PT1411126E - Polinucleótido que codifica para uma nitrilase e polipéptido expresso por um referido polinucleótido - Google Patents

Description

ΕΡ 1 411 126 /PT DESCRIÇÃO "Polinucleótido que codifica para uma nitrilase e polipéptido expresso por um referido polinucleótido" A presente invenção refere-se a um polinucleótido que codifica para uma nitrilase, a um polipéptido e a um material biológico possuindo uma actividade de nitrilase. A presente invenção insere-se num novo processo de preparação do ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico (HMTBA) e/ou do seu sal de amónio (HMTBS). 0 ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutirico e seus sais são utilizados desde há muito tempo na alimentação animal em substituição da metionina, onde apresentam a vantagem sobre esta última de se apresentarem sob uma forma liquida, o que facilita a sua utilização pelas firmas produtoras de alimentos.

Sabe-se desde há muito preparar o ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico por via química. Podem-se assim citar as patentes EP 142 488, EP 143 000, que descrevem a hidrólise do 2-hidroxi-4-metiltio-hidroxibutironitrilo (HMTBN) por um processo em duas etapas. A primeira etapa consiste em colocar em contacto o 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo com um ácido inorgânico forte tal como o ácido clorídrico ou sulfúrico. Numa etapa ulterior, após diluição com água, a hidrólise é completada a uma temperatura mais elevada. O ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico é em seguida extraído com um solvente orgânico pouco miscível com água tal como uma cetona, de preferência a metilisobutilcetona e depois o solvente é eliminado por evaporação. Este tipo de processo, utilizado ao nível industrial, comporta no entanto alguns inconvenientes. Produz uma quantidade molar de sulfato de amónio pelo menos igual à quantidade molar de nitrilo introduzida, que tem que ser eliminada, gerando assim um resíduo industrial que vai ao encontro de uma política de protecção do ambiente. Este processo necessita também da utilização de quantidades importantes de solvente que é absolutamente necessário reciclar. 2

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Outros processos, tais como os descritos nas patentes US 3 773 927 e 4 353 924 consistem em hidrolisar o 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo com o ácido cloridrico e depois concentrar o meio com separação do cloreto de amónio formado. 0 sal obtido é tão difícil de eliminar quanto o sal anterior e adicionalmente, o ácido obtido apresenta uma forte coloração. É ainda descrito na patente EP 330 521 um processo de hidrólise química do metiltio-hidroxipropionitrilo que consiste, como anteriormente, em realizar uma hidrólise em meio sulfúrico. A mistura é parcialmente neutralizada com amoníaco. Surge uma separação bifásica. A fase orgânica contém a maioria do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico e a fase aquosa contém a maioria do sulfato de amónio produzido. A solução orgânica após evaporação da água contida é filtrada de modo a recuperar o sulfato de amónio dissolvido. O ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico é de seguida diluído com um pouco de água e estabilizado com um pouco de ácido sulfúrico. A solução aquosa após eliminação da água permite obter o sulfato de amónio directamente comercializável. Este processo resolve em parte os inconvenientes dos processos da arte anterior no que se refere à utilização de solventes orgânicos mas não resolve em nada os problemas ligados aos resíduos de sais minerais.

Entre as patentes relativas aos sais do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, podem-se citar as patentes US 2 745 745, 2 938 053 e 3 175 000 que se referem a sais de cálcio e/ou de amónio. A mistura obtida por hidrólise do 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo é tratada com hidróxido ou carbonato de cálcio. 0 sulfato de cálcio é então precipitado libertando amoníaco que forma o sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico. Aqui subsiste ainda o problema que consiste em eliminar o sulfato de cálcio. É ainda descrito no pedido de patente WO 96/01808, um processo que consiste em praticar uma hidrólise e uma extracção com um solvente orgânico como no primeiro documento da arte anterior citado, mais uma neutralização da solução orgânica com amoníaco. Este processo, como a maioria dos processos anteriormente descritos, leva à formação de pelo 3

ΕΡ 1 411 126 /PT menos uma mole de sulfato ou de cloreto de amónio por mole de nitrilo introduzido e exige a reciclagem de quantidades importantes de solvente orgânico. Não pode permitir obter uma solução de sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4- metiltiobutírico com um custo industrialmente interessante.

Descreve-se, por outro lado, em W096/09403, a utilização de uma nitrilase como catalisador da hidrólise de um grupo nitrilo em grupo carboxilico. 0 processo descrito neste documento não é no entanto utilizável à escala industrial, devido à insuficiente actividade dos microorganismos que sintetizam estas nitrilases.

Verificou-se agora, graças ao processo que se descreve adiante, que utilizando várias etapas especificas, era possível obter o ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutanóico e/ou o seu sal de amónio por via enzimática à escala industrial, com um rendimento elevado, sem utilização de solventes e sem a produção concomitante de sais minerais.

Este processo de preparação do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico e/ou do sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico por hidrólise enzimática do 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, consiste: a) numa primeira etapa, preparar um material biológico possuindo uma actividade de nitrilase, b) numa segunda etapa, imobilizá-lo, c) numa terceira etapa, colocar o 2-hidroxi-4- metiltiobutironitrilo em presença do material biológico assim imobilizado, para obter o sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, d) numa quarta etapa, eventualmente, converter o sal obtido na etapa c) no ácido correspondente, e e) numa quinta etapa, concentrar o produto obtido na etapa c) ou d) .

Para obter o material biológico possuindo a actividade de nitrilase, requerida para a aplicação do processo anteriormente definido, a presente invenção propõe em particular um polinucleótido que codifica para uma nitrilase, 4

ΕΡ 1 411 126 /PT compreendendo o gene da nitrilase denominado Nit B contido no plasmideo pRPA-BCAT3 depositado na CBS com o número CBS 9 9 8-96, e um polipéptido possuindo uma actividade de nitrilase, compreendendo uma sequência de nitrilase susceptível de ser obtida por expressão do gene da nitrilase denominado Nit B, clonado no plasmideo pRPA-BCAT3 depositado na CBS com o número CBS 998-96. A invenção será explicada de modo detalhado na descrição que se segue na qual se fará referência às figuras anexas nas quais: a figura 1 representa um esquema de uma célula de electrodiálise empregue na etapa facultativa d); a figura IA representa uma célula de electrodiálise de membrana bipolar de três compartimentos; a figura 1B representa uma célula de electrodiálise de membrana bipolar de dois compartimentos. - a figura 2 representa um esquema de uma instalação para a realização do processo de acordo com a invenção; - a figura 3 representa o mapa de restrição dos plasmídeos pRPA-BCATl a 5. a figura 4 representa a estratégia de sequenciação do fragmento de 1130 pb contendo a sequência de ADN (denominada na figura nitB) que codifica para o polipéptido possuindo actividade de nitrilase de acordo com a invenção. Os números referem-se à identidade dos iniciadores utilizados para a sequenciação assim como as notações M13FWD e M13REV. - a figura 5 representa o mapa de restrição dos plasmídeos pRPA-BCAT12 e pRPA-BCAT13. - a figura 6 representa a electroforese em gel de SDS-PAGE a 10% que mostra a expressão das sequências de ADN de acordo com a invenção nas estirpes de E. coli BL21(DE3)/pRPA-BCAT12, BL21(DE3)/pRPA-BCAT13, BL21(DE3)/pRPA-BCAT12 + pXL2231, BL21(DE3)/pRPA-BCAT13 + pXL2231. Cada pista corresponde a uma quantidade de proteínas solúveis de 10 μρ e um volume equivalente de fracção bruta e insolúvel. - a figura 7 representa a electroforese em gel de SDS-PAGE a 10% que mostra a expressão da sequência de ADN de referência de acordo com a invenção nas estirpes de E. coli DH5a/pRPA-BCAT3, DH5a/pRPA-BCAT6, DH5a/pRPA-BCAT6 + pXL2035, RPA- 5

ΕΡ 1 411 126 /PT BIOCAT76. Cada pista corresponde a uma quantidade de proteínas solúveis de 10 μρ e um volume equivalente de fracção bruta e insolúvel. - a figura 8 representa o mapa de restrição do plasmídeo pRPA-BCATl4. - a figura 9 representa a electroforese em gel SDS-PA a 10% que mostra a expressão das sequências de ADN de acordo com a invenção nas estirpes de P. putida G2081 (pRPA-BCATl4), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCATl4), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT23) , A. faecalis ATCC8750(pRPA-BCAT24).

Cada pista corresponde a uma quantidade de proteínas solúveis de 10 μρ e um volume equivalente de fracção bruta e eventualmente insolúvel. - a figura 10 representa o mapa de restrição do plasmídeo PCGL1087. - a figura 11 representa o mapa de restrição do plasmídeo pOS48.7. A primeira etapa consiste em preparar o material biológico possuindo actividade de nitrilase. O material biológico pode consistir numa solução enzimática tal e qual ou em células completas ou destruídas possuindo actividade de nitrilase.

Vantajosamente, utiliza-se um microorganismo que expressa uma nitrilase. A nitrilase pode nomeadamente ser proveniente de um microorganismo, em particular um microorganismo do género Alcaligenes, Rhodococcus ou Gordona, nomeadamente Alcaligenes faecalis, Rhodococcus sp. HT 29-7, Gordona terrae, de preferência as estirpes descritas em WO 96/09403.

Utiliza-se vantajosamente um microorganismo que expressa actividade de nitrilase obtido por transferência da informação genética que codifica para a nitrilase de um microorganismo progenitor num microorganismo hospedeiro. Em 6

ΕΡ 1 411 126 /PT particular, em E. coli, pode-se utilizar a co-expressão das proteínas acompanhantes (chaperonnes) Gro ESL para melhorar os desempenhos da estirpe recombinante.

