JP2022513813A - Ｌ－グルタミン酸生産能が向上した変異菌株、およびそれを用いたｌ－グルタミン酸の製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｌ－グルタミン酸生産能が向上した変異菌株およびそれを用いたＬ－グルタミン酸の製造方法に関し、本発明の一具体例に係る変異菌株は、シトラマレートシンターゼの活性が弱化または不活性化されることで、副産物であるシトラマレートの生産量が減少し、Ｌ－グルタミン酸の生産能に優れており、追加的にＹｇｇＢタンパク質を変異させた菌株がグルタミン酸の排出を強化させ、Ｌ－グルタミン酸の生産収率が向上するため、前記変異菌株を用いると、より効果的にＬ－グルタミン酸を製造することができる。

Description

本発明は、Ｌ－グルタミン酸生産能が向上した変異菌株、およびそれを用いたＬ－グルタミン酸の製造方法に関し、より具体的には、シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が弱化または不活性化されて副産物であるシトラマレートの生産量が減少し、Ｌ－グルタミン酸の生産能が増加したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）変異菌株、およびそれを用いたＬ－グルタミン酸の製造方法に関する。
Ｌ－グルタミン酸は微生物の発酵により生産される代表的なアミノ酸であり、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、ＭＳＧ）は、飲食品の全体的な味のバランスと調和が取れるようにし、肉、魚、鶏肉、野菜、ソース、スープ、薬味などの食品の選好度を高め、塩を３０％まで減らした減塩食品の味を増進させるため、家庭用および加工食品の生産のための調味料に広く用いられている。
Ｌ－グルタミン酸を生産するために、通常、主にブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株およびその変異株を用いて、発酵により生産している。微生物の培養によるＬ－グルタミン酸の生産量を増加させるために、Ｌ－グルタミン酸の生合成経路で遺伝子の発現を増加させるために、該当遺伝子の複写数を増加させたり、遺伝子のプロモーターを変形させたりして生合成経路上の酵素活性を調節する方法が利用されて来た。具体的に、ｐｙｃ遺伝子やｆａｓＲのような特定遺伝子の増幅（米国特許第６，８５２，５１６号）や、ｇｄｈ、ｇｌｔＡ、ｉｃｄ、ｐｄｈ、およびａｒｇＧ遺伝子のプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）部位を操作することで（米国特許第６，９６２，８０５号）、Ｌ－グルタミン酸の生産量を増加させている。
シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｃｉｍＡ）は、アセチル－ＣｏＡとピルベートを基質としてシトラマレートを合成する酵素であり、コリネバクテリウムグルタミカムでｃｉｍＡ遺伝子は存在せず、コリネバクテリウムグルタミカムでｃｉｍＡ遺伝子と相同性が高いｌｅｕＡ遺伝子がシトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の役割をすることが知られている。
Ｌ－グルタミン酸の発酵経路では、基質としてアセチル－ＣｏＡが用いられる。そこで、本出願の発明者らは、シトラマレートシンターゼの活性を弱化または不活性化させることで、基質であるアセチル－ＣｏＡを節約してＬ－グルタミン酸の生産性をより向上させようとした。
一方、コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｙｇｇＢ遺伝子の同族体であり（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２００３，２１８（２），ｐ３０５－３０９，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４，５４（２），ｐ４２０－４３８）、機械受容チャネル（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ）の一種であることが報告されている（ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９，１８（７）:１７３０－７）。コリネ型細菌にＬ－グルタミン酸生産能を付与する方法として、具体的に、本発明のような変異がＬ－グルタミン酸の生産に与える影響は報告されていない。
そこで、本出願の発明者らは、シトラマレートシンターゼの活性を弱化または不活性化させた変異菌株、および追加的にグルタミン酸の排出に関与するＹｇｇＢタンパク質に変異を誘発して変異菌株を製作し、前記変異菌株が優れたＬ－グルタミン酸生産能を有することを確認し、本発明を完成した。
韓国登録特許第１０－１１３８２８９号
本発明の目的は、シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が弱化または不活性化されてＬ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）変異菌株を提供することにある。
本発明の他の目的は、
（ａ）コリネバクテリウム属変異菌株を培地で培養するステップと、
（ｂ）培養された変異菌株または培養培地からＬ－グルタミン酸を回収するステップと、を含む、Ｌ－グルタミン酸の製造方法を提供することにある。
本発明の一態様は、シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が弱化または不活性化されてＬ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）変異菌株を提供する。
本発明において、「シトラマレートシンターゼ」とは、アセチル－ＣｏＡとピルベートをシトラマレートおよびコエンザイムＡ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ）に変換する過程を触媒する酵素を意味する。
本発明において、「生産能が向上した」菌株は、母菌株に比べてＬ－グルタミン酸の生産性が増加したものを意味する。
本発明において、「母菌株」は、変異の対象になる野生型または変異菌株を意味し、直接変異の対象になるか、組換えされたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、母菌株は、野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株、または野生型から変異された菌株であってもよい。好ましくは、コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株であってもよい。
