BRPI0808939A2 - Microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido. - Google Patents

Description

“MICROORGANISMO, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM LAMIN OÁCIDO”

Campo técnico

A presente invenção se refere a um microorganismo que produz um aminoácido da família de ácido L-glutâmico e um método para

e r

produzir o aminoácido. Acido L-glutâmico é amplamente usado como uma matéria-prima de condimentos e assim por diante. L-Glutamina, L-prolina, Lomitina, L-citrulina e L-arginina são úteis para condimentos, agentes promotores de função hepática, infusões de aminoácidos, produtos farmacêuticos de aminoácidos gerais e assim por diante.

Estado da técnica anterior

Ácido L-glutâmico é produzido principalmente por fermentação utilizando bactérias produtoras de ácido L-glutâmico das assim chamadas bactérias corineformes pertencendo ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium ou Mierobaeterium ou cepas mutantes destas (veja, por exemplo, Documento de não patente I). Como métodos para produzir ácido L-glutâmico por fermentação usando outras cepas bacterianas, são conhecidos os seguintes métodos: métodos usando um microorganismo pertencendo ao gênero Baeillus, Streptomyees, Penicillium ou os semelhantes (se referir a, por exemplo, Documento de patente 1), métodos usando um microorganismo pertencendo ao gênero Pseudomonas, Arthrobaeter, Serratia, Candida ou os semelhantes (se referir a, por exemplo, Documento de patente 2), métodos usando um microorganismo pertencendo ao gênero Baeillus, Pseudomonas, Serratia ou os semelhantes, ou Aerobaeter aerogenes (atualmente referida como Enterobaeter aerogenes) (se referir a, por exemplo, Documento de patente 3), métodos usando uma cepa mutante de Escheriehia eoli (se referir a, por exemplo, Documento de patente 4), e assim por diante. Em adição, métodos para produzir ácido L-glutâmico usando um microorganismo pertencendo ao gênero Klebsiella, Erwinia, Pantoea ou Enterobacter também são descritos (se referir a, por exemplo, Documentos de patente 5 a 7).

Além disso, várias técnicas para aumentar capacidade de produzir ácido L-glutâmico acentuando enzimas biossintéticas de ácido Lglutâmico usando técnicas de DNA recombinante foram descritas. Por 5 exemplo, foi relatado para bactérias Corynebacterium ou Brevibacterium que introdução de um gene codificando citrato sintase de Eseheriehia eoli ou Corynebaeterium glutamieum foi efetiva para acentuação de capacidade de produzir ácido L-glutâmico de bactérias corineformes (se referir a, por exemplo, Documento de patente 8). Além disso, também foi relatado que 10 introdução de um gene de citrato sintase de uma bactéria corineforme em enterobactérias pertencendo ao gênero Enterobaeter, Klebsiella, Serratia, Erwinia ou Eseheriehia foi efetiva para acentuação de capacidade de produzir ácido L-glutâmico destas (se referir a, por exemplo, Documento de patente 7).

Aminoácidos da família de ácido L-glutâmico outros do que 15 ácido L-glutâmico, por exemplo, omitina e citrulinas (Documentos de não patente 2 a 4), L-glutamina (Documento de patente 9), L-prolina (Documento de patente 10), L-arginina (Documentos de patente 11 e 12), e assim por diante também são produzidos pelos métodos de fermentação mencionados acima usando microorganismos como os mesmos que ácido L-glutâmico.

Documento de patente 1: Patente Norte-Americana No.

3.220.929

Documento de patente 2: Patente Norte-Americana No.

3.563.857

Documento de patente 3: Publicação de Patente Japonesa (KOKOKU) No. 32-9393

Documento de patente 4: Patente Japonesa Não-examinada (KOKAI) No. 5-244970

Documento de patente 5: Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-106869 Documento de patente 6: Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-189169

Documento de patente 7: Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-189175

Documento de patente 8: Publicação de Patente Japonesa No.

7-121228

Documento de patente 9: Patente Japonesa Não-examinada No. 2002-300887

Documento de patente 10: Patente Européia No. 1172433 Documento de patente 11: Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-287693

Documento de patente 12: Patente Japonesa Não-examinada No. 2001-046082

Documento de não patente I: Akashi K. et al., Amino Acid Fermentation, Japão Scientific Societies Press, pp. 195-215, 1986

Documento de não patente 2: Lee, Y.-J. e Cho, J.-Y. 2006. Biotechnol. Lett 28:1849-1856

Documento de não patente 3: Choi, D.K. et al. 1996. J. Ferment. Bioeng. 81:216-219

Documento de não patente 4: Plachy, J. 1987. Kvasny Prumysl, 33:73-75

Descrição da invenção

Um objetivo da presente invenção é fornecer uma cepa microbiana que pode produzir eficientemente um aminoácido da família de ácido L-glutâmico e fornecer um método para produzir eficientemente o aminoácido usando uma tal cepa.

As técnicas mencionadas acima para acentuar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico empregam principalmente acentuar atividade de uma enzima de ciclo de TCA. Fermentação de ácido L-glutâmico que ocorre através do ciclo de TCA acompanha descarboxilação catalisada por isocitrato desidrogenase, e, portanto, uma molécula de CO2 é necessariamente liberada. Portanto, os requerentes da presente invenção consideraram que, a fim de acentuar adicionalmente a produtividade, foi necessário diminuir esta 5 descarboxilação. Os requerentes da presente invenção então conduziram pesquisas a fim de atingir o objetivo mencionado acima, e como um resultado, eles encontraram que a produtividade de ácido L-glutâmico pode ser melhorada aumentando a atividade enzimática de α-cetoglutarato sintase, que é uma enzima do ciclo TCA redutor, e adicionalmente acentuando atividade

enzimática de ferredoxina NADP+ redutase ou piruvato sintase, que produz ferredoxina reduzida e flavodoxina reduzida necessárias para a atividade enzimática de α-cetoglutarato sintase a partir daquelas do tipo oxidado, respectivamente, ou melhorando capacidade de produção de ferredoxina ou flavodoxina, e assim realizada a presente invenção.

