistenci k chloramfcnikolu (Cm) a fúzní gen Pc.syjBxw/B,

Plazmidy pCGL 1087 a pCGL482 byly vneseny elcktroporací do buněk CGL10K) postupem který popsali Bonnamy et al., 1990 (FEMS Microbiol. Lett. 66: 263-270). Po kultivaci 20 hodin ve 37 °C v 3,7% infúzním médiu „mozek-srdce (Difco Laboratoeies. Detroit, USA) s přídavkem 5 mg/1 chloramfcnikolu.

Testy nitrilázovc aktivity byly provedeny na vzorcích z kultur stejně Jako v příkladu 4. Výsledky ukazují, že kmen CGL1010(pCGL 1087) měl nitrilázovou aktivitu, zatímco kmen CGL1010/pCGL482) neměl žádnou.

Příklad 8

Exprese n itrilázy v Streptomyces lividuns

Nitriláza byla expr imována v kmenu TK24 Streptomyces lividuns Hopwood et al, 1985, Gene tic Man i pu lat i on of Streptomyces. A Laboratorty Manual, The John Innes Foundation, Norwich) pomocí plazmidu plJ6021 (Takano et al., 1995, Gene 166: 133-137) a promotoru PtipA (Holnies etal., 1993, EMBOJ. 12: 3183-3191).

Plazmid pUC19 (Yanisch-Perron ct al, 1985, Genom 33: 103-119) byl modifikován deleci (odstraněním) fragmentu Tfil velikosti 140 bp štěpením enzymem Tfil, ošetřením KLonowovým enzymem a opětovným uzavřením (,,selfligací) vektoru. Takto získaný plazmid byl otevřen štěpením EcoRl a BamHI, aby bylo možné klonovat fragment EcoRI bani!II velikosti 1,15 kb obsahující gen h/7B z pRPA-BCA 1’3. plazmid pOS48.4 takto získaný měl unikátní štěpné místo pro enzym Tfil 1 mezi genem w/7B a místem BamHI. Toto místo bylo využito pro vložení inzertu - fragmentu Qhyg velikosti 2.3 kb, získaného z plazmidu pHP45Qhyg (Blondelet-Roualt et al.. Gene, podáno v publikaci) vyštěpenim BamHI a po ošetření Klenowcm. Fragment Qhyg obsahuje geu pro hygromycinfosfotransferázu (/ng) ze Síereptomyces hygroscopicux (Zalacait et al., 1986, Nud. Acids Res. 14: 1565-1581) a uděluje streptomyces lividuns rezistenci k hygromycinu. Plazmid p()S48.5 takto získaný byl použit k izolaci fragmentu Ndel-BamHI velikosti 3.35 kb obsahujícího nitrilázový gen následovaný genem /?vg, který byl klonován do plazmidu pIJ6021 (lákáno ct al.) otevřeného enzymy Ndel a BamHI. Jelikož sc plazmid pIJ6021 replikuje pouze v buňkách Streptomyces. byla ligační směs transformována konvenčním způsobem (Hopwood et al.) do streptomyces lividuns TK24 a byly selektovány klony rezistentní k 200 mg/1 hygromycinu (Boehringer Manhcim). Piazmidové DNA byla extrahována z těchto klonů standardním způsobem (Hopwood et al.) a po analýze sc ukázalo, že jejich restrikční vzorec skutečně odpovídal očekávanému konstruktu nazvanému p()S48.7 (viz obr. 11).

Dva kmeny Streptomyces lividuns obsahující pOS48.7 a také klon obsahující plazmid pIJ6021 byly kultivovány v 50 ml média TSB (Tryptic Sov Broth, Difco) při 30 °C po dobu 72 hodin se selekcí v 5mg/1 kanamycinu a pak byl přidán thioestrepton v 5mg/l koncentraci a kultivace pokračovala dalších 18 hodin v podmínkách podle Hopwooda et al. Pak byla kultura sklizena byl proveden test aktivity stejně jako v příkladu 4. Výsledky ukázaly, že kmen Streptomyces lividuns TK24 (oOS48.7) exprimoval nitrilázovou aktivitu, zatímco kmen TK24 (píJ6021) nikoliv.