Para isto, utiliza-se qualquer vector de expressão apropriado, nomeadamente um vector plasmídico. A sequência nucleotídica utilizada neste caso será então colocada sob o controlo de sinais que permitem a sua expressão num hospedeiro celular. 0 hospedeiro celular utilizado pode ser seleccionado entre sistemas procariotas, como bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, ou eucariotas, como por exemplo leveduras, fungos ou qualquer outro sistema. Os sinais que controlam a expressão dos polipéptidos são seleccionados em função do hospedeiro celular utilizado. Para isto, o ADN que codifica para uma nitrilase pode ser inserido em vectores de replicação autónoma no seio do hospedeiro seleccionado, ou vectores integrativos do hospedeiro seleccionado. Estes vectores serão preparados de acordo com métodos correntemente utilizados pelo perito na especialidade, e as construções resultantes podem ser introduzidas num hospedeiro apropriado por métodos Standard tais como a electroporação. A título de microorganismo hospedeiro, podem-se citar em particular Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida, Escherichia coli, ou os microorganismos do género Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillium e Aspergillus.

Um vector preferido para a expressão em E. coli é o plasmídeo pRPA-BCAT6. A segunda etapa do processo consiste em imobilizar o material biológico. Esta imobilização faz-se, vantajosamente, em presença de um suporte sólido e permite obter partículas sólidas cujo tamanho, a forma e resistência mecânica podem ser controladas. Permite também empregar simultaneamente polímero de poliazetidina e outros agentes reticulantes. 7

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Este processo de imobilização pode fazer intervir células completas ou permeabilizadas. Pode também aplicar-se a uma solução enzimática isenta de células.

As enzimas utilizadas para a imobilização são nitrilases. 0 processo de imobilização consiste em imobilizar o material biológico activo num suporte sólido, de granulometria nomeadamente compreendida entre 1 μιη e 3 mm, de preferência 10 μιη e 2 mm, graças a agentes quimicos que reagem com as funções amina (NH2, NH) , carboxilo (COOH), hidroxi (OH), tiol (SH) ou amida (CONH2) do agente biológico e do suporte. Estes agentes quimicos permitem também insolubilizar em água o material biológico e o suporte. A massa obtida é muito maleável e pode ser colocada em forma a fim de obter partículas de forma e de tamanho desejados. A coesão e a dureza destas partículas são em seguida obtidas por secagem. O material biológico à imobilizar pode eventualmente conter igualmente um material biológico inactivo presente numa razão de 0 a 200% em peso. Este material biológico inactivo pode ser de proteínas (albumina, gelatina) ou de polissacáridos (quitosano, k-carragenano, alginato). O suporte inerte sobre o qual é depositado o material biológico e o polímero pode ser constituído por partículas orgânicas ou inorgânicas, porosas ou não porosas, hidrófilas ou hidrófobas. Entre estas partículas, podem-se assinalar sem limitação: - as resinas permutadoras de iões, - a alumina, - as sílicas sintéticas ou diatomadas e os géis de sílica, - os zeólitos, - os carvões, - as proteínas insolúveis em água, como o glúten, - os polissacáridos, como o amido. O suporte inerte pode ser adicionado numa razão de 0,01 a 500% em peso do material biológico e de preferência de 10 a 200%. 8

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Os agentes químicos utilizados para insolubilizar o material biológico podem ser polímeros ou moléculas bifuncionalizadas que reagem com as funções amina (NH2, NH), carboxílica (COOH) , hidroxi (OH), tiol (SH), amida (CONH2) . Podem-se citar: - os polímeros de poliazetidina, - os polímeros de polietilenimina, - os polímeros de poliamida, - os polímeros de isocianatos, - os géis de alginato, - os géis de k-carragenano, - as aminas como a hexametilenodiamina, - os aldeídos como o glutaraldeído, - os ácidos carboxílicos como o ácido adípico, e - os isocianatos. 0 processo de imobilização pode fazer intervir um ou mais destes agentes químicos. 0 agente químico é adicionado numa concentração compreendida entre 1 e 50% em peso em relação ao material biológico e ao suporte. Prefere-se uma quantidade compreendido entre 5 e 30% a fim de obter partículas suficientemente sólidas e que conservem uma actividade importante e que não apresentam demasiados problemas de difusão interna. A duração do tratamento de reticulação está compreendida entre 0,5 e 24 horas. A temperatura do processo está geralmente compreendida entre 4 e 65°C. Prefere-se uma temperatura compreendida entre 20 e 40°C. A temperatura empregue no processo de imobilização pode também ser muito dependente da estabilidade do material biológico empregue. O pH durante a fase de imobilização é mantido entre 5 e 11. Prefere-se um pH compreendido entre 6 e 10 com uma preferência para os pH alcalinos. O pH é também seleccionado em função da resistência do material biológico e será facilmente determinado pelo perito na especialidade. A conformação do biocatalisador deverá permitir o seu emprego num sistema qualquer, nomeadamente num leito fixo. 9

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Um método de formulação pode ser a extrusão. Para isto, o material biológico e o suporte são reticulados por adição de um ou mais agentes químicos. Após o tratamento, a massa insolúvel é recuperada por centrifugação ou após floculação e filtração. Prefere-se um teor de matéria seca de pelo menos 10%. A massa é em seguida extrudida. Por este método, obtêm-se de preferência formas cilíndricas finas de diâmetro compreendido entre 0,3 e 0,5 mm e com um comprimento compreendido entre 1 e 10 mm. Estas formas cilíndricas finas podem ser esferonizadas. As partículas obtidas são em seguida secas.

Um outro método de formulação pode ser o revestimento ("spray coating"). Para isto, o material biológico é misturado com um ou mais agentes químicos. Após a reacção, a mistura é pulverizada sobre o suporte sob a forma de uma camada fina. Por este método, obtêm-se grânulos de diâmetro médio compreendido entre 0,1 e 2 mm.

As partículas obtidas podem eventualmente ser em seguida mergulhadas numa solução de um agente redutor como o boro-hidreto de sódio a fim de reduzir as funções imina formadas aquando da reticulação.

As partículas obtidas são suficientemente sólidas e resistentes ao atrito para serem empregues num leito fixo, um leito fluidizado ou um reactor agitado. A terceira etapa do processo de acordo com a invenção consiste em utilizar o material biológico imobilizado numa ou mais colunas ou reactores. A finalidade desta etapa é a de poder produzir em contínuo o sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico a partir do 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo. A, ou as colunas ou reactores são alimentados por uma solução pura ou diluída do 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo ou uma mistura contendo o 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo e o sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico. 10

ΕΡ 1 411 126 /PT A, ou as colunas ou reactores são operados de preferência a uma temperatura compreendida entre 10 e 60°C e a um pH compreendido entre 5 e 9. O sistema utilizado pode ser constituído por duas ou mais colunas ligadas umas às outras em série, com, segundo uma primeira maneira de aplicar a invenção, a alimentação da solução aquosa do 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo no topo da primeira coluna com uma alimentação simultânea das outras colunas com a solução do 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo numa quantidade limitada à solubilidade deste composto na mistura reaccional; este sistema é intitulado sistema em andares. Segundo uma segunda maneira de aplicar a invenção, utiliza-se uma ou mais colunas ligadas umas às outras em paralelo num circuito de circulação. Segundo esta instalação, o 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo em solução aquosa é alimentado em contínuo no circuito, e o meio reaccional é bombeado em contínuo de modo a conservar um volume constante no circuito; este sistema é intitulado sistema-circuito. 0 tipo de reactor utilizado na presente invenção pode ser do tipo leito fixo, leito fluido, ou do tipo agitado em contínuo. Prefere-se utilizar reactores do tipo leito fixo porque estes reduzem os problemas de atrito que podem ser encontrados com as partículas de células imobilizadas. Se o microorganismo for utilizado tal e qual, preferir-se-á utilizar um reactor agitado acoplado a um módulo de ultrafiltração para separar de modo contínuo o microorganismo do produto de interesse. A quarta etapa que é uma etapa facultativa consiste em converter o sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico no ácido correspondente. Esta etapa pode ser realizada segundo dois métodos: - por electrodiálise por meio de um electrodialisador de dois ou três compartimentos, - por aquecimento da solução aquosa que pode ser seguido de uma extracção líquido/líquido.

Seguindo o método por electrodiálise, empregar-se-á um electrodialisador de dois ou três compartimentos. 11

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Entende-se como "compartimento", o espaço entre duas membranas, seja entre uma membrana bipolar e homopolar, ou entre duas membranas homopolares adjacentes. Entende-se como "célula", um conjunto de dois ou três compartimentos. Uma pilha compreende entre 5 e 300 células. O electrodialisador é composto por uma pilha e contém evidentemente um ânodo e um cátodo.

As membranas homopolares que podem ser utilizadas no quadro da invenção dividem-se em duas grandes famílias, de acordo com o seu modo de fabrico.

Assim, podem-se empregar membranas heterogéneas, preparadas a partir de resinas permutadoras de iões, misturadas com um ligante tal como o policloreto de vinilo, o polietileno ou outro. O conjunto assim formado pode induzir uma trama como por exemplo um tecido de poliéster ou de poliacrilonitrilo.

Podem-se utilizar igualmente membranas homogéneas, obtidas por introdução de um grupo funcional num suporte inerte, por enxerto químico ou radioquímico. O método químico mais utilizado, consiste geralmente em funcionalizar um látex de um polímero compreendendo núcleos aromáticos, tal como estireno/divinilbenzeno ou estireno/butadieno. O látex assim funcionalizado pode servir em seguida para induzir uma trama como para as membranas heterogéneas. O método radioquímico compreende geralmente o enxerto, sob a influência de irradiação, de um composto aromático, tal como o estireno, sobre um suporte inerte como uma folha de polietileno ou de politetrafluoroetileno. O núcleo aromático é em seguida funcionalizado como no método químico.