本発明の一具体例によると、Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）変異菌株は、シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が、母菌株に比べて弱化または不活性化されたものであってもよい。
本発明において、「活性が弱化」されたとは、細胞内におけるシトラマレートシンターゼ酵素活性の程度が、野生型菌株または変形前の菌株などの母菌株に比べて減少した場合を意味する。前記弱化は、酵素をコードする遺伝子の変異などにより、酵素自体の活性が微生物が本来有している酵素の活性に比べて減少した場合と、これをコードする遺伝子の転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）阻害または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより前記酵素の発現レベルが低下し、細胞内における全体的な酵素活性の程度が、野生型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む概念である。また、本発明において、「不活性化」とは、シトラマレートシンターゼをコードする遺伝子の発現が、野生型菌株または変形前の菌株に比べて全く発現されないか、発現されてもその活性がない状態を意味する。
本発明の一具体例によると、シトラマレートシンターゼ酵素活性の弱化または不活性化は、当該分野において公知の様々な方法の適用により達成されることができる。例えば、前記酵素の活性が完全に除去された場合を含み、前記酵素の活性が減少するように突然変異された遺伝子で、染色体上の前記酵素をコードする遺伝子を代替する方法；前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列（例えば、プロモーター）に変異を導入する方法；前記酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を、活性が弱いか、活性がない配列で交替する方法；前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合し、前記ｍＲＮＡから酵素への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；前記酵素をコードする遺伝子のＳＤ配列の前段に、ＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造物を形成させることで、リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着を不可能にする方法、および該当配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）方法などが挙げられ、これらの組み合わせによっても達成することができるが、これに限定されない。
本発明の一具体例によると、シトラマレートシンターゼはｌｅｕＡ（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子によりコードされるものであってもよい。
本発明において、ｌｅｕＡ（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子は、ｃｉｍＡ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子と相同性が高く、コリネバクテリウム属菌株でシトラマレートシンターゼの役割をすると知られている。本発明の一具体例によると、前記ｌｅｕＡ遺伝子は、配列番号１４のヌクレオチド配列からなっている。
本発明の一具体例によると、シトラマレートシンターゼの活性が弱化または不活性化されることは、シトラマレートシンターゼをコードするｌｅｕＡ遺伝子の発現が減少し、シトラマレートシンターゼの活性が弱化または不活性化されることである。
本発明において、「発現の減少」は、遺伝子の発現量が本来の発現量より減少することを意味し、発現が完全に阻害されて発現が行われない場合を含む。微生物で発現を減少させようとする場合、遺伝子翻訳の開始コドンを置換させてその発現を減少させるか、既存の遺伝子の発現量が減少するように遺伝工学的に操作することができる。発現の調節のために配列を変形する方法としては、前記発現調節配列の核酸配列に欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導することで行ってもよく、プロモーターをより弱いプロモーターに交替するなどの方法により行ってもよい。前記発現調節配列は、プロモーター、オペレーター配列、リポソーム結合部位をコードする配列、および転写と解読の終止を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。発現を減少させる遺伝子が、変異させようとする微生物中に存在する場合、例えば、前記遺伝子の発現を作動させる固有のプロモーター（ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を弱いプロモーター（ｗｅａｋ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）で置換するかもしくは変異を導入することで、前記遺伝子の発現を減少させることができる。さらに、既存の遺伝子の全部または一部を欠失させることで、前記遺伝子の発現を減少させることができる。
本発明の一具体例によると、ｌｅｕＡ遺伝子の発現が減少することは、核酸配列に欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行ってもよく、より弱いプロモーターで交替するなどの方法により行ってもよい。
本発明の一具体例によるｌｅｕＡ遺伝子が欠失されたコリネバクテリウム属変異菌株は、副産物としてシトラマレート（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ）の生産量が母菌株よりも減少し、アセチル－ＣｏＡを節約することで、Ｌ－グルタミン酸の生産量が増加することができる。
本発明の一具体例によると、前記コリネバクテリウム属変異菌株は、配列番号１５で表されるＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列のうち９３番目のアミノ酸であるロイシンおよび１０９番目のアミノ酸であるロイシンからなる群から選択される１つ以上のロイシンを、アラニンまたはバリンで置換させた変異が追加的に誘発されたものであってもよい。