- 16/-ί j -MW 4 Λ Ί i-.»4 7ťWVJ DO

Příklad 9

Hydrolýza MHTBN jinými nitrilázami

Primární sekvence nitrilázy Comamonas íesiosteroni sp., jak ji popsali Levy-Schil ct al.. 1995 vykazuje 31% identitu s primární sekvencí nitrilázy podle předkládaného vynálezu. Rekombinantní kmen E. coli TG1 (pXL2158, pXL2035), který· exprimuje nitrilázu zCofiiaiiionas iestosíeroni byl kultivován v podmínkách dle Levy-Schil et a. 1995, buněčný pelet byl pak inkubován ve lOOmM fosfátovém pufru pH 7.0 s 50mM HMTBN při 30 °C. Změřená aktivita byla 2.3 kg/h.kg CS. Podobně jako nitriláza podle předkládaného vynálezu je nitriláza z Comamonas leslosieroni schopna hydrolvzovat HMTBN.

Dále údaje uvedené v příkladu 4 s plazmidu pRPA-BCAT12 a pRPA-BCATI3 ukazují. že substituce Asn279 Asp279 v nitriláze z Alcaligenes faecalis umožňuje konzervovat aktivitu na HMTBN.

Příklad 10 Přidávání nosiče g suchých buněk bylo přidáno do 20 g vody s hodnotou pH nastavenou na 7,0. Potřebné množství (viz tabulka) nosiče (CELÍTE 545. Prolabo, Francie) bylo přidáno a dokonalé homogenizaci byla suspenze zesítěna přídavkem 15 % glutaraldehydu (vzhledem k celkové suché hmotnosti) a pak 10% polyetylcniminu (SED1PUR, BASF, Německo). Suspenze se míchala 1 hodinu při teplotě místnosti. Suspenze pak byla vy vločkována přídavkem 0.001% aniontového flokulačního činidla Superfloc A100. Zesílená hmota pak byla izolována filtrací.

Takto získaná hmota byla znovu zesítěna přídavkem 10% polyazetidinu (KYMENE 557, Hercules, USA) vzhledem k celkové suché hmotnosti. Hmota, ještě za vlhka, byla extrudována skrz hubici s průměrem 0,5 mm a usušena.

Aktivita částic získaných extruzí byla stanovena způsobem popsaným v patentové přihlášce USA 08/809 184. na kterou se tímto odkazujeme.

Nosič (g)	Aktivita (%)
0 g	100
2,5 g	215
s g	250

Přídavek nosiče v buňkách podstatně zvýšil jejich aktivitu. Pokus byl opakován s tím. že CELÍTE byl nahrazen pšeničným glutancm (Roquette, Francie) částečně rozpustným ve vodě nebo želatinou (SBI, Francie) úplně rozpustnou ve vodě.

Nosič (g)	Aktivita (%)
0 g	100
5 g glutenu	160
5 g želatiny	nestanoveno*

* Nebylo stanoveno, protože buněčná suspenze nevločkovala a nebylo možné ji zachytit filtrací

- 17νζ, * /lituj υυ

Tento příklad ukázal, že CELÍTE může byt nahrazen glutenem. V případe, ze se použita želatina (zcela rozpustná), vytvoření katalyzátoru výše popsaným způsobem (extruzí) jc nemožné.

Příklad 11 g E. coli Biocatl71 z příkladu 4 připravených aerobní kultivací v LB médiu bylo smícháno s 10 g CLARCEL78 (CECA. Francie) v 500 g ΙΟΟπιΜ fosfátového pufru pH 7,0. Po homogenizaci se přidalo 6 g 25% glutaraldehydu a suspenze se míchala 15 minut při teplotě místnosti. Pak se přidaly 2 g polyetylén iminu a ještě 6 g 25% glutaraldehydu. Celá směs se míchala 1 hodinu při io teplotě místnosti. Směs se pak vyvločkovala přídavkem 5 ml roztoku SUPERELOC A100 na

0,2% (CYTEC, Francie). Vzniklá hmota se izolovala filtrací a do získané pasty sc přimíchalo 16 g 12,5 % polyazetidinu (KYNEME 557, Hercu les, USA), a pak byla extrudována hubicí s průměrem 0,5 mm. Takto získané tenké válečky „nudličky („vermicclli) se usušily při 35 °C v sušárně a pak byl} ponořeny na 30 minut do lázně 1% NaBH₂ v 50mM borátovém pufru pH 15 10.0. Biokatalyzátor byl pak opláchnut destilovanou vodou. Biokatalyzátor byl uskladněn v 5 °C nebo při teplotě místnosti v 500mM fosfátovém pufru pH 8,0.

