BR112014017910B1 - Microrganismo recombinante com capacidade aumentada de produção de putrescina e método para a produção de putrescina que emprega o mesmo - Google Patents

Abstract

MICRORGANISMO RECOMBINANTE COM CAPACIDADE AUMENTADA DE PRO-DUÇÃO DE PUTRESCINA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PUTRESCINA QUE EMPREGA O MESMO. A presente invenção diz respeito a microrganismos de Corynebacterium que podem utilizar xilose e a um método para a produção de L-lisina utilizando os mesmos. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a microrganismos de Corynebacte-rium que são modificados, nos quais genes que codificam xilose-isomerase e xiluloci-nase, que são xilose-sintases, são introduzidos para expressar a xilose-sintase. A presente invenção também diz respeito a um método para a produção de L-Iisina, o qual compreende um passo de cultura dos microrganismos modificados de Coryne-bacterium utilizando xilose como fonte de carbono e recuperação de L-lisina a partir da cultura.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um microrganismo recombinante com uma capacidade aumentada para produzir putrescina e a um método para a produção de putrescina que emprega o mesmo.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] A putrescina (ou 1,4-butanodiamina) é um tipo de poliamina, tal como a espermidina e a espermina e é encontrada em bactérias gram- negativas e fungos. Dado que a putrescina está presente em uma grande variedade de concentrações em várias espécies prevê-se que desempenhe um importante papel no metabolismo dos microrganismos. A putrescina é vulgarmente produzida através de síntese química, por meio de acrilonitrilo e succinonitrilo de propileno. A síntese química utiliza substâncias derivadas de produtos petroquímicos como material de partida e utiliza produtos químicos tóxicos, não sendo, assim, ecológicos e contribuindo para o esgotamento dos recursos petrolíferos.

[003] A fim de resolver estes problemas, tem sido desenvolvida muita investigação sobre o desenvolvimento de um método de biossíntese de putrescina empregando microrganismos que seja mais ecológico e reduza o consumo energético. De acordo com os conhecimentos atuais, a putrescina pode ser biossintetizada através de duas vias. Em uma via, a ornitina é produzida a partir de glutamato e a ornitina é descarboxilada para sintetizar putrescina. Na outra via é sintetizada arginina a partir de ornitina, é produzida agmatina a partir de arginina e depois é sintetizada putrescina a partir de agmatina. Além disso, existem outros métodos de síntese de putrescina recorrendo a um microrganismo alvo que é transformado com as enzimas envolvidas nas vias de síntese conhecidas da putrescina. Por exemplo, a WO 09/125924 apresenta um método de produção da putrescina com um elevado nível de rendimento por meio da inativação da via envolvida na decomposição e utilização da putrescina em E. coli, por meio da inativação da via através da qual a ornitina, um precursor da putrescina, é convertida em arginina e aumentando a via da biossíntese da ornitina. Um artigo publicado em 2010 apresenta um método de produção da putrescina em alta concentração através da introdução e aumento da proteína que converte a ornitina em putrescina em estirpes de Corynebacterium que não são capazes de produzir putrescina. Apresenta ainda um método de produção de putrescina a partir de arginina através da introdução nas estirpes de arginina descarboxilase e agmatinase derivadas de E. coli. Nesta perspectiva, a via da ornitina produziu uma quantidade de putrescina cerca de 50 vezes superior comparativamente à via da arginina (Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88:4, 859-868, 2010). DIVULGAÇÃO

Problemas Técnicos

[004] Neste contexto, os autores da presente invenção identificaram que a putrescina pode ser produzida com alto rendimento em um microrganismo do gênero Corynebacterium enfraquecendo ou removendo a atividade da proteína NCgl0101, completando assim a presente invenção.

Solução Técnica

[005] Um objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um microrganismo recombinante do gênero Corynebacterium capaz de produzir putrescina com alto rendimento, microrganismo esse que é modificado para possuir a atividade enfraquecida da NCgl0101 comparativamente com a atividade endógena da mesma.

[006] Outro objeto da presente invenção consiste em apresentar um método para a produção de putrescina utilizando o microrganismo.

[007] Efeito vantajoso

[008] Quando o microrganismo do gênero Corynebacterium, com uma capacidade melhorada de produzir putrescina da presente invenção é utilizado pra a produção de putrescina, este é modificado para enfraquecer a atividade NCgl0101 comparativamente com a atividade endógena do mesmo e por conseguinte pode produzir putrescina com um alto rendimento. Assim, o microrganismo pode ter uma ampla utilização na produção mais eficiente da putrescina.

Descrição das Figuras

[009] FIG. 1 representa um diagrama esquemático que mostra as posições relativas de genes codificadores de NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 e NCgl0104 que se encontram no cromossoma da estirpe de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, e

[010] FIG. 2 representa os resultados do teste de comparação entre as estirpes recombinantes preparadas na presente invenção, em que 1, 2, 3, 4, 5 e 6 são estirpes preparadas através da introdução de pHC139T, pHC139T- P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103 e pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104 em KCCM11138P respectivamente.

Melhor Modo

[011] Em um aspecto para alcançar os objetivos supra, a presente invenção apresenta um microrganismo recombinante do gênero Corynebacterium com uma capacidade aumentada para produzir putrescina, a qual é modificada através do enfraquecimento ou remoção da atividade da proteína NCgl0101 com uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 17 ou SEQ ID NO. 19 em comparação com a atividade endógena do mesmo.

[012] Como presentemente utilizado, o termo “NCgl0101” significa uma proteína que apresenta a atividade de uma enzima dependente do metal, a qual é expressa em Corynebacterium glutamicum e cuja função ainda não é inteiramente conhecida. Inclui um domínio de ligação de metal da peptidase M20 ou proteína da utilização de aminobenzoíl-glutamato (AbgB). A AbgB de E. coli constitui aminobenzoil-glutamato hidrolase com AbgA para hidrolizar aminobenzoíl-glutamato em aminobenzoato e glutamato. É conhecida a utilização de aminobenzoato como precursor para a síntese de folato, mas ainda não é conhecida a relação deste com a produtividade da putrescina.