本発明において、ＹｇｇＢ遺伝子は、機械受容チャネル（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ）をコードする遺伝子を意味する。ＹｇｇＢ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００３４５０と登録されているゲノム配列のうち１，３３６，０９２～１，３３７，６９３の配列の相補配列に相当し、ＮＣｇｌ１２２１とも称する。ＹｇｇＢ遺伝子でコードされるＹｇｇＢタンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６００４９２号と登録されている。本発明の一具体例によると、ＹｇｇＢ遺伝子でコードされたＹｇｇＢタンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列からなっている。
一具体例によると、配列番号１５で表されるＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列のうち９３番目のアミノ酸であるロイシンおよび１０９番目のアミノ酸であるロイシンからなる群から選択される１つ以上のロイシンをアラニンまたはバリンで置換させた変異により、Ｌ－グルタミン酸が排出可能なＹｇｇＢタンパク質のポアの内部に関与するメチルグループが除去され、ポアの直径が増加する。これにより、前記変異を有する菌株は、Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上することができる。
具体的に、前記変異菌株は、突然変異により前記ＹｇｇＢタンパク質の変異体を含むか、前記ＹｇｇＢタンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されたものであってもよい。
本発明において、「ベクター」は、宿主細胞への塩基のクローニングおよび／または転移のための任意の媒介物のことである。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合し、結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であってもよい。「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節により複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）のことである。本発明において、ベクターとしては、宿主内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界で公知の任意のベクターが使用できる。前記組換えベクターの製作に用いられたベクターは、天然状態であってもよく、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージであってもよい。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどが使用でき、プラスミドベクターとして、ｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、およびｐＥＴ系などが使用できる。使用可能なベクターは特に制限されず、公知の発現ベクターが使用できるが、これに限定されない。
本発明において、「形質転換」は、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させることができるようにすることであり、形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現されることができれば、宿主細胞の染色体内に挿入されているかまたは染色体外に位置しているかを問わずに含まれることができる。
本発明の一具体例による、ｌｅｕＡ遺伝子が欠失され、ＹｇｇＢタンパク質に変異が起こったコリネバクテリウム属変異菌株は、母菌株よりもＬ－グルタミン酸の生産量が増加し、Ｌ－グルタミン酸の生産のための培養時間が短縮されるため、効率的にＬ－グルタミン酸を生産することができる。
本発明の一具体例によると、前記コリネバクテリウム属菌株はコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよい。
本発明の一具体例によると、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムアセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウムアセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムアルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウムリリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウムメラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、またはコリネバクテリウムハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によると、前記コリネバクテリウム属菌株はコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰであることが最も好ましい。
本発明の他の態様は
（ａ）コリネバクテリウム属変異菌株を培地で培養するステップと、
（ｂ）培養された変異菌株または培養培地からＬ－グルタミン酸を回収するステップと、を含むＬ－グルタミン酸の製造方法を提供する。
本発明の一具体例によると、前記培養は、当業界で公知の適切な培地と培養条件により行われることができ、通常の技術者であれば、培地および培養条件を容易に調整して用いることができる。具体的に、前記培地は液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせの培養を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によると、前記培地は、適切な方式により特定菌株の要件を満たす必要があり、通常の技術者により適宜変形されてもよい。コリネバクテリウム属菌株の培養培地については、公知された文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）を参照することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によると、培地に様々な炭素源、窒素源、および微量の元素成分を含んでもよい。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として用いることができるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆かす、およびユリア、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムが含まれてもよい。窒素源も、個別的にまたは混合物として用いることができるが、これに限定されるものではない。