BR112018068816B1

BR112018068816B1 - Microrganismo corynebacterium glutamicum produtor de putrescina e método para produzir putrescina utilizando o mesmo

Info

Publication number: BR112018068816B1
Application number: BR112018068816-9A
Authority: BR
Inventors: Na Hum Lee; Jae Hun Lee; Hong Xian Li; Jun Ok Moon; Hye Won Um
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-01-05
Publication date: 2022-07-26
Also published as: AU2020250273A1; AU2020250273B2; KR101871037B1; US20200002737A1; CN109072246A; MX2018010929A; KR20170107615A; RU2018134282A; CA3017944C; NZ745668A; US11124812B2; BR112018068816A2; EP3431605A1; EP3431605A4; AU2017232873A1; CA3017944A1; PH12018501981A1; CL2018002572A1; SG11201807791TA; JP2019506178A

Abstract

A presente invenção refere-se um microrganismo produtor de putrescina no qual a atividade da enzima formato desidrogenase está aumentada, e a um método para a produção de putrescina utilizando o mesmo.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001]A presente invenção refere-se a um microrganismo produtor de putrescina e a um método para a produção de putrescina utilizando o microrganismo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]Putrescina é uma matéria-prima conhecida para preparar poliamida. Até o momento, a putrescina tem sido preparada por métodos químicos utilizando compostos de petróleo, como matérias-primas, e atualmente estão sendo estudadas tecnologias para a produção de putrescina por fermentação que fazem uso de tecnologias da engenharia genética e de fermentação.

[003]Por exemplo, é conhecido um microrganismo capaz de produzir putrescina, em que a via metabólica de um microrganismo do gênero Corynebacterium foi manipulada (Publicação do Pedido de Patente KR No 20140115244, Publicação Internacional No WO 2014-148743).

[004]Enquanto isso, a enzima formato desidrogenase reduz NAD+ (ou seja, o segundo substrato) ao catalisar a oxidação de ácido fórmico e, como consequência, produz NADH e CO2. NADH é conhecido como material importante no metabolismo global de microrganismos. Isso porque quando se aumenta NADH, o poder redutor em microrganismos fica maior, o que pode ser vantajoso para a produção de um material alvo.

[005]Já se conhece um método para produzir ácido succínico e bioálcool em condições anaeróbicas que reforça NADH utilizando formato desidrogenase. O ácido succínico pode ser produzido por uma via redutiva de TCA (TCA reverso) sob condições de fermentação anaeróbica. A quantidade de NADH na via redutiva de TCA está diretamente relacionada à produção de ácido succínico, e dois moles de NADH são consumidos na via desde oxaloacetato ao ácido succínico. Na verdade, foi relatado que quando ácido succínico é produzido a partir de glucose sob condições anaeróbicas, o reforço de FDH pode resultar em um rendimento 20% maior de ácido succínico (Appl Environ Microbiol., 2012, 78(9): 3325 a 3337). Contudo, diferentemente do ácido succínico, NADH não é utilizado como substrato direto na via de biossíntese da putrescina, e não foi relatada qualquer associação entre formato desidrogenase e produção de putrescina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema técnico

[006]Os presentes inventores empreenderam esforços para aumentar a produção de putrescina em um microrganismo produtor de putrescina e, como resultado, eles confirmaram que a superexpressão de formato desidrogenase pode aumentar os níveis de NADH e ATP em um microrganismo produtor de putrescina e, assim, a produção de putrescina pode ser aumentada, pelo qual concluindo a presente invenção.

Solução técnica

[007]A presente invenção tem por objeto prover um microrganismo produtor de putrescina do gênero Corynebacterium no qual a atividade da enzima formato desidrogenase (FDH) está aumentada quando comparada àquela anterior à modificação.

[008]Outro objeto da presente invenção é prover um método para a produção de putrescina fazendo uso do microrganismo.

Efeitos vantajosos da invenção

[009]O microrganismo do gênero Corynebacterium com produtividade aumentada de putrescina da presente invenção é modificado de modo que a atividade de formato desidrogenase (Fdh) possa ser aumentada, o que leva a um aumento na produção de NADH e ATP. Como resultado, o microrganismo pode aumentar a produção de putrescina e pode ser efetivamente utilizado para produção em grande escala de putrescina.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[010]A Figura 1 mostra a imagem de um gel por SDS-PAGE ilustrando os resultados da superexpressão de CbFdh utilizando um hospedeiro Escherichia coli, no qual a Banda 1 representa o resultado da expressão de uma proteína em um lisado celular que foi expressa na cepa BL21 DE3 de E. coli a 18 °C por 24 horas; a Banda 2 representa o resultado de uma proteína solúvel expressa na cepa BL21 DE3 de E. coli a 18 °C por 24 horas; a Banda 3 representa o resultado da expressão de uma proteína em um lisado celular que foi expressa na cepa BL21 DE3 de E. coli a 30 °C por 8 horas; a Banda 4 representa o resultado de uma proteína solúvel expressa na cepa BL21 DE3 de E. coli a 30 °C por 8 horas; a Banda 5 representa o resultado da expressão de uma proteína em um lisado celular que foi expressa na cepa Rosetta DE3 de E. coli a 18 °C por 24 horas; a Banda 6 representa o resultado de uma proteína solúvel expressa na cepa Rosetta DE3 de E. coli a 18 °C por 24 horas; a Banda 7 representa o resultado da expressão de uma proteína em um lisado celular que foi expressa na cepa Rosetta DE3 de E. coli a 30 °C por 8 horas; e a Banda 8 representa o resultado de uma proteína solúvel expressa na cepa Rosetta DE3 de E. coli a 30 °C por 8 horas.