[013] A proteína NCgl0101 da presente invenção pode compreender a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19. No entanto não está limitada a estas porque pode existir a diferença na sequência de aminoácidos da proteína dependendo da espécie ou estirpe microbiana. Por outras palavras, pode ser uma proteína mutante ou variante artificial com uma sequência de aminoácidos compreendendo substituição, eliminação, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos em uma ou mais localizações da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19 desde que possa ajudar a aumentar a capacidade de produção de putrescina através do enfraquecimento da atividade da proteína. Neste caso, "vários" poderão diferir dependendo da localização ou tipo na estrutura tri-dimensional dos resíduos de aminoácidos da proteína, mas significa especificamente 2 a 20, especificamente 2 a 10 e mais especificamente 2 a 5. Além disso, a substituição, eliminação, inserção, adição ou inversão do aminoácido inclui aquelas provocadas por variantes artificiais ou mutação natural, com base na diferença no indivíduo ou espécie do microrganismo.

[014] O polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos da presente invenção pode compreender a sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19 ou a sequência de aminoácidos de 80% o mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais e particularmente especificamente 97% ou mais de homologia com os mesmos, desde que tenha uma atividade similar à da proteína NCgl0101. O mais especificamente, pode ser a sequência de polinucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.

[015] O termo "homologia" refere-se à identidade entre as duas sequências de aminoácidos e pode ser determinada pelos métodos bem conhecidos dos peritos na técnica, utilizando BLAST 2.0 para calcular o parâmetro, tal como grau, identidade e similaridade.

[016] Além disso, a sequência de polinucleotídeos codificadora de NCgl0101 da presente invenção pode ser hibridada com o polinucleótido da SEQ ID. NO: 16 ou a sonda preparada a partir do mesmo em condições rigorosas e pode ser uma sequência de polinucleotídeos modificada codificadora da proteína NCgl0101 que funciona normalmente. Como utilizado presentemente, "condições rigorosas" refere-se às condições que permitem a hibridação específica entre o polinucleótido e encontram-se descritas especificamente, por exemplo, em Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2- Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) ou Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque). Por exemplo, a hibridação é efetuada no tampão de hibridação a 65 °C (3,5 x SCC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina de soro de bovino, 2,5 mM de NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA). SSC é cloreto de sódio 0,15 M /0.15 M citrato de sódio de pH 7. Após a hibridação, a membrana para a qual o ADN é transferido é enxaguada com 2 X SSC à temperatura ambiente e depois é lavada novamente com 0,1 a 0,5 X SSC/0,1 X SDS a uma temperatura de 68 °C.

[017] A atividade da proteína NCgl0101 na presente invenção pode ser enfraquecida com 1) uma eliminação total ou parcial de um polinucleótido que codifica a proteína, 2) modificação de uma sequência reguladora da expressão para reduzir a expressão de um polinucleótido, 3) uma modificação da sequência de polinucleotídeos no cromossoma ou 4) uma combinação dos mesmos.

[018] Nos anteriores, pode ser executada uma eliminação parcial ou total de um polinucleótido que codifica a proteína através da substituição do polinucleótido que codifica uma proteína alvo endógena no cromossoma para um gene marcador ou um polinucleótido cuja sequência de nucleotídeos parcial foi eliminada, por um vetor para inserção do gene cromossomal. O comprimento da eliminação "parcial" depender do tipo de polinucleotídeos, mas tem especificamente entre 2 bp a 300 bp, mais especificamente 2 bp a 100 bp e ainda mais especificamente 1 bp a 5 bp.

[019] Além disso, para diminuir a expressão de polinucleotídeos, pode ser modificada uma sequência reguladora da expressão através da indução de mutações na sequência reguladora da expressão através da eliminação, inserção, substituição conservadora ou não conservadora da sequência de nucleotídeos ou uma combinação destes para enfraquecer ainda mais a atividade da sequência reguladora da expressão ou através da substituição da sequência reguladora da expressão pela sequência com atividade mais fraca. A sequência reguladora da expressão pode incluir um promotor codificador da sequência, local de ligação ribossomal da sequência operadora e a sequência que controla a terminação da transcrição e da tradução.

[020] Além disso, a sequência de polinucleotídeos no cromossoma para enfraquecer a atividade da proteína pode ser modificada através da indução de mutações na sequência através da eliminação, inserção, substituição conservadora ou não conservadora da sequência de nucleotídeos ou uma combinação destes processos para enfraquecer ainda mais a atividade da sequência ou através da substituição da sequência de polinucleotídeos pela sequência modificada para apresentar uma atividade mais fraca da proteína.

[021] Entretanto, um microrganismo do gênero Corynebacterium com capacidade aumentada para produzir putrescina da produto pode ainda ser modificado para enfraquecer a atividade da ornitina carbamoiltransferase (ArgF) envolvida na síntese da arginina a partir da ornitina e a atividade da proteína (NCgl1221) envolvida na exportação do glutamato, comparativamente com a atividade endógena do mesmo. Além disso, o microrganismo do gênero Corynebacterium pode ser modificado por meio da introdução adicional da atividade da ornitina descarboxilase (ODC). Além disso, o microrganismo do gênero Corynebacterium pode ainda ser modificado para aumentar a atividade de acetil glutamato sintase para converter glutamato em acetil glutamato ou ornitina acetiltransferase (ArgJ) para converter acetil ornitina em ornitina, a atividade de acetil glutamato quinase (ArgB) para converter acetil glutamato em acetil glutamil fosfato, a atividade de acetil gama glutamil fosfato redutase (ArgC) para converter acetil glutamil fosfato em acetil glutamato semialdeído e a atividade de acetil ornitina amino transferase (ArgD) para converter acetil glutamato semialdeído em acetil ornitina, em comparação com as atividades endógenas do mesmo, aumentando assim a via de biossíntese da ornitina, um precursor da putrescina (Sakanyan V et al., Microbiology. 142:1, 99-108, 1996).