As membranas permutadoras de catiões compreendem grupos ácidos fortes, mais frequentemente grupos sulfonato, ou grupos ácidos fracos, frequentemente grupos carboxilato. Mais raramente, os grupos ácidos podem ser grupos PCq2-, HP02~, As032“, SeCb”.

As membranas permutadoras de aniões possuem grupos básicos fortes, muito frequentemente grupos amónio quaternário, ou grupos básicos fracos, mais frequentemente 12 ΕΡ 1 411 126 /PT grupos amina. Mais raramente, os grupos básicos podem ser grupos fosfónio quaternário ou grupos sulfónio.

No presente processo, as membranas catiónicas possuem de preferência grupos ácidos fortes e entre eles preferencialmente grupos sulfonato e as membranas aniónicas possuem de preferência grupos básicos fortes e entre eles grupos amónio quaternário.

As membranas bipolares são uma montagem de duas membranas, uma catiónica, a outra aniónica. Quando a membrana é submetida a um campo eléctrico suficiente, a água de solvatação na interface da membrana dissocia-se em iões H+ e OfT, que migram respectivamente para o cátodo atravessando a face catiónica e para o ânodo atravessando a face aniónica. Como membranas bipolares, podem-se citar a titulo de exemplo as membranas comercializadas pelas firmas Aqualytics, Tokuyama Soda ou FuMaTech. 0 ânodo do electrodialisador pode ser constituído por materiais classicamente utilizados em electrodiálise, por exemplo grafite, níquel ou titânio revestido com metais preciosos ou óxidos de metais preciosos, nomeadamente titânio platinado. 0 cátodo pode igualmente ser constituído por materiais classicamente utilizados em electrodiálise, por exemplo grafite, aço inoxidável ou níquel. 0 electrodialisador é alimentado com a solução aquosa a tratar. É igualmente necessário fazer circular ao ânodo uma solução de um anólito e ao cátodo uma solução de um católito. Pode-se empregar igualmente uma solução única de electrólito. No presente processo, é bem conveniente um circuito único de electrólito. 0 papel da solução de electrólito é o de assegurar uma suficiente condutividade. De preferência, esta condutividade será igual ou superior a 20 milisiemens por centímetro (mS/cm), sem que este limite inferior se considere crítico para a realização do processo. O electrólito utilizado é um composto ionizável tal como um sal, um ácido ou uma base. O electrólito é de preferência seleccionado entre os compostos não electroactivos. Assim, 13

ΕΡ 1 411 126 /PT por exemplo, é preferível utilizar sais neutros como os sulfatos, ácidos como o ácido sulfúrico, bases como a soda.

As densidades de corrente aplicadas estão geralmente compreendidas entre 0,2 e 1,5 kA/m2, e de preferência entre 0, 4 e 1 kA/m2. A temperatura à qual é realizado o processo da invenção situa-se num domínio compatível com a estabilidade das membranas. Operar-se-á de preferência a uma temperatura compreendida entre 30 e 60°C. O electrodialisador pode funcionar de diferentes maneiras. Pode por um lado funcionar em contínuo, a solução a tratar atravessando em contínuo a pilha; são então dispostas várias etapas em série se as taxas de tratamento a obter o exigirem. Pode também funcionar em descontínuo, a solução a tratar recirculando sobre uma cuba até que seja obtida a taxa de tratamento desejada. Finalmente, pode funcionar em passagem directa com recirculação parcial.

De acordo com uma primeira variante, a dissociação do sal de amónio em ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico e em amoníaco pode realizar-se numa célula de electrodiálise de membranas bipolares de três compartimentos tal como representado esquematicamente na figura IA.

Um aparelho de electrodiálise conveniente para a realização do processo é constituído por diferentes compartimentos, delimitados respectivamente por membranas catiónicas (MC), membranas bipolares (MB) e membranas aniónicas (MA). Estes compartimentos dividem-se em compartimento "sal" (S) onde diminuem os compostos a separar, em compartimento "base" (B) e ácido (A) onde se concentram respectivamente o ácido e a base regenerados a partir do sal. O sal de amónio é introduzido no compartimento "sal". Sob a acção do campo eléctrico, o ião amónio migra para o cátodo saindo do compartimento (S) onde se encontra, através de uma membrana permutadora de catiões (membrana catiónica) e combina-se com os iões OH” provenientes da face aniónica da 14

ΕΡ 1 411 126 /PT membrana bipolar, no seio da qual se efectua a dissociação da água sob o efeito do campo eléctrico.

Simultaneamente, os iões carboxilato (2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato) migram para o ânodo saindo do compartimento (S) onde se encontram, através de uma membrana permutadora de aniões (membrana aniónica). Após passagem para o compartimento (A) seguinte, são protonados por captação de iões H+ provenientes da face catiónica da membrana bipolar. Os três compartimentos (B) , (A), (S) adjacentes formam uma célula de electrodiálise.

Numa segunda variante, a regeneração do ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico pode fazer-se numa célula de electrodiálise de membranas bipolares de dois compartimentos tal como representado na figura 1B. Estes dois compartimentos são delimitados respectivamente por membranas catiónicas e membranas bipolares. Estes compartimentos dividem-se em compartimento "sal/ácido" (S/A) e base (B). 0 sal de amónio é introduzido no compartimento "sal/ácido". Sob a acção do campo eléctrico, o ião amónio migra para o cátodo saindo do compartimento (S/A) onde se encontra, através de uma membrana permutadora de catiões (membrana catiónica) e combina-se com os iões ΟΒΓ provenientes da face aniónica da membrana bipolar, no seio da qual se efectua a dissociação da água sob o efeito do campo eléctrico.

Simultaneamente, o compartimento S/A acidifica-se por captação de iões H+ provenientes da face catiónica da membrana bipolar. Os dois compartimentos (B) e (S/A) adjacentes formam uma célula de electrodiálise.

Esta configuração apresenta a vantagem de um menor consumo energético e permite fazer variar a proporção sal/ácido desejada.

Para obter um bom funcionamento do electrodialisador, a condutividade eléctrica do compartimento "base" (tal como a do compartimento ácido no caso da configuração de três compartimentos), deve ser suficiente e pode ser ajustada com 15

ΕΡ 1 411 126 /PT ο auxílio de um electrólito de suporte. Assim, a condutividade da solução de amoníaco pode ser aumentada por adição de um sal de amónio, como o sulfato de amónio.

Numa variante preferida, utilizar-se-á o 2-hidroxi-4-metiltiobutanoato de amónio.

Numa concretização particular, introduz-se no compartimento "sal" de uma célula de electrodiálise de três compartimentos uma mistura de sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico e de 2-hidroxi-4- metiltiobutironitrilo. 0 sal será dissociado como anteriormente em 2-hidroxi-4-metiltiobutirato e migrará para o ânodo ou será transformado em ácido 2-hidroxi-4- metiltiobutírico, o ião amónio migrará para o cátodo onde será transformado em amoníaco, no compartimento "sal" subsistirá a água e o 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo não transformado que será reciclado para a coluna de hidrólise.

Seguindo o método por aquecimento, recupera-se o ácido deslocando o equilíbrio entre sal de amónio, ácido livre aquecendo a solução aquosa rica em HMTBS e removendo o amoníaco assim libertado. Pode-se assim prosseguir aquecendo sob vácuo ou à pressão atmosférica com ou sem tratamento por separação. 0 emprego de CO2 sob pressão pode ser considerado a fim de facilitar o deslocamento do equilíbrio. Obtém-se uma mistura de HMTBS e de HMTBA à razão de 5 a 99,9% de HMTBA, e de preferência 10 a 50% de HMTBA em relação à soma de HMTBA e HMTBS. A viscosidade destas soluções está compreendida entre 1200 e 30 mm2.s_1 (1200 e 30 cSt) e de preferência entre 200 e 50 mm2.s_1 (200 e 50 cSt) a 25°C.

As soluções aquosas podem ser decompostas por extracção do ácido com utilização de produtos solventes parcialmente miscíveis ou não com água. Existe um grande número de solventes possíveis para a separação. Os solventes preferidos são as cetonas de C5 a C8, em particular a metilisobutilcetona; os éteres como o isopropiléter; os álcoois como o isopropanol; os ésteres; as aminas terciárias como a trioctilamina. No âmbito da invenção, os solventes preferidos são: a acetona, a MIBK, o isopropanol, o acetato de isopropilo, o éter isobutílico ou propílico ou o THF, a 16 ΕΡ 1 411 126 /PT trioctilamina. A proporção entre a fase aquosa e a fase orgânica não é crítica. No entanto, por razões de grau de eficácia, não deve descer abaixo de uma proporção mínima de 1/1 e por razões de rentabilidade não deve ir além de uma proporção de 1/3. Prefere-se uma proporção de 1/1,5 a 2,0. A extracção pode ser realizada em contínuo ou descontínuo, em qualquer tipo de tecnologia de extracção líquido-líquido. Pode-se citar, por exemplo, a cascata de misturadores-decantadores em cocorrente ou contracorrente, as centrífugas extractoras, as colunas guarnecidas ou de pratos, etc. A solução aquosa empobrecida em ácido livre pode ser de novo tratada e isto, conforme desejado, até completar o esgotamento do amoníaco se desejado. A fase orgânica é submetida a um tratamento para isolar o HMTBA. Este é realizado de preferência por vaporização do solvente ou através de uma extracção com água quente. Para evitar uma eventual deterioração do HMTBA, poder-se-á manter a solicitação térmica tão fraca quanto possível por aplicação de vácuo.