[011]A Figura 2 mostra um gráfico ilustrando a quantidade de NADH produzido ao longo do tempo. O tampão utilizado foi tampão fosfato 100 mM (pH 7,2) e o grupo controle usado foi uma amostra de reação excluindo a proteína solúvel. CbFdh constitui uma amostra de reação contendo 10% de uma proteína solúvel, que é a formato desidrogenase superexpressa a 30 °C utilizando a cepa E. coli BL21 DE3. No caso de CbFdh, confirmou-se que a quantidade de NADH (ou seja, um reagente de CbFdh) continuou a aumentar ao longo do tempo.

[012]A Figura 3 mostra um gráfico ilustrando a concentração de ácido fórmico ao longo do tempo. O grupo controle é uma cepa na qual o vetor pSCEC_CJ7 foi inserido em um microrganismo Corynebacterium glutamicum. CbFdh é um microrganismo no qual é inserido o plasmídeo pSCEC_CJ7_CbFdh capaz de expressar o gene de formato desidrogenase derivado de C. boidinii. Ácido fórmico, nas concentrações de 0 g/L, 2 g/L e 10 g/L, foi adicionado ao meio de cultura, e foram observadas as mudanças na concentração do ácido fórmico entre o grupo controle e CbFdh.

Melhor modo

[013]Para atingir os objetos acima, em um aspecto, a presente invenção provê um microrganismo produtor de putrescina do gênero Corynebacterium no qual a atividade de formato desidrogenase está aumentada.

[014]Neste relatório descritivo, o termo “formato desidrogenase” (a seguir, “Fdh”) refere-se coletivamente a uma enzima que catalisa uma reação de oxidação utilizando ácido fórmico como substrato e, pelo qual, reduz NAD+ e produz NADH e CO2.

[015]Considerando que a sequência amino de uma dada proteína que mostra atividade pode variar dependendo da espécie ou cepa do microrganismo, a origem ou sequências da Fdh não se limitam às mesmas.

[016]Especificamente, a Fdh pode ser derivada de Ceriporiopsis subvermispora, Methylobacterium extorquens, Methylosinus trichosporium, Cupriavidus oxalaticus, Candida methylica, Methylotrophic bacterium, Ancylobacter aquaticus, Komagataella pastoris, Mycobacterium vaccae, Arabidopsis thaliana, etc. e pode ser derivada de Corynebacterium glutamicum (Microbiology (2012), 158, 2428 a 2439) e que foi recentemente revelada. Especificamente, a Fdh pode ser derivada de Candida boidinii, porém, a origem da Fdh não se limita à mesma.

[017]Adicionalmente, na presente invenção, a Fdh pode incluir, entre outras, qualquer proteína que tenha a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, ou qualquer proteína que, sendo uma proteína com substancialmente a atividade da Fdh, possua uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 70%, especificamente pelo menos 80%, mais especificamente pelo menos 90%, ainda mais especificamente pelo menos 95% e, o mais específico, pelo menos 99% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[018]É evidente que quaisquer sequências de aminoácidos que seja igual àquela de SEQ ID NO: 10 e com atividade biológica substancialmente igual ou equivalente à proteína de SEQ ID NO: 10 podem ser abrangidas no âmbito da presente invenção, mesmo se a sequência de aminoácidos contiver uma deleção parcial, modificação, substituição ou adição.

[019]O polinucleotídeo codificador da Fdh da presente invenção pode incluir um polinucleotídeo que tenha pelo menos 70%, especificamente pelo menos 80%, mais especificamente pelo menos 90%, ainda mais especificamente pelo menos 95% e, o mais específico, pelo menos 99% de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, desde que o polinucleotídeo tenha uma atividade semelhante àquela da Fdh. Por exemplo, o polinucleotídeo pode incluir a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9.

[020]Adicionalmente, o polinucleotídeo codificador da Fdh da presente invenção pode ser hibridizado com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 ou com uma sonda derivada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 sob condições rigorosas, e pode ser uma forma modificada codificando a Fdh que funciona normalmente.

[021]Neste relatório descritivo, o termo “homologia” refere-se a um grau de identidade com uma dada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos e pode ser expressa em porcentagem. No presente relatório descritivo, uma sequência homóloga da dada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos com atividade igual ou semelhante com a dada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos pode ser indicada em termos de “% de homologia”. Por exemplo, a homologia pode ser confirmada por meio de um software padrão que calcula parâmetros como pontuação, identidade e similaridade, especificamente, BLAST 2.0, ou comparando sequências por experimentos de hibridização Southern sob condições definidas de rigor, e as condições rigorosas definidas para hibridização são abrangidas no âmbito da tecnologia e podem ser determinadas por um método conhecido por qualquer técnico no assunto (p. ex., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Neste relatório descritivo, o termo “condições rigorosas” refere-se a condições que se destinam a permitir a hibridização específica entre polinucleotídeos. Por exemplo, essas condições são especificamente descritas na literatura (p. ex., J. Sambrook et al., supra).