[022] Neste caso, ArgF, NCgl1221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB e ArgD podem apresentar, sem se limitarem especificamente, as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID. NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 respectivamente, ou as sequências de aminoácidos com uma homologia de 80% ou mais, especificamente de 90% ou mais, mais especificamente de 95% ou mais e o mais especificamente de 97% ou mais com as mesmas.

[023] Tal como presentemente utilizado, o termo "ornitina descarboxilase (ODC)" refere-se a uma enzima que produz putrescina utilizando ornitina e a ODC precisa de piridoxalfosfato (piridoxal 5'-fosfato, PLP) como coenzima. A ODC encontra-se na maioria das bactérias gram-negativas e pode ser encontrada nalgumas das bactérias intestinais, tais como Lactobacillus de bactérias gram-positivas. E. coli tem dois tipos de genes que codificam a ODC, um dos quais, speC, é expresso continuamente à concentração específica e o outro, speF, é expresso sob condições específicas (a presença de ornitina a uma concentração superior a determinadas e pH baixo). Dependendo da espécie, algumas espécies, como E. coli, apresentam dois tipos de ODC e outras apresentam só um tipo. As espécies, tais como Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp. e Enterobacter sp. apresentam dois tipos de ODC (speC, speF), e as estirpes Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp. têm um tipo de ODC (speC). No caso do lactobacillus, a ODC é expressa em um tipo de gene (speF) e sabe-se que é induzida para ser expressa em condições de pH baixo ou ornitina e histidina abundante.

[024] A atividade ODC pode ser introduzida no microrganismo recombinante do gênero Corynebacterium da presente invenção utilizando genes codificadores de ODC derivados das várias espécies. O polinucleótido que codifica o ODC pode incluir, sem constituir limitação, o polinucleótido que codifica a proteína que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 22 e a sequência de aminoácido com uma homologia de 70% ou mais, especificamente de 80% ou mais, mais especificamente de 90% ou mais com as mesmas.

[025] Além disso, a introdução da atividade da ornitina descarboxilase (ODC) nos microrganismos pode ser executada através dos vários métodos conhecidos na técnica, por exemplo, o método de inserção do polinucleótido incluindo uma sequência de nucleotídeos codificadora de ODC no cromossoma, o método de inserção do polinucleótido nos microrganismos através da introdução no sistema vetor, o método de inserção do promotor que é modificado ou possui uma atividade melhorada na região superior da sequência de nucleotídeos que codifica a ODC e o método de inserção de mutação na sequência de nucleotídeos que codifica a ODC. Mais especificamente, se a sequência de nucleotídeos codificadora de ODC for introduzida, pode ser utilizado o promotor CJ7 como o promotor que controla a expressão da mesma.

[026] Além disso, a intensificação da atividade de ArgC, ArgJ, ArgB e ArgD pode ser alcançada através de 1) um aumento do número de cópias dos polinucleotídeos que codificam a enzima, 2) uma modificação da sequência reguladora da expressão para aumentar a expressão de polinucleotídeos, 3) uma modificação da sequência de polinucleotídeos que codifica a enzima no cromossoma para aumentar a atividade da enzima ou 4) uma combinação destes métodos.

[027] No método 1), o aumento do número de cópias de polinucleotídeos que codificam a enzima pode ser alcançado ligando operavelmente o polinucleótido ao vetor ou através da inserção do mesmo no cromossoma da célula hospedeira. Mais especificamente, o número de cópias do polinucleótido da célula hospedeira pode ser aumentado introduzindo um vetor que é capaz de se replicar e funcionar independentemente, em que o polinucleótido codificador da enzima da presente invenção se encontra operavelmente ligado, ou através da introdução do vetor capaz de inserir o polinucleótido no cromossoma da célula hospedeira, em que o polinucleótido se encontra ligado operavelmente.

[028] Tal como presentemente utilizado, o termo "vetor" refere-se à construção de ADN que compreende a sequência de nucleotídeos do polinucleótido codificador da proteína alvo ligado operavelmente à sequência reguladora devida para expressar a proteína alvo no hospedeiro adequado. A sequência reguladora inclui o promotor que pode iniciar a transcrição, qualquer sequência operadora para controlar a transcrição, a sequência para codificar o local de ligação do ribossoma mARN apropriado e a sequência para controlar a terminação da transcrição e tradução. O vetor pode ser transfectado para um hospedeiro adequado e depois pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro e pode ser integrado no próprio genoma.

[029] Na presente invenção qualquer vetor que é conhecido na técnica pode ser utilizado sem qualquer limitação específica desde que possa ser replicado no hospedeiro. Exemplos de vetores vulgarmente utilizados são plasmídeos, cosmídeos, vírus e bacteriófagos em estado natural ou estado recombinante. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A e Charon21A podem ser utilizados como um vetor fago ou vetor cosmídeo e sistema pBR, sistema pUC, sistema pBluescriptII, sistema pGEM, sistema pTZ, sistema pCL e sistema pET podem ser utilizados como o vetor plasmídeo. O vetor que pode ser utilizado na presente invenção não se encontra particularmente limitado e os vetores de expressão conhecidos podem ser utilizados. Especificamente, podem ser utilizados os vetores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC. Mais especificamente podem ser utilizados os vetores pACYC177, pCL, pCC1BAC.

[030] Além disso, o vetor que pode inserir o polinucleótido que codifica a proteína alvo no cromossoma da célula hospedeira pode ser especificamente, por exemplo, um vetor vai-vem, pECCG112 (Publicação da Patente Coreana N°. 1992-0000933) que seja capaz de replicar por si só tanto em bactérias E. coli e Coryneform, sem ficar limitado a estas espécies.