使用可能なリン供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいが、これに限定されるものではない。また、培養培地には、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩が含有されてもよいが、これに限定されるものではない。その他に、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。また、培養培地に適した前駆体が用いられてもよい。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に、適した方式により回分式または連続式に添加されてもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によると、培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式により添加し、培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に，脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑えることができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、酸素または酸素－含有気体（例えば、空気）を培養液中に注入することができる。培養液の温度は、通常、２０℃～４５℃、例えば、２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、所望の生産量で有用物質が得られるまで続くことができ、例えば、１０～１６０時間であってもよい。
本発明の一具体例によると、前記培養された変異菌株および培養培地からＬ－グルタミン酸を回収するステップは、培養方法に応じて、当該分野で公知された適した方法により、培地から生産されたＬ－グルタミン酸を収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムサルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、およびサイズ排除）などの方法を用いてもよいが、これに制限されない。
本発明の一具体例によると、グルタミン酸を回収するステップは、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上清をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。
本発明の一具体例によると、前記Ｌ－グルタミン酸を回収するステップは、Ｌ－グルタミン酸を精製する工程を含むことができる。
本発明の一具体例による変異菌株は、シトラマレートシンターゼの活性が弱化または不活性化されることで、副産物であるシトラマレートの生産量が減少し、Ｌ－グルタミン酸の生産能に優れており、追加的にＹｇｇＢタンパク質を変異させた菌株がグルタミン酸の排出を強化させ、Ｌ－グルタミン酸の生産収率が向上するため、前記変異菌株を用いると、より効果的にＬ－グルタミン酸を製造することができる。
シトラマレートの合成経路を示す。 コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株でｌｅｕＡ遺伝子を破壊するために製造したｐＫＬＡベクターを示す。 ｌｅｕＡ遺伝子が欠失された部分で、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）１、４の位置を示す。 Ａは、ＹｇｇＢタンパク質の構造を示し、Ｂは、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で、９３番目のロイシンをアラニンで置換したＹｇｇＢタンパク質のポア（ｐｏｒｅ）構造を示し、Ｃは、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で、１０９番目のロイシンをアラニンで置換したＹｇｇＢタンパク質のポア（ｐｏｒｅ）構造を示す。 Ｉ１０菌株において、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で、９３番目のアミノ酸を他のアミノ酸で置換させるために製造したｐＫＹ９３ベクターを示す。
以下、１つ以上の具体例を、実施例を挙げてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、１つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．菌株発酵終了液の細胞内代謝体の分析
コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株は、Ｉ６菌株を、化学的にＤＮＡ変異を起こすニトロソグアニジン（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ、ＮＴＧ）で処理して得られた変異菌株であり、糖蜜耐性を有するため、原料コストが安い糖蜜を主な炭素源として用いることで、高い収率でＬ－グルタミン酸を生産することができる（韓国特許公開第１０－２０１１－００３４７１８号）。
グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウムグルタミカムＩ６（以下、Ｉ６）およびコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ（以下、ＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ）の細胞内部の代謝体物質およびＬ－グルタミン酸の量を分析した。
ＫＣＴＣ １１５５８ＢＰおよびＩ６を、それぞれＣＭ液状培地（ｇｌｕｃｏｓｅ １％、ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ １％、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、ｕｒｅａ ０．２％、５０％ ＮａＯＨ １００ｌ、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）２５ｍｌに接種した後、３０℃で２００ｒｐｍで振盪培養した。培養途中に、細胞成長が指数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に達した時に急速真空濾過（ｒａｐｉｄ ｖａｃｕｕｍ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ ＨＶ、０．４５ ｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により培養液から細胞を分離した。細胞が吸着されたフィルターを１０ｍｌの冷却水で２回洗浄した後、５Ｍのモルホリンエタンスルホン酸（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）および５Ｍのメチオニンスルホン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎｅ）を含有するメタノールに１０分間浸し、反応を停止させた。それから得られた抽出液に、同量のクロロホルムと０．４倍体積の水を混合した後、水層（ａｑｕｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ）のみをスピンカラム（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）に適用してタンパク質汚染物を除去した。濾過された抽出液を、キャピラリー電気泳動質量分析（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により相対的なシトラマレート量を分析し、その結果を下記表１に記載した。