[022]Neste relatório descritivo, o termo “aumento da atividade” significa que a atividade está aumentada quando comparada à atividade endógena possuída por um microrganismo ou a sua atividade antes da modificação. O aumento da atividade pode incluir introduzir uma Fdh exógena e intensificar a atividade da Fdh endógena. Especificamente, o aumento da atividade pode significar que a atividade da Fdh está aumentada e que, com isso, a capacidade de produção de putrescina é aumentada.

[023]Especificamente, o aumento da atividade na presente invenção pode ser realizado pelos seguintes métodos: (1) aumentando o número de cópias de um polinucleotídeo codificador da enzima; (2) modificando a sequência controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo; (3) modificando a sequência do polinucleotídeo no cromossomo para intensificar a atividade da enzima; e (4) modificando a sequência do polinucleotídeo para intensificar a atividade da enzima por uma combinação dos Métodos (1) a (3), etc., porém os métodos não se limitam aos mesmos.

[024]O aumento do número de cópias de um polinucleotídeo de acordo com o Método (1) pode ser realizado em uma forma em que polinucleotídeo seja ligado operacionalmente a um vetor ou inserindo o polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira, porém, o método não se limita especialmente ao mesmo. Especificamente, o aumento do número de cópias de um polinucleotídeo pode ser realizado introduzindo, em uma célula hospedeira, um vetor, ao qual o polinucleotídeo codificador da enzima da presente invenção esteja ligado operacionalmente, que possa replicar e funcionar independentemente de um hospedeiro. Alternativamente, o aumento do número de cópias de um polinucleotídeo pode ser realizado introduzindo, em uma célula hospedeira, um vetor, ao qual o polinucleotídeo esteja ligado operacionalmente, que possa inserir o polinucleotídeo no cromossomo da célula hospedeira, aumentando, assim, o número de cópias do polinucleotídeo no cromossomo da célula hospedeira.

[025]Adicionalmente, em um aspecto, o aumento do número de cópias pode ser realizado introduzindo um polinucleotídeo exógeno ou o polinucleotídeo em uma forma modificada com códons otimizados. A introdução de uma sequência polinucleotídica exógena pode ser realizada introduzindo, em uma célula hospedeira, um polinucleotídeo exógeno codificado de uma enzima que exibe a mesma atividade ou semelhante à da enzima. O polinucleotídeo exógeno pode ser utilizado sem limitação, independentemente de sua origem ou sequência, desde que exiba uma atividade igual ou semelhante à da enzima acima. Adicionalmente, para a transcrição e tradução otimizada do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, seu códon pode ser otimizado e introduzido em uma célula hospedeira. A introdução pode ser realizada por qualquer técnico no assunto selecionando-se um método de transformação adequado, conhecido na técnica, e a expressão do polinucleotídeo introduzido na célula hospedeira pode produzir a enzima, aumentando, assim, a sua atividade.

[026]Em seguida, a modificação da sequência controle de expressão para aumentar a expressão de um polinucleotídeo de acordo com o Método (2) pode ser realizada induzindo-se uma modificação da sequência controle de expressão por deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora, ou uma combinação destas para intensificar mais a atividade da sequência controle de expressão; ou substituindo por uma sequência de ácido nucleico que tenha uma atividade muito mais forte, embora o método não se limite especialmente ao mesmo. A sequência controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência operadora, uma sequência codificadora de uma região de ligação a ribossomo, sequências que controlam o término da transcrição e tradução, etc., porém, a sequência controle de expressão não se limita especialmente ao mesmo.

[027]Especificamente, em vez do promotor original, um promotor forte heterólogo pode ser ligado upstream (sentido ascendente) de uma unidade para a expressão do polinucleotídeo, e exemplos do promotor forte podem incluir o promotor CJ7, o promotor lysCP1, o promotor EF-Tu, o promotor groEL, o promotor aceA, o promotor aceB, etc. Mais especificamente, um promotor derivado de Corynebacterium (p. ex., o promotor lysCP1: WO 2009/096689) ou o promotor CJ7 (Patente Coreana No 10-0620092 e Publicação Internacional No WO 2006/065095) pode ser ligado operacionalmente à unidade para a expressão do polinucleotídeo de modo a aumentar a taxa de expressão do polinucleotídeo codificador da enzima, porém, o promotor não se limita ao mesmo.

[028]Além do mais, a modificação da sequência do polinucleotídeo no cromossomo de acordo com o Método (3) pode ser realizada induzindo uma mutação na sequência controle de expressão por deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora da sequência do polinucleotídeo, ou uma combinação destas, ou substituindo a sequência por uma sequência de polinucleotídeo modificada para ter uma atividade mais intensificada, porém, o método não se limita especialmente ao mesmo.

[029]Finalmente, é possível realizar o Método (4), o qual está relacionado à modificação visando intensificar a atividade da enzima por uma combinação dos Métodos (1) a (3), aplicando uma combinação de pelo menos um método entre os métodos seguintes: aumentar o número de cópias do polinucleotídeo codificador da enzima, modificar a sequência controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo, modificar a sequência do polinucleotídeo no cromossomo e modificar um polinucleotídeo exógeno que exiba a atividade da enzima ou um polinucleotídeo deste modificado com códon otimizado.