[031] Além disso, o polinucleótido codificador da proteína alvo no cromossoma pode ser substituído por um novo polinucleótido empregando um vetor para inserção de gene cromossômico. A inserção do polinucleótido no cromossoma pode ser alcançado através de qualquer método conhecido da técnica, por exemplo, através de recombinação homóloga. Dado que o vetor da presente invenção pode ser inserido no cromossoma mediante indução de uma recombinação homóloga, o marcador de seleção pode ser adicionalmente incluído para confirmar a inserção com êxito do gene no cromossoma. Um marcador de seleção destina-se ao varrimento de células que são transformadas com o vetor, por outras palavras, para determinar se o polinucleótido alvo está inserido. Podem ser utilizados os marcadores que proporcionam fenótipos selecionáveis, tais como resistência aos fármacos, auxotrofia, resistência a agentes tóxicos ou expressão de proteínas de superfície. Em um ambiente tratado com um agente seletivo, apenas as células que expressam o marcador de seleção podem sobreviver, ou as células revelam um fenótipo diferente, podendo assim as células transformadas com êxito ser selecionadas com este método.

[032] Tal como presentemente utilizado, o termo "transformação" refere-se à introdução do vetor compreendendo um polinucleótido codificador da proteína alvo na célula hospedeira, de forma que a proteína possa ser expressa na célula. O polinucleótido transformado inclui todos os polinucleotídeos que codificam proteínas alvo que podem ser expressas na célula hospedeira independentemente da localização, esteja este inserido no cromossoma da célula hospedeira ou esteja localizado fora do cromossoma. Além disso, o polinucleótido inclui ADN e ARN que codificam a proteína alvo. O polinucleótido pode ser introduzido sob qualquer forma desde que seja introduzido na célula hospedeira e expresso. Por exemplo, o polinucleótido pode ser introduzido em uma célula hospedeira em uma forma de cassete de expressão que é uma construção de genes que compreende todos os elementos necessários para a autoexpressão. A cassete de expressão inclui tipicamente um promotor operavelmente ligado ao polinucleótido, sinal de terminação da transcrição, local de ligação do ribossoma e sinal determinação da tradução. A cassete de expressão pode ser a forma de vetor de expressão com capacidade de autorreplicação. Além disso, o polinucleótido pode ser introduzido em uma célula hospedeira sob a sua própria forma e ligado operavelmente às sequências necessárias para a expressão da célula hospedeira.

[033] Tal como presentemente utilizado, o termo "ligado operavelmente" refere-se à ligação funcional entre a sequência promotora que inicia ou medeia a transcrição do polinucleótido codificador da proteína alvo e o polinucleótido.

[034] Além disso, a modificação do método 2) da sequência reguladora da expressão para aumentar a expressão do polinucleótido na presente invenção pode ser executado através da indução da mutação da sequência através da eliminação, inserção, substituição conservadora ou não conservadora da sequência de nucleotídeos ou uma combinação destes ou através da substituição pela sequência de nucleotídeos com atividade intensificada. A sequência reguladora da expressão inclui um promotor sequência operadora, locais de ligação ribossomal codificadores da sequência e a sequência que controla a terminação da transcrição e da tradução.

[035] Um forte promotor heterólogo pode ser ligado à unidade de expressão superior do polinucleótido em vez dos promotores originais. Um exemplo de um promotor forte é o promotor pcj7, promotor lysCP1, promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceA ou aceB, etc. e mais especificamente o promotor lysCP1 ou promotor pcj7 derivado de Corynebacterium encontra-se ligado operavelmente para aumentar a expressão do polinucleótido codificador da enzima. Neste caso, o promotor lysCP1, que é um promotor melhorado através da substituição da sequência de nucleotídeos da região promotora do polinucleótido codificador de aspartato quinas e aspartato semialdeído desidrogenase é suficientemente forte para aumentar 5 vezes a atividade da enzima correspondente comparativamente com o tipo selvagem através do aumento da expressão do gene aspartato quinase (Publicação de Patente Internacional N° 2009-096689). Além disso, o promotor pcj7 foi identificado para ser expresso em Corynebacterium ammoniagenes e Escherichia e possuir uma forte atividade promotora e pode ser expresso em Corynebacterium glutamicum assim como em alta intensidade (patente coreana n° 0620092).

[036] Além disso, a modificação do método 3) da sequência de polinucleotídeos no cromossoma pode ser executada, sem constituir especificamente limitação, através da indução da mutação da sequência através de eliminação, inserção, substituição conservadora ou não conservadora da sequência de nucleotídeos ou uma combinação destes para aumentar a atividade da sequência ou através da substituição pela sequência de nucleotídeos com atividade intensificada.

[037] O microrganismo na presente invenção, que é um microrganismo com a capacidade para produzir putrescina, inclui microrganismos procariontes, em que a proteína que compreende a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19 é expressa e pode ser, por exemplo, o microrganismo de Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Sllenomanas sp., e Vibrio sp.

[038] O microrganismo na presente invenção é especificamente o microrganismo do gênero Corynebacterium e pode ser, mais especificamente, de Corynebacterium glutamicum.

[039] Em uma realização da presente invenção, foi modificado o microrganismo do gênero Corynebacterium com o número de acesso KCC11138P (Divulgação de Patente Coreana N° 2012-0064046) que possui a capacidade de produzir putrescina em alta concentração através de uma via de biossíntese de putrescina aumentada. Especificamente, a estirpe produtora de putrescina KCCM11138P é a estirpe produtora de putrescina em excesso, em que são eliminados o gene codificador da ornitina carbamoiltransferase (ArgF) para acumulação de ornitina e o gene codificador do exportador glutamato (NCgl1221) para aumentar o glutamato intracelular das estirpes ATCC13032, o gene codificador de ornitina descarboxilase (speC) é introduzido e o nível de expressão dos genes da biossíntese de ornitina (argCJBD) são aumentados.