また、Ｃ１８カラム（Ａｐｏｌｌｏ Ｃ１８、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を用いた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）を行い、Ｌ－グルタミン酸の生産量を分析した。その結果は下記表１に記載した。ＫＨ２ＰＯ４ ８．８５ｇ／Ｌ、水酸化テトラブチルアンモニウム溶液（Ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１．６５２ｇ／Ｌ、アセトニトリル１０ｍｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）１２．５ｍｇ／Ｌの組成を有し、ｐＨ３．１５（リン酸で調整）である分析バッファーを０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＨＡ）でフィルトレーションして使用した。
表１に示されたように、ＫＣＴＣ １１５５８ＢＰが生産するシトラマレート（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ）が、対照群であるＩ６に比べて約３倍増加したことを確認した。
Figure 2022513813000002
実施例２．ｌｅｕＡ遺伝子が欠失されたコリネバクテリウムグルタミカム変異菌株の製造
図１はシトラマレートの合成経路を示す。シトラマレートは大腸菌でｃｉｍＡ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子により生成されるが、コリネバクテリウムグルタミカムではｃｉｍＡ遺伝子が存在しない。しかし、コリネバクテリウムグルタミカムで、ｃｉｍＡ遺伝子と相同性の高いｌｅｕＡ遺伝子がシトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の役割をすることが知られている。したがって、ｌｅｕＡ（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を破壊して副産物であるシトラマレートを減少させ、Ｌ－グルタミン酸の製造に用いられる基質であるアセチル－ＣｏＡを節約することで、Ｌ－グルタミン酸の生産性をより向上させようとした。配列番号１４は、ｌｅｕＡ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
実施例２－１．ｌｅｕＡ遺伝子破壊ベクターの製造
コリネバクテリウムグルタミカムでｌｅｕＡ遺伝子（ＮＣｇｌ０２４５）を破壊するために、Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰを使用した。
コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株の染色体ＤＮＡを分離し、それを鋳型とし、下記プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）１、２セットとプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）３、４セットをそれぞれ利用して、９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で６０秒の条件で３０サイクル繰り返してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物（図２においてＨ１およびＨ２）を精製した。
精製したＰＣＲ産物は、さらにクロスオーバーＰＣＲ（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のための鋳型として用いられ、プライマー１、４セットでさらに１回増幅した。
ｌｅｕＡ遺伝子を欠損させるための１６００ｂｐのクロスオーバーＰＣＲ産物を精製した後、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素（タカラ、日本）で切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクター（Ｇｅｎｅ，１４５：６９－７３，１９９４）でクローニングしてｌｅｕＡ遺伝子破壊用ベクターを製造し、これをｐＫＬＡと命名した。図２は、コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株でｌｅｕＡ遺伝子を破壊するために製造したｐＫＬＡベクターを示す。
Figure 2022513813000003
実施例２－２．コリネバクテリウムグルタミカム菌株の形質転換およびｌｅｕＡ欠損変異菌株の製造
ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔの方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１－５４５，１９９９）を用いて、エレクトロコンピテントセル製造法により形質転換を可能としたコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株（以下、ＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ）に、実施例２－１で製造されたベクターｐＫＬＡを電気衝撃により導入させた。
