JP2017006133A - プトレシン生産能が向上した組換え微生物及びそれを用いてプトレシンを生産する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム属微生物において、NCgl0101活性が低下して高収率でプトレシンを生産することのできる組換え微生物及び前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法の提供。
【解決手段】プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム属微生物であり、更に、特定な配列からなるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が内在的活性より低下又は欠失した、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。好ましくは、オルニチンデカルボルボキラーゼ(speC)の活性が高められ、オルニチンカルボモイルトランスフェラーゼ(ArgF)及びグルタミン酸エクスポーター(NCg11221)から選択される一種の活性が内在的活性よりに低下させた微生物。
【選択図】図2
【解決手段】プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム属微生物であり、更に、特定な配列からなるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が内在的活性より低下又は欠失した、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。好ましくは、オルニチンデカルボルボキラーゼ(speC)の活性が高められ、オルニチンカルボモイルトランスフェラーゼ(ArgF)及びグルタミン酸エクスポーター(NCg11221)から選択される一種の活性が内在的活性よりに低下させた微生物。
【選択図】図2
Description
本発明は、プトレシン生産能が向上した組換え微生物及びそれを用いてプトレシンを生産する方法に関する。
プトレシン(putrescine又は1,4−ブタンジアミン)は、スペルミジン(spermidine)、スペルミン(spermine)などのポリアミンの一種であり、グラム陰性バクテリアやカビから発見され、様々な種に高濃度で存在するので、微生物の代謝に重要な役割を果たことが予測されている。プトレシンは、主にプロピレンからアクリロニトリル(acrylonitrile)及びスクシノニトリル(succinonitrile)を経由する化学合成法で生産される。この化学合成法は、石油化学物質を出発物質とし、有毒性物質などを用いるので、環境にやさしいものではなく、石油資源の枯渇問題を抱えている。
前記問題を解決するために、より環境にやさしく、エネルギー消費を削減できるように、微生物を用いてプトレシンを生合成する方法を開発する研究が盛んに行われている。従来技術によれば、プトレシンは微生物から2つの経路を経て生合成することができる。一方はグルタメートからオルニチンを生成し、前記オルニチンを脱カルボキシル化してプトレシンを合成する経路であり、他方は前記合成されたオルニチンから合成されたアルギニンを用いてアグマチン(agmatine)を生成し、前記アグマチンからプトレシンを合成する経路である。また、このように公知のプトレシン合成経路に関与する酵素を用いて標的微生物を形質転換することによりプトレシンを合成する方法も研究されている。例えば、特許文献1には、大腸菌に存在するプトレシンの分解及び利用に関与する経路を不活性化し、プトレシンの前駆体であるオルニチンがアルギニンに変換される経路を不活性化し、オルニチン生合成経路を強化することにより、プトレシンを高収率で生産する方法が開示されている。2010年に発表された論文においては、プトレシン生産能のないコリネバクテリウム属菌株に、オルニチンをプトレシンに変換するタンパク質を導入し、活性を向上させることにより、プトレシンを高濃度で生産する方法が開示されており、大腸菌由来のアルギニンデカルボキシラーゼとアグマチナーゼ(Agmatinase)を導入してアルギニンからプトレシンを生産する方法が開示されている。ここで、アルギニン経路よりオルニチン経路によるプトレシン生産のほうが約50倍高かった(非特許文献1)。
Schneider et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.88:4,859−868,2010
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こうした背景の下、本発明者らは、NCgl0101タンパク質の活性を低下又は欠失させると、コリネバクテリウム属微生物においてプトレシンの生産量が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明は、NCgl0101の活性が内在的活性より低下するように変異し、プトレシンを高収率で生産することのできる組換えコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法を提供することを目的とする。
本発明のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を用いると、NCgl0101の活性が内在的活性より低下するように変異し、プトレシンを高収率で生産することができるので、より効果的なプトレシンの生産に広く活用することができる。
前記本発明の目的を達成するための一実施態様として、本発明はプトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム属微生物において、配列番号17又は19で表されるアミノ酸配列を有するNCgl0101タンパク質の活性が内在的活性より低下又は欠失した、プトレシン生産能が向上した組換えコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明における用語「NCgl0101」とは、コリネバクテリウムグルタミカムにおいて発現し、いまだ機能が明らかにされていない金属依存性酵素活性を示すタンパク質を意味するが、ペプチダーゼM20ファミリー又はアミノベンゾイルグルタメート分解タンパク質(aminobenzoyl−glutamate utilization protein,abgB)が有する金属結合ドメインを含むものである。大腸菌に存在するabgBは、abgAと共にアミノベンゾイルグルタメートヒドロラーゼを構成し、アミノベンゾイルグルタメートをアミノベンゾエートとグルタメートに分解することができる。前記アミノベンゾエートは葉酸(folate)を合成する前駆体として用いられることが知られているが、プトレシン生産能との関連は明らかにされていない。