Termostatovaná kolona s vnitřním průměrem 3 cm a výškou 45 cm byla naplněna lOOg biokatalyzátoru. Kolona byla napojena na pumpu prostřednici vím recirku lační okruhu. Celkový 20 objem takto vzniklého reaktoru byl 430 ml. Okruh byl naplněn 25% roztokem amoniové soli kyseliny hydroxymethylthiomáselné. Roztok byl nanášen na kolonu směrem ze shora dolů průtokem 20 l/h. Voda, která probíhala pláštěm kolony a výměníkem tepla umožňovala udržovat teplotu na 35 °C. Demincralizovaná voda se přidávala do okruhu rychlostí 80 g/h a 2-hydroxy4-methylthiobutyronitril rychlostí 20 g/h. Nadbytečný objem reakčního média se odpařoval 25 dnem kolony, takže celkový objem v obvodu byl udržován konstantní. Takže byl získán kontinuální průtok s rychlostí konverze nitrilu 95%. Výsledná koncentrace vodného roztoku amoniové soli 2 hydroxy-4-mclylthiomáselné kyseliny na výstupu z rektoru byla 25%,

Příklad 12

Elektrodialyzér použitý v tomto případu obsahoval zásobník s devíti buňkami s plochou aktivního povrchu 2 dm\ přičemž každá buňka byla složena ze dvou koinpartinentů následujícím způsobem:

solný/kyselinový kompartment: omezen na katodové straně kationtovou výměnnou 35 membránou Neosept CMB od firmy Tokyuama Soda a na anodové straně kationtovou stranou bipolární menibrány Aqualytic, a bazický kompartment: omezený na anodové straně kationtovou membránou a na katodové straně aniontovou stranou bipolární membrány.

Anoda byla vytvořena z titanu potaženého platinou. Katoda byla z nerezové oceli.

Elektrolyt obsahující vodný roztok síranu sodného měl vodivost 100 mS/cm ve 40 °C. Rychlost cirkulace v místě elektrod byla 2 x 100 l/h. Objem byl 5 I.

Bazický komponent byl na počátku naplněn 5 1 ]% roztoku síranu amonného.

Solný/kyselinový kompartment byl na začátku naplněn 5 1 roztoku 1,44 mol/l amoniové soli kyseliny 2-hydroxyM-metylthiobutanové.

Rychlost recirkulace byla nejdříve nastavena na 130 l/h pro solný/kyselinový kompartment a 190 l/h pro bazický kompartment.

- 18r ' i mw nt ' n f v;- i/Lnvv· uv

Elektrodialýza byla provedena dávkovým způsobem (s cirkulací) při průměrné teplotě 40 ^GC.

Intenzita proudu byla nastavena na 9A. což poskytovalo proudovou hustotu 0.45 kA/m2.

Po 155 minutách činnosti zařízení vodivost v solncm/kyselém kompartmentu poklesla z 59 na

7.8 mS/cm.

Solný/kyselinový kompartment obsahoval 1,35 mol/mol kyseliny 2-hydroxy 4-metylthiobutanové, a to zc 100 % ve formě kyseliny .

Earadický výtěžek byl vypočten na 71 % a spotřeba energie byla 0,53 kWh na 1 kg vytvořené kyseliny.

Příklad 13

Elektrodialyzér použitý v tomto příkladu obsahoval zásobník sosmi buňkami uspořádanými stejně jako v příkladu 12.

Bazický kompartment byl na počátku naplněn 5,27 I 1% roztoku síranu amonného.

Solný/kyselinový kompartment byl na počátku naplněn 4.85 I roztoku 1,39 mol/1 amoniové soli kyseliny 2-hydroxy-4-rnctylthiobutanovc.

