JP2018531033A - Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いてｌ−イソロイシンを生産する方法 - Google Patents

Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いてｌ−イソロイシンを生産する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を有するタンパク質を含むＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物、及びそれを用いてＬ−イソロイシンを生産する方法に関する。

Description

本出願は、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物及びこれを用いてＬ−イソロイシンを生産する方法に関する。
分岐鎖アミノ酸（ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）は、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−イソロイシン３種を指すもので、食品添加物、薬学剤などの用途に産業的に用いられる。特に、Ｌ−イソロイシンは筋肉で代謝されてエネルギーを生成し、ヘモグロビンの生成に関与して疲労軽減と成長促進機能をする。これにより、輸液製剤及び栄養剤などに多様に用いられており、スポーツ栄養食品にも使用が増加している。
微生物を用いたＬ−イソロイシンの生合成は、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）と、２−ケト酪酸（２−ｋｅｔｏｂｕｔｙｒａｔｅ）を前駆体として使用して、３つの中間代謝物質を経て合成される（非特許文献１）。
しかし、Ｌ−イソロイシン生合成段階中のＬ−トレオニンから２−ケト酪酸を生成するトレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ、遺伝子ｉｌｖＡ）と、次の段階のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ、遺伝子ｉｌｖＢＮ）はすべてＬ−イソロイシンによってフィードバック阻害を受ける。
したがって、Ｌ−イソロイシンによるフィードバック解除を介して生合成に関与する酵素を調節することが高収率のＬ−イソロイシン生産菌株を製作するのに重要な要素であることが分かる（非特許文献２）。これに加え、分岐鎖アミノ酸は、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）まで同様の生合成経路を介して生成されるため、高収率のＬ−イソロイシンを大量生産するためには、２−ケト酪酸の前段階であるＬ−トレオニンの円滑な供給がなされるべきである（特許文献１）。
韓国登録特許第１０−０８２３０４４号公報 韓国登録特許第１０−０６２００９２号公報 国際公開第２００６／０６５０９５号 韓国登録特許第１０−０９２４０６５号公報 韓国登録特許第１０−１３３５７８９号公報
Jinhwan Park et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 85: 491-506, 2010 Jinhwan Park et al., Biotechnology Journal, 560-577, 2010 Howell et al., J Bacteriol. 181: 331-333, 1999 Xu et al., J Bacteriol. 186: 5400-5409, 2004 Risso et al., J Bacteriol. 190: 2266-2274, 2008 Biotechnology Letters 13(10): 721-726, 1991 Schreiner et al., J Bacteriol. 187: 6005-18, 2005
本発明者らはＬ−トレオニンを前駆体として利用しない新規生合成経路を検討していた中、シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を有する遺伝子をＬ−イソロイシン生合成経路に導入した結果、Ｌ−イソロイシン生産が向上されたことを確認し、本出願を完成した。
本出願の目的は、新規生合成経路が導入されたＬ−イソロイシン生産能を有する組み換え微生物を提供することにある。
本出願の他の目的は、前記新規生合成経路が導入された組み換え微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物または培地からＬ−イソロイシンを回収する段階を含む、Ｌ−イソロイシンを生産する方法を提供することにある。
本出願のＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、シトラマレートシンターゼ活性が導入されてＬ−トレオニンを前駆体として利用しない新しい生合成経路を介してＬ−イソロイシンを高収率で生産しうる。
前記目的を達成するために、本出願の一態様は、シトラマレートシンターゼ活性を有するタンパク質を含むＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物を提供する。
本出願で用語、「Ｌ−イソロイシン」は、必須アミノ酸の一つであり、構造的にＬ−バリン、Ｌ−ロイシンと共に分岐鎖アミノ酸に該当する化学式ＨＯ２ＣＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であるＬ−アミノ酸を意味する。
本出願で用語、「Ｌ−イソロイシン生産能を有する」とは、該当微生物が培地で培養されるときの培地または微生物内にＬ−イソロイシンを蓄積できる能力を示すことを意味する。このようなＬ−イソロイシン生成能は野生型菌株によって保有された特性であるか、または菌株の改良によって付与または増強された特性であってもよい。
例えば、Ｌ−イソロイシン生産能を有するために、該当微生物は栄養要求性変異株、アナログ耐性変異株、または代謝制御変異株の取得、またはＬ−イソロイシン生合成関連酵素の活性を強化させるなどの組み換え変異株の製作などの微生物の変形に用いられる方法を単独または組み合わせて適用してもよい。
また、Ｌ−イソロイシン生合成に関連する酵素活性を強化する場合、強化されるＬ−イソロイシン生合成に関与する遺伝子、具体的にはｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ、ｉｌｖＤ及びｉｌｖＡ遺伝子は、単独または２種以上で組み合わせて強化されてもよい。前記ｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ、ｉｌｖＤ及びｉｌｖＡ遺伝子は、それぞれアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムＩＩの大型サブユニット、小型サブユニット、トランスアミナーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ及びトレオニンデアミナーゼを暗号化する。
本出願で用語、「シトラマレートシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１８２）」は、アセチルＣｏＡとピルビン酸をシトラマレート及びコエンザイムＡ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ）に変換する過程を触媒する酵素である。この酵素は、メタノカルドコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（非特許文献３）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｏｇａｎｓ）（非特許文献４）、ゲオバクター・スルフレデュセンス（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）などの古細菌類で発見され、イソロイシン生合成のトレオニン非依存型経路に関与する（非特許文献５）。前記酵素は基質としてのピルビン酸に対する特異性が高く、典型的にイソロイシンによって阻害されることが公知されている。
本出願で用語、「シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質」及び「それをコードする遺伝子」には、前記のようなシトラマレートシンターゼの活性を有する任意のタンパク質及びこれをコードする任意の遺伝子が制限なく含まれてもよい。
具体的には、シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質はメタノカルドコッカス由来であってもよく、より具体的には、メタノカルドコッカス・ヤナシイ由来であってもよい。前記シトラマレートシンターゼは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有し、これをコードするｃｉｍＡ遺伝子は、配列番号２に記載される塩基配列を有する。微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列の違いが存在するか、または遺伝子コードの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により機能的に同様の多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードしうるため、前記開示された配列番号に限定されない。
また、実質的に配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、もっと具体的には９８％以上の相同性を示すアミノ酸配列として実質的にシトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
さらに、前記配列と相同性を有する配列として実質的に配列番号１のタンパク質と同一または相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本出願の範囲に含まれるのは自明である。
また、前記シトラマレートシンターゼをコードする遺伝子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドはコドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、または前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよい。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２のポリヌクレオチド配列を有してもよく、それと相同性が８０％、具体的には９０％以上、より具体的には９９％以上の塩基配列を有してもよい。しかし、これに限定されない。
また、前記シトラマレートシンターゼの活性が向上された変異型を収得するために、配列番号１のタンパク質の変異型として本出願は、エラープローンＰＣＲを用いて収得されたＣｉｍＡ（Ｍ）突然変異ライブラリーを提供する。
具体的には、本出願によるＣｉｍＡ（Ｍ）突然変異ライブラリーは
配列番号３のアミノ酸配列を有するＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ１（具体的に配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる）；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ２（具体的に配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる）；