Nestes dois processos de dissociação do sal de amónio, gera-se uma solução aquosa de amoníaco. Esta última pode ser tratada a fim de concentrar o amoníaco. Prefere-se a destilação e a concentração do amoníaco numa ou mais etapas com ou sem pressão. Pode ser considerada uma etapa preliminar de separação. A solução concentrada de amoníaco pode ser devolvida à síntese do ácido cianídrico que entra em jogo na síntese do 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo.

Na quinta etapa, concentra-se a solução aquosa de HMTBS e/ou de ácido livre. Isto é realizado de preferência por evaporação da água.

Uma instalação para a realização do processo é ilustrada esquematicamente na figura 2 e compreende as condutas 1,2 destinadas a introduzir respectivamente a cianidrina de AMTP e a água, no reactor 3. O reactor 3 é um leito fixo com recirculação que é provido das estirpes ou enzimas 17 ΕΡ 1 411 126 /PT imobilizadas. Uma parte da solução é removida do reactor 3 e enviada para um reactor acabador 4. 0 reactor acabador 4 é do tipo de leito fixo provido das estirpes ou enzimas imobilizadas. Uma solução concentrada de HMTBS é em seguida recuperada à saida do reactor 4 através da conduta 5.

Esta solução concentrada de HMTBS pode sofrer dois tratamentos totalmente independentes consoante o tipo de produto final desejado.

Quando se deseja recuperar um produto contendo uma grande proporção de HMTBS, a solução da conduta 5 é levada a um evaporador 6 que permite concentrar o produto, e recupera-se na conduta 8 uma solução concentrada composta principalmente por HMTBS e contendo um pouco de ácido livre. A água em excesso assim como uma fracção do amoníaco são evacuados pela conduta 7.

Quando se deseja recuperar um produto contendo uma grande proporção de ácido livre, a solução concentrada de HMTBS da conduta 5 é levada a um sistema de electrodiálise bipolar 9. Neste aparelho, o amoníaco é mais ou menos separado do ácido por electrodiálise. A mistura empobrecida em amónio é recuperada na conduta 11 depois concentrada no evaporador 12 a fim de obter uma solução concentrada composta principalmente pelo ácido livre e contendo pouco, ou não contendo, HMTBS. A solução rica em amoníaco é removida pela conduta 10. O amoníaco é recuperado através de uma separação 15.

Este efluente de amoníaco pode ser concentrado por destilação 16, a água é recuperada em 18. A solução de amoníaco concentrada 17 pode ser devolvida à síntese do HCN.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção. 18

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EXEMPLOS

Exemplo 1: Purificação e sequenciação Nter da nitrilase A nitrilase foi purificada em quatro etapas. 0 resumo da purificação é dado na tabela 1.

As células de Alcaligenes faecalis são cultivadas 24 horas, a 30°C, num meio minimo em presença de benzonitrilo (0,5 g/1). Após centrifugação da cultura, a pelete é retomada em tampão TG (Tris-HCl 25 mM, 10% (p/v) glicerol, pH 7,5) . A suspensão celular é tratada com ultra-sons, depois é centrifugada a fim de obter o extracto bruto. O extracto bruto é em seguida tratado com sulfato de amónio até 30% da saturação. O precipitado obtido é ressuspenso no tampão TG e depois é dialisado contra 2 litros do mesmo tampão durante uma noite. A solução obtida é em seguida depositada sobre uma coluna permutadora de aniões Q Sepharose Fast Flow HR26/10 previamente equilibrada com tampão TG. A actividade é em seguida eluida com um gradiente de 0 a 1 M de NaCl. As fracções activas são em seguida depositadas numa coluna permutadora de aniões Mono Q HR 5/5 previamente equilibrada com tampão TG. A nitrilase é eluida com o auxílio de um gradiente de 0 a 1 M de NaCl. Para acabar, as fracções contendo a actividade são reunidas, a concentração de sulfato de amónio é em seguida levada a 1 M. Esta solução é então depositada sobre uma coluna de interacções hidrófobas Fenil Superose HR5/5 previamente equilibrada com tampão TG com (NH4) 2SO4 1 M adicionado. A actividade é em seguida eluida com um gradiente de 1 M a 0M de sulfato de amónio.

Tabela 1: Resumo da purificação da nitrilase

Fracção Prot. total (mg) Actividade total (μπιοΐ/h) Actividade específica (pmol/h.mg) Rdt. de proteína (%) Factor de purificação Células completas 955 4300 4,5 100 1 Extracto bruto 2400 Sulfato de amónio 650 QSHL 26/10 3 360 120 0,3 27 MonoQ HR5/5 1,5 240 160 015 35 Fenil Sépharose 1 120 110 0,1 24

Condições operatórias: [nitrilo] = 50 mM; tampão fosfato 100 mM pH 7, 0; 30 °C. 19

ΕΡ 1 411 126 /PT Ο peso molecular da proteína é determinado por filtração em gel. É de cerca de 260 kDa. Em gel de SDS-PAGE, observa-se uma única banda de 43 kDa (pureza de 95%). É portanto provavelmente uma proteína de estrutura αβ, com α pesando 43 kDa.

Exemplo 2: Clonagem da nitrilase de Alcaligenes faecalis ATCC8750 A sequência NH2-terminal apresentada no exemplo 1 apresenta uma identidade total com a sequência da extremidade N-terminal da nitrilase de A. faecalis JM3 (Kobayashi et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9_0: 247- 251), quando as extremidades N-terminais das nitrilases bacterianas apresentam de 35 a 57% de identidade em 14 resíduos. Os inventores colocaram a hipótese de que a nitrilase da invenção purificada a partir da estirpe ATCC8750 era similar à descrita por Kobayashi et al. (supracitado). A estratégia de clonagem consistiu agora em amplificar, por reacção PCR, do ADN genómico da estirpe ATCC8750, o gene desta nitrilase, com o auxílio de duas sondas nucleotidicas determinadas a partir da sequência dada por Kobayashi et al. (supracitado).

As duas sondas foram sintetizadas, podendo uma hibridar com a parte 5' da sequência dada por Kobayashi et al. (supracitada) e a outra com a parte 3':

Parte 5' (PCRAF1):CCGGGAATTCATATGCAGACAAGAAAATCGTCC Parte 3' (PCRAF2): TCCTTCTGCGTCCCCATCCCGCAT O iniciador PCRAF1 compreende 12 nucleótidos em 5' que permitem introduzir a montante do codão de iniciação ATG os locais de restrição das enzimas FcoRI e Ndel. O iniciador PCRAF2 permite introduzir o local de restrição da enzima BarriHI. O ADN genómico da estirpe de A. faecalis ATCC8750 foi extraído segundo o protocolo CTAB descrito por Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons Inc. Ed, 2.4.12.4.5) e utilizaram-se 100 ng para cada reacção PCR. A fim de jogar com a especificidade de amplificação, testaram-se diferentes concentrações de MgCl2 como indicado em Ausubel et al. (supracitado) num volume total de amostra de 100 μΐ e com 2,5 unidades de ADN-polimerase Taq (Perkin 20

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Elmer). Foram realizadas duas reacções suplementares com MgCl2 1,5 mM e DMSO a 5% ou formamida a 5%. Um aparelho de ciclos térmicos Perkin Elmer 9600 foi programado com o seguinte encadeamento: 5 min a 95°C, 30 ciclos (30 s a 95°C, 30 s a 55°C, 45 s a 72°C) e 4 min a 72°C. Os diferentes produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose a 0,8%. Uma banda maioritária, cujo tamanho corresponde ao tamanho atingido de 1,15 kb, foi amplificada em todas as reacções mas mais especificamente com MgCl2 1,5 mM e DMSO a 5%. Os produtos da reacção nestas condições foram portanto retidos para o que se segue. A amostra foi tratada com proteinase K, precipitada com etanol após uma extracção com fenol-clorofórmio. A pelete novamente em suspensão foi incubada durante 2h a 37°C com 40 unidades da enzima EcoRI e 40 unidades da enzima BamRl. Após migração no gel de agarose a 0,7%, a banda de 1,15 kb foi cortada e extraída para ser clonada no vector pBSíT (Stratagène, La Jolla, EUA) aberto com EcoRI-Bamhl pelos métodos clássicos. Cinco clones independentes, denominados pRPA-BCATl a 5, foram analisados por digestão enzimática do ADN plasmídico com as enzimas Ndel, EcoRI, BamRI, BspM.1 e Bgl II (figura 3). Os perfis obtidos correspondiam aos perfis de restrição teóricos de um plasmídeo obtido por este método com a sequência descrita por Kobayashi et al. (supracitado). A estirpe XLIBlue (pRPA-BCAT3) foi depositada na CBS com o número CBS 998-96.