具体的に、２％のブドウ糖が添加された２ＹＴ培地（トリプトン１６ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ）１００ｍｌでＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株を一次培養し、ブドウ糖を除いた同一培地に、１ｍｇ／ｍｌ濃度のイソニコチン酸ヒドラジン（ｉｓｏｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒａｚｉｎｅ）および２．５％のグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）を添加した。次に、ＯＤ６１０値が０．３になるように種培養液を接種した後、１８℃、１８０ｒｐｍで１２～１６時間培養し、ＯＤ６１０値が１．２～１．４になるようにした。氷で３０分間放置した後、４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、上清を捨て、沈殿されたＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株を１０％グリセロール溶液で４回洗浄し、最終的に１０％のグリセロール溶液０．５ｍｌに再懸濁した。電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）は、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）社のエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）を用いて行った。電気穿孔キュベット（０．２ｍｍ）に上記の方法により製造したコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を入れ、実施例２－１で製造したｐＫＬＡベクターを添加した後、２．５ｋＶ、２００Ω、および１２．５μＦの条件で電気衝撃を加えた。電気衝撃が終わった直後に再生（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ １８．５ｇ／ｌ、ソルビトール０．５Ｍ）１ｍｌを添加し、４６℃で６分間熱処理した。その後、室温で冷却した後、１５ｍｌのキャップチューブに移して３０℃で２時間培養し、選別培地（トリプトン５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌ、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｐｏｗｄｅｒ １８．５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ソルビトール９１ｇ／ｌ、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）２０μｇ／ｌ）に塗抹した。３０℃で７２時間培養して生成されたコロニーは、ＢＨＩ培地で静止期まで培養して二次組換えを誘導し、１０－５～１０－７まで希釈して抗生剤のない平板（１０％スクロース含有）に塗抹して、カナマイシン耐性がなく、且つ１０％スクロースが含まれた培地で成長する菌株を選別した。選別された菌株は、前記表２に記載のプライマー１、４セットを用いて、ｌｅｕＡ遺伝子が欠失されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株を確認し、ｌｅｕＡ遺伝子が欠失された欠損株を「Ｉ１０」と命名した。図３はｌｅｕＡ遺伝子が欠失された部分で、プライマー１、４の位置を示す。
実施例２－３．ｌｅｕＡ欠損株（Ｉ１０）の栄養要求性の確認
前記実施例２－２で製造されたｌｅｕＡ欠損株（以下、Ｉ１０）はｌｅｕＡ遺伝子が欠損されているため、ロイシン栄養要求性菌株となり、これを確認するために、下記表３に記載の組成で製造した最小培地およびロイシン添加培地に塗抹し、３０℃で２４時間培養して生育の程度を測定し、その結果を表４に記載した。
Figure 2022513813000004
表４に示されたように、ロイシンを添加していない最小培地で、母菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株に比べてＩ１０菌株の生育が急激に低下し、ロイシンを添加することで生育が回復した。このことから、Ｉ１０菌株でｌｅｕＡ遺伝子の欠損を確認した。
Figure 2022513813000005
実施例３．ｌｅｕＡ遺伝子が欠失されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（Ｉ１０）のＬ－グルタミン酸およびシトラマレート生産量の確認
下記表５に記載の含量で製造された活性平板培地を用いて、ｌｅｕＡ欠損株（以下、Ｉ１０）およびコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ（以下、ＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ）を３０℃で２４時間培養した。その後、下記表６に記載の含量で製造されたＬ－グルタミン酸フラスコ培地１０ｍｌを１００ｍｌフラスコに入れ、上記で培養した菌をループにより接種して３０℃、２００ｒｐｍ、４８時間培養した。培養終了液は、Ｌ－グルタミン酸の生産量と細胞内代謝体の分析に使用された。Ｌ－グルタミン酸の生産量と相対的なシトラマレート量は、実施例１に記載の方法と同様に行って測定した。
表７は、Ｉ１０およびＫＣＴＣ １１５５８ＢＰでのＬ－グルタミン酸の生産量および相対的なシトラマレート量を示す。表７に示されたように、Ｉ１０菌株でＬ－グルタミン酸の生産量が増加し、シトラマレートは著しく減少したことが確認できた。
Figure 2022513813000006
Figure 2022513813000007
Figure 2022513813000008
実施例４．ＹｇｇＢ変異菌株の製造
ｌｅｕＡ欠損株（Ｉ１０）の代謝体の分析結果、細胞の内部に多くのＬ－グルタミン酸が積もっていることが確認され、Ｌ－グルタミン酸の排出を強化させようとした。
ＹｇｇＢは、機械受容チャネルの同族体（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｈｏｍｏｌｏｇ）であり、コリネバクテリウムグルタミカムでＬ－グルタミン酸の排出において重要な役割をすると知られている。配列番号１５はＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を示す。図４のＡはＹｇｇＢタンパク質の構造を示す。ＹｇｇＢのタンパク質構造を分析し、排出を強化することができる変異を探索した。
図４のＢは、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で、９３番目のロイシンをアラニンで置換したＹｇｇＢタンパク質のポア（ｐｏｒｅ）構造を示し、図４のＣは、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で、１０９番目のロイシンをアラニンで置換したＹｇｇＢタンパク質のポア（ｐｏｒｅ）構造を示す。
実施例４－１．ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で９３番目のアミノ酸を置換させた菌株の製作