配列番号７のアミノ酸配列を有するＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３（具体的に配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる）；
配列番号９のアミノ酸配列を有するＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ４（具体的に配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる）；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ５（具体的に配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる）；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ６（具体的に配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる）；及び
配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ７（具体的に配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる）を含んでもよい。
また、実質的に前記配列番号のアミノ酸配列と、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、もっと具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列として実質的に前記シトラマレートシンターゼ変異体の活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
本出願で用語、「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで示されてもよい。本明細書で、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一であるか、または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と示される。例えば、スコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及び類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などのパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算する標準ソフトウェア、具体的にＢＬＡＳＴ ２．０を用いたり、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験によって配列を比較することにより確認でき、定義される適切な混成化条件は当該技術の範囲内であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ １９８９参照）、当業者によく知られている方法で決定されうる。
具体的な一実施態様で、本出願の微生物は、メタノカルドコッカス・ヤナシイに由来の下記配列番号１のシトラマレートシンターゼ及びその変異体として配列番号３、５、７、９、１１、１３及び１５で構成された群から選択されるアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。より具体的には、前記遺伝子をそれぞれ含む組み換えベクターを微生物内に形質転換させて目的の遺伝子を発現させることができる。
本出願で使用される用語、「組み換えベクター」は、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。組み換えベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそれ自体に統合されてもよい。
本出願で用いられる組み換えベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いて作製されてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組み換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどが用いられてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などが用いられてもよい。本出願に使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく公知の発現ベクターを用いてもよい。具体的には、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いられてもよい。
一例として、宿主細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への導入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組み換えによって行ってもよいが、これに限定されない。
本出願で用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドが宿主細胞内で発現されることさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これら両方を含みうる。
また、前記で用語、「作動可能に連結」されたということは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
一方、本出願の具体的な実施態様で、コリネバクテリウム属微生物は活性が強化されたイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をさらに含んでもよい。
本出願で用語、「タンパク質の活性の強化」とは、当該タンパク質の活性が野生型または変異前の状態に比べて活性が増加されることを意味する。具体的に、当該タンパク質をコードする内在的遺伝子の活性の増加、内部または外部要因から内在的遺伝子の増幅、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子の導入、発現調節配列の変形、特にプロモーターの交替または変形及び遺伝子内の突然変異によるタンパク質活性の増加等によりその活性が増加されることを含んでもよい。
具体的に、本出願でイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼまたはイソプロピルマレートデヒドラターゼタンパク質の活性を強化させることは、
１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記酵素の活性が増強されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、または
４）これらの組み合わせから選択された方法で行なわれてもよいが、特にこれに限定されない。
前記でポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行われうる。具体的に、本出願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された宿主とは無関係に複製されて機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されることによって行なわれてもよいが、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより、前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行なわれてもよい。
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形することは、特に限定されないが、前記発現調節配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含む。
前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ｃｊ７プロモーター（特許文献２及び３）、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがあり、さらに好ましくはコリネバクテリウム由来のプロモーターであるｃｊ７プロモーターと作動可能に連結されて、前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させうる。
また、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性を強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行われてもよい。
本出願で用語、「イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ」及び「イソプロピルマレートデヒドラターゼ」は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの生合成経路に関与する酵素であって、これらの活性を有するタンパク質及びこれをコードする遺伝子には、前記のような酵素活性を有する任意のタンパク質及びこれをコードする任意の遺伝子が制限なく含まれてもよい。
具体的に、本出願でイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８５）は、コリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来であってもよい。
一方、本出願のイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼは、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。また、実質的に配列番号１７のアミノ酸配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、もって具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列として、実質的にイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
また、前記イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在するか、または遺伝子コードの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により機能的に同様の多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードしうるため、前記遺伝子は開示された配列番号に限定されないが、例えば、配列番号１８の塩基配列を有してもよく、これと相同性が８０％、具体的には９０％以上、より具体的には９９％以上の塩基配列を有してもよい。