Exemplo 3: Sequenciação de um fragmento de 1130 pb contendo o ADN que codifica para o polipéptido possuindo actividade de nitrilase. A inserção clonada no plasmídeo pRPA-BCAT3 foi sequenciada pela firma Génome Express S.A. (Grenoble, França) a partir de uma preparação de ADN feita em laboratório (kit Wizzard Midi-prep, Promega). A estratégia de sequenciação deste fragmento, realizada segundo métodos clássicos conhecidos pelo perito na especialidade, é indicada na figura 4. Os dez iniciadores nucleotídicos internos (identificados pelos números 623 a 629 e 681 a 682 na figura 4) foram sintetizados segundo a sequência da nitrilase de A. faecalis JM3 (Kobayashi et al., supracitado). Esta montagem foi completada pelos iniciadores universais 21 ΕΡ 1 411 126 /PT "Reverse" e "M13 Forward". Cada região foi lida pelo menos uma vez em cada cadeia do ADN. A sequência de ADN obtida apresenta duas diferenças em relação à sequência publicada: uma na estrutura que é suposto servir de terminador de transcrição e a outra no gene da nitrilase, denominado nitB, que conduz a substituição Asn -> Asp. Estas duas regiões foram então sequenciadas em laboratório nos plasmideos pRPA-BCATl, 2, 4, 5 com dois iniciadores específicos 710 e 682 (cf. figura 4). A alteração C-> T na posição 1412 (conforme a numeração de Kobayashi, supracitado) no terminador foi encontrada em todos os clones. Trata-se de uma mutação que diferencia as duas estirpes de A. faecalis. A alteração A-> G na posição 1138 apenas está presente no plasmídeo pRPA-BCAT3. Trata-se portanto de uma mutação introduzida aquando da PCR pela ADN-Polimerase Taq.

Exemplo 4: Expressão da nitrilase em E. coli BL21 (DE3). A fim de confirmar a identificação da sequência de ADN clonada com o gene da nitrilase purificado, o gene nitB foi colocado sob o controlo do promotor do gene Φ10 fago T7 (PT7) de acordo com o modo operatório descrito adiante: as inserções Ndel-BamRI de 1,13 kb dos plasmideos pRPA-BCAT3 e pRPA-BCAT4 foram clonadas no vector pXL2432 para dar respectivamente os vectores pRPA-BCAT12 e pRPA-BCAT13 descritos na figura 5. O vector progenitor pXL2432 é um híbrido entre a região do plasmídeo pET9 (Studier et al., 1990, Methods In Enzymol. 185, 60-89), compreendido entre os locais Accl e EcoRI, que engloba a origem de replicação (ORI) e o marcador de selecção portador da resistência à canamicina (Kan), e a região compreendida entre os locais EcoRI e Accl do plasmídeo pETlla (Novagen Inc., Madison WI, EUA) que engloba a cassete de expressão, o gene do repressor lacl e o gene do regulador do número de cópias ROP.

Realizaram-se culturas em condição de indução de acordo com o modo operatório adiante: A estirpe BL21(DE3) (Novagen Inc., Madison WI, EUA) contendo o plasmídeo pRPA-BCAT12, a estirpe BL21(DE3) contendo o plasmídeo pRPA-BCAT13 assim como a estirpe BL21(DE3) contendo o plasmídeo pXL2432 foram cultivadas 16 h em meio LB a 37°C (Miller, 1972, Experiments 22

ΕΡ 1 411 126 /PT in Molecular Genetics - Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) contendo 50 μg/ml de canamicina, depois diluídas de 1:100 no mesmo meio e à mesma temperatura. Quando as culturas atingiram uma DCboo compreendida entre 0,5 e 1, adicionou-se IPTG, numa concentração final de 1 mM. Após 6 horas de cultura, as bactérias foram recolhidas. Adoptou-se um modo operatório similar para cultivar a estirpe BL21(DE3) contendo os plasmídeos pRPA-BCAT12 e pXL2231, a estirpe BL21(DE3) contendo os plasmídeos pRPA-BCAT13 e pXL2231 assim como a estirpe BL21(DE3) contendo os plasmídeos pXL2432 e pXL2231, adicionando ao meio de cultura tetraciclina à razão de 12 μρ/ιηΐ de meio. O plasmídeo pXL2231, que deriva do vector pXL1635 (Pedido FR 90/05185 de 24/04/1990), pertence ao grupo de incompatibilidade IncP e é portanto compatível com os plasmídeos pRPA-BCAT12 e 13 que possuem a origem de replicação do plasmídeo ColEl. O seu marcador de selecção é a resistência à tetraciclina e possui um fragmento EcoRI-Hindlll de 2,2 kb contendo os genes GroES e GroEL que codificam para chaperons moleculares de E. coli (Fayet et ai., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 435-445). A expressão da nitrilase foi analisada em gel SDS-PA a 10% na fracção bruta após tratamento das células com ultra-sons, e após centrifugação na pelete e no sobrenadante. Os resultados estão apresentados na figura 6 e mostram um nível de expressão da nitrilase (NitB) nos extractos de células em que um dos plasmídeos pelo menos contém a inserção nitB; no entanto, esta proteína está essencialmente sob a forma insolúvel ainda que a presença do plasmídeo pXL2231 permita aumentar a quantidade de polipéptido nitrilásico na fracção solúvel.

Na figura 6, M representa o marcador de pesos moleculares; estes são indicados em kDa. Por outro lado, as pistas possuem os significados seguintes: A, D, G representam as fracções brutas respectivamente de BL21(DE3) + p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL 2432; - B, E, H representam os sobrenadantes obtidos respectivamente A partir das mesmas estirpes; C, F, I representam as peletes obtidas respectivamente a partir destas mesmas estirpes; 23

ΕΡ 1 411 126 /PT J, N, Q representam as fracções brutas obtidas respectivamente a partir de BL21(DE3) + pXL2231 + p/RPA- BCAT12/RPA-BCAT13/XL 2432: K, 0, R representam os sobrenadantes obtidos respectivamente a partir destas estirpes; L, P, S representa as peletes obtidas respectivamente a partir destas estirpes. A estirpe BL21(DE3)/pRPA-BCAT12 + pXL2231 foi denominada RPA-BIOCAT126. A estirpe BL21(DE3)/pRPA-BCAT13 + pXL2231 foi denominada RPA-BI0CAT127. As actividades nitrilásicas de culturas de RPABIOCAT126, RPA-BI0CAT127 e RPA-BIOCAT66 que correspondem a BL21(DE3)/pXL2432 foram determinadas como se segue: as culturas foram conduzidas de acordo com o protocolo descrito acima modificando o volume de cultura (50 ml) e a concentração final de IPTG (0,1 mM). As culturas foram centrifugadas e as peletes celulares foram retomadas em 10 ml de tampão de fosfato de potássio 100 mM pH 7. A hidrólise de HMTBN é realizada com 500 μΐ desta suspensão ajustada a 500 μΐ de solução de HMTBN 200 mM pH7. Uma cinética de hidrólise é obtida misturando 100 μΐ desta mistura com 900 μΐ de ácido fosfórico 0,1 N em intervalos regulares durante 1 a 4 horas. As quantidades de HMTBA produzido são analisadas por HPLC como descrito no pedido WO 96/09403. Os resultados estão agrupados na tabela 2.

Tabela 2: Actividades das estirpes RPA-BIOCAT66, 126 e 127 RPA-BIOCAT MEIO INDUÇÃO TEMPO DE CULTURA DOeeo ACTIVIDADE (U) 66 LB Km 0,1 mM IPTG 24 h 2,5 0 126 LB Km Tc 0,1 mM IPTG 24 h 2,4 15 127 LB Km Tc 0,1 mM IPTG 24 h 1,9 10 ABREVIATURAS: Km: Canamicina 50 μg/ml; Tc: tetraciclina 12 μρ/ιηΐ; h: horas; U: kg de HMTBA formado por hora e por kg de peso seco. A fim de melhorar a solubilizaçao do polipéptido nitrilásico expresso, o plasmídeo pRPA-BCAT37 foi construído 24

ΕΡ 1 411 126 /PT como atrás. O plasmídeo pXL2391 foi obtido ligando o fragmento de 5, 9 kb EcoRI-PvuII do plasmídeo pDSK519 (Keen et al., 1988, Gene 7_0: 191-197), tratado com a polimerase

Klenow, com o fragmento HindiII de 2056 pb extraído do plasmídeo pHP45QSp (Prentki e Krisch, 1984, Gene 29: 303- 313) tratado com Nuclease de Mung Bean. O plasmídeo pXL2391 foi em seguida digerido com Smal e Saci e a inserção de 2,3 kb possuindo o operão GroESL, extraído do plasmídeo pXL2231 digerido com HindIII, tratado com Klenow e digerido com Saci, foi introduzido. O plasmídeo pRPA-BCAT37 é portanto um derivado do plasmídeo RSF1010 com maior número de cópias que o plasmídeo pXL2231, compatível com os plasmídeos portadores da origem ColEl e portador de um marcador de resistência à estreptomicina. Este plasmídeo foi introduzido na estirpe BL21(DE3)/pRPA-BCAT12 para dar a estirpe RPA-BIOCAT171. A actividade de uma cultura conduzida de acordo com um modo operatório similar ao descrito atrás, mas substituindo a tetraciclina pela estreptomicina a 100 μρ/ιηΐ, foi determinada e é apresentada na tabela 3.

Tabela 3: Actividade da estirpe RPA-BIOCAT171 RPA—BIOCAT MEIO INDUÇÃO TEMPO DE CULTURA DOeeo ACTIVIDADE (U) 171 LB Km Sm 0,1 mM IPTG 24 h 3, 2 14 ABREVIATURAS: Km: Canamicina 50 μυ/πιΐ; Sm: Estreptomicina 100 μυ/ιηΐ; h: horas; U: kg de HMTBA formado por hora e por kg de peso seco.

Exemplo 5: Expressão da nitrilase em E. coli DH5alpha.