本発明のNCgl0101タンパク質は、配列番号17又は19で表されるアミノ酸配列を含むことができる。しかし、微生物の種又は菌株によって前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列が異なることがあるので、これらに限定されるものではない。すなわち、活性を低下させることにより、プトレシン生産性の向上を助けるタンパク質であれば、配列番号17又は19のアミノ酸配列の少なくとも1つの位置における1個又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は添加などを含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする突然変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「複数」とは、タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体的には2個〜20個、好ましくは2個〜10個、より好ましくは2個〜5個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、添加、又は逆位などには、前記ポリペプチドの活性を有する微生物の個体又は種の違いに基づく場合など、天然に生じる突然変異又は人為的な変異(variant)により発生するものも含まれる。
本発明の前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、本発明のNCgl0101タンパク質に類似した活性を有するものであれば、配列番号17又は19のアミノ酸配列又はこれと80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、最も好ましくは配列番号16又は18で表されるポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
前記用語「相同性」とは、2つのアミノ酸配列間の同一性を示すものであり、スコア(score)、同一性(identity)、類似性(similarity)などのパラメーター(parameter)を計算するBLAST2.0を用いる、当業者に周知の方法で決定されうる。
また、本発明のNCgl0101をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号16のポリヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列から製造されたプローブと「ストリンジェントな条件」でハイブリダイズすることができ、正常に機能するNCgl0101タンパク質をコードする変異型であってもよい。本発明における用語「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイズを可能にする条件を意味する。例えば、分子クローニング(非特許文献2)又は分子生物学カレント・プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)(非特許文献3)に具体的に記載されており、例えば65℃のハイブリダイゼーション緩衝液(3.5×SSC,0.02%フィコール,0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%牛血清アルブミン,2.5mM NaH2PO4(pH7),0.5%SDS,2mM EDTA)におけるハイブリダイゼーションが記載されている。SSCは、pH7の0.15M塩化ナトリウム/0.15Mクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーション後に、DNAが転写されているメンブランを室温にて2×SSCで洗浄し、その後68℃の温度にて0.1〜0.5×SSC/0.1×SDSで洗浄する。
本発明のNCgl0101タンパク質の活性低下は、1)前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部又は全部の欠失、2)前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の改変、3)前記NCgl0101タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、又は4)それらの組み合わせにより行うことができる。
前記方法のうち、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部又は全部を欠失させる方法は、細菌内染色体挿入ベクターにより染色体内の内在的な標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には2個〜300個、好ましくは2個〜100個、より好ましくは1個〜5個である。
また、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれる。
また、本発明のタンパク質をコードする、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、前記配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良された核酸配列に置換することにより行うこともできる。
一方、本発明のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物は、オルニチンにおいて、アルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ornithine carbamoyltransfrase, ArgF)、及びグルタメートの排出に関与するタンパク質(NCgl1221)の活性を内在的活性より低下するようにさらに変異させてもよい。それだけでなく、オルニチンデカルボキシラーゼ(ornithine decarboxylase, ODC)の活性を導入するように変異させてもよく、プトレシン前駆体であるオルニチン生合成経路の強化のために、グルタメートをアセチルグルタメートに変換させるアセチルグルタミン酸シンターゼ、又はアセチルオルニチンをオルニチンに変換させるオルニチンアセチルトランスフェラーゼ(ArgJ)、アセチルグルタミン酸をアセチルグルタミルホスフェートに変換させるアセチルグルタミン酸キナーゼ(ArgB)、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタミン酸セミアルデヒドに変換させるアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ(ArgC)、及びアセチルグルタミン酸セミアルデヒドをアセチルオルニチンに変換させるアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(ArgD)の活性を内在的活性より向上するようにさらに変異させてもよい(非特許文献4)。
ここで、前記記載のArgF、NCgl1221、ODC、ArgC、ArgJ、ArgB及びArgDは、特にこれらに限定されるものではないが、好ましくは、それぞれ配列番号20、21、22、23、24、25、26のアミノ酸配列、又はそれらと80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