また、本出願でイソプロピルマレートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３３）は、コリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来であってもよい。一方、本出願のイソプロピルマレートデヒドラターゼは、２つの小単位（ｓｍａｌｌ／ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）で構成され、これらそれぞれは、配列番号１９及び配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。また、実質的に配列番号１９及び２１のアミノ酸配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、もっと具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列として、実質的にイソプロピルマレートデヒドラターゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
また、前記イソプロピルマレートデヒドラターゼをコードする遺伝子は、配列番号１９及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在するか、または遺伝子コードの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により機能的に同様の多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードしうるため、前記遺伝子は、開示された配列番号に限定されない。例えば配列番号２０及び配列番号２２の塩基配列を有してもよく、この相同性が８０％、具体的には９０％以上、より具体的には９９％以上の塩基配列を有してもよい。
一方、本出願の具体的な実施態様で、コリネバクテリウム属微生物は、活性が強化されたＬ−イソロイシン生合成経路に関与する酵素をさらに含んでもよい。
本出願で用語、「Ｌ−イソロイシン生合成経路に関与する酵素」には、アスパラギン酸キナーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ｋｉｎａｓｅ、ｌｙｓＣ遺伝子）、アスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ−β−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ａｓｄ遺伝子）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｈｏｍ遺伝子）、ホモセリンキナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ｔｈｒＢ遺伝子）、トレオニンシンターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｔｈｒＣ遺伝子）、トレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ、ｉｌｖＡ遺伝子）、アミノトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｉｌｖＥ遺伝子）などが含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
一方、本出願の具体的な実施態様で、コリネバクテリウム属微生物は、不活性化されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をさらに含んでもよい。
本出願で用語、「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．４．１）」は、ピルビン酸をアセチルＣｏＡ及びＣＯ２に転換させる酵素である。本出願では、ｃｉｍＡ遺伝子の前駆体として用いられるアセチルＣｏＡの供給を増加させるために、前記酵素をコードするａｃｅＥ遺伝子が欠損された菌株を製造することができる。
具体的に、本出願でピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．４．１）は、コリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来であってもよい。一方、本出願のピルビン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。また、実質的に配列番号２５のアミノ酸配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、もっと具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列として、実質的にピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
また、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号２５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在するか、または遺伝子コードの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により機能的に同様の多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードしうるため、前記遺伝子は開示された配列番号に限定されない。例えば、配列番号２６の塩基配列を有してもよく、これと相同性が８０％、具体的には９０％以上、より具体的には９９％以上の塩基配列を有してもよい。
本出願で用語、「不活性化」とは、該当ポリペプチドをコードする遺伝子が発現されないか、遺伝子発現において不完全な発現による活性の減少を示したり、発現されても機能性のある該当ポリペプチドを生産しないことを意味する。
また、当該ポリペプチドをコードする遺伝子が完全に不活性化されているだけでなく、その発現レベルが著しく低くて実質的に発現しないものも含まれる意味である。したがって、遺伝子不活性化は、完全（ノックアウト）されたり、部分的（例えば、遺伝子が正常の発現レベル未満を示す低次形遺伝子（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈ）またはこれが影響を与える活性において部分的な減少を示す突然変異体遺伝子の生成物）であってもよい。
さらに、本出願で該当ポリペプチドの「不活性化」には、変形されない菌株に比べて、該当ポリペプチドの活性が減少されたことだけでなく、その活性が削除された場合も含む。具体的に、本出願でトレオニンデヒドラターゼの不活性化は、
１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が弱化するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、または
４）これらの組み合わせから選択された方法で行なわれてもよいが、特にこれに限定されない。
前記でタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体を欠失する方法は、細菌内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に置換することによって行われてもよい。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には１〜３００個、より具体的には１〜１００個、さらに具体的には１〜５０個であってもよい。
次に、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を変形する方法は、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をより弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有する核酸配列に交替することによって行ってもよい。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含んでもよく、これに限定されない。
また、染色体上のポリヌクレオチド配列を変形する方法は、前記タンパク質の活性をより弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することにより行ってもよく、これに限定されない。
本出願の別の具体的実施態様で、イソロイシン生産能を有する微生物は、前記シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質が導入されて発現されうる微生物であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。例としては、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、アルカノバクテリウム属（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）など属する微生物であってもよい。具体的に、本出願の微生物はコリネバクテリウム属に属する微生物であり、より具体的にコリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これに限定されない。
本出願の別の態様は、
シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を有するタンパク質を含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び
前記微生物または培地からＬ−イソロイシンを回収する段階を含む、Ｌ−イソロイシン生産方法を提供する。
前記方法において、シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が導入されたコリネバクテリウム属微生物は、先に説明した通りである。
簡単に説明すると、前記コリネバクテリウム属微生物は、メタノカルドコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）由来のシトラマレートシンターゼをコードする遺伝子が導入されたものであってもよく、具体的には配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５で構成された群から選択されるアミノ酸配列を有するシトラマレートシンターゼをコードする遺伝子が導入されたものであってもよい。
また、本出願によるコリネバクテリウム属微生物は、イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）の活性がさらに強化されたものであってもよい。さらに、前記コリネバクテリウム属微生物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性がさらに不活性化されたものであってもよい。
具体的に、本出願の一例によるコリネバクテリウム属微生物は、シトラマレートシンターゼをコードする遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムであってもよい。
前記方法において、本出願によるコリネバクテリウム属微生物を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行なわれてもよい。
このとき、培養条件は、特に限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８）を調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。
酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよく、培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃を維持してもよい。培養は、目的のＬ−イソロイシンの生成量が最大に得られるまで続き、この目的を達成するために、通常１０〜１６０時間培養してもよい。前記培養によって生産されたＬ−イソロイシンは培地中に分泌されるか、または細胞内に残留してもよい。