図４のＢに示されたように、Ｌ－グルタミン酸の移動通路を確張するために、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で９３番目のロイシンをアラニンで置換すると、ポアの内部の狭い部分に関与するメチルクループが除去され、ポアの直径が増加するはずであると推定し、変異菌株を製作した。
実施例２－２で製作したＩ１０菌株の染色体ＤＮＡを分離し、これを鋳型としてプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）５、６セットおよびプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）７、８セットをそれぞれ用いて、９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で６０秒の条件で３０サイクルを繰り返してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を精製した。精製されたＰＣＲ産物を鋳型として用い、プライマー５、８を用いてクロスオーバーＰＣＲにより増幅した。増幅された産物は、塩基配列分析により変異を確認した後、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ制限酵素（タカラ、日本）を用いて切断した。ｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターを同一の制限酵素で切断し、前記増幅されたクロスオーバーＰＣＲ産物とライゲーションしてベクターを製作し、これをｐＫＹ９３と命名した。使用したプライマー配列は表８に記載した。図５は、Ｉ１０菌株において、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で９３番目のアミノ酸を置換させるためのｐＫＹ９３ベクターを示す。
Figure 2022513813000009
前記実施例２－２と同様の方法によりＩ１０菌株に前記ｐＫＹ９３ベクターを導入して形質転換された菌株を選別し、これをＩ１０－９３と命名した。Ｉ１０－９３変異菌株は、ＹｇｇＢタンパク質の９３番目のアミノ酸であるロイシンがアラニンで置換されている。
実施例４－２．ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で１０９番目のアミノ酸を置換させた菌株の製作
図４のＣに示されたように、Ｌ－グルタミン酸の移動通路を確張するために、ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列で１０９番目のロイシンをアラニンで置換すると、ポアの内部の狭い部分に関与するメチルクループが除去され、ポアの直径が増加するはずであると推定し、変異菌株を製作した。
実施例２－２で製作したＩ１０菌株の染色体ＤＮＡを分離し、これを鋳型としてプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）５、９セットおよびプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）１０、８セットをそれぞれ用いて、９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で６０秒の条件で３０サイクルを繰り返してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を精製した。精製されたＰＣＲ産物は鋳型として用い、プライマー５、８を用いてクロスオーバーＰＣＲにより増幅した。増幅された産物は、塩基配列分析により変異を確認した後、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ制限酵素（タカラ、日本）を用いて切断した。ｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターを同一の制限酵素で切断し、前記増幅されたクロスオーバーＰＣＲ産物とライゲーションしてベクターを製作し、これをｐＫＹ１０９と命名した。使用したプライマー配列は表８に記載した。
前記実施例２－２と同一の方法によりＩ１０菌株に前記ｐＫＹ１０９ベクターを導入して形質転換された菌株を選別し、これをＩ１０－１０９と命名した。Ｉ１０－１０９変異菌株は、ＹｇｇＢタンパク質の１０９番目のアミノ酸であるロイシンがアラニンで置換されている。
実施例５．変異菌株のＬ－グルタミン酸生産性の確認
実施例１および実施例３と同様の方法により、フラスコ規模でＩ１０、Ｉ１０－９３、およびＩ１０－１０９菌株がＬ－グルタミン酸を生産した量およびかかった時間を測定し、その結果を表９に記載した。
Figure 2022513813000010
表９に記載されたように、ＹｇｇＢタンパク質のポア（ｐｏｒｅ）の拡張を誘導したＩ１０－９３およびＩ１０－１０９変異菌株で、Ｌ－グルタミン酸の生産量がＩ１０菌株よりも増加した。特に、Ｉ１０－１０９菌株は、Ｌ－グルタミン酸の生産量がＩ１０より著しく増加し、発酵時間も４８時間から４４時間に短縮され、効率的にＬ－グルタミン酸を生産することができる。

Claims (5)

  1. シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が弱化または不活性化されてＬ－グルタミン酸の生産能が向上した、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）変異菌株。
  2. 前記シトラマレートシンターゼが、ｌｅｕＡ（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子によりコードされるものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属変異菌株。
  3. 前記コリネバクテリウム属変異菌株は、配列番号１５で表されるＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列のうち９３番目のアミノ酸であるロイシンおよび１０９番目のアミノ酸であるロイシンからなる群から選択される１つ以上のロイシンをアラニンまたはバリンで置換させた変異が追加的に誘発されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属変異菌株。
  4. 前記菌株がコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属変異菌株。
  5. （ａ）請求項１に記載のコリネバクテリウム属変異菌株を培地で培養するステップと、
    （ｂ）前記培養された変異菌株または培養培地からＬ－グルタミン酸を回収するステップと、を含むＬ－グルタミン酸の製造方法。
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