本発明における用語「オルニチンデカルボキシラーゼ(ornithine decarboxylase, ODC)」とは、オルニチンを用いてプトレシンを生成する酵素を意味するが、前記ODCは補酵素としてピリドキサールホスフェート(Pyridoxal 5’−phosphate, PLP)を必要とし、ほとんどのグラム陰性菌に存在し、グラム陽性菌のうちラクトバシラス(Lactobacillus)などの腸内細菌の一部に存在する。大腸菌の場合、ODCをコードする遺伝子は2つあるが、一方のspeCは持続的に一定濃度で発現し、他方のspeFは特定条件(一定濃度以上のオルニチンの存在及び低いpH条件)下で発現が誘導される遺伝子である。種によって、大腸菌のように2種類のODCを有する種もあり、1種類しかない種もある。エシェリキア属(Escherichia sp.)、シゲラ属(Shigella sp.)、シトロバクター属(Citrobacter sp.)、サルモネラ属(Salmonella sp.)、エンテロバクター属(Enterobacter sp.)などの種は2種類のODC(speC,speF)を有し、エルシニア属(Yersinia sp.)、クレブシエラ属(Klebsiella sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)などの菌株は1種類のODC(speC)を有する。乳酸菌の場合、ODCが1種類の遺伝子(speF)から発現し、低いpHやオルニチンとヒスチジンが豊富な条件で発現が誘導されることが知られている。
本発明の組換えコリネバクテリウム属微生物は、前述した様々な種由来のODCコード遺伝子を用いてODC活性を導入することができる。前記ODCをコードするポリヌクレオチドは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号22のアミノ酸配列、又はそれと70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。
また、微生物にオルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)の活性を導入することは当該分野で周知の様々な方法で行うことができ、例えばODCをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、ODCをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を入れたODCを導入する方法、ODCをコードする塩基配列の変異体を導入する方法などを用いることができ、より好ましくは、前記ODCをコードする塩基配列を導入する場合は、この発現を調節するためのプロモーターとして公知のCJ7プロモーターを用いることができる。
また、前記ArgC、ArgJ、ArgB及びArgDの活性向上は、1)前記酵素をコードするポリヌクレオチドのコピー数増加、2)前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変、3)前記酵素の活性が向上するように染色体上の前記酵素をコードするポリヌクレオチド配列の改変、4)それらの組み合わせにより向上するように改変する方法などにより行うことができる。
具体的には、前記1)ポリヌクレオチドのコピー数増加は、ベクターに作動可能に連結した形態で行うか、宿主細胞内の染色体内に挿入することにより行うことができる。より具体的には、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結した、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞に導入することにより行うことができ、前記ポリヌクレオチドを作動可能に連結した、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞に導入することにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行うことができる。
本発明における用語「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むDNA産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、好適な宿主内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
本発明において用いられるベクターは、宿主内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A及びCharon21Aなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及びpET系などを用いることができる。本発明において使用可能なベクターは、特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。好ましくは、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いることができる。最も好ましくは、pACYC177、pCL、pCC1BACベクターを用いることができる。
また、宿主細胞を形質転換し、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体内に挿入することのできるベクターの好ましい例としては、大腸菌とコリネフォルム細菌の両方で自己複製可能なシャトルベクターpECCG112ベクター(特許文献2)を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
また、細菌内染色体挿入ベクターにより染色体内の内在的な標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを新規ポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されるので、前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカーをさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチドが挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、又は表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーを用いてもよい。選択剤(selective agent)で処理された環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
本発明における用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体以外に位置するかに関係なく、それらを全て含むものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするDNAやRNAを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセットの形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
また、前記用語「作動可能に連結」とは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結していることを意味する。