Rychlost recirkulace byla nejdříve nastavena na 60 1/h pro solný/kyselinový kompartment a 150 1/h pro bazicky kompartment.

Elektrodialýza byla provedena dávkovým způsobem (s rccirkulaeí) při průměrné teplotě 40 °C. Intenzita proudu byla nastavena na 9A. což poskytovalo proudovou hustotu 0,45 kA/m2.

Po 172 minutách činnosti zařízení vodivost v solncm/kyselcm kompartmentu poklesla z 59 na

9,5 mS/cin.

Konečný objem solného/kyselého kompartmentu byl 4,67 1.

Solný/kyselinový kompartment obsahoval 1,24 mol/1 kyseliny 2-hydroxy—4-mety lthiobutanové a 0,148 mol/1 2 hydroxy-4-metylihiobutanoátu. Konverze byla 86%. Earadický výtěžek byl vypočten na 74 % a spotřeba energie byla určena na 0,58 kWh na 1 kg vytvořené kyseliny.

Příklad 14

V tomto příkladu bylo použito obdobné zařízeni jako v příkladu 13.

Bazický kompartment byl na počátku naplněn 5,46 I 1% roztoku síranu amonného.

Solný/kyselinový kompartment byl na počátku naplněn 5.23 1 roztoku 1,24 mol/1 amoniové soli kyseliny 2-hydroxy-4 metylthiobutanové.

Rychlost recirkulace byla nejdříve nastavena na 90 1/h pro solný/kyselinový kompartment a 150 1/h pro bazický kompartment.

Elektrodialýza byla provedena dávkovým způsobem (s recirkulací) při průměrné teplotě 40 °C. Intenzita proudu byla nastavena na 14 A, což poskytovalo proudovou hustotu 0.7 kA/m2.

Po 105 minutách činnosti zařízení vodivost v solném/kyselém kompartmentu poklesla z 57,6 na

9.8 mS/cm.

- 19lžu

Konečné sloužení roztoku v solncho/kyselého kompartmentu bylo následující:

1,28 mol/l kyselina 2-hydroxy-4-metylthiobutanová a 0.14 mol/l 2-hydroxy 4 metylthiobutanoát. Konverze by la 86%. Produkt byl tedy z 90% ve formě kyseliny.

Příklad 15

Bylo použito zařízení podobné zařízení použitému v příkladu 13.

Pokus byl proveden s obsahem bazického kompartmentu který byl získán jako výsledek příkladu 14.

Solný/kysclinový kompartment byl na počátku naplněn 5.2 1 roztoku 1.44 mol/l amonné soli kyseliny 2-hydroxy-4 metylthiobutanové.

Rychlost rccirkulace byla nejdříve nastavena na 50 1/h pro solný/kysclinový kompartment a 150 1/h pro bazický kompartment.

Elektrodialýza byla provedena dávkovým způsobem (s rccirkulací) při průměrné teplotě 42 °C. Intenzita proudu byla nastavena na 19 a, což poskytovalo proudovou hustotu 0.95 kA/m2.

Po 53 minutách činnosti zařízení vodivost v solném/kysclcm kompartmentu poklesla z 59 na 27 mS/cm.

Konečný objem solného/kyselého kompartmentu byl 4.85 1.

Složení bylo následující: 0,87 mol/l kyseliny 2-hydroxy-4 metylthiobutanové a 0.56 mol/l 2-hydroxyM-metylthiobutanoátu. Míra konverze byla 56 %. Finální produkt byl z 61% ve formě kyseliny. Faradický výtěžek byl vypočten na 83 % a spotřeba energie byla určena na 0,7 kWh na 1 kg vytvořené kyseliny.

Příklad 16

200,1 g HMTBS koncentrace přibližně I.5M bylo koncentrováno dávkovým způsobem v rotační odparce. Teplota lázně byla 45 ± 5 °C. Tlak byla regulován na přibližně 2,5 x 10' Pa (25 mbar). Teplota v destilačním zařízení se měnila od 25 °C na počátku destilace až do 40 °C na jejím konci. Po třech hodinách bylo získáno 41.9 g žlutého viskózniho média s následujícími charakteristikami.