Isto é, a presente invenção fornece os seguintes.

(1) Um microorganismo que é capaz de produzir um ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-omitina, L-citrulina e Larginina, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada para

aumentar atividade de α-cetoglutarato sintase.

(2) O microorganismo como descrito acima, caracterizado pelo fato de que a atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada aumentando expressão de um gene codificando a α-cetoglutarato sintase e/ou aumentando tradução do gene.

(3) O microorganismo como descrito acima, caracterizado pelo

fato de que a atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada aumentando número de cópias do gene codificando a α-cetoglutarato sintase ou modificando uma seqüência de controle de expressão do gene.

(4) O microorganismo como descrito acima, caracterizado pelo fato de que o gene codificando α-cetoglutarato sintase codifica um polipeptídeo selecionado a partir de (A) a (D) e um polipeptídeo selecionado a partir de (E) a (H):

(A) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:2,

(B) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos aminoácidos em SEQ ID NO:2, e constitui uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase com o polipeptídeo selecionado a partir

de (E) a (H),

(C) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:58,

(D) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou

diversos aminoácidos em SEQ ID NO:58, e constitui uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase com o polipeptídeo selecionado a partir de (E) a (H),

(E) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:4,

(F) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de

aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos aminoácidos em SEQ ID NO:4, e constitui uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase com o polipeptídeo selecionado a partir de (A) a (D),

(G) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de

aminoácidos de SEQ ID NO:60,

(H) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos aminoácidos em SEQ ID N0:60, e constitui uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase com o polipeptídeo selecionado a partir de (A) a (D).

(5) O microorganismo como descrito acima, caracterizado pelo fato de que o gene codificando α-cetoglutarato sintase compreende um DNA selecionado a partir de (a) a (d) e um DNA selecionado a partir de (e) a (h):

(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de

SEQID NO:l,

(b) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:l ou uma sonda

que pode ser preparada a partir da seqüência em condições estringentes, e codifica um polipeptídeo que constitui uma proteína tendo atividade de acetoglutarato sintase com um polipeptídeo codificado pelo DNA selecionado a partir de (e) a (h),

(c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO: 57,

(d) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:57 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência em condições estringentes, e codifica um polipeptídeo que constitui uma proteína tendo atividade de a

cetoglutarato sintase com um polipeptídeo codificado pelo DNA selecionado a partir de (e) a (h),

(e) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de

SEQ IDNO:3,

(f) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:3 ou uma sonda

que pode ser preparada a partir da seqüência em condições estringentes, e codifica um polipeptídeo que constitui uma proteína tendo atividade de acetoglutarato sintase com um polipeptídeo codificado pelo DNA selecionado a partir de (a) a (d), (g) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO:59,

(h) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:59 ou uma sonda

que pode ser preparada a partir da seqüência em condições estringentes, e codifica um polipeptídeo que constitui uma proteína tendo atividade de acetoglutarato sintase com um polipeptídeo codificado pelo DNA selecionado a partir de (a) a (d).

(6) O microorganismo como descrito acima, que foi

modificado para aumentar atividade de ferredoxina NADP+ redutase.

(7) O microorganismo como descrito acima, que foi modificado para aumentar atividade de piruvato sintase.

(8) O microorganismo como descrito acima, que foi modificado para aumentar atividade para produzir ferredoxina ou

flavodoxina.

(9) O microorganismo como descrito acima, que foi modificado para diminuir atividade de α-cetoglutarato desidrogenase.

(10) O microorganismo como descrito acima, que é uma bactéria pertencendo a um gênero selecionado a partir do grupo consistindo

dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, e Serratia.

(11) O microorganismo como descrito acima, que é uma bactéria corineforme.

(12) Um método para produzir um L-aminoácido compreendendo cultivar o microorganismo como descrito acima em um meio

para produzir e acumular um ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-omitina, L-citrulina e L-arginina no meio ou nas células do microorganismo, e coletar o L-aminoácido do meio ou das células.

(13) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é cultivado em condições aeróbicas.

(14) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato de que o meio contém íons de carbonato, íons de bicarbonato ou dióxido de carbono, e o microorganismo é cultivado em condições anaeróbicas ou microaeróbicas.

Descrição das Formas de realização preferidas A seguir, a presente invenção será explicada em detalhe.

<1> Microorganismo da presente invenção O microorganismo da presente invenção é um microorganismo que é capaz de produzir um L-aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-omitina, Lcitrulina e L-arginina e foi modificado para aumentar atividade de acetoglutarato sintase.

Na presente invenção, o "L-aminoácido" significa ácido L15 glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-omitina, L-citrulina ou L-arginina, a menos que especificamente mencionado. Estes aminoácidos são também chamados aminoácidos da família de ácido L-glutâmico o que inclui ácido Lglutâmico e aminoácidos que podem ser biossintetizados a partir de ácido Lglutâmico como um precursor.