また、本発明の2)ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに向上するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよく、前記強力なプロモーターの例としては、pcj7プロモーター、lysCP1プロモーター、EF−Tuプロモーター、groELプロモーター、aceA又はaceBプロモーターなどが挙げられ、より好ましくは、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるlysCP1プロモーター又はpcj7プロモーターが作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができる。ここで、lysCP1プロモーターは、アスパラギン酸キナーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドのプロモーター部位の塩基配列の置換により改良されたプロモーターであり、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子の発現量増大により糖酵素の活性を野生型に比べて約5倍向上させることのできる強力なプロモーターである(特許文献3)。また、pcj7プロモーターは、コリネバクテリウムアンモニアゲネスから強力なプロモーター配列を有する領域を探索中にコリネバクテリウムアンモニアゲネス及びエシェリキアから発現可能で、かつ強力なプロモーター活性を有することが確認されたプロモーターであり、コリネバクテリウムグルタミカムにおいても高い発現強度が可能なプロモーターである(特許文献4)。
また、3)染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記配列の活性がより向上するように、核酸配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
本発明の微生物は、プトレシンの生産が可能な微生物であり、配列番号17又は19で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質が発現する原核微生物を含み、その例としては、エシェリキア属(Escherichia sp.)、シゲラ属(Shigella sp.)、シトロバクター属(Citrobacter sp.)、サルモネラ属(Salmonella sp.)、エンテロバクター属(Enterobacter sp.)、エルシニア属(Yersinia sp.)、クレブシエラ属(Klebsiella sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium sp.)、ラクトバシラス属(Lactobacillus sp.)、セレノモナス属(Selenomanas sp.)、ビブリオ属(Vibrio sp.)に属する微生物が挙げられる。
好ましくは、本発明の微生物は、コリネバクテリウム属に属する微生物であり、より好ましくは、コリネバクテリウムグルタミカムであってもよい。
本発明の一実施態様においては、グルタミン酸からのプトレシン生成経路が強化されて高濃度プトレシン生産能を有する、寄託番号KCCM11138Pのコリネバクテリウム属微生物(特許文献5)を変異させた。具体的には、プトレシン生産菌株KCCM11138Pは、ATCC13032菌株において、オルニチン蓄積のためのオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ArgF)をコードする遺伝子、及び細胞内のグルタミン酸を増加させるためのグルタミン酸エクスポーター(NCgl1221)をコードする遺伝子が欠損し、オルニチンデカルボキシラーゼ(speC)をコードする遺伝子が導入され、オルニチン生合成遺伝子(ArgCJBD)の発現量が増加したプトレシン過剰生産菌株である。
本発明の他の実施態様においては、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13032ベースのプトレシン生産菌株であるKCCM11138Pと同じ遺伝子型を有するコリネバクテリウムグルタミカムATCC13869ベースのプトレシン生産菌株DAB12−aを変異させた。具体的には、プトレシン生産菌株DAB12−aは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection; ATCC)から入手したATCC13869菌株において、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ArgF)をコードする遺伝子及びグルタミン酸排出タンパク質NCgl1221をコードする遺伝子が欠損し、大腸菌由来のオルニチンデカルボキシラーゼ(OCD)をコードする遺伝子(speC)が導入され、オルニチン生合成遺伝子オペロン(ArgCJBD)のプロモーターが改良されたプロモーターに置換されたことを特徴とする。
本発明の一実施例においては、野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株ATCC13032において、染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ArgF)をコードする遺伝子及びグルタミン酸排出に関与するグルタミン酸エクスポーターNCgl1221をコードする遺伝子が欠損し、グルタミン酸においてオルニチン合成に関与する酵素をコードするArgCJBD遺伝子群のプロモーターが置換され、オルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)をコードする遺伝子(speC)が染色体内に導入されることにより作製された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物KCCM11138Pに基づいて、高濃度プトレシン培地で成長性のよいクローンA15を選択し、選択したA15にNCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103及びNCgl0104をコードする遺伝子が含まれることが確認され(実施例1)、前記5種の遺伝子のうちNCgl0101をコードする遺伝子により高濃度プトレシン培地でも前記微生物が成長することが確認された(実施例2)。NCgl0101をコードする遺伝子の特性を研究した結果、NCgl0101をコードする遺伝子が過剰発現した菌株においてはプトレシンの生産量が減少し(実施例3)、前記NCgl0101をコードする遺伝子が欠失した菌株においてはプトレシンの生産量が増加する(実施例4)ことが確認された。
よって、本発明者らは、プトレシン生産菌株であるKCCM11138Pにおいて、NCgl0101遺伝子を欠失することによりプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株をCorynebacterium glutamicum CC01−0244と命名し、2011年12月26日付けで韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms,以下「KCCM」という)に受託番号KCCM11241Pとして寄託した。
前記目的を達成するための本発明の他の態様によれば、配列番号17又は19で表されるアミノ酸配列を含むNCgl0101タンパク質の活性が低下するように変異し、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を培養する工程と、前記工程で得られた培養物からプトレシンを分離する工程とを含むプトレシン生産方法に関する。