Visko žita při 2 5 °C (mrr.- s^L)	1150
«ΗΜΤΒΑ (Br/BrO₃)	83, 3

Po nastavení titru (naředěním vodou) byl získán produkt s následujícími charakteristikami:

Viskosita při 25 °C (míro'	396
ŠHMTBA (Br/BrO₃j	79,5

Potenciometricky byla zjištěna následující distribuce hmoty:

-20f · HIV 1 <VT r, ,· vz, iwrvó¹ uu

7 HMTBS	8 C 6
5 HMTBA	6, 0

Poměr ploch monomeru nebo dimerů/(monomer + dimery) byl stanoven pomocí HPLC:

Monomer/(monomcr + dimery') 100

Dimery/(monomery + dimery) 0

Což znamená, že žádné dimery nebyly detekovány.

Příklad 17

200.0 g HMTBS koncentrace přibližně L5 M bylo koncentrováno dávkovým způsobem v rotační odparce. Teplota lázně byla I2l t 5 °C. Tlak byl regulován na přibližně 9,5 x I0⁴ Pa. Teplota v destilačním zařízení se měnila od 100 °C na počátku destilace až do l I3 °C na jejím konci. Po třech hodinách bylo získáno41,5 g žlutého viskózního média s následujícími charakteristikami.

Viskosita při 25 °C (mír? s“¹)	-
£HMTBA (Br/BrOj	90, 7

Po nastavení titru (nareděním vodou) byl získán produkt s následujícími charakteristikami:

Viskosita při 25 °C (mrv s^_i)	117
ÍHMTBA (Br/BrOj)	78,8

Potenciometricky byla zjištěna následující distribuce hmoty:

í HMTBS	q 7 r b 1 / Q
-3 HMTBA	6, 0

Poměr ploch monomeru nebo dimcrů/(monomerů + dimery ) byl stanoven pomocí HPLC:

Monomer/(monomer + dimery) 95

Dimery/( monomer + dimery) 5,0

Příklad 18 g II,O bylo přidáno ke lOO.Og média z příkladu 17. Médium bylo extrahováno 75,0 g izopropyléteru. Po rozdělení fází bylo po odpaření organické fáze získáno 25,6 g HMTBA s následujícími charakteristikám i.

Stanoveni
Monomer/(monomer + dimery)	(¾ plochy;	97
Dimery/(monomer y dimery) (’	é plochy)	3,0
Viskozita při 25 °C (mm² s’J	55

-2I Příklad 19

Stárnutí roztoků popsaných v předchozích příkladech

	Příklad 16	Přiklad 17	Příklad 18
Doba uchovávání ve 25 °C	40 dnů	4 0 dnů	100 dnů
Viskožita ínm2s-l 1	387	116	66
Mor.o.noner/ ímoncTier-sdiraer)	100,0	95, 0	82
D m e r y / í monome r + d i ras r)	o o	5/0	18

Roztoky v příkladech 16 a 17 nemění obsah dimerů po 40 dnech skladování.

Claims

1. Způsob kontinuální přípravy kyseliny 2 hydroxy-4-melylthiomáselné (HMTBA) a/nebo amonné soli kyseliny 2-hydroxy-4· metylthiomáselné (HMTBS) enzymatickou hydrolýzou i? 2-hydroxy-4-metylthiobulyronitrilu, vyznačující se tím, žc

b) v druhém kroku sc uvedený biologický materiál iinobílizuje,

c) ve třetím kroku se 2-hydroxy-4-nictvlthiobutyroniiril vystaví působení imobilizovaného biologického materiálu, aby se získala amonná sůl kyseliny 2-hydroxy~4-metylthiomáseInc.

20 d) ve čtvrtém kroku se případná sůl získaná podle bodu c) přemění na odpovídající kyselinu a

e) v pátém kroku sc produkt získaný podle kroku c) nebo d) koncentruje.

2. Způsob podle nároku 1, vyznaču jící se tím, že nitrilázová aktivita se získá z nitrilázy Alcaligenes, výhodně druhu faecalis.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2. vyznačující sc tím. že nitrilázová aktivita sc získá z genetické informace kódující nitrilázu, která sc exprimuje v hostitelském organismu.