[040] Outra realização da presente invenção, foi modificado Corynebacterium glutamicum estirpe DAB12-a produtora de putrescina com base em ATCC13869. A estirpe ATCC13869 é baseada no mesmo genótipo que a KCCM11138P, que é uma estirpe produtora de putrescina baseada em Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Especificamente, a estirpe produtora de putrescina DAB12-a é da estirpe ATCC13869, obtida da American Type Culture Collection (ATCC), em que são substituídos o gene codificador da ornitina carbamoiltransferase (ArgF) e o gene codificador da proteína NCgl1221 para exportar glutamato, o gene (speC) codificador de ornitina descarboxilase (ODC) derivado de E. coli é introduzido e o promotor do operon da biossíntese de ornitina (argCJBD) pelo promotor melhorado.

[041] De acordo com uma realização da presente invenção, um microrganismo do gênero Corynebacterium (KCCM11138P) tem uma capacidade para produzir putrescina, que é preparada por meio de eliminação do gene codificador da ornitina carbamoil transferase (ArgF) e o gene codificador do exportador glutamato (NCgl1221) envolvido na exportação do glutamato, substituição do promotor próprio do aglomerado de genes ArgCJBD codificador de uma enzima envolvida na síntese da ornitina a partir de glutamato e introdução do gene (speC) codificador da ornitina descarboxilase (ODC) no cromossoma na Corynebacterium glutamicum de tipo selvagem ATCC13032. Com base em KCCM11138P, foi selecionado um poço de desenvolvimento do clone (A15) em um meio contendo uma alta concentração de putrescina e foi confirmado que o A15 selecionado inclui os genes codificadores de NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 e NCgl0104 (exemplo 1). Além disso, o microrganismo desenvolve-se no meio que contém uma alta concentração de putrescina devido ao gene codificador de NCgl0101 entre os cinco tipos de genes (exemplo 2). No que respeita ao caráter do gene codificador de NCgl0101 foi confirmado que a produção de putrescina foi reduzida em uma estirpe em que o gene codificador de NCgl0101 é expresso em excesso (exemplo 3) e a produção de putrescina foi aumentada em uma estirpe em que o gene codificador de NCgl0101 é eliminado (exemplo 4).

[042] Assim, os autores da presente invenção nomearam a estirpe Corynebacterium glutamicum como tendo uma maior capacidade de produzir putrescina, a qual é preparada por meio da remoção do gene NCgl0101 na estirpe produtora de putrescina KCCM 11138P por Corynebacterium glutamicum CC01-0244 e depositaram no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (doravante designado “KCCM” em 26 de Dezembro de 2011, com o n° de acesso KCCM11241P.

[043] Noutro aspecto da presente invenção para alcançar os objetivos acima, a presente invenção refere-se a um método para a produção de putrescina, compreendendo as fases de:

[044] cultura do microrganismo do gênero Corynebacterium com uma capacidade aumentada de produção de putrescina, que é modificado para ter uma atividade enfraquecida da proteína NCgl0101 com uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 17 ou SEQ ID NO. 19 e

[045] isolar putrescina do caldo de cultura obtido no passo acima.

[046] O processo de cultura na presente invenção pode ser executado em meio apropriado e nas condições de cultura conhecidas na técnica. Os especialistas na técnica podem facilmente ajustar e utilizar o processo de cultura dependendo das estirpes selecionadas. Um exemplo do processo de cultura inclui tipos de cultura descontínua, contínua e alimentação descontínua, mas sem que estes constituam qualquer limitação. O meio de cultura pode ter de satisfazer apropriadamente os requisitos de uma estirpe específica.

[047] O meio de cultura pode ter de satisfazer apropriadamente os requisitos de estirpes específicas. São apresentados meios de cultura para vários microrganismos (por exemplo "Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). Podem ser empregues como fonte de carbono no meio açúcar e hidratos de carbono (por. ex. glucose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), nata e gordura (por ex., óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos gordos (por ex. ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcool (por ex. glicerol e etanol) e ácido orgânico (por ex., ácido acético), etc. Estas substâncias podem ser utilizadas individualmente ou misturadas. Como fonte de nitrogênio podem ser empregues compostos orgânicos contendo nitrogênio (por ex., peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, xarope de milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por ex. sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) e estas substâncias podem também ser utilizadas individualmente ou misturadas. Como fonte de fósforo pode ser utilizado di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofostato dipotássico ou o sal contendo sódio correspondente. Além disso, o meio de cultura pode compreender sais metálicos (por ex., sulfato de magnésio ou sulfato de ferro) que são essenciais para o desenvolvimento e finalmente, podem ser empregues substâncias promotoras do crescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas para além das substâncias já referidas. O precursor apropriado pode ser ainda adicionado ao meio de cultura. A substância nutriente pode ser fornecida na cultura uma vez ou adequadamente durante a cultura.

[048] O pH da cultura pode ser ajustado através de um composto básico adequado (por ex. hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amoníaco) ou um composto ácido (por ex. ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). A formação de espuma pode ser ajustada com um agente antiespumante, tal como éster poliglicólico de ácido gordo. As condições aeróbicas da cultura podem ser mantidas mediante introdução de oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio, por exemplo, ar. A temperatura de cultura pode situar-se tipicamente entre 20 e 45 °C, especificamente entre 25 e 40 °C. Pode-se prosseguir com a cultura até a produção de putrescina atingir o máximo desejado, pode ser normalmente atingido em 10 a 160 horas. A putrescina pode ser libertada no meio de cultura ou contida na célula.

[049] Para o método de coleta e recuperação da putrescina produzida no processo de cultura da presente invenção, a substância alvo pode ser recuperada a partir do meio de cultura utilizando o método conhecido na técnica apropriado dependendo do método de cultura, por exemplo, tipo de cultura descontínua, contínua ou alimentação descontínua.

[050] Modo da Invenção

[051] De seguida a presente invenção será descrita mais detalhadamente com os seguintes exemplos. No entanto, estes exemplos destinam-se exclusivamente a fins ilustrativos e não se pretende que a invenção seja limitada por estes.