[030]Neste relatório descritivo, o termo “vetor” refere-se a uma construção de DNA incluindo a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo codificador de uma proteína alvo, no qual a proteína alvo está ligada operacionalmente a uma sequência controle adequada de modo que possa ser expressa em um hospedeiro apropriado. A sequência controle incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer sequência operadora para o controle da transcrição, uma sequência codificadora de um domínio de ligação a ribossomo no mRNA adequado e uma sequência que controla o término da transcrição e tradução. O vetor, depois de ser transformado em uma célula hospedeira adequada, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode ser integrado no próprio genoma do hospedeiro.

[031]O vetor usado na presente invenção pode não se limitar especialmente, desde que seja capaz de se replicar em uma célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser utilizado. Os exemplos do vetor podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, pode-se utilizar um vetor tipo fago ou tipo cosmídeo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc.; e como vetor tipo plasmídeo, aqueles à base de pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. podem ser utilizados e, especificamente, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etc. podem ser utilizados.

[032]Em uma modalidade, um polinucleotídeo codificador de uma proteína alvo no cromossomo pode ser substituído por um polinucleotídeo modificado através de um vetor para inserção cromossômica. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica (p. ex., recombinação homóloga), mas o método não se limita ao mesmo.

[033]Neste relatório descritivo, o termo “transformação” refere-se a um processo de introduzir, em uma célula hospedeira, um vetor incluindo um polinucleotídeo codificador de uma proteína alvo, possibilitando, assim, a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. Para o polinucleotídeo transformado, não importa se o polinucleotídeo transformado é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e ali se localize ou se está localizado fora do cromossomo, desde que possa ser expresso na célula hospedeira, e ambos os casos estão incluídos. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codifiquem a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser inserido em qualquer forma desde que possa ser introduzido e expresso em uma célula hospedeira. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, o qual é uma construção gênica incluindo todos os elementos essenciais necessários para expressão independente. O cassete de expressão pode incluir convencionalmente um promotor ligado operacionalmente ao polinucleotídeo, um sinal de término de transcrição, um domínio de ligação a ribossomo e um sinal de término de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão capaz de auto-replicação. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma em que está e ser ligado operacionalmente a uma sequência essencial para sua expressão na célula hospedeira, mas o polinucleotídeo não se limita ao mesmo.

[034]Adicionalmente, neste relatório descritivo, o termo “ligado operacionalmente” refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência promotora, que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo codificador da proteína alvo da presente invenção, e a sequência gênica acima.

[035]Neste relatório descritivo, o termo “microrganismo produtor de putrescina” ou “microrganismo com produtividade de putrescina” refere-se a um microrganismo que tenha naturalmente a capacidade para produzir putrescina ou um microrganismo no qual uma capacidade para produzir putrescina seja proporcionada a sua cepa original desprovida da capacidade para produzir putrescina.

[036]O microrganismo produtor de putrescina pode ser um microrganismo com produtividade aumentada de ornitina (ou seja, uma matéria-prima para a biossíntese de putrescina), em que o microrganismo é modificado para que tenha atividades maiores de acetilglutamato sintase, que converte glutamato em N- acetilglutamato, ou ornitina acetiltransferase (ArgJ), que converte acetil ornitina em ornitina, acetilglutamato quinase (ArgB), que converte acetil glutamato em N- acetilglutamil fosfato, acetil gama glutamil fosfato redutase (ArgC), que converte acetil glutamil fosfato em N-acetilglutamato semialdeído, ou acetilornitina aminotransferase (ArgD), que converte acetilglutamato semialdeído em N- acetilornitina, quando comparadas às suas atividades endógenas, a fim de aumentar a via de biossíntese de glutamato para ornitina glutamato, mas não se limita especialmente ao mesmo.

[037]Adicionalmente, o microrganismo pode ser um microrganismo que é modificado para inativar a atividade endógena de ornitina carbamoiltransferase (ArgF), envolvida na síntese de arginina a partir de ornitina, uma proteína que exibe a atividade de um exportador de glutamato, e/ou de acetiltransferase, que acetila putrescina, e/ou é modificado para introduzir a atividade de ornitina descarboxilase (ODC).

[038]Em particular, a ornitina carbamoiltransferase (ArgF), uma proteína que exibe a atividade de um exportador de glutamato, a ornitina descarboxilase (ODC), a ornitina acetiltransferase (ArgJ), a acetilglutamato quinase (ArgB), a acetil gama glutamil fosfato redutase (ArgC) e a acetilornitina aminotransferase (ArgD) podem incluir especificamente uma sequência de aminoácidos representada por cada uma das SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, especificamente pelo menos 80%, mais especificamente pelo menos 90%, ainda mais especificamente pelo menos 95% e, o mais específico, pelo menos 99% de homologia com as sequências acima, porém, as sequências de aminoácidos não se limitam especialmente às mesmas.

[039]Adicionalmente, a acetiltransferase que acetila putrescina pode incluir especificamente uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 ou 19 o uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, especificamente pelo menos 80%, mais especificamente pelo menos 90%, ainda mais especificamente pelo menos 95% e, o mais específico, pelo menos 99% de homologia com as sequências acima, porém, as sequências de aminoácidos não se limitam especialmente às mesmas.

[040]Adicionalmente, o microrganismo pode ser aquele no qual a atividade da proteína exibindo exportação de putrescina está aumentada quando comparada à sua atividade endógena, porém, o microrganismo não se limita ao mesmo. A proteína exibindo a atividade de exportação de putrescina pode incluir uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 ou 21, e uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, especificamente pelo menos 80%, mais especificamente pelo menos 90%, ainda mais especificamente pelo menos 95% e, o mais específico, pelo menos 99% de homologia com as sequências acima, porém, as sequências de aminoácidos não se limitam especialmente às mesmas.