O termo “capacidade de produzir L-aminoácido” se refere à

capacidade de produzir L-aminoácido e causar acumulação de L-aminoácido nas células do microorganismo da presente invenção ou em um meio de tal forma que L-aminoácido pode ser coletado das células ou meio quando a bactéria é cultivada no meio. O aminoácido produzido pela bactéria pode ser 25 um aminoácido ou dois ou mais aminoácidos. O microorganismo que é capaz de produzir L-aminoácido pode ser uma bactéria que inerentemente tem a capacidade, ou pode ser uma bactéria à qual é conferida a capacidade modificando a bactéria usando mutagênese ou técnicas de DNA recombinante, ou introduzindo o gene da presente invenção na bactéria. Além disso, o "aumento de atividade de a-cetoglutarato sintase" significa tanto aumento da atividade da enzima em um microorganismo tendo inerentemente α-cetoglutarato sintase, e fornecimento da atividade da enzima a um microorganismo não tendo a a-cetoglutarato sintase.

<1-1> Fornecimento de capacidade de produzir L-aminoácido

O microorganismo da presente invenção pode ser obtido a partir de um microorganismo que é capaz de produzir L-aminoácido como uma cepa parental modificando-o de forma que a atividade de a-cetoglutarato 10 sintase é aumentada. O microorganismo da presente invenção também pode ser obtido a partir de um microorganismo que foi modificado de forma que a atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada como uma cepa parental fornecendo uma capacidade de produzir L-aminoácido a esta ou acentuando uma capacidade de produzir L-aminoácido desta.

Métodos para conferir capacidade de produzir L-aminoácido a

um microorganismo e microorganismos conferidos com uma capacidade de produzir L-aminoácido, que podem ser usados para a presente invenção, serão exemplificados abaixo. Entretanto, contanto que seja escolhido um método que pode fornecer uma capacidade de produzir L-aminoácido ou um 20 microorganismo tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido, os métodos e microorganismos não são limitados a estes.

Exemplos do microorganismo usado para a presente invenção incluem bactérias, por exemplo, enterobactérias pertencendo a γproteobactérias do gênero Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, 25 Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, ou os semelhantes, assim chamadas bactérias corineformes pertencendo ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium ou Mierobaeterium, microorganismo pertencendo ao gênero Alicyclobacillus, Baeillus, Saccharomyees, ou os semelhantes. Como as γ-proteobactérias, aquelas classificadas em microorganismo de acordo com a classificação descrita em Banco de Dados de Taxonomia de NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef &id= 123 6&lvl=3&p=mapview&p=has_linkout&p=blast_url&p=genome_bla st&lin=f&keep= 1 &srchmode=l &unlock) podem ser usadas.

Exemplos de bactérias Escherichia incluem Eseheriehia eoli e assim por diante. Quando cepas Eseheriehia eoli são geradas usando uma técnica de engenharia genética, a cepa Kl 2 de E. eoli e derivados desta, a cepa MG1655 de Eseheriehia eoli (ATCC No. 47076) e cepa W3110 (ATCC 10 No. 27325) podem ser usadas. A cepa Kl2 de Eseheriehia eoli foi isolada na Stanford University em 1922. Esta cepa é uma bactéria lisogênica de fago λ e tem o fator F. Esta cepa é uma cepa altamente versátil a partir da qual recombinantes genéticos podem ser construídos por conjugação ou os semelhantes. Além disso, a seqüência genômica da cepa K12 de Eseheriehia 15 eoli já foi determinada, e a informação gênica desta também pode ser usada livremente. A cepa K12 de Eseheriehia eoli e derivados desta podem estar disponíveis a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América).

Em particular, bactérias pertencendo aos gêneros Pantoea, Erwinia e Enterobaeter são classificadas como γ-proteobactérias, e elas são taxonomicamente muito próximas umas às outras (Harada H. e Ishikawa H.

1997. J. Gen. Appl. Microbiol. 43:355-361; Kwon S.W. et al. 1997. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:1061-1067). Nos anos recentes, algumas bactérias pertencendo ao gênero Enterobaeter foram reclassificadas como Pantoea 25 agglomerans, Pantoea dispersa, ou as semelhantes, com base em análise de hibridização DNA-DNA etc. (Gavini, F. et al. 1989. Int. J. Syst. Bacteriol. 39:337-345). Além disso, algumas bactérias pertencendo ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (se referir a Mergaert, J. et al. 1993. Int. J. Syst. Bacteriol. 43:162-173). Exemplos das bactérias Enterobacter incluem, mas não são limitados a, Enterobaeter agglomerans, Enterobaeter aerogenes, e assim por diante. Especificamente, as cepas exemplificadas em Publicação de Patente Européia No. 952221 podem ser usadas. As cepas típicas de bactérias Enterobaeter incluem cepa ATCC 12287 de Enterobaeter aerogenes.

Cepas típicas das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, e Pantoea eitrea. Exemplos específicos incluem as cepas seguintes:

Pantoea ananatis AJ133 5 5 (FERM BP-6614, Publicação de Patente Européia No. 0952221)

Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, Publicação de Patente Européia No. 0952221)

Embora estas cepas sejam descritas como Enterobaeter agglomerans em Publicação de Patente Européia No. 0952221, elas são atualmente classificadas como Pantoea ananatis com base em análise de seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA etc., como descrito acima.

Exemplos das bactérias Erwinia incluem, mas não são limitados a, Erwinia amylovora e Erwinia earotovora, e exemplos das bactérias Klebsiella incluem Klebsiella plantieola. Exemplos específicos incluem as cepas seguintes:

Erwinia amylovora ATCC 15580 Erwinia earotovora ATCC 15713

Klebsiella plantieola AJl3399 (FERM BP-6600, Publicação de Patente Européia No. 955368)

Klebsiella plantieola AJ13410 (FERM BP-6617, Publicação

de Patente Européia No. 955368).