本発明の前記培養過程は、当業界で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。前記培養方法の例としては、回分培養、連続培養及び流加培養が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
用いられる培養培地は特定の菌株の要件を満たさなければならない。各微生物の培養培地は公知である(例えば、非特許文献5)。培地内の炭素供給源としては、糖及び炭水化物(例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース)、油脂(例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油)、脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸)、アルコール(例えば、グリセリン及びエタノール)、並びに有機酸(例えば、酢酸)などを用いることができる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物(例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア)、又は無機化合物(例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム)を用いることができる。これらの物質も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩を用いることができる。また、培養培地は、成長に必要な金属塩(例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄)を含有してもよい。最後に、前述した物質以外にも、アミノ酸やビタミンなどの成長に必要な促進物質をさらに用いてもよい。好適な前駆体を前記培養培地にさらに加えてもよい。前記供給物質は、培養物に一度に全て加えてもよく、培養中に適宜供給してもよい。
培養物のpHは、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア)又は酸性化合物(例えば、リン酸又は硫酸)を適宜用いることにより調節することができる。発泡は、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いることにより調節することができる。酸素又は酸素を含むガス混合物、例えば空気を培養物中に導入することにより、好気性条件を維持することができる。培養温度は、通常20〜45℃、好ましくは25〜40℃である。培養は、プトレシンの所望の生成量が最大限に得られるまで続ける。これらの目的は、通常10〜160時間で達成される。プトレシンは、培養培地中に排出されるか、細胞中に含まれている場合もある。
本発明の前記培養工程で生産されたプトレシンを収集及び回収する方法は、培養方法、例えば回分培養、連続培養、流加培養方法などにより、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から標的アミノ酸を収集することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1:プトレシンに対する有効遺伝子選択用ライブラリーの作製及びクローンの選択
野生型コリネバクテリウム菌株の染色体からプトレシン生合成に有効な遺伝子をスクリーニングするために、野生型コリネバクテリウム菌株の染色体ライブラリーを作製した。具体的には、野生型コリネバクテリウムグルタミカムATCC13032菌株から抽出された染色体を制限酵素Sau3AIで処理してランダムに切断し、そこから5〜8kbの断片を選択し、大腸菌とコリネバクテリウムのシャトルベクターであるpECCG122(特許文献2)にクローニングすることにより染色体ライブラリーを作製した。
野生型コリネバクテリウム菌株の染色体からプトレシン生合成に有効な遺伝子をスクリーニングするために、野生型コリネバクテリウム菌株の染色体ライブラリーを作製した。具体的には、野生型コリネバクテリウムグルタミカムATCC13032菌株から抽出された染色体を制限酵素Sau3AIで処理してランダムに切断し、そこから5〜8kbの断片を選択し、大腸菌とコリネバクテリウムのシャトルベクターであるpECCG122(特許文献2)にクローニングすることにより染色体ライブラリーを作製した。
作製したコリネバクテリウム染色体ライブラリーからプトレシン生合成に有効な遺伝子を選択するために、プトレシンを高濃度で含む培地で成長可能なコロニーを確保した。
一方、本発明者らによる特許文献5に開示されている、野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株ATCC13032において、染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ArgF)をコードする遺伝子、及びグルタミン酸の排出に関与するグルタミン酸エクスポーター(NCgl1221)をコードする遺伝子が欠損し、野生型大腸菌W3110菌株由来のオルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)をコードする遺伝子(speC)が染色体内に導入され、グルタミン酸においてオルニチン合成に関与する酵素をコードするArgCJBD遺伝子群のプロモーターが置換されることにより作製された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物(KCCM11138P)に、前記ライブラリーを導入することによりそれぞれの形質転換体を作製し、0.35Mのプトレシンを含む最小培地(ブドウ糖10g/リットル,MgSO4・7H2O 0.4g/リットル,NH4Cl 4g/リットル,KH2PO4 1g/リットル,K2HPO4
1g/リットル,尿素2g/リットル,FeSO4・7H2O 10mg/リットル,MnSO4・5H2O 1mg/リットル,ニコチンアミド5mg/リットル,チアミン塩酸塩5mg/リットル,ビオチン0.1mg/リットル,1mMアルギニン,カナマイシン25mg/リットル,0.35Mプトレシン,pH7.0)で成長する形質転換体を選択した。その結果、275個のコロニーが選択され、高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかったコロニーを2次確認し、各ライブラリークローンを得てプトレシン菌株に再導入し、その後高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかったコロニーを3次確認することにより最終的に1つのクローン(A15)を選択した。選択した前記クローンをシークエンシングで確認した結果、N末端の436個のアミノ酸が除去されたNCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103及びNCgl0104の計5つのORFが含まれることが確認された(図1)。図1は野生型コリネバクテリウムグルタミカムATCC13032菌株の染色体に存在するNCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103及びNCgl0104をコードする遺伝子の相対的な位置を示す概略図である。