また、使用される培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用してもよい。しかし、これに限定されるものではない。
窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して使用してもよい。しかし、これに限定されるものではない。
リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用してもよいが、これに限定されるものではない。また、その他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本出願の具体的な実施態様でイソロイシンを生産する方法は、前記コリネバクテリウム属微生物の培養段階で酢酸がさらに供給されてもよい。
前記方法において、培養段階で生産されたＬ−イソロイシンを回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などによって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用されてもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願の別の態様は、
シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を有するタンパク質を含むコリネバクテリウム属微生物のイソロイシン生産用途を提供する。
前記用途において、シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が導入されたコリネバクテリウム属微生物は、先に説明した通りである。
前記で説明したように、本出願のＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、シトラマレートシンターゼの活性が導入されてＬ−トレオニンを前駆体として用いない新しい生合成経路を介してＬ−イソロイシンを高収率で生産することができる。
（実施例）
実施例１：メタノカルドコッカス由来のｃｉｍＡ遺伝子を含む組み換えベクターの作製
＜１−１＞メタノカルドコッカス由来のｃｉｍＡ遺伝子断片の準備
シトラマレートシンターゼをコードするｃｉｍＡ遺伝子（ＮＣ＿０００９０９．１）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む１４７６ｂｐ断片を得るために、ジェノミックチップシステム（Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ｓｙｓｔｅｍ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、メタノカルドコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＤＳＭ ２６６１からゲノムＤＮＡを抽出した。
メタノカルドコッカス・ヤナシイＤＳＭ ２６６１由来のシトラマレートシンターゼは配列番号１に記載される４９１個のアミノ酸配列を有し、これをコードするｃｉｍＡ遺伝子は、配列番号２に記載される塩基配列を有する。
前記で抽出されたｇＤＮＡを鋳型にして、下記配列番号３５及び３６のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で６０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ＣｉｍＡ（Ｍ）断片」と命名した。
プライマーｃｉｍＡ−５−ＮｄｅＩ（配列番号３５）：
５’−ＧＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣ−３’
プライマーｃｉｍＡ−３−ＸｂａＩ（配列番号３６）：
５’−ＣＧＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴ−３’
＜１−２＞組み換えベクターｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）の製作
公知のコリネバクテリウム属微生物由来のプロモーターｃｊ７を含むｐ１１７−ｃｊ７−ｇｆｐを鋳型としてＰＣＲを行った（特許文献２）。ここで、「ｐ１１７」は、大腸菌コリネバクテリウムシャトルベクター（Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＥＣＣＧ１１７（非特許文献６）を示すものである。前記ＰＣＲ反応は、下記配列番号２７及び２８のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５６℃で２０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、３２３ｂｐサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｃｊ７断片」と命名した。
プライマーＰｃｊ７−５−ＫｐｎＩ（配列番号２７）：
５’−ＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣ−３’
プライマーＰｃｊ７−３ ＮｄｅＩ（配列番号２８）：
５’−ＣＧＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧ−３’
前記で準備したｃｊ７断片と前記実施例＜１−１＞で作製したＣｉｍＡ（Ｍ）断片を鋳型にして、配列番号２７及び３６のプライマー対を用いて融合（ｓｅｗｉｎｇ）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１７９９ｂｐサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）断片」と命名した。
前記で収得したｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）断片を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じ制限酵素で処理された線形ｐ１１７断片とライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）した。
このことから製作された組み換えベクターを大腸菌ＤＨ５α細胞に熱ショックで形質転換（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、以下同一）させ、これをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。前記培養したコロニーの一白金耳をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ＃２７１０４、以下同一）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
組み換えベクターの作製有無は制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理して確認し、下記配列番号２９及び３０のプライマー対で９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で９０秒の伸長過程を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、クローンを確認した。このことから収得された組み換えベクターを「ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）」と命名した。
プライマー１１７−Ｆ（配列番号２９）：
５’−ＣＣＡＣＡＧＣＣＧＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡ−３’
プライマー１１７−Ｒ（配列番号３０）：
５’−ＣＴＣＡＧＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＴＣＧＧＴ−３’
＜１−３＞２−ケト酪酸の生合成経路に関与するｌｅｕＢＣＤ遺伝子断片の準備
２−ケト酪酸の生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、コリネバクテリウム属微生物由来のイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードするｌｅｕＢＣＤ遺伝子断片を下記のように準備した。
まず、イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８５）をコードするｌｅｕＢ遺伝子のＯＲＦを含む１３５９ｂｐ断片を得るために、ジェノミックチップシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２からのゲノムＤＮＡを抽出した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼは、配列番号１７に記載される３４０個のアミノ酸配列を有し、これをコードするｌｅｕＢ遺伝子は、配列番号１８に記載される塩基配列を有する。
前記で抽出されたｇＤＮＡを鋳型にして、下記配列番号３１及び３２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｌｅｕＢ断片」と命名した。
プライマーｌｅｕＢ−５−ｃｉｍＡ（配列番号３１）：
５’−ＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＧＴＧＧ−３’
プライマーｌｅｕＢ−３−ｌｅｕＣ（配列番号３２）：
５’−ＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＴＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＧＣ−３’
イソプロピルマレートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３３）をコードするｌｅｕＣＤ遺伝子のＯＲＦを含む２０７８ｂｐ断片を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のｇＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。
ｌｅｕＣ遺伝子はイソプロピルマレートデヒドラターゼの大きな小単位（ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）を暗号化し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｌｅｕＣ遺伝子は、配列番号２０に記載される塩基配列を有し、これから配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。また、ｌｅｕＤ遺伝子は、イソプロピルマレートデヒドラターゼの小さな小単位（ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）を暗号化し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｌｅｕＤ遺伝子は、配列番号２２に記載される塩基配列を有し、これから配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
前記ＰＣＲ反応は、下記配列番号３３及び３４のプライマー対を用いて９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で８０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｌｅｕＣＤ断片」と命名した。