As bactérias corineformes referidas na presente invenção são um grupo de microorganismos definido em Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., p.599, 1974, e incluem bacilos aeróbicos, Gram-positivos e não álcool-ácido resistente não tendo uma capacidade de esporular, que foram até agora classificados no gênero Brevibacterium, mas unidos no gênero Corynebacterium no presente (Liebl, W. et.al. 1991. Int. J. Syst. Bacteriol. 41:255), e também incluem bactérias 5 pertencendo ao gênero Brevibacterium ou Mierobaeterium intimamente relacionadas ao gênero Corynebaeterium.

Exemplos de bactérias corineformes preferivelmente usadas para produção de um aminoácido da família de ácido L-glutâmico são listados abaixo.

Corynebaeterium acetoaeidophilum

Corynebaeterium acetoglutamieum Corynebaeterium alkanolytieum Corynebaeterium eallunae Corynebaeterium glutamieum Corynebaeterium lilium (Corynebaeterium glutamieum)

Corynebacterium melasseeola

Corynebaeterium thermoaminogenes (Corynebaeterium

effieiens)

Corynebaeterium hereulis Brevibacterium divaricatum (Corynebaeterium glutamieum)

Brevibacterium flavum (Corynebaeterium glutamieum) Brevibacterium immariophilum

Brevibacterium laetofermentum {Corynebaeterium

glutamieum)

Brevibacterium roseum

Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis

Brevibacterium ammoniagenes (Corynebaeterium

ammoniagenes) Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum

Especificamente, as cepas seguintes podem estar abrangidas:

Corynebaeterium thermoaminogenes AJl 2340 (FERM BP

1539)

Corynebaeterium glutamieum ATCC 13032 Brevibacterium flavum (Corynebaeterium glutamieum) ATCC 13826, ATCC 14067

Brevibacterium lactofermentum {Corynebaeterium

glutamieum) ATCC 13665, ATCC 13869

Brevibacterium ammoniagenes {Corynebaeterium

glutamieum) ATCC 6871

Cepas produtoras de ácido L-glutâmico Exemplos do método para fornecer capacidade de produzir

ácido L-glutâmico incluem, por exemplo, modificar o microorganismo de forma que expressão de um gene codificando uma enzima envolvida na biossíntese de ácido L-glutâmico é acentuada. Exemplos de tais enzimas que estão envolvidas em produção de ácido L-glutâmico incluem, por exemplo, 20 glutamato desidrogenase (gdh, de agora em diante esta enzima será também referida como “GDH”), glutamina sintetase {glnA), glutamato sintetase {gltAB), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase (pyc), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato quinase (pgk), 25 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase {gapA), triose fosfato isomerase {tpiA), frutose bifosfato aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfkA,pfkB), glicose fosfato isomerase {pgi), 6-fosfogluconato desidratase {edd), 2-ceto-3-deoxi-6- fosfogluconato aldolase {edd), transidrogenase, e assim por diante. Nos parênteses depois dos nomes das enzimas são mostrados os nomes dos genes. O mesmo deve se aplicar às mesmas ocasiões daqui por diante.

Métodos para modificar microorganismos de forma que expressão de um gene codificando uma enzima envolvida na biossíntese de ácido L-glutâmico é acentuada serão explicados abaixo.

O primeiro método é aumentar número de cópias de um gene

alvo. Por exemplo, número de cópias do gene alvo pode ser aumentado clonando o gene em um plasmídeo apropriado e transformando um microorganismo hospedeiro com o plasmídeo obtido. Quando seqüência de nucleotídeos do gene alvo já foi elucidada para, por exemplo, bactérias Escherichia ou bactérias Corynebaeterium, o gene pode ser obtido sintetizando iniciadores baseados na seqüência de nucleotídeos, e realizando PCR (reação em cadeia da polimerase, se referir a White, T.J. et al. 1989. Trends Genet. 5:185-189) com eles usando DNA genômico como um molde. Para glutamato desidrogenase, o gene gdhA de Eseheriehia eoli (Vallea F. et al. 1984. Gene 27:193-199) e o gene gdh de Corynebaeterium glutamieum (Bormann, E.R. et al. 1992. Mol. Microbiol. 6:317-326) são conhecidos. Para fosfoenolpiruvato carboxilase, o gene ppe de Eseheriehia eoli (Fujita, N. et al. 1984. J. Biochem. (Tokyo) 95:909-916) e o gene ppe de Corynebaeterium glutamieum (Eikmanns, B.J. et al. 1989. Mol. Gen. Genet. 218:330-339) são conhecidos.

O vetor usado para transformação pode ser um vetor autonomamente replicável em uma célula do microorganismo hospedeiro. Exemplos dos vetores autonomamente replicáveis em bactérias das Enterobaeteriaeeae incluem vetores plasmídeos pUC19, pUC18, pBR322, 25 RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (vetores pHSG e pSTV estão disponíveis a partir de Takara Bio Inc.), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (vetores pMW estão disponíveis a partir de Nippon Gene Co., Ltd.) e assim por diante. Além disso, vetores para bactérias corineformes incluem pAM330 (Patente Japonesa Não-examinada No. 58-67699), pHM1519 (Patente Japonesa Não-examinada No. 58-77895), pSFK6 (Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-262288), pVK7 (USP2003-0175912A), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (Patente Japonesa Nãoexaminada No. 58-192900), pCGl (Patente Japonesa Não-examinada No. 57- 5 134500), pCG2 (Patente Japonesa Não-examinada No. 58-35197), pCG4, pCGll (Patente Japonesa Não-examinada No. 57-183799), pHK4 (Patente Japonesa Não-examinada No. 5-7491) e assim por diante. Além disso, se um fragmento de DNA tendo uma capacidade de fazer um plasmídeo autonomamente replicável em uma bactéria corineforme é removido destes 10 vetores e inserido nos vetores mencionados acima para Escherichia eoli, eles podem ser usado como um assim chamado vetor de transferência autonomamente replicável tanto em Eseheriehia eoli como bactérias corineformes. Em adição, um DNA de fago também pode ser usado como o vetor ao invés de um plasmídeo.