[041]Entretanto, o microrganismo da presente invenção pode ser um microrganismo tendo produtividade de putrescina e pode incluir microrganismos procarióticos que expressam a proteína Fdh (p. ex., os microrganismos do gênero Escherichia, Shigella, Citrobacter, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella, Erwinia, Corynebacterium, Brevibacterium, Lactobacillus, Selenomanas, Vibrio, Pseudomonas, Streptomyces, Arcanobacterium, Alcaligenes, etc.). Especificamente, o microrganismo da presente invenção pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium ou do gênero Escherichia e, mais especificamente, Corynebacterium glutamicum, porém, o microrganismo não se limita ao mesmo.

[042]Em outro aspecto, a presente invenção prove o uso do microrganismo Corynebacterium para produzir putrescina. O microrganismo Corynebacterium pode ser um microrganismo no qual a atividade de formato desidrogenase (Fdh) está aumentada em comparação àquela anterior à sua modificação, e o uso pode produzir putrescina.

[043]Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê um método para a produção de putrescina, o qual inclui (a) cultivar um microrganismo produtor de putrescina do gênero Corynebacterium no qual a atividade de formato desidrogenase (Fdh) esteja aumentada em um meio; e (b) recuperar putrescina do microrganismo ou do meio de cultura obtido na etapa (a).

[044]As explicações sobre formato desidrogenase e o microrganismo com produtividade aumentada de putrescina são iguais às descritas acima.

[045]No método acima, a cultura de um microrganismo do gênero Corynebacterium pode ser realizada por uma cultura em batelada conhecida, cultura contínua, cultura com alimentação em batelada, etc., porém, o método não se limita especialmente aos mesmos. Especificamente, para as condições de cultura, um pH adequado (p. ex., um pH entre 5 e 9, especificamente, um pH entre 6 e 8 e mais especificamente um pH de 6,8) pode ser ajustado utilizando um composto básico (p. ex., hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (p. ex., ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), porém, o ajuste do pH não se limita especialmente ao mesmo. Adicionalmente, oxigênio ou uma mistura gasosa contendo oxigênio pode ser introduzido na cultura para manter as condições aeróbicas. A temperatura da cultura pode ser mantida entre 20 °C e 45 °C, especificamente, 25 °C a 40 °C, e ser cultivada por 10 horas a 160 horas, mas as condições do cultivo não se limitam às mesmas. A putrescina produzida pode ser secretada no meio ou pode permanecer nas células.

[046]Adicionalmente, como fonte de carbono para um meio de cultura utilizado, açúcares e carboidratos (p. ex., glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (p. ex., óleo de soja, óleo de sementes de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (p. ex., ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (p. ex., glicerol e etanol), ácidos orgânicos (p. ex., ácido acético), etc. podem ser utilizados isoladamente ou em combinação, porém, a fonte de carbono não se limita aos mesmos. Como fonte de nitrogênio, compostos orgânicos contendo nitrogênio (p. ex., peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, água de maceração de milho, pó de carne de soja e ureia), compostos inorgânicos (p. ex., sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio), etc. podem ser utilizados isoladamente ou em combinação, porém, a fonte de nitrogênio não se limita aos mesmos. Como fonte de fósforo, dihidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico, sais contendo sódio, correspondentes aos mesmos, etc. podem ser utilizados isoladamente ou em combinação, porém, a fonte de fósforo não se limita aos mesmos. Adicionalmente, materiais essenciais promotores do crescimento, como sais metálicos (p. ex., sulfato de magnésio e sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas podem estar contidos no meio de cultura.

[047]Com respeito à recuperação da putrescina produzida durante o cultivo da presente invenção, os aminoácidos desejados podem ser coletados do caldo de cultura por um método adequado conhecido na técnica (p. ex., centrifugação, filtração, cromatografia por troca aniônica, cristalização, HPLC, etc.), e a putrescina pode ser recuperada do meio de cultura ou microrganismo utilizando um método adequado conhecido na técnica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[048]Abaixo, a presente invenção será descrita mais detalhadamente com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, esses Exemplos são para fins ilustrativos apenas, e o âmbito da invenção não é limitado por esses Exemplos.

Exemplo 1: Expressão de CbFdh em E. coli e avaliação da reatividade 1) Expressão do gene CbFdh em E. coli

[049]Para a superexpressão de formato desidrogenase de Candida boidinii (CbFdh) em E. coli, cultivou-se a cepa KCTC17776 de Candida boidinii e seu DNA genômico foi obtido. O gene de formato desidrogenase (CbFdh) (SEQ ID NO: 9) foi inserido no vetor pET28a utilizando primers (iniciadores) de SEQ ID NOS: 1 e 2.