1g/リットル,尿素2g/リットル,FeSO4・7H2O 10mg/リットル,MnSO4・5H2O 1mg/リットル,ニコチンアミド5mg/リットル,チアミン塩酸塩5mg/リットル,ビオチン0.1mg/リットル,1mMアルギニン,カナマイシン25mg/リットル,0.35Mプトレシン,pH7.0)で成長する形質転換体を選択した。その結果、275個のコロニーが選択され、高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかったコロニーを2次確認し、各ライブラリークローンを得てプトレシン菌株に再導入し、その後高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかったコロニーを3次確認することにより最終的に1つのクローン(A15)を選択した。選択した前記クローンをシークエンシングで確認した結果、N末端の436個のアミノ酸が除去されたNCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103及びNCgl0104の計5つのORFが含まれることが確認された(図1)。図1は野生型コリネバクテリウムグルタミカムATCC13032菌株の染色体に存在するNCgl0100、NCgl0101、NCgl0102、NCgl0103及びNCgl0104をコードする遺伝子の相対的な位置を示す概略図である。
実施例2:A15クローンに含まれるプトレシンに対する有効遺伝子の確認
実施例2−1.A15クローンに含まれる5つの遺伝子のクローニング及び形質転換体の作製
実施例1で得たA15クローンの塩基配列は既に公開されている。ATCC13032菌株の公知の塩基配列に基づいて、NCgl0100遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号1及び2のNCgl0100−F、NCgl0100−Rを作製し、N末端の436個のアミノ酸が除去された形態のtNCgl0100遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号2及び3のNCgl0100−R、tNCgl0100−Fを作製し、NCgl0101遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号4及び5のNCgl0101−F、NCgl0101−Rを作製し、NCgl0102とNCgl0103遺伝子を同時に増幅するためのプライマーとして配列番号6及び7のNCgl0102−F、NCgl0103−Rを作製し、NCgl0104遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号8及び9のNCgl0104−F、NCgl0104−Rを作製した。また、発現プロモーターであるP(CJ7)(又はpcj7)(特許文献4参照)を増幅するためのプライマーとして配列番号10及び11のP(CJ7)−F、P(CJ7)−Rを作製した(表1)。
実施例2−1.A15クローンに含まれる5つの遺伝子のクローニング及び形質転換体の作製
実施例1で得たA15クローンの塩基配列は既に公開されている。ATCC13032菌株の公知の塩基配列に基づいて、NCgl0100遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号1及び2のNCgl0100−F、NCgl0100−Rを作製し、N末端の436個のアミノ酸が除去された形態のtNCgl0100遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号2及び3のNCgl0100−R、tNCgl0100−Fを作製し、NCgl0101遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号4及び5のNCgl0101−F、NCgl0101−Rを作製し、NCgl0102とNCgl0103遺伝子を同時に増幅するためのプライマーとして配列番号6及び7のNCgl0102−F、NCgl0103−Rを作製し、NCgl0104遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号8及び9のNCgl0104−F、NCgl0104−Rを作製した。また、発現プロモーターであるP(CJ7)(又はpcj7)(特許文献4参照)を増幅するためのプライマーとして配列番号10及び11のP(CJ7)−F、P(CJ7)−Rを作製した(表1)。
次に、ATCC13032菌株の染色体を鋳型とし、前記配列番号1〜9の各プライマーを用いたPCR(95℃、30秒間の変性、50℃、30秒間のアニーリング、72℃、1分〜1分30秒間の伸長を25サイクル)を行うことにより、5種類の遺伝子断片を増幅した。また、コリネバクテリウムアンモニアゲネスの染色体を鋳型とし、前記配列番号10及び11のプライマーを用いたPCRを行うことにより、プロモーター断片を増幅した。
KpnIとXbaIにより切断された5つの遺伝子とEcoRVとKpnIにより切断されたCJ7プロモーターをEcoRVとXbaIにより切断された発現ベクターであるpHC139T(特許文献6)に結合することにより、計5つの発現ベクターpHC139T−P(CJ7)−NCgl0100、pHC139T−P(CJ7)−tNCgl0100、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0101、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0102−NCgl0103、及びpHC139T−P(CJ7)−NCgl0104を作製した。
作製された前記5つの発現ベクターと対照群であるpHC139Tを実施例1で用いられたKCCM11138P菌株に電気穿孔法(electroporation)で導入し、その後25μg/mlのカナマイシンを含むBHIS平板培地に塗抹して形質転換体を選択した。
実施例2−2.プトレシンに対する有効遺伝子の探索
実施例2−1で得た全6種の形質転換体を対象に、実施例1と同様の方法で高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかった形質転換体を選択した(図2)。図2は本発明で作製した各形質転換菌株の成長の程度を比較した結果を示す写真であり、1、2、3、4、5及び6は、それぞれ前記6種の発現ベクターであるpHC139T、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0100、pHC139T−P(CJ7)−tNCgl0100、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0101、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0102−NCgl0103、及びpHC139T−P(CJ7)−NCgl0104が導入された菌株を示す。図2に示すように、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0101が導入された形質転換体(4番)のみ高濃度プトレシンを含む培地で成長がよかったことが確認されたので、前記NCgl0101をプトレシン有効遺伝子として選択した。