Exemplos de métodos de transformação incluem tratar células

receptoras com cloreto de cálcio de forma a aumentar permeabilidade do DNA, o que foi relatado para Escherichia eoli K-12 (Mandei, M. e Higa, A. 1970. J. Mol. Biol. 53:159-162), e preparar células competentes a partir de células que estão na fase de crescimento, seguido por transformação com 20 DNA, o que foi relatado para Baeillus subtilis (Duncan, C.H. et al/ 1977. Gene 1:153-167). Alternativamente, um método de fazer células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente absorver DNA recombinante, seguido por introduzir o DNA recombinante nas células, o que é conhecido por ser aplicável a Baeillus subtilis, actinomicetos e 25 leveduras (Chang, S. e Choen, S.N. 1979. Molec. Gen. Genet. 168:111-115; Bibb, M.J. et al. 1978. Nature, 274:398-400; Hinnen, A. et al. 1978. Proc. Natl. Sci., USA, 75:1929-1933), também podem ser empregados. Em adição, transformação de microorganismos também pode ser realizada pelo método de pulso elétrico (Patente Japonesa Não-examinada No. 2-207791). Aumentar o número de cópias de um gene alvo também pode ser atingido introduzindo múltiplas cópias do gene no DNA genômico do microorganismo. Introduzir múltiplas cópias do operon no DNA genômico do microorganismo pode ser realizado por recombinação homóloga (MillerI, 5 J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory) usando uma seqüência cujas múltiplas cópias existem como alvos no DNA genômico. Seqüências tendo múltiplas cópias no DNA genômico incluem, mas não são limitados a, DNA repetitivo, ou repetições invertidas existentes na extremidade de um elemento transponível. Como descrito em 10 Patente Japonesa Não-examinada No. 2-109985, também é possível incorporar o gene alvo em um transposon, e permitir que ele seja transferido para introduzir múltiplas cópias do gene no DNA genômico. Introdução de múltiplas cópias de um gene em um cromossomo bacteriano também pode ser atingida pelo método usando fago Mu (Patente Japonesa Não-examinada No. 15 2-109985), ou os semelhantes. Transferência de um gene alvo para um cromossomo pode ser confirmada por hibridização de Southern usando uma parte do gene como uma sonda.

Embora o número de cópias não seja particularmente limitado contanto que atividade do produto de gene alvo possa ser acentuada, é desejável 2 ou mais.

O segundo método é acentuar expressão de um gene alvo substituindo uma seqüência reguladora de expressão do gene alvo tal como promotor no DNA genômico ou plasmídeo por um promotor que tem uma força apropriada. Por exemplo, o promotor thr, promotor lac, promotor trp, 25 promotor trc, promotor pL, promotor tac, etc., são conhecidos como promotores freqüentemente usados. Exemplos de promotores com alta atividade de expressão em bactérias corineformes incluem promotor do gene de fator de alongamento Tu (EF-Tu), tuf (SEQ ID NO:77), promotores de genes que codificam cochaperonina GroES-chaperonina GroEL, tiorredoxina redutase, fosfoglicerato mutase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e os semelhantes (Patente Internacional 2006/028063, Patente Européia 1697525). Exemplos de promotores fortes e métodos para avaliar a força de promotores são descritos em um artigo por Goldstein e Doi (Goldstein, Μ. A. e Doi R. H.

1995. Biotechnol. Annu. Rev. 1:105-128), etc.

Além disso, também é possível substituir diversos nucleotídeos em uma região promotora de um gene, de forma que o promotor tenha uma força apropriada, como descrito em Publicação de Patente Internacional WOOO/1893 5. Substituição da seqüência reguladora de 10 expressão pode ser realizada, por exemplo, da mesma maneira que em substituição gênica usando um plasmídeo sensível a temperatura. Exemplos de vetores tendo uma origem de replicação sensível à temperatura que podem ser usados para Escherichia eoli ou Pantoea ananatis incluem, por exemplo, plasmídeo pMAN997 descrito em Publicação Internacional W099/03988, 15 seus derivados, e assim por diante. Além disso, substituição de uma seqüência reguladora de expressão também pode ser realizada por métodos que empregam DNA linear, tal como um método chamado “integração dirigida por Red” usando recombinase Red de fago λ (Datsenko, Κ. A. e Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97:6640-6645), um método 20 combinando o método de integração dirigida por Red e o sistema de excisão de fago λ (Cho, E. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184:5200-5203) (Patente Internacional 2005/010175), e assim por diante. A modificação de uma seqüência reguladora de expressão pode ser combinada com número de cópias de gene crescente.

Além disso, sabe-se que substituição de diversos nucleotídeos

em um espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo (RBS) e o códon de início, e particularmente, as seqüências imediatamente antes do códon de início afetam profundamente a capacidade de tradução de mRNA. Tradução pode ser acentuada modificando estas seqüências. Exemplos de microorganismos modificados de forma que expressão de um gene que participa em produção de ácido L-glutâmico é acentuada pelos métodos mencionados acima incluem aqueles descritos em Publicação de Patente Internacional W099/07853, Patente Européia No.