O plasmídeo pRPA-BCAT6 foi construído clonando em pBCAT3 (cf. figura 3) o fragmento de 0,6 kb Scal-Ndel de pXL2158 contendo o promotor Ptrp e o local de fixação no ribossoma RBScII (Levy-Schill et al., 1995, Gene 161: 15-20). A expressão foi realizada com a estirpe DH5alpha contendo o plasmídeo pRPA-BCAT6 e/ou o plasmídeo pXL2035 (Levy-Schill et al., supracitado) com o modo operatório seguinte: a pré-cultura é incubada 16h a 37°C em meio M9 glucose (Miller, J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring 25

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Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) contendo 0,4% de casaminoácidos, 100 μg/ml de triptofano, 100 μρ/ιηΐ de carbenicilina. Para as estirpes contendo pXL2035, é adicionada canamicina à razão de 50 mg/1. A expressão faz-se após diluição de 1/100 da cultura saturada num meio idêntico mas sem triptofano e incubação 8 a 16 h a 37°C. A análise por SDS-PAGE dos extractos das diferentes estirpes é realizada como descrito no exemplo anterior e é apresentada na figura 7.

Nesta figura, M representa o marcador de pesos moleculares, sendo estes indicados em kDa. Por outro lado, as pistas têm os significados seguintes: L, I, F, C representam as fracções brutas obtidas respectivamente a partir das estirpes DHSalpha + pRPA-BCAT/3, /6, /6 +PXL2035, RPA-BIOCAT 76; K, Η, E, B representam os sobrenadantes obtidos respectivamente a partir destas mesmas estirpes; J, G, D, A representam as peletes obtidas respectivamente a partir destas mesmas estirpes. O plasmídeo pRPA-BCAT6 permite obter uma fraca acumulação de um polipéptido de 43 kDa, maioritariamente insolúvel. A co-expressão de GroE a partir do plasmídeo pXL2035 reduz a super-expressão, mas após três repicagens sucessivas da estirpe DHSalpha (pRPA-BCAT6 +pXL2035), a estirpe RPA-B10CAT76 seleccionada reencontra o nível inicial de expressão do polipéptido nitrilásico, sendo este quase completamente solúvel. Os doseamentos das actividades das culturas realizados de acordo com os modos operatórios descritos acima e no exemplo anterior são apresentados na tabela 4. 26

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Tabela 4: Actividade das estirpes DHSalpha (pRPA-BCAT3), DH5alpha (pRPA-BCAT6), DH5alpha (pRPA-BCAT6 +pXL2035), RPA-BI0CAT7 6 ESTIRPE MEIO TEMPO DE CULTURA DO660 ACTIVIDADE (U) DH5alpha (pRPA-BCAT3) M9 Cb 24 h 4 0 DH5alpha (pRPA-BCAT6) M9 Cb 24 4 0, 6 DH5alpha (pRPA-BCAT6 + pXL 2035) M9 Cb km 24 h 3 1,6 RPA-BIOCAT76 M9 Cb Km 24 h 3, 8 5 ABREVIATURAS: Km: Canamicina 50 μg/ml; Cb: Carbenicilina 100 μg/ml; h: horas; U: kg de HMTBA formado por hora e por kg de peso seco.

Estes dados mostram que a co-expressão de GroE permite melhorar a expressão da nitrilase e que uma selecção de estirpe clássica por repicagens sucessivas contribui também para melhorar da actividade dos recombinantes.

Exemplo 6: Expressão da nitrilase em Pseudomonas putida e Alcaligenes faecalis. 0 sistema de expressão descrito no exemplo 5 foi utilizado para produzir nitrilase em Pseudomonas putida e em A. faecalis. O fragmento de 1,14 kb iVdel-Xfoal de pRPA-BCAT6 contendo o gene nitB foi introduzido nos locais Ndel-Xbal do vector pXL1289. O vector pXL1289 é um derivado de pKT230 (Bagdasarian et al., 1981, Gene _15g 237-247) possuindo a origem de replicação (oriV) multi-hospedeiro nas bactérias Gram-negativas e que contém um fragmento EcoRI-Ndel de 120 pb portador do promotor Ptrp e do RBScII de pXL534 (Latta et al., 1990, DNA and Cell Biology, 9_: 129-137) , uma inserção NdeI-Xbal que codifica para o gene cobA (Crouzet et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 5968-5979) e uma inserção Xbal-BamHI de 500 pb contendo o terminador Trr^B de pXL534 (Latta et al., 1990, DNA and Cell Biology, 9_: 129-137) . O plasmideo obtido pRPA-BCAT14 é portanto um derivado de pKT230 contendo um gene que confere resistência a canamicina (Kan) e o gene nitB sob o controlo de Ptrp:RBScII (figura 8). 27

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Aquando da introdução deste plasmídeo na estirpe de E. coli DHSalpha, é seleccionado um clone particular: expressa uma nitrilase cujo peso molecular no gel SDS-PA é de 44 kDa em vez de 43 kDa. 0 plasmídeo hospedado por este clone apresenta o mesmo perfil de restrição que pRPA-BCAT14 e foi denominado pRPA-BCAT24. Finalmente, o plasmídeo pRPA-BCAT23 foi construído de acordo com o mesmo modo operatório que pRPA-BCAT14 com a seguinte modificação: o fragmento de 136 pb Stul-Bsml de pRPA-BCAT6 foi substituído pelo fragmento Stul-Bsml de pRPA-BCAT4. 0 plasmídeo pRPA-BCAT23 expressa portanto uma nitrilase NitB com um resíduo Asn na posição 279.

Os plasmídeos pRPA-BCAT14, 23 e 24 foram introduzidos por electroporação na estirpe de Pseudomonas putida G2081. A estirpe G2081 derivada da estirpe KT2440 (Bagdasarian e Timmis, 1981, em Hofschneid e Goebel, Topics in Microbiology and Immunology, _47_, Springer Verlag, Berlin) por selecção da resistência espontânea ao ácido nalidíxico e à rifampicina. 0 vector pKT230 foi utilizado como plasmídeo de controlo.

Os plasmídeos pRPA-BCAT14, pRPA-BCAT23, pRPA-BCAT24 e pKT230 foram então extraídos das estirpes de P. putida para serem introduzidos por electroporação na estirpe de A. faecalis ATCC8750 (= RPBI0CAT1).

As estirpes G2081 (pRPA-BCATl4), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), G2081 (pKT230) e RPA-BI0CAT1 (pRPA-BCAT14), RPBI0CAT1 (pRPA-BCAT23), RPA-BI0CAT1 (pRPA-BCAT24), RPA-BI0CAT1 (pKT230) foram cultivadas durante a noite a 30°C em meio LB contendo 50 mg/1 de canamicina. Estas pré-culturas foram diluídas 1/100 em meio M9 contendo 50 mg/1 de canamicina e incubadas 20 h a 30°C.

Após tratamento das células com ultra-sons, a expressão da nitrilase foi medida num gel SDS-PA a 10% na fracção bruta após tratamento das células com ultra-sons, e após centrifugação na pelete e no sobrenadante. Os resultados são apresentados na figura 9. Para as estirpes RPA-BIOCAT1 (pKT230) e G2081 (pKT230), apenas os extractos brutos foram depositadas (pistas A e I respectivamente). Nesta figura, M representa o marcador de pesos moleculares; estes são 28

ΕΡ 1 411 126 /PT indicados em kDa. Por outro lado, as pistas possuem os seguintes significados: - B, D, F representam as fracções brutas obtidas respectivamente a partir das estirpes RPA-BI0CAT1 (pRPA-BCAT14), RPA-BI0CAT1 (pRPA-BCAT23), RPA-BI0CAT1 (pRPA-BCAT24); - C, E, G representam os sobrenadantes obtidos respectivamente a partir destas mesmas estirpes; H representa a pelete obtida a partir de RPA-BI0CAT1 (pRPA-BCAT 2 4); - J, L, 0 representam as fracções brutas obtidas respectivamente a partir das estirpes G2081 (pRPA-BCAT14), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24); - K, N, P representam os sobrenadantes obtidos respectivamente a partir destas mesmas estirpes; Q representa a pelete obtida a partir de G2081 (pRPA-BCAT24).

Esta experiência mostra que as estirpes de P. putida expressam quantidades importantes dos três polipéptidos nitrilásicos solúveis e que somente o polipéptido nitrilásico de 44 kDa é super-expresso para a estirpe de A. faecalis. Os doseamentos de actividade destas culturas, realizados de acordo com o protocolo descrito no exemplo 4, mostram que as estirpes G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), e RPA- BI0CAT1 (pRPA-BCAT 2 4) possuem uma actividade nitrilásica sobre HMTBN.

Exemplo 7: Expressão da nitrilase em Corynebacterium glutamicum. A expressão da nitrilase foi realizada na estirpe CGL1010 (=ATCC 14752) com o auxilio do promotor PcspB (Peyret et al., 1993, Molecular Microbiol. 9_:97-109). Um fragmento de 530 pb contendo o promotor PcspB foi amplificado a partir do plasmideo pCGL815 (Peyret et al., supracitado) com o auxilio dos iniciadores KS1 e KS2 seguintes: KS1: 5 ACGCGTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG -3' KS2 : 5 ' - CATAGAGGCGAAGGCTCCTTA -3 ' 29

ΕΡ 1 411 126 /PT

Após digestão com SalI, o fragmento de 53 0 pb amplificado foi clonado no plasmideo pBSK (Statagene, La Jolla EUA) aberto com Sal I e EcoRV para dar o plasmideo pCGL1084. Um adaptador EcóNI/Ndel foi fabricado hibridando os dois oligonucleótidos KS8 e KS9 que se seguem: KS8: 5 TCAAGGAGCCTTCGCCTACA -3 ' KS9: 5 TATGAGGCGAAGGCTCCTTG -3' O gene da nitrilase foi extraído do plasmideo pRPA-BCAT6 sob a forma de um fragmento Ndel-Xbal de 1,1 kb. Foi introduzido em pCGL1084 aberto com EcoNI e Xbal utilizando o adaptador FcoNI/iVdel descrito adiante para dar o plasmideo pCGL1086. O fragmento Sall-Bamtil de pCGL1086 contendo PcspB::nitB foi em seguida clonado no vector pCGL482 (Peyret et al., supracitado) nos locais SalI e Bamtil conduzindo ao plasmideo pCGL1087. O plasmideo pCGL1087 (figura 10) é portanto um vector vaivém à base de pBll (Santamaria et al., 1984, J. Gen. Microbiol., 130: 2237-2246) contendo a origem de replicação de pACYC184 reconhecido em E. coli, um gene que confere resistência ao cloranfenicol (Cm) e a fusão Pcsp::nitB.