[050] Especifica mente, a PCR foi realizada sob as seguintes condições: 30 ciclos, cada qual consistindo em desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto. O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, e uma banda de 1,1 kb foi eluída e purificada. Uma amostra, contendo o produto da PCR purificado e uma solução com o vetor pET28a, foi tratada com as enzimas de restrição, NcoI e XhoI, a 37 °C por 4 horas, submetida à eletroforese em gel de agarose 1,5%, os fragmentos de ácido nucleico com tamanho do CbFdh e do vetor foram cortados e os fragmentos purificados do ácido nucleico foram obtidos utilizando o kit Gel prep (GeneAll, Coreia). O fragmento de CbFdh foi ligado ao fragmento do vetor, cada qual em uma quantidade de 1 mg, utilizando a T4 ligase, e introduzidos por eletroporação na cepa DH5α de E. coli a 2.500 V. Depois da eletroporação, a cepa recuperada foi semeada em uma placa com meio LB contendo espectinomicina (50 μg/L), cultivada durante a noite a 37 °C por um dia, e as cepas resistentes foram dali selecionadas. A cepa recuperada foi semeada em uma placa com meio LB contendo canamicina (50 μg/L), cultivada durante a noite a 37 °C por um dia, e as cepas resistentes foram selecionadas. A cepa selecionada foi submetida a PCR, sob as mesmas condições que as descritas acima, utilizando o promotor T7 e os primers de SEQ ID NOS: 3 e 4 da sequência do terminador, submetida à eletroforese em gel de agarose 1,0%, e a inserção de CbFdh foi confirmada observando uma banda de 1,3 kb.

[051]A cepa, na qual a inserção de CbFdh foi confirmada, foi cultivada em meio LB (3 mL) a 37 °C por 12 horas após adição de ampicilina (50 mg/mL) ao mesmo. A cepa cultivada foi adicionada ao meio LB (50 mL), contendo um antibiótico, e cultivada a 37 °C. Quando a absorbância a 600 nm atingiu 0,8, adicionou-se IPTG 0,2 mM e a expressão foi induzida em várias condições de temperatura/tempo. A cepa cultivada foi lavada e as células foram lisadas utilizando um sonicador. Após a lise das células, a superexpressão de CbFdh (41 kDa, SEQ ID NO: 10) foi confirmada através dos resultados de eletroforese em gel de SDS-PAGE (Figura 1).

2) Avaliação da atividade do gene CbFdh expresso

[052]Para avaliação da atividade de CbFdh, usou-se tampão fosfato 100 mM (pH 7,2) como tampão da reação. A solução que foi preparada adicionando NAD+ 10 mM e formato de sódio 0,1% ao tampão foi utilizada como o grupo controle. Entretanto, o lisado das células, nas quais a superexpressão de CbFdh foi confirmada no Exemplo 1-1, foi adicionado ao grupo controle até uma concentração de 10%, e a atividade de CbFdh foi avaliada. As mudanças em valor da solução de reação foram confirmadas no comprimento de onda de 339 nm utilizando um leitor de placa de 96 cavidades. Sabe-se que a luz no comprimento de onda de 340 nm é absorvida seletivamente por NADH.

[053]Consequentemente, confirmou-se que NADH foi produzido continuamente por diversos minutos (Figura 2). Através desse Exemplo, foi avaliado que CbFdh pode ser superexpresso em E. coli e que a proteína expressa possui sua atividade única.

Exemplo 2: Preparo do microrganismo Corynebacterium expressando CbFdh

[054]A seguir, tentou-se confirmar se a capacidade para produzir putrescina pode ser aumentada intensificando-se a função de CbFdh em um microrganismo produtor de putrescina do gênero Corynebacterium. Para expressar CbFdh no microrganismo do gênero Corynebacterium e confirmar sua atividade, o promotor CJ7 (KCCM10617, Patente KR No 10-0620092) foi introduzido em uma região upstream ao códon de iniciação do gene CbFdh.

[055]Primeiramente, foi realizada PCR utilizando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como molde, juntamente com um par de primers de SEQ ID NOS: 5 e 6, de modo a obter o gene incluindo a sequência do promotor CJ7. A PCR foi realizada sob as seguintes condições: 30 ciclos, cada qual consistindo em desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos. A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1,5% e a presença de um ácido nucleico como o produto da PCR com tamanho de 400 pares de base (bp) foi confirmada. Assegurou-se um fragmento purificado de ácido nucleico do promotor CJ7 no produto obtido da PCR utilizando o kit PCR prep (GeneAll, Coreia). Uma amostra, contendo o fragmento purificado de ácido nucleico do promotor CJ7 e uma solução com o vetor pSCEC, foi tratada com as enzimas de restrição, BamHI e XbaI, a 37 °C por 4 horas, submetida à eletroforese em gel de agarose 1,5%, os fragmentos de ácido nucleico com tamanho de 400 bp foram cortados e o fragmento do promotor CJ7 e os fragmentos de ácido nucleico do vetor pSCEC foram obtidos por meio do kit Gel prep (GeneAll, Coreia). O fragmento do promotor CJ7 foi ligado ao vetor pSCEC, cada qual em uma quantidade de 1 mg, utilizando a T4 ligase, e introduzidos por eletroporação na cepa DH5α de E. coli a 2.500 V. Depois da eletroporação, a cepa recuperada foi semeada em uma placa com meio LB contendo espectinomicina (50 μg/L), cultivada durante a noite a 37 °C por um dia, e 18 tipos diferentes de cepas resistentes foram selecionados. Os 18 tipos diferentes selecionados de cepas foram submetidos à PCR de colônia utilizando os primers de SEQ ID NOS: 5 e 6, e a presença de um produto da PCR com tamanho de 400 bp foi confirmada. A partir dos resultados da PCR de colônia, o preparo de pSCEC_CJ7 contendo o promotor CJ7 foi confirmado.