1352966, e assim por diante.

Quando um gene alvo é introduzido no plasmídeo ou cromossomo mencionado acima, qualquer promotor pode ser usado para expressão do gene contanto que seja escolhido um promotor que funciona no microorganismo usado. O promotor pode ser o promotor inerente do gene, ou 10 um promotor modificado. Expressão de um gene também pode ser controlada escolhendo adequadamente um promotor que potencialmente funciona no microorganismo usado, ou aproximando regiões -35 e -10 de um promotor perto da seqüência consenso. Microorganismos modificados pelos métodos descritos acima de forma que expressão de gene de glutamato desidrogenase é 15 acentuada são descritos em Publicação de Patente Internacional WOOO/18935, Publicação de Patente Européia No. 1010755, e assim por diante.

O método para acentuar expressão de um gene descrito acima também pode ser aplicado ao gene codificando α-cetoglutarato sintase descrito posteriormente.

Modificação para fornecer uma capacidade de produzir ácido

L-glutâmico também pode ser realizada diminuindo ou eliminando uma atividade de uma enzima que catalisa síntese de um composto outro do que ácido L-glutâmico que se ramifica de uma via de biossíntese de ácido Lglutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem α-cetoglutarato desidrogenase, 25 isocitrato liase, acetato quinase, ácido acetohidroxi sintase, acetolactato sintase, formato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato descarboxilase, l-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase, e assim por diante. Dentre estas, é preferível diminuir ou eliminar atividade de a-cetoglutarato desidrogenase. A fim de reduzir ou eliminar as atividades das enzimas mencionadas acima, mutações para reduzir ou eliminar atividades intracelulares das enzimas podem ser introduzidas em genes das enzimas mencionadas acima por uma mutagênese usual ou técnicas de engenharia 5 genética. Exemplos da mutagênese incluem, por exemplo, raios X ou radiação ultravioleta, tratamento com um mutagênico tal como N-metil-N’nitro-N-nitrosoguanidina, e assim por diante. O sítio de gene onde a mutação é introduzida pode ser em uma região de codificação codificando uma proteína enzima ou uma região de controle de expressão tal como um 10 promotor. Exemplos das técnicas de engenharia genética incluem recombinação genética, transdução, fusão celular e assim por diante.

Diminuição ou eliminação da atividade intracelular da enzima objetiva e o grau de diminuição podem ser confirmados medindo a atividade enzimática em um extrato celular ou uma fração purificada deste obtida a 15 partir de uma cepa candidata, e comparando-os com aqueles de uma cepa tipo selvagem. Por exemplo, atividade de α-cetoglutarato desidrogenase pode ser medida pelo método de Reed e Mukherjee (Reed, LJ. e Mukherjee, B.B. 1969. Methods in Enzymology 13:55-61).

Métodos para eliminar ou reduzir atividade de a-cetoglutarato 20 desidrogenase em bactérias Escherichia são descritos em Patente Japonesa Não-examinada Nos. 5-244970, 7-203980 e assim por diante. Métodos para eliminar ou reduzir atividade de α-cetoglutarato desidrogenase em bactérias corineformes são descritos em Publicação de Patente Internacional W095/34672. Além disso, tais métodos para bactérias Enterobaeter são 25 descritos em Patente Japonesa Não-examinada No. 2001-333769.

Por exemplo, atividade de α-cetoglutarato desidrogenase pode ser reduzida modificando gene sueA (odhA) que codifica a subunidade Elo da enzima. Exemplos de cepas cuja atividade de α-cetoglutarato desidrogenase é reduzida incluem as cepas seguintes. Brevibacterium lactofermentum AS (Patente Internacional

95/34672)

Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172; Patente Francesa 9401748)

Brevibacterium flavum AJ12822 (FERM BP-4173; Patente

Francesa 9401748)

Corynebaeterium glutamieum AJl2823 (FERM BP-4174; Patente Francesa 9401748)

Corynebaeterium glutamieum ATCC 13869, OAGNDOA2- 2DOAGN2-2 (Patente Internacional 2006/028298)

E. eoli AJ12624 (FERM BP-3853)

E. eoli AJ12628 (FERM BP-3854)

E. eoli AJ12949 (FERM BP-4881)

Pantoea ananatis AJl3601 (FERM BP-7207, Patente Européia

1078989A)

Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, Patente NorteAmericana 6.331.419)

Pantoea ananatis SC17sucA (FERM BP-8646, Patente Internacional 2005/085419)

Klebsiella plantieola cepa AJ13410 (FERM BP-6617, Patente

Norte-Americana 6.197.559).

Exemplo de cepa produtora de ácido L-glutâmico de Pantoea inclui cepa AJ13355 de Pantoea ananatis. Esta cepa foi isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka, Japão como uma cepa que pode ser proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em baixo pH.

A cepa AJl3355 de Pantoea ananatis foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 19 de Fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16644. Ela foi então convertida para um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste em 11 de Janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6614. A cepa acima foi identificada como Enterobacter 5 agglomerans quando ela foi isolada e depositada como a cepa AJ13355 de Enterobacter agglomerans. Entretanto, ela foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base em sequenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA e assim por diante.