[052] Exemplo 1: Preparação da biblioteca para seleção de genes eficazes para a biossíntese de putrescina e seleção de clones

[053] A fim de detectar genes eficazes para a biossíntese de putrescina a partir do cromossoma da estirpe de Corynebacterium de tipo selvagem foi preparada uma biblioteca de cromossomas da estirpe de Corynebacterium de tipo selvagem. Detalhadamente, o cromossoma extraído da estirpe Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de tipo selvagem foi clivado aleatoriamente com a enzima de restrição Sau3AI e os fragmentos 5 a 8 foram selecionados desta e depois clonados no vetor vai-vem E.coli-Corynebacterium pECCG122 (Patente Coreana Divulgada N° 1992-0000933) para preparar uma biblioteca de cromossomas.

[054] A fim de selecionar os genes eficazes para a biossíntese da putrescina a partir da biblioteca de cromossomas de Corynebacterium preparada deste modo, foram obtidas as colônias em crescimento em um meio contendo elevada concentração de putrescina.

[055] Entretanto, as bibliotecas foram introduzidas em um microrganismo do gênero Corynebacterium (KCCM11138P) com uma capacidade de produzir putrescina de forma a preparar cada um dos transformantes. Os transformantes que foram capazes de crescer em meio mínimo contendo 0,35 M de putrescina (10 g/l de glicose, 0,4 g/l de MgSO4 • 7H2O, 4 g/l de NH4CI, 1 g/l de KH2PO4, 1 g/l de K2HPO4, 2 g/l de ureia, 10 mg/l de FeSO4 • 7H2O, 1 mg/l de MnSO4 • 5H2O, 5 mg/l de nicotinamida, 5 mg/l de cloridrato de tiamina, 0,1 mg/l de biotina, 1 mM de arginina, 25 mg/l de canamicina, 0,35 M de putrescina, pH 7,0) foram selecionados.

[056] A estirpe KCCM11138P é apresentada em uma patente pedida pelos autores da presente invenção (patente coreana divulgada N° 20120064046), a qual foi preparada por eliminação dos genes codificadores da ornitina carbamoiltransferase (argF) e exportador glutamato (NCgl1221) no cromossoma da estirpe ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum , introduzindo uma ornitina descarboxilase (ODC) codificadora de gene (speC), derivada da estirpe de E. coli W3110 no cromossoma e substituindo o promotor do aglomerado de genes argCJBD codificador da enzima envolvida na síntese da ornitina a partir de glutamato, de forma a preparar cada um dos transformantes. Em resultado, foram selecionadas 275 colônias e as colônias com bom crescimento no meio que continham elevada concentração de putrescina foram depois identificadas. Cada clone da biblioteca foi obtido e introduzido novamente na estirpe de putrescina. Em seguida, as colônias com bom crescimento no meio que continham elevada concentração de putrescina foram identificadas e foi assim selecionado por fim um clone (A15). Este clone selecionado foi identificado mediante sequenciação. Assim, foi confirmado que o clone compreende um total de 5 ORFs de NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 e NCgl0104, dos quais foram removidos 436 aminoácidos no N- terminal (FIG 1). FIG. 1 é um diagrama esquemático que mostra as posições relativas de genes codificadores de NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 e NCgl0104 que se encontram no cromossoma da estirpe de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

[057] Exemplo 2: Identificação de genes eficazes para a síntese de putrescina em um clone A15

[058] Exemplo 2-1: Clonagem de 5 genes no clone A15 e preparação de um transformante

[059] A sequência de nucleotídeos do clone A15 obtido no exemplo 1 já era conhecida. Com base na sequência de nucleotídeos da estirpe ATCC13032 anteriormente descrita, foram construídos NCgl0100-F e NCgl0100-R representados pelas SEQ ID NOs. 1 e 2 como iniciadores para a amplificação do gene NCgl0100; NCgl0100-R e tNCgl0100-F representados pelas SEQ ID NOs. 2 e 3 como iniciadores para a amplificação do gene tNCgl0100, do qual foram removidos 436 aminoácidos no N-terminal, NCgl0101-F e NCgl0101-R representados pelas SEQ ID NOs. 4 e 5 como iniciadores para a amplificação do gene NCgl0101; NCgl0102-F e NCgl0103-R representados pelas SEQ ID NOs. 6 e 7 como iniciadores para a amplificação dos dois genes NCgl0102 e NCgl0103 e NCgl0104-F e NCgl0104-R representados pelas SEQ ID NOs. 8 e 9 como iniciadores para a amplificação do gene NCgl0104. Além disso foram construídos P(CJ7)-F e P(CJ7)-R representados pelas SEQ ID NOs. 10 e 11 como iniciadores para a amplificação do promotor de expressão P(CJ7)(ou pcj7) (patente coreana N° 10-0620092) (quadro 1).

[060] Em seguida, foi efetuado PCR utilizando o cromossoma da estirpe ATCC 13032 como modelo e cada um dos iniciadores representados pelas SEQ ID NOs. 1 a 9 (desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, hibridação a 50 °C durante 30 segundos e extensão a 72 °C durante 1 minuto ~ 1 minuto 30 segundos, 25 ciclos) de forma a amplificar 5 tipos de fragmentos de genes. Foi ainda efetuado PCR utilizando o cromossoma de Corynebacterium ammoniagenes como modelo e os iniciadores representados pelas SEQ ID NOs. 10 e 11 de forma a amplificar o fragmento promotor.

[061] 5 genes clivados com KpnI e XbaI, e promotor CJ7 clivado com EcoRV e KpnI foram ligados a um vetor de expressão pHC139T (Patente Coreana No. 10-0860932) clivado com EcoRV e XbaI, de forma a preparar um total de 5 tipos de vetores de expressão, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101, pHC139T-P(CJ7)- NCgl0102-NCgl0103, e pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104.

[062] Quadro 1

[063] Iniciadores para a preparação de estirpes que expressam 5 genes contidos em um clone A15

[064] 5 tipos dos vetores de expressão preparados deste modo e um grupo de controle pHC139T foram introduzidos na estirpe KCCM11138P do exemplo 1 por meio de eletroporação e depois foram espalhados em placas BHIS contendo 25 g/ml de canamicina para selecionar transformantes.