Os plasmídeos pCGL1087 e pCGL482 foram introduzidos por electroporação em CGL1010 como descrito por Bonnamy et al., 1990 (FEMS Microbiol. Lett. 6_6: 263-270) . Após 20 horas de cultura a 30°C em meio Brain Heart Infusion a 3,7% (Difco Laboratories, Detroit, EUA) com cloranfenicol adicionado a 5 mg/1, realizaram-se os doseamentos da actividade de nitrilase em amostras de cultura como descrito no exemplo 4. Os resultados mostram que a estirpe CGL1010 (pCGL1087) possui uma actividade de nitrilase enquanto a estirpe CGL1010 (PCGL482) não.

Exemplo 8: Expressão da nitrilase em Streptomyces lividans. A expressão da nitrilase foi realizada na estirpe de S. lividans TK24 (Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces; A laboratory Manual, The John Innes Foundation, Noruega) com o auxílio do plasmideo plJ6021 (Takano et al., 1995, Gene 166: 133-137) utilizando o promotor PtipA (Holmes et al., 1993, EMBO J. 12: 3183-3191). 30

ΕΡ 1 411 126 /PT Ο plasmídeo pUC19 (Yanisch-Perron et al.r 1985, Gene 33: 103-119) foi modificado por deleção do fragmento Tfil de 140 pb por digestão com Tfil, tratamento com Klenow e ligação do vector sobre si mesmo. O plasmideo obtido foi aberto com EcoRI e BamHI a fim de clonar o fragmento de 1,15 kb EcoRI-BamHI de pRPA-BCAT3 contendo o gene nitB. O plasmídeo pOS48.4 assim obtido possui um local único Tfil situado entre o gene nitB e o local Bamtil. Este local foi utilizado para inserir um fragmento Qhyg de 2,3 kb extraído do plasmídeo pHP45Qhyg (Blondelet-Rouault et al., Gene, apresentado) após digestão por BamEI e tratamento com Klenow. O fragmento Qhyg contém o gene da higromicina-fosfotransferase (hyg) de Streptomyces hygroscopicus (Zalacain et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14: 1565-1581) e confere a S. lividans uma resistência à higromicina. O plasmídeo pOS48.5 assim obtido foi utilizado para isolar um fragmento Ndel-Bamhl de 3,45 kb contendo o gene da nitrilase seguido do gene hyg, que foi clonado no plasmídeo plJ6021 (Takano et al., supracitado) aberto com iVdel e BamEI. O plasmídeo pIJ6021 apenas replica em Streptomyces, a mistura de ligação foi transformada em S. lividans TK24 por métodos clássicos (Hopwood et al., supracitado) seleccionando os clones resistentes a 200 mg/1 de higromicina (Boehringer Manheim). Os ADN plasmídicos destes clones foram extraídos por métodos clássicos (Hopwood et al., supracitado) e os seus perfis de restrição correspondiam bem à construção atingida que foi denominada pOS48.7 (figura 11).

Dois clones de S. lividans contendo pOS48.7 assim como um clone contendo o plasmídeo pIJ6021 foram cultivados em 50 ml de meio TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) a 30 °C durante 72 h com uma selecção por canamicina 5 mg/1, depois foi adicionada tioestreptona na concentração de 5 mg/1 e a cultura foi prosseguida durante mais 18 h de acordo com as condições descritas (Hopwood et al., supracitado). A cultura foi recolhida e o doseamento da actividade, realizado nas condições descritas no exemplo 4, mostra que a estirpe de S. lividans TK24 (pOS48.7) expressa uma actividade de nitrilase contrariamente à estirpe TK24 (plJ6021). 31

ΕΡ 1 411 126 /PT

Exemplo 9: Hidrólise de HMTBN com outras nitrilases A sequência primária da nitrilase de Comamonas testosteroni sp., descrita em Levy-Schil et al., 1995 (supracitado) apresenta 31% de identidade com a sequência primária da nitrilase descrita na presente invenção. A estirpe recombinante de E. coli TG1 (pXL2158, pXL2035), que expressa a nitrilase de C. testosteroni, foi cultivada nas condições descritas por Lévy-Schil et al. (supracitado) e uma pelete celular foi incubada em tampão fosfato 100 mM a pH 7 com HMTBN 50 mM, a 30°C. A actividade medida era de 2,3 kg/h.kq de CS. Como a nitrilase da invenção, a nitrilase de C. testosteroni é capaz de hidrolisar HMTBN.

Adicionalmente, os dados apresentadas no exemplo 4 com os plasmideos pBCAT12 e pBCAT13 mostram que a substituição Asn279 -> Asp279 na nitrilase de A. faecalis ATCC8750 permite conservar a actividade sobre HMTBN.

Exemplo 10: Fornecimento do suporte

Adicionaram-se 5 g de células secas a 20 g de água ajustada a pH 7,0. A quantidade de suporte (CELITE 545, Prolabo, França) indicada é em seguida adicionada e após uma perfeita homogeneização, a suspensão é reticulada por adição de 15% de glutaraldeído com base na massa seca total seguida de 10% de polietilenoimina (SEDIPUR, BASF, Alemanha). A suspensão é agitada 1 hora à temperatura ambiente. A suspensão é em seguida floculada por adição de 0,001% de um floculante aniónico, Superfloc A100. A massa reticulada é recuperada por filtração.

Esta massa é em seguida reticulada de novo por adição de 10% de poliazetidina (KYMENE 557, Hercules, EUA) com base na massa seca total. A massa ainda húmida é em seguida extrudida através de um orifício de 0,5 mm de diâmetro e seca. A actividade das partículas obtidas é em seguida determinada seguindo uma procedimento descrito no pedido de patente WO 96/09403. 32

ΕΡ 1 411 126 /PT g de suporte Actividade (em %) 0 100 2,5 g 215 5 g 250 A adição de suporte para as células melhora notavelmente a actividade. A experiência foi repetida substituindo a CELITE por glúten de trigo (Roquette, França) parcialmente solúvel em água ou gelatina (SBI, França) totalmente solúvel em água.

Suporte % de actividade 0 100 5 g de glúten 160 5 g de gelatina nd* * a suspensão celular nao flocula e não é filtrável.

Este exemplo mostra que o glúten pode ser substituído pela CELITE. Ao contrário, se a adição é de gelatina (totalmente solúvel), a conformação do catalisador é impossível pela técnica descrita anteriormente (extrusão).

Exemplo 11

10 g de Escherichia coli BIOCAT171 do exemplo 4 preparados por cultura aeróbia num meio LB foram misturados com 10 g de CLARCEL 78 (CECA, França) em 500 g de tampão fosfato 100 mM pH 7,0. Após homogeneização, 6 g de glutaraldeido a 25% foram adicionados e a suspensão foi agitada 15 minutos à temperatura ambiente. 2 g de polietilenoimina foram adicionados em seguida assim como 6 g de glutaraldeido a 25%. O conjunto foi agitado durante uma hora à temperatura ambiente. O conjunto foi floculado por adição de 5 ml de uma solução de SUPERFLOC A100 a 0,2% (CYTEC, França). A massa foi filtrada e a pasta obtida foi misturada com 16 g de poliazetidina a 12,5% (KYMENE 557, Hercules) e depois extrudida através de um orifício de 0,5 mm de diâmetro. As formas cilíndricas obtidas foram secas a 35°C numa estufa e depois mergulhadas 30 minutos num banho de NaBH4 a 1% preparado num tampão borato 50 mM pH 10,0. O biocatalisador é em seguida lavado com água destilada. O 33 ΕΡ 1 411 126 /PT catalisador é conservado a 5°C ou à temperatura ambiente num tampão fosfato 500 mM pH 8,0.

Uma coluna termostatizada de 3 cm de diâmetro interior e de 45 cm de altura foi cheia com 100 g de biocatalisador. Esta coluna é ligada a uma bomba através de um circuito de recirculação. O volume total do reactor é de 430 ml. O circuito é cheio com uma solução de sal de amónio do ácido hidroximetiltiobutirico a 25%. A solução é alimentada pelo topo da coluna para baixo a um caudal horário de 20 1/h. A água que circula no duplo envelope da coluna e no permutador térmico permite manter a temperatura a 35°C. A água desmineralizada é adicionada ao circuito a um caudal de 80 g/h. O 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo é adicionado a 20 g/h. O excedente de volume do meio de reacção é evacuado pela base da coluna de modo a que o volume do circuito permaneça constante. Assim, obtém-se um fluxo continuo com uma taxa de transformação do nitrilo de 95%. Adicionalmente, a concentração da solução aquosa de sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico obtida à saída do reactor é de 25%.