Além disso, exemplos de cepas de Pantoea ananatis produtoras de ácido L-glutâmico incluem bactérias pertencendo ao gênero Pantoea cuja atividade de α-cetoglutarato desidrogenase (aKGDH) é eliminada ou reduzida. Exemplos de tais cepas incluem a cepa AJ13356 (Patente Norte-Americana No. 6.331.419) que corresponde à cepa AJl3355 cuja subunidade El de gene de aKGDH (sueA) é eliminada, e à cepa SC17sucA (Patente Norte-Americana No. 6.596.517) que é uma cepa deficiente em gene sueA derivada da cepa SC 17 e selecionada como um mutante de baixa produção de fleuma. A cepa AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, a agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566)) em 19 de Fevereiro de

1998, recebendo um número de acesso de FERM P-16645. Então, o depósito 25 foi convertido no depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste em 11 de Janeiro de 1999, recebendo um número de acesso de FERM BP-6616. Embora as cepas AJ13355 e AJ13356 descritas acima, e a cepa AJ13601 descrita abaixo tenham sido depositadas no depósito mencionado acima como Enterobaeter agglomerans, elas são referidas como Pantoea ananatis neste relatório. A cepa SC17sucA foi designada com um número privado de AJ417, e depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary em 26 de Fevereiro de 2004, recebendo um número de acesso de FERM BP08646.

Exemplos de cepas de Pantoea ananatis produtoras de ácido L-glutâmico incluem adicionalmente as cepas

SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, AJ13601, NP106, e NAl. A cepa SC 17sucA/RSFCPG+pST VCB foi obtida introduzindo o plasmídeo RSFCPG contendo o gene de citrato sintase (gltA), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppsA) e o gene de glutamato desidrogenase (gdhA) de Escherichia eoli e o plasmídeo pSTVCB contendo o gene de citrato sintase (gltA) de Brevibacterium lactofermentum na cepa SC17sucA. A cepa AJ13601 foi selecionada a partir da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB como uma cepa mostrando resistência a alta concentração de ácido Lglutâmico em uma condição de baixo pH. A cepa NP 106 corresponde à cepa AJ13601 cujo plasmídeo RSFCPG+pSTVCB é eliminada como descrito nos exemplos. A cepa AJl 3601 foi depositada na agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1- 1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 18 de Agosto de 1999, recebendo um número de acesso FERM P-17516. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste em 6 de Julho de 2000, recebendo um número de acesso FERM BP-7207.

Como o método para fornecer capacidade de produzir ácido Lglutâmico a bactérias corineformes, um método de amplificar o gene yggB (NCgl 1221; NP_600492 [gi: 19552490]), e um método de introduzir um gene yggB variante introduzido com uma mutação na região de codificação (Patente Internacional 2006/070944) também podem ser empregados.

A capacidade de produzir ácido L-glutâmico também pode ser fornecida amplificando o gene yhfK, que é um gene de secreção de ácido Lglutâmico (Patente Internacional 2005/085419).

Exemplos de outros métodos para conferir ou acentuar

capacidade de produzir ácido L-glutâmico incluem fornecer resistência a um análogo de ácido orgânico, inibidor respiratório ou os semelhantes e fornecer sensibilidade para um inibidor de síntese de parede celular. Estes métodos incluem, por exemplo, fornecer resistência a ácido monofluoroacético (Patente Japonesa Não-examinada No. 50-113209), fornecer resistência a adenina ou resistência a timina (Patente Japonesa Não-examinada No. 57- 065198), atenuar urease (Patente Japonesa Não-examinada No. 52-038088), fornecer resistência a ácido malônico (Patente Japonesa Não-examinada No. 52-038088), fornecer resistência a benzopironas ou naftoquinonas (Patente Japonesa Não-examinada No. 56-1889), fornecer resistência a HOQNO (Patente Japonesa Não-examinada No. 56-140895), fornecer resistência a ácido α-cetomalônico (Patente Japonesa Não-examinada No. 57-2689), fornecer resistência a guanidina (Patente Japonesa Não-examinada No. 56- 35981), fornecer sensibilidade para penicilina (Patente Japonesa Nãoexaminada No. 4-88994), e assim por diante.

Exemplos de tais bactérias resistentes incluem as cepas

seguintes.

Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 50-113209)

Corynebacterium glutamicum AJl 1628 (FERM P-5736, se

referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 57-065198)

Brevibaeterium flavum AJl 1355 (FERM P-5007, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 56-1889)

Corynebaeterium glutamicum AJl 1368 (FERM P-5020, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 56-1889)

Brevibacterium flavum AJl 1217 (FERM P-4318, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 57-2689)

Corynebaeterium glutamicum AJl 1218 (FERM P-4319, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 57-2689)

Brevibacterium flavum AJl 1564 (FERM P-5472, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 56-140895)

Brevibacterium flavum AJl 1439 (FERM P-5136, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 56-35981)

Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, se

referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 04-88994)

Brevibacterium lactofermentum AJl 1426 (FERM P-5123, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 56-048890)

Corynebaeterium glutamicum AJl 1440 (FERM P-5137, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 56-048890)

Brevibacterium lactofermentum AJ11796 (FERM P-6402, se referir a Patente Japonesa Não-examinada No. 58-158192)

Bactérias produtoras de L-glutamina

Exemplos preferíveis de microorganismos tendo capacidade de 20 produzir L-glutamina são bactérias cuja atividade de glutamato desidrogenase é acentuada, bactérias cuja atividade de glutamina sintetase (glnA) é acentuada, e bactérias cujo gene de glutaminase é interrompido (Publicação de Patente Européia Nos. 1229121 e 1424398). Acentuação da atividade de glutamina sintetase também pode ser atingida interrompendo um gene 25 codificando glutamina adenililtransferase (glnE) ou um gene codificando proteína de controle PII (glnB) (Patente Européia 1229121). Além disso, uma cepa pertencendo ao gênero Escherichia e tendo uma glutamina sintetase variante na qual o resíduo de tirosina em posição 397 é substituído por outro resíduo de aminoácido também pode ser exemplificada como uma bactéria produtora de L-glutamina preferível (Publicação de Pedido de Patente NorteAmericana No. 2003/0148474).