[065] Exemplo 2-2: Pesquisa dos genes eficientes para a putrescina

[066] De um total de 6 tipos de transformantes obtidos no exemplo 2-1, os transformantes com bom crescimento no meio que continham elevada concentração de putrescina foram selecionados da mesma forma que no exemplo 1 (FIG. 2). FIG. 2 é os resultados da comparação do crescimento entre os transformantes preparados na presente invenção, em que 1, 2, 3, 4, 5 e 6 representam estirpes introduzidas com os 6 tipos de vetores de expressão pHC139T, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103 e pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104 respectivamente. Como se mostra na FIG. 2, apenas o transformante (n°. 4) introduzido com pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101 revelava um excelente crescimento no meio que continha elevada concentração de putrescina, sendo assim selecionado NCgl0101 como o gene eficiente para a biossíntese da putrescina.

[067] Exemplo 3: Avaliação da capacidade de produção de putrescina em uma estirpe com sobreexpressão-NCgl0101

[068] Foi avaliada a capacidade para produzir putrescina da estirpe com sobreexpressão do gene NCgl0101 que foi identificado como o gene eficiente no exemplo 2. Foi preparada uma estirpe de avaliação através da introdução de pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101 na estirpe KCCM11138P produtora de putrescina.

[069] pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101 preparado no exemplo 2-1 e vetor pHC139T como grupo de controle foram introduzidos na estirpe KCCM11138P produtora de putrescina por meio de eletroporação e depois foram espalhados em placas BHIS contendo 25 g/ml de canamicina para selecionar transformantes. Os transformantes foram designados KCCM 1138P/pHC139T e KCCM 11138P/pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101 respectivamente. Estes dois transformantes selecionados deste modo foram cultivados em placas CM contendo 1 mM de arginina (1% glicose, 1% polipeptona, 0,5% extrato de levedura, 0,5% extrato de carne de vaca, 0,25% de NaCl, 0,2% de ureia, 100 l de 50% de NaOH, 2% de agar, pH 6,8 por 1 L) a 30 °C durante 24 horas e depois foi inoculado uma cultura de células em circuito fechado em 25 ml de meio de titulação do quadro 2 contendo 25 g/ml de canamicina e cultivado com agitação a 200 rpm a 30 °C durante 96 horas. Todas as estirpes preparadas foram cultivadas com adição de 1 mM de arginina no meio durante a fermentação.

[070] Quadro 2

[071] Em resultado, como se mostra no quadro 3, quando foi sobreexpresso o NCgl0101, a produção de putrescina sofreu uma redução.

[072] Quadro 3

[073] Exemplo 4: Avaliação da capacidade de produção de putrescina em uma estirpe com NCgl0101 eliminado

[074] Exemplo 4-1: Preparação da estirpe com eliminação de NCgl0101 na estirpe produtora de putrescina com base em ATCC 13032

[075] A sobreexpressão de NCgl0101 aumentou o crescimento celular no meio que continha elevada concentração de putrescina, mas diminuiu a produção de putrescina de acordo com o exemplo 3. Com base neste resultado, foi examinado o efeito da eliminação de NCgl0101 na capacidade de produzir putrescina.

[076] Pormenorizadamente, com base na sequência de nucleotídeos NCgl0101 da estirpe ATCC 13032, foram construídos NCgl0101-del-F1_BamHI e NCgl0101-del-R1_SalI representados pelas SEQ ID NOs. 12 e 13 como iniciadores para se obter um fragmento recombinante homólogo da região N- terminal de NCgl0101. Foram construídos NCgl0101-del-F2_SalI e NCgl0101- del-R2_XbaI representados pelas SEQ ID NOs. 14 e 15 como iniciadores para se obter um fragmento recombinante homólogo da região C-terminal de NCgl0101.(quadro 4). Os fragmentos das regiões N-terminal e C-terminal do gene NCgl0101 foram preparados por PCR, utilizando os dois pares de iniciadores. Os produtos de PCR foram tratados com BamHI & SalI e SalI & XbaI respectivamente e clonados em um vetor pDZ tratado com BamHI & XbaI. O plasmídeo clonado foi designado pDZ-NCgl0101(K/O).

[077] Quadro 4

[078] Iniciadores para a preparação de estirpes com NCgl0101 eliminado

[079] O vetor pDZ-NCgl0101(K/O) preparado para se obter a estirpe KCCM 11138P NCgl0101 foi introduzido na estirpe KCCM 11138P por meio de eletroporação e depois foi espalhado na placa BHIS contendo 25 g/ml de canamicina. A inserção com êxito do vetor no cromossoma foi confirmada verificando se a colônia estava azul no meio sólido contendo X-gal (5-bromo-4- cloro-3-indolil--D-galactosídeo). A principal estirpe com cromossoma inserido foi cultivada com agitação em meio nutriente (30 °C, 8 horas), foi depois diluída de 10-4 a 10-10 e depois espalhada no meio sólido que continha X-gal. Enquanto a maioria das colônias surgia como colôniaa azul, uma baixa proporção de colônias surgiu como colônias brancas. Finalmente, as estirpes com o gene NCgl0101 eliminado foram selecionadas mediante duplo cruzamento com as colônias brancas e identificadas por PCR utilizando os iniciadores representados pelas SEQ ID NOs. 12 e 15. A variante identificada deste modo foi designada KCCM 11138P NCgl0101.

[080] Exemplo 4-2: Preparação da estirpe com eliminação de NCgl0101 na estirpe produtora de putrescina com base em ATCC 13869

[081] Foi utilizada a estirpe DAB12-a produtora de putrescina com base em ATCC ATCC13869 Corynebacterium glutamicum (estirpe com argF eliminado, NCgl1221 eliminado, E.coli speC introduzido e promotor arg operon- argCJBD substituído), que possui o mesmo genótipo que a estirpe produtora de putrescina KCCM11138P baseada em Corynebacterium glutamicum ATCC13032, para preparar estirpes com NCgl0101 eliminado.