プライマーｌｅｕＣ−５−ｌｅｕＢ（配列番号３３）：
５’−ＧＣＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＡＡＡＴＡＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡ−３’
プライマーｌｅｕＤ−３−ＸｂａＩ（配列番号３４）：
５’−ＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧ−３’
前記で収得したｌｅｕＢ断片とｌｅｕＣＤ断片を鋳型にして、配列番号３１及び３４のプライマー対を用いる融合ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１２０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、３４３７ｂｐサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｌｅｕＢＣＤ断片」と命名した。
＜１−４＞組み換えベクターｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤの製作
２−ケト酪酸生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、前記実施例＜１−２＞で作製した組み換えベクターであるｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）をＸｂａＩで処理し、前記実施例＜１−３＞で収得したｌｅｕＢＣＤ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理した後、これらの２つの断片をライゲーションした。
このことから製作された組み換えベクターを大腸菌ＤＨ５α細胞に熱ショックで形質転換させ、これをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。前記培養したコロニーの一白金耳をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
組み換えベクターの作製有無は、制限酵素ＸｂａＩで処理して確認し、前記配列番号２９及び３０のプライマー対で９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１８０秒の伸長過程を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、クローンを確認した。このことから収得した組み換えベクターを「ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ」と命名した。
＜１−５＞エラープローンＰＣＲを用いたＣｉｍＡ（Ｍ）変異体断片の準備
ｃｉｍＡ遺伝子にランダム変異が導入されたＤＮＡプール（ｐｏｏｌ）を確保するために、前記実施例＜１−１＞で収得したＣｉｍＡ（Ｍ）断片を鋳型にして、多様化ＰＣＲランダム突然変異化キット（ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、カタログ＃６３０７０３）を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、製品のユーザーマニュアルの表ＩＩＩ内の突然変異化反応４を条件にして行われた。そのために、下記配列番号３５及び３６のプライマー対を用い、９５℃で３０秒の変性と６８℃で３０秒の伸長過程を２５回繰り返し行った。
このことから、塩基置換変異がランダムに導入されたＣｉｍＡ（Ｍ）遺伝子変異体のプール（ｍｕｔａｔｅｄ ａｒｔ ｃｉｍＡ ＤＮＡ ｐｏｏｌ）をＰＣＲ結果物として収得した。前記ＰＣＲ結果物（以下、「ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ断片」と命名した）を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、溶離して収得した。
プライマーｃｉｍＡ−５−ＮｄｅＩ（配列番号３５）：
５’−ＧＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣ−３’
プライマーｃｉｍＡ−３−ＸｂａＩ（配列番号３６）：
５’−ＣＧＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴ−３’
＜１−６＞ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ突然変異ライブラリーの作製
前記実施例＜１−２＞で作製した組み換えベクターｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）を制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩで処理した後、同じ制限酵素で処理された前記実施例＜１−５＞で収得されたＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ断片とライゲーションした。
このことから製作された組み換えベクターを大腸菌ＤＨ５α細胞に熱ショックで形質転換させ、これをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。前記培養したコロニーを集めてプラスミドミニプレップキットを用いプラスミドＤＮＡを回収して、「ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ突然変異ライブラリー」を作製した。
実施例２：ｃｉｍＡ遺伝子導入を通じたＬ−イソロイシン生産能付与の確認
メタノカルドコッカス由来のｃｉｍＡ遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカムに導入した場合、Ｌ−イソロイシン生産能が付与されるかどうかを確認するために、まず、トレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードするｉｌｖＡ遺伝子が除去された菌株を作製し、この菌株にｃｉｍＡ遺伝子を導入してＬ−イソロイシン生産能が回復されるかどうかを確認した。
トレオニンデヒドラターゼは、Ｌ−イソロイシン生合成の前駆体であるＬ−トレオニンを２−ケト酪酸に転換させる酵素である。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のトレオニンデヒドラターゼは、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列を有し、これをコードするｉｌｖＡ遺伝子は、配列番号２４に記載される塩基配列を有する。また、実質的にトレオニンデヒドラターゼ活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれる。
＜２−１＞ｉｌｖＡ遺伝子欠損ベクターの製作
ｉｌｖＡ遺伝子の断片を得るために、ジェノミックチップシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、下記配列番号３７及び３８のプライマー対と、配列番号３９及び４０のプライマー対とを用いてそれぞれＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で４５秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、それぞれ５４７ｂｐ及び４６７ｂｐサイズのバンドを溶離して収得した。
前記で収得したｉｌｖＡ遺伝子の両断片を鋳型にして、下記配列番号３７及び４０のプライマー対を用いる融合ＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１０１４ｂｐサイズのバンドを溶離収得した。このように収得されたｉｌｖＡ遺伝子が欠損された断片を「ＤｉｌｖＡ」と命名した。
前記で収得したＤｉｌｖＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理した後、同じ制限酵素でｐＤＺベクター（特許文献４）を処理して得られた線形ｐＤＺ断片とライゲーションしてｉｌｖＡ遺伝子欠損組み換えベクターを作製した。
このように製作された組み換えベクターを大腸菌ＤＨ５α細胞に熱ショックで形質転換させ、これをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。前記培養したコロニーの一白金耳をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
組み換えベクターの作製有無は、制限酵素ＸｂａＩで処理して確認し、下記配列番号４１及び４２のプライマー対を用いて、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で９０秒の伸長過程を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、クローンを確認した。このことから収得された組み換えベクターを「ｐＤＺ−ｉｌｖＡ（Ｄｅｌ）」と命名した。
プライマーｉｌｖＡ−５−ＸｂａＩ（配列番号３７）：
５’−ＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＣ−３’
プライマーｉｌｖＡ−Ｄｅｌ−Ｒ（配列番号３８）：
５’−ＣＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＴＣＣＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＴ−３’
プライマーｉｌｖＡ−Ｄｅｌ−Ｆ（配列番号３９）：
５’−ＡＧＣＧＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＧ−３’
プライマーｉｌｖＡ−３−ＸｂａＩ（配列番号４０）：
５’−ＧＣＡＴＣＴＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＡＣＣＴＴＧＧＧＣ−３’
プライマーＴｏｐｏ−Ｆ（配列番号４１）：
５’−ＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴ−３’
プライマーＴｏｐｏ−Ｒ（配列番号４２）：
５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡ−３’
＜２−２＞ｉｌｖＡ遺伝子欠損菌株の製作
親菌株として、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に前記実施例＜２−１＞で製造された組み換えベクターであるｐＤＺ−ｉｌｖＡ（Ｄｅｌ）を電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５μｇ／ｍｌが含まれた固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。
このことから２次継代（ｐａｓｓａｇｅ）によりｐＤＺ−ｉｌｖＡ（Ｄｅｌ）ベクターが染色体内に導入された菌株をそれぞれ選抜した。前記選抜された各菌株から収得したｇＤＮＡを鋳型にして、下記配列番号４３及び４４のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で９０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから、ｉｌｖＡ遺伝子が欠損した菌株を獲得し、これを「ＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ」菌株と命名した。