4. Způsob podle nároků I až 3, vyznačující se tím, žc hostitelský 30 mikroorganismus je Escherichia coli nebo patří do rodu Bacillus. Corynebactcrium,

Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces. Penicillium a Aspergillus.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nitrilázová aktivita se získá z nitrilázy kódované genem klonovaným do plazmidu pRPA-BCAT3, který je uložen v CBS pod

35 číslem CBS 998- 96.

6. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že nitriláza je koexprimována s chapcronovým proteinem.

40

7. Způsob podle nároku I. vyznačuj ící se tím. že chaperonový protein jc GroESL z Escherichia coli.

íjw

8. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím. že biologicky mateirál podle kroku a) se i mobilizuje na pevný nosič.

9. Způsob podle nároku 8. vyznač uj ící se tím. že pevný nosič má částice velikosti 5 v rozmezí 1 až 500 gm, výhodně 10 až 200 gm. a jc přidán v množství odpovídajícím 0.01 až

200 % hmotnostních, výhodné 10 až 100 % hmotnostních biologického materiálu.

10. Způsob podle nároku 9. v y z n a č u j í c í se tím. že pevný nosič se vybere ze skupiny obsahující ίο - iontoměníčové pryskyřice.

oxid hlinitý, syntetické oxidy křemičité, křemclinu a siIikagely.

zeolity,

- dřevěné uhlí.

15 - ve vodě částečně rozpustné proteiny a polysacharidy.

11. Způsob podle nároku 10. v y z n a č u j í c í se tím. že pevný nosič je glulen.

2o

12. Způsob podle nároku 8, v y z n a č u j í c í se tím. že se použije alespoň jedno chemické činidlo k zesílení nebo zrušení rozpustnosti - insolubiIizaci - biologického materiálu a nosiče.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím. že chemické činidlo se vybere ze skupiny obsahující

25 - polymery polyazetidinu, polymery polyetyleniminu, polymery' polyamidu, polymery' izokyanátu.

alginátové gely.

30 - karagenové gely.

aminy, aldehydy.

karboxylové kyše I i ny a izokyanáty.

14. Způsob podle nároků 10 až 13. vyznačující se tím. že biologický materiál a nosič se smíchají za přítomnosti chemického činidla, aby se získala pasta, která se extrahuje a suší.

15. Způsob podle nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že biologický materiál 40 a alespoň jedno chemické činidlo se smíchají a pak nanesou na nosič v podobě tenké vrstvy.

16. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároku, vyznačující se tím, že směs IIMTBS a ΗΜΤΒΛ, obsahující alespoň 60 % 1IMTBA, výhodně alespoň 80% ΗΜΤΒΛ, doplněk jc HMTBS, se získá elektrolytickou disociaci odpovídající amonné soli, přičemž sc uvolňuje

45 hydroxid amonný.

17. Způsob podle nároku 16. v y z n a č uj í c í se tím, že disociace se provádí velektrodialyzačním zařízení s bipolárnimi membránami, které má tří kompartmenty.

f ’· f πινιιιι r > z v.. Z , uv

18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím. že disociace sc provádí v clektrodialyzačním zařízení s bipolárními membránám i. které má dva kompartmenty.

19. Způsob podle kteréhokoliv znároků 1 až 15. vyznačující sc tím, že směs HMTBS a HMTBA se získá zahříváním roztoku amonné soli.

20. Způsob podle nároků 16 až 19, vyznačující se tím. že uvolňovaný hydroxid amonný se destiluje, koncentruje a recykluje v syntéze HCN.

21. Vodný roztok získaný způsobem podle nároků 16 až 19, který obsahuje směs HMTBA a HM TBS, přičemž poměr hmotnosti ΗΜΤΒΛ/(ΗΜΤΒΑ i HMTBS) je 5 až 99,9%, výhodně 10 až 50%.

22. Zařízení k provádění způsobu podle nároku I, v y z n a č u j í c í se tím. že obsahuje

- jeden nebo několik reaktorů (3, 4) naplněných imobilizovanými enzymy s nitrilázovou aktivitou nebo imobilizovanými hostitelskými mikroorganismy exprimujícími enzym s nitrilázovou aktivitou, případně alespoň jedno elektrodialyzační zařízení (9) a zařízení (6, 12) koncentrující výsledný produkt.