Exemplo 12 0 electrodialisador utilizado é constituído por uma pilha de 9 células de 2 dm2 de superfície activa, cada uma composta por 2 compartimentos designados como se segue: compartimento "sal/ácido": limitado do lado do cátodo por uma membrana permutadora de catiões Neosepta CMB de Tokuyama Soda, e do lado do ânodo pela face catiónica de uma membrana bipolar Aqualytics compartimento "base": limitado do lado do ânodo pela membrana catiónica, e do lado do cátodo pela face aniónica da membrana bipolar. O ânodo é constituído por titânio platinado. O cátodo é de aço inoxidável. O electrólito é constituído por uma solução aquosa de sulfato de sódio possuindo uma condutividade de 100 mS/cm a 34

ΕΡ 1 411 126 /PT 40°C. 0 caudal de circulação nos eléctrodos é de 2x100 1/h. O volume é de 5 1. O compartimento "base" é inicialmente cheio com 5 litros de uma solução de sulfato de amónio a 1%. O compartimento "sal/ácido" é inicialmente cheio com 5 litros de uma solução a 1,44 mol/1 do sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico. O caudal de recirculação das soluções é inicialmente fixado a 130 1/h para o compartimento "sal/ácido" e a 190 1/h para o compartimento "base". A electrodiálise é efectuada em modo descontínuo (funcionamento em recirculação), a uma temperatura média de 40°C. A intensidade é imposta a 9 A, ou seja uma densidade de corrente de 0,45 kA/m2.

Após 155 minutos de funcionamento, a condutividade do compartimento "sal/ácido" é passada de 59 para 7,8 mS/cm. O compartimento "sal/ácido" contém 1,35 mol/1 de ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, a 100% sob a forma de ácido. O rendimento farádico é estimado em 71% e o consumo energético em 0,53 kWh por kg de ácido formado.

Exemplo 13 O electrodialisador utilizado é constituído por uma pilha de 8 células de configuração idêntica à do exemplo 12. O compartimento "base" é inicialmente cheio com 5,27 litros de uma solução de sulfato de amónio a 1%. O compartimento "sal/ácido" é inicialmente cheio com 4,85 litros de uma solução a 1,39 mol/1 do sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico. 35

ΕΡ 1 411 126 /PT Ο caudal de recirculação das soluções é inicialmente fixado em 60 1/h para o compartimento "sal/ácido" e em 150 1/h para o compartimento "base". A electrodiálise é efectuada em modo descontinuo (funcionamento em recirculação), a uma temperatura média de 40°C. A intensidade é imposta a 9 A, ou seja uma densidade de corrente de 0,45 kA/m2.

Após 172 minutos de funcionamento, a condutividade do compartimento "sal/ácido" é passada de 59 para 9,5 mS/cm. 0 volume final do compartimento "sal/ácido" é de 4,67 litros. A composição é a seguinte: ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico: 1,24 mol/1 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amónio: 0,148 mol/1 A taxa de transformação é de 86%. O produto final está a 89% sob a forma de ácido. O rendimento farádico é de 74%. O consumo energético é estimado em 0,58 kWh por kg de ácido formado.

Exemplo 14

Utiliza-se um dispositivo análogo ao do exemplo 13. O compartimento "base" é inicialmente cheio com 5,46 litros de uma solução de sulfato de amónio a 1%. O compartimento "sal/ácido" é inicialmente cheio com 5,23 litros de uma solução a 1,24 mol/1 do sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico. O caudal de recirculação das soluções é inicialmente fixado em 90 1/h para o compartimento "sal/ácido" e em 150 1/h para o compartimento "base". A electrodiálise é efectuada em modo descontinuo (funcionamento em recirculação), a uma temperatura média de 36

ΕΡ 1 411 126 /PT 40°C. A intensidade é imposta em 14 A, ou seja uma densidade de corrente de 0,7 kA/m2.

Após 105 minutos de funcionamento, a condutividade do compartimento "sal/ácido" é passada de 57,6 para 9,8 mS/cm. A composição final do compartimento "sal/ácido" é a seguinte: ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico: 1,28 mol/1 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amónio: 0,14 mol/1 O produto está portanto a 90% sob a forma de ácido. Exemplo 15

Utiliza-se um dispositivo análogo ao do exemplo 13. 0 ensaio é realizado com o conteúdo do compartimento "base" obtido no exemplo 14. O compartimento "sal/ácido" é inicialmente cheio com 5,2 litros de uma solução a 1,44 mol/1 do sal de amónio do ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico. 0 caudal de recirculação das soluções é inicialmente fixado em 50 1/h para o compartimento "sal/ácido" e em 150 1/h para o compartimento "base". A electrodiálise é efectuada em modo descontinuo (funcionamento em recirculação), a uma temperatura média de 42 °C. A intensidade é imposta a 19 A, ou seja uma densidade de corrente de 0,95 kA/m2.

Após 53 minutos de funcionamento, a condutividade do compartimento "sal/ácido" é passada de 59 para 27 mS/cm. O volume final do compartimento "sal/ácido" é de 4,85 litros. 0,87 mol/1 0,56 mol/1 A composição é a seguinte: ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico: 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amónio: 37

ΕΡ 1 411 126 /PT A taxa de transformação é de 56%. 0 produto final está a 61% sob a forma de ácido. 0 rendimento farádico é de 83%. 0 consumo energético é estimado em 0,7 kWh por kg de ácido formado.

Exemplo 16

Concentra-se um lote de 200, 1 g de solução de HMTBS a cerca de 1,5 M num evaporador rotativo. A temperatura do banho é de 45 + /- 5°C. A pressão é regulada para cerca de 2,5.103 Pa (25 mbar). A temperatura no ebulidor evolui de 25°C no inicio da destilação para 40°C no fim. Ao fim de 3 horas, recuperam-se 41,9 g de um meio viscoso amarelo cujas caracteristicas são as seguintes:

Viscosidade a 25°C (mm2. s_1) 1150 % de HMTBA (Br-/Br03-) 83,3

Após ajustamento do titulo (diluição com H20), obtém-se um produto cujas caracteristicas são as seguintes:

Viscosidade a 25°C (mm2. s~2) 396 % de HMTBA (Br-/Br03-) 79,5

Por potenciometria obtém-se a repartição mássica seguinte: % de HMTBS 81,6 % de HMTBA 6,0

Em CLHP, mede-se a razao entre superfícies de monómero ou dimero/(monómero+dimeros) 100 0 monómero/(monómero+dimeros) dimeros/(monómero+dimeros) (*) (*) não se detectam dimeros 38

ΕΡ 1 411 126 /PT

Exemplo 17

Concentra-se um lote de 200, 0 g de solução de HMTBS a cerca de 1,5 M num evaporador rotativo. A temperatura do banho é de 121 + /- 5°C. A pressão é regulada para cerca de 9,5.104 Pa. A temperatura no ebulidor evolui de 100°C no inicio da destilação para 113°C no fim. Ao fim de 3 horas, recuperam-se 41,5 g de um meio viscoso castanho cujas caracteristicas são as seguintes: viscosidade a 25°C (mm2. s-1) % de HMTBA (Br-/Br03-) 90, 7

Após ajustamento do titulo (diluição com H20), obtém-se um produto cujas caracteristicas são as seguintes:

Viscosidade a 25°C (mm2. s~4) 117 % de HMTBA (Br-/Br03-) 78,8

Por potenciometria, obtém-se a repartição mássica seguinte: % de HMTBS 52,2 % de HMTBA 28, 7

Em CLHP, mede-se a razao entre as superfícies de monómero ou de dímeros/(dímeros+monómero) monómero/(monómero+dímeros) 95,0 dímeros/(monómero+dímeros) 5,0

Exemplo 18 A 100,0 g do meio descrito no exemplo 17, adicionam-se 40,0 g de H20. Extracta-se o meio com 75,0 g de éter isopropílico. Após separação das fases, recuperam-se na fase orgânica após evaporação, 25,6 g de HMTBA cujas caracteristicas são as seguintes: 39

ΕΡ 1 411 126 /PT

Determinação Monómero/(monómero+dímeros) (% de superfície) 97, 0 Dímeros/(monómero+dímeros) (% de superfície) 3,0 Viscosidade a 25°C (mm2.s_1) 55

Exemplo 19: Envelhecimento das soluções descritas nos exemplos anteriores exemplo 16 exemplo 17 exemplo 18 Duração do armazenamento a 25°C 40 d 40 d 100 d Viscosidade (mm2.s_1) 387 116 66 Monómero(monómero+dímero) 100, 0 95,0 82 Dímeros/(monómero+dímeros) 0,0 5, 0 18

As soluções dos exemplos 16 e 17 nao evoluíram no que se refere ao seu teor de dímeros após 40 dias de armazenamento.

Lisboa

Claims (8)

1. ΕΡ 1 411 126 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido que codifica para uma nitrilase, compreendendo o gene da nitrilase denominado Nit B contido no plasmideo pRPA-BCAT3 depositado na CBS com o número CBS 998- 96 .
2. 2. Vector compreendendo um polinucleótido de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Vector de acordo com a reivindicação 2, consistindo num plasmideo.
4. 4. Polipéptido possuindo uma actividade de nitrilase, compreendendo uma sequência de nitrilase susceptível de ser obtida por expressão do gene da nitrilase denominado Nit B, clonado no plasmideo pRPA-BCAT3 depositado na CBS com o número CBS 998-96.
5. 5. Polipéptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de nitrilase ser co-expressa com uma proteína acompanhante (chaperonne).
6. 6. Polipéptido de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a proteína acompanhante (chaperonne) ser a proteína GroESL de Escherichia coli.
7. 7. Polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado por a sequência de nitrilase ser susceptível de ser obtida por expressão do gene da nitrilase num microorganismo hospedeiro.
8. 8. Polipéptido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o microorganismo hospedeiro ser seleccionado do grupo que consiste em Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida e os géneros Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillium e Aspergillus. ΕΡ 1 411 126 /PT 2/2 5. Material biológico compreendendo um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8. Lisboa,