プライマーＣＦｉｌｖＡ（配列番号４３）：
５’−ＧＡＴＣＴＧＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＴＧ−３’
プライマーＣＲｉｌｖＡ（配列番号４４）：
５’−ＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＴＣＴＣＡ−３’
＜２−３＞Ｌ−イソロイシン生合成経路に関与する遺伝子断片の準備
Ｌ−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、コリネバクテリウム属微生物由来のｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｈｏｍ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ及びｉｌｖＡ遺伝子断片を下記のように準備した。
まず、アスパラギン酸キナーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）及びアスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ−β−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードするｌｙｓＣ−ａｓｄ遺伝子のＯＲＦを含むＤＮＡ断片を得るために、前記実施例＜２−１＞に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、下記配列番号４５及び４６のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で９０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、２６６６ｂｐサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｌｙｓＣ−ａｓｄ断片」と命名した。
プライマーｌｙｓＣ−５−ＫｐｎＩ（配列番号４５）：
５’−ＴＧＡＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＣＧＡＴＴＧＴＴＡＡＴＧＣ−３’
プライマーａｓｄ−３−ＳｆｏＩ（配列番号４６）：
５’−ＣＴＡＧＧＣＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＣＡＣＴＣＡＡＧＣＧＧＡ−３’
ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びホモセリンキナーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）をコードするｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子のＯＲＦを含むＤＮＡ断片を得るために、前記実施例＜２−１＞に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、下記配列番号４７及び４８のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で９０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、２６３３ｂｐサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｈｏｍ−ｔｈｒＢ断片」と命名した。
プライマーｈｏｍ−５−ＢａｍＨＩ（配列番号４７）：
５’−ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴ−３’
プライマーｔｈｒＢ−３−ＢａｍＨＩ（配列番号４８）：
５’−ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＧＧＧＣ−３’
トレオニンシンターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードするｔｈｒＣ遺伝子のＯＲＦを含むＤＮＡ断片を得るために、前記実施例＜２−１＞に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、下記配列番号４９及び５０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１７０３ｂｐサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｔｈｒＣ断片」と命名した。
プライマーｔｈｒＣ−５−ＳｐｅＩ（配列番号４９）：
５’−ＴＧＣＡＣＴＡＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＡＣＡＧＧＴＴＣＣＡ−３’
プライマーｔｈｒＣ−３−ｉｌｖＡ（配列番号５０）：
５’−ＧＧＣＡＴＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＡＣＴＴＣＡＣＧＧＡＡＧＴＧ−３’
トレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードするｉｌｖＡ遺伝子のＯＲＦを含むＤＮＡ断片を得るために、前記実施例＜２−１＞に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、下記配列番号５１及び５２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１８６２ｂｐサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｉｌｖＡ断片」と命名した。
プライマーｉｌｖＡ−５−ｔｈｒＣ（配列番号５１）：
５’−ＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣ−３’
プライマーｉｌｖＡ−３−ＳｐｅＩ（配列番号５２）：
５’−ＴＧＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＡＣＣＴＴＧＧＧＣ−３’
前記で獲得したｔｈｒＣ断片とｉｌｖＡ断片を鋳型にして、配列番号４９及び５２のプライマー対を用い融合ＰＣＲを行った。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１２０秒の伸長過程を３０回繰り返し行った。
このことから増幅されたＰＣＲ結果物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、３５６５ｂｐサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ｔｈｒＣ−ｉｌｖＡ断片」と命名した。
＜２−４＞Ｌ−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化ベクターの製作
Ｌ−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、前記実施例＜２−３＞で獲得したｌｙｓＣ−ａｓｄ断片を制限酵素ＫｐｎＩとＳｆｏＩで処理した後、ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶで処理された線形ｐ１１７断片とライゲーションした。
前記実施例＜１−２＞と同様の方法でプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの作製有無は、配列番号２９及び３０のプライマー対で９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１００秒の伸長過程を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、クローンを確認した。このことから収得された組み換えベクターを「ｐ１１７−ｌｙｓＣ−ａｓｄ」と命名した。
前記実施例＜２−３＞で収得されたｈｏｍ−ｔｈｒＢ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理した後、ＢａｍＨＩで処理された線形ｐ１１７−ｌｙｓＣ−ａｓｄ断片とライゲーションした。
前記実施例＜１−２＞と同様の方法でプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの作製有無は、配列番号２９及び３０のプライマー対で９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１８０秒の伸長過程を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、クローンを確認した。このことから収得された組み換えベクターを「ｐ１１７−ｌｙｓＣ−ａｓｄ−ｈｏｍ−ｔｈｒＢ」と命名した。
前記実施例＜２−３＞ｖｔｈｒＣ−ｉｌｖＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで処理した後、ＳｐｅＩで処理された線形ｐ１１７−ｌｙｓＣ−ａｓｄ−ｈｏｍ−ｔｈｒＢ断片とライゲーションした。
前記実施例＜１−２＞と同様の方法でプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの作製有無は、配列番号２９及び３０のプライマー対で９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３００秒の過程を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、クローンを確認した。
このことから収得された組み換えベクターを「ｐ１１７−ＩＢＧＣ（ＩｓｏｌｅｕＣｉｎｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅｓ Ｃｌｕｓｔｅｒ）」と命名し、これはＬ−イソロイシン生合成に関与する６種のｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｈｏｍ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ及びｉｌｖＡ遺伝子断片を含むＬ−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターである。
＜２−５＞Ｌ−イソロイシン生産能の比較
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株の実施例＜１−２＞、＜１−４＞及び＜２−４＞で製造した組み換えベクターであるｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）、ｐ１１７−ｃｊ７−ｃｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ及びｐ１１７−ＩＢＧＣをそれぞれ電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。このことから選別された菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム「ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）」、「ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ」及び「ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ＩＢＧＣ」と命名した。