[082] Pormenorizadamente, a fim de identificar o gene codificador de NCgl0101 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 e a sequência de aminoácidos da proteína expressa deste, foi executado PCR com ADN genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como modelo e um par de iniciadores, SEQ ID NOs. 12 e 15 (NCgl0101-del-F1_BamHI, NCgl0101-del-R2_XbaI). Neste caso, a reação PCR foi executada com 30 ciclos de desnaturação a 95 °C, hibridação a 53 °C durante 30 segundos e extensão a 72 °C durante 2 minutos e 30 segundos. Os produtos PCR foram separados por eletroforese e as respectivas sequências foram analisadas. Através da análise da sequência identificou-se que o gene codificador de NCgl0101 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 inclui uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO. 18 e a proteína codificada por este inclui uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 19. Quando as sequências de aminoácidos de NCgl0101 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e as de NCgl0101 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 foram comparadas revelaram uma homologia de 98%.

[083] A fim de eliminar o gene codificador de NCgl0101 de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, a região N-terminal e C-terminal do gene NCgl0101 foram amplificadas por PCR utilizando um ADN genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como modelo e dois pares de iniciadores indicados no quadro 4 da mesma forma que no exemplo <4-1>. Então, os produtos de PCR foram tratados com BamHI & SalI e SalI & XbaI respectivamente e clonados em um vetor pDZ tratado com BamHI & XbaI, construindo assim um plasmídeo pDZ-2’NCgl0101(K/O).

[084] O plasmídeo pDZ-2’NCgl0101(K/O) foi transformado em Corynebacterium glutamicum DAB12-a da mesma forma que no exemplo <4-1> e foi selecionada a estirpe em que o gene codificador de NCgl0101 foi eliminado. A variante de Corynebacterium glutamicum selecionada foi designada DAB12-a NCgl0101.

[085] Exemplo 4-3: Avaliação da capacidade de produção de putrescina em uma estirpe com NCgl0101 eliminado

[086] A fim de investigar o efeito da eliminação de NCgl0101 na capacidade para produzir putrescina na estirpe produtora de putrescina, foram comparadas as variantes de Corynebacterium glutamicum preparadas nos exemplos <4-1> e <4-2>.

[087] Em detalhe, foi avaliada a capacidade para putrescina nos dois tipos de variantes Corynebacterium glutamicum (KCCM11138P NCgl0101 e DAB12-a NCgl0101) do mesmo modo que no exemplo 3. Como se mostra no quadro 5 seguinte, constatou-se que a produção de putrescina aumentou com a eliminação.

[088] Quadro 5

[089] Tomados em conjunto, os resultados dos exemplos 3 e 4 mostram que a produção de putrescina diminuiu com a sobreexpressão do gene codificador de NCgl0101 e aumentou com a eliminação do gene na estirpe de Corynebacterium glutamicum, indicando que NCgl0101 afeta diretamente a biossíntese da putrescina.

[090] Assim, os autores da presente invenção designaram a estirpe de Corynebacterium glutamicum com uma capacidade melhorada para produzir putrescina, que foi preparada mediante eliminação do gene NCgl0101 na estirpe produtora de putrescina KCCM 11138P no exemplo anterior, como Corynebacterium glutamicum CC01-0244, que foi depositado no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (doravante abreviado para "KCCM") que é a autoridade depositária internacional ao abrigo do Tratado de Budapeste em 26 de dezembro de 2011 com o número de acesso KCCM11241P.

[091] Com base nas descrições acima, os peritos na técnica terão noção que a presente invenção pode ser conduzida de outras formas, sem alterar a ideia técnica ou as características técnicas essenciais. Desta perspectiva, os exemplos descritos anteriormente destinam-se a ilustrar a invenção em todos os aspetos, sem constituir limite do âmbito da invenção. Subentende-se que o âmbito da presente invenção compreende quaisquer alterações das formas modificadas derivadas do significado, âmbito e conceito equivalente das reivindicações seguintes e não das descrições detalhadas expostas.

Claims (5)

1. Microrganismo recombinante de Corynebacterium glutamicum com uma capacidade aumentada de produção de putrescina, caracterizado por a atividade de uma proteína, representada pela SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19, em um microrganismo do gênero Corynebacterium capaz de produzir putrescina ser modificado para enfraquecer ou remover, comparativamente com a atividade endógena do mesmo, em que é ainda introduzida neste a atividade da ornitina descarboxilase codificada por um speC, e em que a atividade da proteína é enfraquecida por eliminação de um polinucleótido que codifica a proteína que tem uma sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.

2. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a ornitina descarboxilase é representada pela SEQ ID NO: 22.

3. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as atividades de uma ou mais das enzimas do grupo constituído por ornitina carbamoiltransferase e exportador glutamato NCgl1221 serem ainda enfraquecidas em comparação com a atividade endógena do mesmo, em que a ornitina carbamoiltransferase é representada pela SEQ ID NO: 20 e exportador glutamato NCgl1221 é representado pela SEQ ID NO: 21.

4. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as atividades de uma ou mais enzimas selecionadas do grupo constituído por acetil gama glutamil fosfato redutase, acetil glutamato sintase ou ornitina acetiltransferase, acetil glutamato quinase e acetil ornitina amino transferase serem reforçadas, em que acetil gama glutamil fosfato redutase, acetil glutamato sintase ou ornitina acetiltransferase, acetil glutamato quinase e acetil ornitina amino transferase serem representadas pelas SEQ ID NOs: 23, 24, 25 e 26, respectivamente.

5. Método para a produção de putrescina caracterizado por compreender a cultura de um microrganismo modificado de Corynebacterium glutamicum com uma capacidade aumentada de produção de putrescina, em que a atividade de uma proteína, representada pela SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19, é enfraquecida ou removida em comparação com a atividade endógena do mesmo, e isolando a putrescina a partir do caldo de cultura celular obtido, em que a atividade da proteína é enfraquecida por eliminação de um polinucleótido que codifica a proteína que tem uma sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18.

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