[056]Nas mesmas condições utilizadas para obter o produto de PCR de CbFdh que no Exemplo 1, foi obtido o produto de PCR de CbFdh que pode ser inserido em pSCEC_CJ7, utilizando os primers de SEQ ID NOS: 7 e 8. O pSCEC_CJ7, que foi tratado com enzimas de restrição (XbaI e SalI) e o produto de PCR de CbFdh foram ligados e, a seguir, inseridos na cepa DH5α de E. coli. O pSCEC_CJ7_CbFdh foi obtido das cepas selecionadas e introduzido, por eletroporação nos microrganismos produtores de putrescina do gênero Corynebacterium (ou seja, KCCM11240P (Publicação do Pedido de Patente KR No 2013-0082478) e KCCM11401P (Publicação do Pedido de Patente KR No 20140017243)) a 2.500 V.

[057]As cepas obtidas por eletroporação foram cultivadas em uma placa com meio BHIS (Infusão cérebro e coração 37 g/L, sorbitol 91 g/L e ágar 2%) contendo espectinomicina (50 μg/L), pelo qual, colônias foram formadas. As cepas selecionadas foram cultivadas em uma incubadora com agitação em meio CM (glicose 10 g/L, polipeptona 10 g/L, extrato de leveduras 5 g/L, extrato de carne 5 g/L, NaCl 2,5 g/L e ureia 2 g/L (pH 6,8)) contendo espectinomicina (50 μg/L) e, assim, finalmente selecionadas. A cepa KCCM11240P, na qual pSCEC_CJ7_CbFdh está inserido, recebeu o nome de KCCM11240P/pSCEC_CJ7_CbFdh (CC04-0081), e a KCCM11240P, na qual pSCEC_CJ7 está inserido, foi denominada como KCCM11240P/pSCEC_CJ7. Do mesmo modo, a cepa KCCM11401P, na qual pSCEC_CJ7_CbFdh está inserido, foi denominada como KCCM11401P/pSCEC_CJ7_CbFdh, e a cepa KCCM11401P, na qual pSCEC_CJ7 está inserido, recebeu o nome de KCCM11401P/pSCEC_CJ7.

[058]Entre essas, a cepa CC04-0081 foi depositada no Centro Coreano de Culturas de Microrganismos (KCCM), o qual é uma autoridade depositória internacional segundo os termos do Tratado de Budapeste, em 08 de janeiro de 2016 (No de acesso KCCM 11798P).

Exemplo 3: Avaliação da atividade de CbFdh em microrganismo Corynebacterium

[059]Para confirmar a atividade de formato descarboxilase em um microrganismo do gênero Corynebacterium no qual CbFdh é inserido, foram analisadas as mudanças em concentração de ácido fórmico em um meio onde ácido fórmico foi adicionado (Figura 3). Ácido fórmico, nas concentrações de 0 g/L, 2 g/L e 10 g/L, foi adicionado a um caldo de cultura de uma cepa de Corynebacterium na qual a atividade de CbFdh foi intensificada e um caldo de cultura de uma cepa de Corynebacterium na qual um vetor vazio foi inserido. Como a cepa com atividade intensificada de CbFdh e a cepa com vetor vazio, KCCM11240P/pSCEC_CJ7_CbFdh e KCCM11240P/pSCEC_CJ7 foram utilizados, respectivamente.

[060]Como resultado do cultivo, confirmou-se que, no caso da cepa com um vetor vazio, o ácido fórmico permanecia no caldo de cultura quando ácido fórmico era adicionado ao caldo de cultura nas concentrações de 2 g/L e 10 g/L. Em contraste, no caso da cepa com atividade intensificada de CbFdh, o ácido fórmico adicionado a uma concentração de 2 g/L foi todo decomposto dentro de 24 horas e, adicionalmente, o ácido fórmico adicionado a uma concentração de 10 g/L não foi todo decomposto dentro de 32 horas, mas o nível de ácido fórmico continuou a diminuir. Ao se comparar com a cepa do grupo controle no momento de 32 horas, confirmou-se que aproximadamente 80% do ácido fórmico haviam convertido.

[061]A partir da análise das mudanças na quantidade de ácido fórmico, foi confirmado que a cepa com atividade intensificada de CbFdh decompõe ácido fórmico. Como resultado, confirmou-se que o CbFdh introduzido em um microrganismo do gênero Corynebacterium foi expresso normalmente e que a sua função se manteve.

Exemplo 4: Avaliação da produtividade do microrganismo Corynebacterium produtor de putrescina com atividade intensificada de CbFdh