また、前記実施例＜２−２＞で製造したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ菌株も、前記のようにｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）及びｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤをそれぞれ電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。このことから選別された菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム「ＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）」及び「ＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ」と命名した。
このように用意されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ＩＢＧＣ、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ、ＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ、ＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ／ｐ１１７ −ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）及びＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤを対象にＬ−イソロイシン生産性の力価の評価を行った。
具体的に、下記表１の組成のようにブドウ糖が含まれた２５ｍｌの力価培地を含有した２５０ｍｌ三角フラスコに、前記菌株をそれぞれ接種した後、これを３２℃、２００ｒｐｍの培養器で３０時間培養した。このことから生産されたＬ−イソロイシン濃度は、下記表２に示した。
前記表２に記載されたように、ｉｌｖＡ遺伝子が欠損しない野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２は０．０２ｇ／ＬのＬ−イソロイシンを生産しており、Ｌ−イソロイシン生合成経路の遺伝子６種を同時に導入した形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ＩＢＧＣは０．７０ｇ／ＬのＬ−イソロイシンを生産して、野生型に比べて３４００％が向上されたＬ−イソロイシン生産能を示した。
また、形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）とＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤは、それぞれ０．８３ｇ／Ｌと１．２５ｇ／ＬのＬ−イソロイシンを生産しており、これはＬ−イソロイシン生産能が野生型に比べて、それぞれ４０５０％及び６１５０％が向上されたものである。
このことから、Ｌ−イソロイシン生合成経路のそれ自体を強化した形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ＩＢＧＣより、従来のＬ−イソロイシン生合成経路にｃｉｍＡ遺伝子を追加導入した形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）のＬ−イソロイシン生産能がより優れていることを確認した。また、ｌｅｕＢＣＤ遺伝子をさらに強化した形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤのＬ−イソロイシン生産能は、より優れていることを確認した。
一方、ｉｌｖＡ遺伝子を欠損したＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ菌株はＬ−イソロイシンの生産能を喪失したが、ここにｃｉｍＡ遺伝子が導入されたＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）菌株は、０．０８ｇ／Ｌ、ｃｉｍＡ遺伝子が導入されてｌｅｕＢＣＤ遺伝子を強化したＡＴＣＣ１３０３２△ｉｌｖＡ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ菌株は、０．１５ｇ／ＬのＬ−イソロイシンを生産した。
前記結果は、Ｌ−トレオニンを前駆体として用いる既存のＬ−イソロイシン生合成経路ではなく、ｃｉｍＡ遺伝子導入を通じた新規生合成経路を用いてＬ−イソロイシン生産が可能であることを示す。
実施例３：形質転換された組み換え菌株の製造及びＬ−イソロイシン生産性の比較
＜３−１＞野生型コリネバクテリウム属微生物を用いた遺伝子組み換え菌株の製造
ｃｉｍＡ遺伝子の前駆体として用いられるアセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）の供給のために、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードするａｃｅＥ遺伝子が欠損した酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）要求性菌株を製造し、この菌株を「ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ」と命名した（非特許文献７）。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のピルビン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を有し、これをコードするａｃｅＥ遺伝子は、配列番号２６に記載される塩基配列を有する。
前記実施例１で製造した組み換えベクターであるｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）とｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ突然変異ライブラリーを、前記で製造したＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ菌株に電気穿孔法で導入した。このように製作された菌株をそれぞれ「ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）」及び「ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ突然変異ライブラリー」と命名した。
前記菌株ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ、ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）及びＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ突然変異ライブラリーをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した後、選別された菌株を対象にＬ−イソロイシン生産性に対する力価の評価を行った。
具体的に、力価の評価は表３の組成のように酢酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）の形態で酢酸を含有した力価培地を用いて行われた。２５ｍｌの力価培地を含有した２５０ｍｌ三角フラスコに前記菌株を接種した後、これを３２℃、２００ｒｐｍの培養器で３０時間培養した。このことから、Ｌ−イソロイシン濃度が増加したコロニー７種を選別し、そのリストと生産されたＬ−イソロイシン濃度を下記表４に示した。
その結果、前記表４に記載されたように、親菌株であるＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ菌株は０．０５ｇ／ＬのＬ−イソロイシンを生産したが、形質転換菌株は、０．８４〜２．２３ｇ／ＬのＬ−イソロイシンを生産して親菌株に比べて向上されたＬ−イソロイシン生産能を示し、これは親菌株に比べてＬ−イソロイシン生産能は約１５８０％から４３６０％向上されたものである。これらの中でも、特に形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３が親菌株であるＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥに比べて最も高いＬ−イソロイシン生産能を示した。
表４に示したように、Ｌ−イソロイシン生産能の増加を示して、選別された変異型ＣｉｍＡ（Ｍ）遺伝子の変異の位置と、各変異の置換されたアミノ酸を確認するためにシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。
その結果、ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ突然変異ライブラリーとして、
ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ１は配列番号３のアミノ酸配列を有し、これは配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく；
ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ２は配列番号５のアミノ酸配列を有し、これは配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく；
ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３は配列番号７のアミノ酸配列を有し、これは配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく；
ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ４は配列番号９のアミノ酸配列を有し、これは配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく；
ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ５は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、これは配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく；
ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ６は配列番号１３のアミノ酸配列を有し、これは配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく；
ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ７は配列番号１５のアミノ酸配列を有し、これは配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよい。
＜３−２＞選別されたｐ１１７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ突然変異ライブラリーの中で最も活性が高いｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３を用いた遺伝子組み換え菌株の製造
前記実施例＜３−１＞で最も高いＬ−イソロイシン生産能を示すものとして選別されたｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３ベクターをＸｂａＩで処理した後、実施例＜１−３＞で収得したｌｅｕＢＣＤ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理して獲得したＤＮＡ断片とライゲーションした。