実施例2−1で得た全6種の形質転換体を対象に、実施例1と同様の方法で高濃度プトレシンを含む培地で成長のよかった形質転換体を選択した(図2)。図2は本発明で作製した各形質転換菌株の成長の程度を比較した結果を示す写真であり、1、2、3、4、5及び6は、それぞれ前記6種の発現ベクターであるpHC139T、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0100、pHC139T−P(CJ7)−tNCgl0100、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0101、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0102−NCgl0103、及びpHC139T−P(CJ7)−NCgl0104が導入された菌株を示す。図2に示すように、pHC139T−P(CJ7)−NCgl0101が導入された形質転換体(4番)のみ高濃度プトレシンを含む培地で成長がよかったことが確認されたので、前記NCgl0101をプトレシン有効遺伝子として選択した。
実施例3:NCgl0101過剰発現菌株におけるプトレシン生産能の評価
実施例2で有効遺伝子として確認されたNCgl0101遺伝子を過剰発現する菌株のプトレシン生産能を評価した。プトレシン生産菌株KCCM11138PにpHC139T−P(CJ7)−NCgl0101が導入された菌株を用いた。
実施例2で有効遺伝子として確認されたNCgl0101遺伝子を過剰発現する菌株のプトレシン生産能を評価した。プトレシン生産菌株KCCM11138PにpHC139T−P(CJ7)−NCgl0101が導入された菌株を用いた。
実施例2−1で作製したpHC139T−P(CJ7)−NCgl0101と対照群として用いるpHC139TベクターをKCCM11138Pプトレシン生産菌株に電気穿孔法で導入し、その後25μg/mlのカナマイシンを含むBHIS平板培地に塗抹して形質転換体を選択し、KCCM11138P/pHC139T、KCCM11138P/pHC139T−P(CJ7)−NCgl0101と命名した。選択した2つの形質転換体を対象に、1mMアルギニンを含むCM平板培地(ブドウ糖1%,ポリペプトン 1%,酵母抽出物0.5%,牛肉エキス0.5%,NaCl 0.25%,尿素 0.2%,50%NaOH 100μl,寒天 2%,pH6.8,1L中)で30℃にて24時間培養し、その後25μg/mlのカナマイシンを含む表2の力価培地25mlに1白金耳ほど接種し、次いでそれを30℃にて200rpmで96時間振盪培養した。作製された全ての菌株において、発酵の際に培地にアルギニン1mMを添加して培養した。
その結果、表3に示すように、NCgl0101を過剰発現する場合はプトレシン生産量が減少することが確認された。
実施例4:NCgl0101が欠失した菌株におけるプトレシン生産能の評価
実施例4−1.ATCC13032ベースのプトレシン生産菌株におけるNCgl0101欠損菌株の作製
NCgl0101を過剰発現する場合は高濃度プトレシン培地で細胞成長性が増加するが、実施例3によれば、NCgl0101を過剰発現する場合にプトレシン生産量が減少することが確認された。このような結果に基づいて、NCgl0101欠損時にプトレシン生産性に及ぼす影響を確認した。
実施例4−1.ATCC13032ベースのプトレシン生産菌株におけるNCgl0101欠損菌株の作製
NCgl0101を過剰発現する場合は高濃度プトレシン培地で細胞成長性が増加するが、実施例3によれば、NCgl0101を過剰発現する場合にプトレシン生産量が減少することが確認された。このような結果に基づいて、NCgl0101欠損時にプトレシン生産性に及ぼす影響を確認した。
具体的には、ATCC13032菌株のNCgl0101塩基配列に基づいて、NCgl0101のN末端外部の相同組換え(homologous recombination)断片を得るためのプライマーとして配列番号12及び13のNCgl0101−del−F1_BamHI、NCgl0101−del−R1_SalIを作製し、NCgl0101のC末端外部の相同組換え断片を得るためのプライマーとして配列番号14及び15のNCgl0101−del−F2_SalI、NCgl0101−del−R2_XbaIを作製した(表4)。2組のプライマーを用いてNCgl0101遺伝子のN末端部分の断片とC末端部分の断片をPCRで作製し、PCR産物をそれぞれBamHI&SalIとSalI&XbaIで処理し、BamHI&XbaIで処理したpDZベクターにクローニングした。結果として得られたプラスミドをpDZ−NCgl0101(K/O)と命名した。
KCCM11138P△NCgl0101菌株を得るために作製したpDZ−NCgl0101(K/O)ベクターをKCCM11138P菌株に電気穿孔法で導入し、その後25μg/mlのカナマイシンを含むBHIS平板培地に塗抹した。ベクターの染色体挿入が成功したか否かは、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド)を含む固体培地で青色を示すか否かにより判別した。染色体に1次挿入された菌株を栄養培地で振盪培養(30℃,8時間)し、その後それぞれ10−4から10−10に希釈し、X−galを含む固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに対して、低い割合で出現する白色のコロニーを選択することにより、2次交差による最終のNCgl0101欠失菌株を選択し、配列番号12及び15のプライマーを用いてPCRで確認した。確認した菌株をKCCM11138P△NCgl0101と命名した。
実施例4−2.ATCC13869ベースのプトレシン生産菌株におけるNCgl0101欠損菌株の作製
コリネバクテリウムグルタミカムATCC13032ベースのプトレシン生産菌株であるKCCM11138Pと同じ遺伝型を有するコリネバクテリウムグルタミカムATCC13869ベースのプトレシン生産菌株DAB12−a(ArgF欠損、NCgl1221欠損、大腸菌speC導入、Argオペロン−ArgCJBDプロモーター置換により強化)を対象に、NCgl0101欠損菌株を作製した。
コリネバクテリウムグルタミカムATCC13032ベースのプトレシン生産菌株であるKCCM11138Pと同じ遺伝型を有するコリネバクテリウムグルタミカムATCC13869ベースのプトレシン生産菌株DAB12−a(ArgF欠損、NCgl1221欠損、大腸菌speC導入、Argオペロン−ArgCJBDプロモーター置換により強化)を対象に、NCgl0101欠損菌株を作製した。
具体的には、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13869由来のNCgl0101をコードする遺伝子及びそこから発現するタンパク質配列を確認するために、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13869のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号12及び15(NCgl0101−del−F1_BamHI,NCgl0101−del−R2_XbaI)のプライマー対を用いてPCRを行った。ここで、PCR反応は、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で2分30秒間の伸長を30サイクル行った。こうして得られたPCR産物を電気泳動で分離し、その後配列分析を行った結果、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13869由来のNCgl0101をコードする遺伝子は配列番号18で表される塩基配列を含み、それによりコードされるタンパク質は配列番号19で表されるアミノ酸配列を含むことが確認された。コリネバクテリウムグルタミカムATCC13032由来のNCgl0101とコリネバクテリウムグルタミカムATCC13869由来のNCgl0101のアミノ酸配列を比較した結果、これらは98%の配列相同性を有することが確認された。