[062]Cada um dos quatro tipos de cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum (ou seja, KCCM11240P/pSCEC_CJ7_CbFdh, KCCM11240P/pSCEC_CJ7, KCCM11401P/pSCEC_CJ7_CbFdh e KCCM11401P/pSCEC_CJ7), preparadas para a avaliação de produtividade do microrganismo Corynebacterium produtor de putrescina com atividade intensificada de CbFdh, foi espalhado em placas com meio CM (glicose (1%), polipeptona (1%), extrato de leveduras (0,5%), extrato de carne (0,5%), NaCl (0,25%), ureia (0,2%), NaOH 50% (100 μL), espectinomicina (50 μg), ágar (2%), pH 6,8, com base em 1 litro) contendo arginina (1 mM) e cultivado a 30 °C por 24 horas. Uma alça de platina de cada cepa cultivada foi inoculada em 25 mL de um meio de titulação (glicose (8%), proteína de soja (0,25%), sólidos macerados de milho (0,50%), (NH4)2SO4 (4%), KH2PO4 (0,1%), MgSO47H2O (0,05%), ureia (0,15%), biotina (100 μg), tiamina^HCl (3 mg), ácido pantotênico-cálcio (3 mg), nicotinamida (3 mg), CaCO3 5%, espectinomicina (50 μg), em base em 1 litro) e, a seguir, cultivada em uma incubadora com agitação a 30 °C e 200 rpm por 98 horas, no caso das cepas KCCM11240P/pSCEC_CJ7_CbFdh e KCCM11240P/pSCEC_CJ7, e 104 horas no caso das cepas KCCM11401P/pSCEC_CJ7_CbFdh e KCCM11401P/pSCEC_CJ7.

[063]As concentrações de putrescina produzida em cada produto da cultura foram medidas e os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1

[064]A concentração de putrescina na cultura foi analisada por HPLC. Como mostrado na Tabela 1 acima, no caso da cepa KCCM11240P/pSCEC_CJ7, não houve mudança significativa na quantidade de putrescina produzida de acordo com a presença/ausência de ácido fórmico (5 g/L). Em contraste, a cepa na qual KCCM11240P/pSCEC_CJ7_CbFdh foi introduzido mostrou um aumento na quantidade de putrescina produzida acima de 7% quando comparada à quantidade de produção pela cepa KCCM11240P/pSCEC_CJ7, independentemente da presença/ausência de ácido fórmico (5 g/L). Foi confirmado que a quantidade de putrescina produzida na cepa na qual a atividade de Fdh estava intensificada foi aumentada independentemente da presença/ausência de ácido fórmico.

[065]Adicionalmente, no caso da cepa KCCM11401P/pSCEC_CJ7, que foi avaliada no mesmo meio sem a adição de ácido fórmico, a quantidade de putrescina produzida foi 11,4 g/L e, na cepa KCCM11401P/pSCEC_CJ7 cultivada em um meio onde ácido fórmico (5 g/L) foi adicionado, a produtividade foi diminuída em aproximadamente 6% (10,7 g/L). Em contraste, no caso da cepa KCCM11401P/pSCEC_CJ7_CbFdh na qual a atividade de CbFdh estava intensificada, a mesma quantidade de putrescina (12,0 g/L) foi produzida independentemente da presença/ausência de ácido fórmico.

[066]Como resultado da análise da putrescina produzida na cepa KCCM11401P/pSCEC_CJ7_CbFdh e na cepa KCCM11401P/pSCEC_CJ7, foi confirmado que a cepa, na qual a atividade de CbFdh estava intensificada, mostrou um aumento na produção de putrescina de pelo menos 5% em comparação à cepa KCCM11401P/pSCEC_CJ7. foi confirmado que a cepa, na qual a atividade de CbFdh estava intensificada, mostrou um aumento na produtividade de putrescina independentemente da presença/ausência de ácido fórmico.

[067]Resumindo os resultados acima, foi confirmado que a cepa, na qual a enzima formato desidrogenase (CbFdh) é introduzida em um microrganismo produtor de putrescina, mostrou um aumento adicional na quantidade produzida de putrescina, e este é um efeito que aparece independentemente da adição de ácido fórmico. Assim, prevê-se que a presente invenção possibilite uma produção eficiente de putrescina em larga escala.

[068]A partir do precedente, o técnico no assunto ao qual pertence a presente invenção será capaz de entender que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem, contudo, modificar os conceitos técnicos ou as características essenciais da presente invenção. A este respeito, as modalidades exemplares aqui descritas são para fins ilustrativos apenas e não devem ser interpretadas como limitações ao âmbito da presente invenção. Pelo contrário, a presente invenção destina-se a abranger não só as modalidades exemplares, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem ser incluídas dentro do espírito e âmbito da presente invenção conforme definida pelas reivindicações anexadas.

Claims

1. Microrganismo Corynebacterium glutamicum produtor de putrescina com produtividade aumentada de putrescina quando comparado a um microrganismo Corynebacterium glutamicum não modificado, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo modificado (A) apresenta atividade de formato desidrogenase (Fdh) aumentada quando comparada à atividade de Fdh de um microrganismo glutamicum não modificado como resultado da introdução de um polinucleotídeo que codifica Fdh de Candida boidinii no microrganismo modificado, em que o polinucleotídeo que codifica o Fdh de Candida boidinii compreende a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 9 ou sequência degenerada da mesma; e (B) compreende um polinucleotídeo que codifica a ornitina descarboxilase (ODC).

2. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a Fdh consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

3. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo modificado ainda (C) apresenta atividade da putrescina acetiltransferase reduzida como resultado da inativação de um gene da putrescina acetiltransferase no microrganismo modificado.

4. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo modificado ainda (C) apresenta atividade de exportação de putrescina aumentada como resultado da introdução de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de exportação de putrescina no microrganismo modificado.

5. Método para produzir putrescina, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) cultivar o microrganismo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em um meio; e (b) recuperar putrescina do microrganismo ou do meio cultivado obtido na etapa (a).

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo é cultivado em um meio que não contém ácido fórmico.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo é cultivado em condição aeróbica.