このことから製作された組み換えベクターで大腸菌ＤＨ５α細胞を熱ショックによって形質転換させ、これをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。前記培養したコロニーの一白金耳をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いて、プラスミドＤＮＡを回収した。
組み換えベクターの作製有無は、制限酵素ＸｂａＩで処理して確認し、配列番号２９及び３０のプライマー対で９５℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１８０秒の伸長過程を３０回繰り返す条件でＰＣＲを行い、クローンを確認した。前記組み換えベクターを「ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３−ｌｅｕＢＣＤ」と命名した。
前記実施例＜１−２＞のｐ１１７−ｃｊ７−ｃｉｍＡ（Ｍ）、実施例＜１−４＞のｐ１１７−ｃｊ７−ｃｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ、実施例＜３−１＞のｐ１１７−ｃｊ７−ｃｉｍＡ（Ｍ）ｍ３及び実施例＜３−２＞のｐ１１７−ｃｊ７−ｃｉｍＡ（Ｍ）ｍ３−ｌｅｕＢＣＤを実施例＜３−１＞で用いたＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ菌株にそれぞれ電気穿孔法で導入した後、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。
選別された菌株を前記表３の組成に応じてブドウ糖が含まれた２５ｍｌの力価培地を含有した２５０ｍｌ三角フラスコに接種した後、これを３２℃、２００ｒｐｍの培養器で３０時間培養してＬ−イソロイシン生産性を確認した。その結果を下記表５に示した。
前記表５に記載されたように、親菌株ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥは、０．０４ｇ／ＬのＬ−イソロイシンを生産したが、形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）は、０．９８％ｇ／Ｌ、ＡＴＣＣ１３０３２△ ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤは、２．０９ｇ／Ｌであって、親菌株よりそれぞれ０．９４ｇ／Ｌ及び２．０５ｇ／Ｌが上昇したＬ−イソロイシン生産量を示した。
また、実施例＜３−１＞で収得したＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３変異型遺伝子を含む形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３とＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ｃｉｍＡ（Ｍ）ｍ３−ｌｅｕＢＣＤは、それぞれ２．２２ｇ／Ｌと３．７６ｇ／ＬのＬ−イソロイシン生産量を示した。これは親菌株に比べて５４５０％と９３００％増加したものとして、ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３変異型がその野生型よりＬ−イソロイシン生産能の増加に効果的であることを示す結果である。
前記実施例を通じて獲得した形質転換菌株の中でＡＴＣＣ１３０３２△ａｃｅＥ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３を「コリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１０−１００２」と命名し、ブダペスト条約下、２０１５年２月２７日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１６７２Ｐを与えられた。
＜３−３＞Ｌ−イソロイシン生産菌株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐを用いた遺伝子組み換え菌株の製造
前記実施例＜３−１＞及び＜３−２＞で使用された組み換えベクターｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）、ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ、ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３及びｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３−ｌｅｕＢＣＤをそれぞれＬ−イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ（特許文献５）に電気穿孔法で導入し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌが含まれた固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。
選別された菌株をそれぞれＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３及びＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３−ｌｅｕＢＣＤと命名した。
これらの菌株を下記表６の組成で作製されたイソロイシン力価培地を用いて、三角フラスコで以下に記述した方法のように培養し、Ｌ−イソロイシン生産性を確認した。
具体的に、親菌株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐと、形質転換菌株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３及びＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３−ｌｅｕＢＣＤを表６の組成のようにブドウ糖が含まれた２５ｍｌの力価培地を含有した２５０ｍｌ三角フラスコに接種した後、これを３２℃、２００ｒｐｍの培養器で６０時間培養した。その結果を下記表７に示した。
前記表７に記載されたように、親菌株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐは、３．３３ｇ／ＬのＬ−イソロイシンを生産したが、形質転換菌株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）は、４．０４ｇ／Ｌ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）−ｌｅｕＢＣＤは、４．８２ｇ／Ｌであって、親菌株よりそれぞれ０．７１ｇ／Ｌ及び１．４９ｇ／Ｌが増加したＬ−イソロイシン生産量を示した。
一方、形質転換菌株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３とＫＣＣＭ１１２４８Ｐ／ｐ１１７−ｃｊ７−ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３−ｌｅｕＢＣＤは、それぞれ４．７１ｇ／Ｌと１１．２１ｇ／ＬのＬ−イソロイシン生産量を示し、これは親菌株に比べて、４１．４％と２３６．６％が増加した。
これはコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を用いた実施例＜３−２＞の結果と同様に、ＣｉｍＡ（Ｍ）ｍ３変異型がその野生型よりＬ−イソロイシン生産能の増加に効果的であることを再び証明する結果である。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例及び実験例は、すべての面で例示的なものであり、本出願の範囲を限定するものではないと理解するべきである。本出願の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (12)

  1. 下記段階を含むＬ−イソロイシンを生産する方法：
    シトラマレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性を有するタンパク質を含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び
    前記微生物または培地からＬ−イソロイシンを回収する段階。
  2. 前記シトラマレートシンターゼが、メタノカルドコッカス属（ｇｅｎｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）微生物に由来する、請求項１に記載のＬ−イソロイシンを生産する方法。
  3. 前記シトラマレートシンターゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５で構成された群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＬ−イソロイシンを生産する方法。
  4. 前記コリネバクテリウム属微生物が、活性が強化されたイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ（３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をさらに含む、請求項１に記載のＬ−イソロイシンを生産する方法。
  5. 前記コリネバクテリウム属微生物が、不活性化されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をさらに含む、請求項１に記載のＬ−イソロイシンを生産する方法。
  6. 前記コリネバクテリウム属微生物の培養段階で酢酸がさらに供給される、請求項１に記載のＬ−イソロイシンを生産する方法。
  7. 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１に記載のＬ−イソロイシンを生産する方法。
  8. シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質を含む、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  9. 前記シトラマレートシンターゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５で構成された群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  10. 前記微生物が、活性が強化されたイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ及びイソプロピルマレートデヒドラターゼタンパク質をさらに含む、請求項８に記載のＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  11. 前記微生物が、不活性化されたピルビン酸デヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項８に記載のＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  12. 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項８に記載のＬ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
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