コリネバクテリウムグルタミカムATCC13869由来のNCgl0101をコードする遺伝子を欠損させるために、前記実施例4−1と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13869のゲノムDNAを鋳型とし、表4に示す2組のプライマーを用いてNCgl0101遺伝子のN末端部分の断片とC末端部分の断片をPCRで作製し、PCR産物をそれぞれBamHI&SalIとSalI&XbaIで処理し、pDZベクターはBamHI&XbaIで処理してクローニングすることにより、プラスミドpDZ−2’NCgl0101(K/O)を作製した。
前記プラスミドpDZ−2’NCgl0101(K/O)を実施例4−1と同様の方法でコリネバクテリウムグルタミカムDAB12−aに形質転換することにより、NCgl0101をコードする遺伝子が欠失した菌株を選択した。こうして選択されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株をDAB12−a△NCgl0101と命名した。
実施例4−3.NCgl0101欠損菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株においてNCgl0101欠損がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例4−1及び4−2で作製されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株を対象に、プトレシン生産能を比較した。
プトレシン生産菌株においてNCgl0101欠損がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例4−1及び4−2で作製されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株を対象に、プトレシン生産能を比較した。
具体的には、2種のコリネバクテリウムグルタミカム変異株(KCCM11138P△NCgl0101,DAB12−a△NCgl0101)を対象に、実施例3と同じ評価方法でプトレシン生産性を測定した。その結果、下記表5に示すように、NCgl0101欠失によりプトレシン生産量が増加することが確認された。
実施例3及び4の内容をまとめると、野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株においてNCgl0101をコードする遺伝子が過剰発現するとプトレシンの生産量が減少し、欠失するとプトレシンの生産量が増加したので、前記NCgl0101はプトレシンの生合成に直接影響を及ぼすことが分かった。
よって、本発明者らは、前記実施例で作製された、プトレシン生産菌株であるKCCM11138PにおいてNCgl0101遺伝子を欠失させてプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株をCorynebacterium glutamicum CC01−0244と命名し、2011年12月26日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに受託番号KCCM11241Pとして寄託した。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例は全ての面において例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
Claims (11)
- プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム(Corynebacterium)属微生物に対して、さらに、配列番号17又は19で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を内在的活性より低下又は欠失させた、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
- オルニチンデカルボキシラーゼ(speC)の活性がさらに高められた、請求項1に記載の微生物。
- 前記オルニチンデカルボキシラーゼが配列番号22のアミノ酸配列を有する、請求項2に記載の微生物。
- オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ArgF)及びグルタミン酸エクスポーター(NCgl1221)からなる群から選択される少なくとも1種の活性が内在的活性よりさらに低下した、請求項1に記載の微生物。
- ArgFが配列番号20のアミノ酸配列を有し、NCgl1221が配列番号21のアミノ酸配列を有する、請求項4に記載の微生物。
- アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ(ArgC)、アセチルグルタミン酸シンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ(ArgJ)、アセチルグルタミン酸キナーゼ(ArgB)、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(ArgD)からなる群から選択される少なくとも1種の活性がさらに向上した、請求項1に記載の微生物。
- 前記ArgC、ArgJ、ArgB及びArgDが、それぞれ配列番号23、24、25及び26のアミノ酸配列を有する、請求項6に記載の微生物。
- 活性低下が、1)前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部の欠失、2)前記遺伝子発現の減少、3)前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列の変異、又は4)それらの組み合わせにより行われる、請求項1に記載の微生物。
- コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項1に記載の微生物。
- 配列番号17又は19で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が内在的活性より低下又は欠失した、向上したプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する工程と、
前記工程で得られた培養物からプトレシンを分離する工程とを含むプトレシンの生産方法。 - コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項10に記載のプトレシンの生産方法。
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