O método para conferir ou acentuar capacidade de produzir Lglutamina inclui fornecer resistência a 6-diazo-5-oxo-norleucina (Patente 5 Japonesa Não-examinada No. 3-232497), fornecer resistência a análogo de purina e/ou resistência a sulfóxido de metionina (Patente Japonesa Nãoexaminada No. 61-202694), fornecer resistência a ácido a-cetomalônico (Patente Japonesa Não-examinada No. 56-151495), e assim por diante. Exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir 10 L-glutamina incluem as cepas seguintes.

Brevibacterium flavum AJl 1573 (FERM P-5492, veja Patente Japonesa Não-examinada No. 56-151495)

Brevibacterium flavum AJ12210 (FERM P-8123, veja Patente Japonesa Não-examinada No. 61-202694)

Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, veja Patente

Japonesa Não-examinada No. 61-202694)

Bactérias produtoras de L-prolina

Exemplos de microorganismos tendo capacidade de produzir L-prolina incluem, por exemplo, bactérias tendo γ-glutamil quinase cuja 20 inibição por retroalimentação por L-prolina é dessensibilizada e bactérias cujo sistema de decomposição de L-prolina é atenuado. O método para modificar bactérias usando um DNA codificando γ-glutamil quinase cuja inibição por retroalimentação por L-prolina é dessensibilizada é descrito em Dandekar e Uratsu (J. Bacteriol., 170, 12:5943-5945, 1988). Além disso, exemplos dos 25 métodos para obter uma bactéria cujo sistema de decomposição de L-prolina é atenuado incluem, por exemplo, introduzir uma mutação em um gene de prolina desidrogenase para reduzir a atividade enzimática. Exemplos de bactérias tendo capacidade de produzir L-prolina incluem a cepa NRRL B12403 e a cepa NRRL B-12404 de Eseheriehia eoli (Patente Britânica No. 2075056), cepa VKPM B-8012 de Escherichia eoli (Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana No. 2002/0058315), e cepas tendo o plasmídeo mutante descrito em Patente Alemã No. 3127361 ou o plasmídeo mutante descrito na referência de Bloom F.R. et al. (The 15th Miami Winter 5 Symposium, 1983, p.34).

Além disso, microorganismos preferíveis tendo capacidade de produzir L-prolina também incluem a cepa 702 de Eseheriehia eoli (VKPMB8011), que é resistente a 3,4-dehidroxiprolina e azetidina-2-carboxilato, cepa 702ilvA (cepa VKPMB-8012), que é uma cepa deficiente em ilvA da cepa 10 702, cepas de E. eoli cuja atividade de proteína codificada pelo gene b2682, b2683, bl242 ou b3434 é acentuada (Patente Japonesa Não-examinada No. 2002-300874), e assim por diante.

Bactérias produtoras de L-arginina

Exemplos de bactérias que produzem L-arginina incluem, mas 15 não são limitados a, mutantes de E. eoli tendo resistência a a-metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, hidroxamato de arginina, S-(2-aminoetil)cisteína, a-metilserina, β-2-tienilalanina, ou sulfaguanidina (Patente Japonesa 56-106598A). E. eoli cepa 237 (Pedido de Patente Russa No. 2000117677) abrigando N-acetilglutamato sintetase mutante que é dessensibilizada para 20 inibição por retroalimentação por L-arginina e tem alta atividade enzimática também é uma cepa produtora de L-arginina preferível. A cepa 237 foi depositada na VKPM (a Russian National Collection of Industrial Microorganisms (Rússia, 117545 Moscou, I Dorozhny proezd, 1) em 10 de Abril de 2000 sob o número de acesso VKPM B-7925. Ela foi então 25 convertida para um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste em 18 de Maio 2001. A cepa 382 de E. eoli (Patente Japonesa 2002-017342A) derivada da cepa 237, que tem atividade aumentada para utilizar ácido acético também pode ser usada. Eseheriehia eoli cepa 382 foi depositada na VKPM (a Russian National Collection of Industrial Microorganisms, (Rússia, 117545 Moscou, I Dorozhny proezd, 1) em 10 de Abril de 2000 sob o número de acesso VKPM B-7926.

Exemplos de bactérias às quais é fornecida capacidade de produzir L-arginina incluem cepas nas quais expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-arginina é acentuada. Exemplos das enzimas biossintéticas de L-arginina incluem N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), omitina acetil transferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilomitina transaminase (argD), acetilomitina deacetilase (argE), omitina carbamoil transferase (argF), ácido argininosuccínico sintetase (argG), ácido argininosuccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB). Como para N-acetilglutamato sintase (argA), é mais preferível usar um gene mutante codificando a enzima cuja seqüência de aminoácidos correspondendo a posições 15 a 19 de enzima tipo selvagem é substituída e inibição por retroalimentação por L-arginina é dessensibilizada (Publicação de Patente Européia No. 11703 61).

Bactérias corineformes produtoras de L-arginina não são especificamente limitadas contanto que a bactéria seja capaz de produzir Larginina. Exemplos de tais bactérias corineformes incluem, mas não são limitados a, cepas tipo selvagem de bactérias corineformes; uma bactéria que 20 é resistente a um fármaco tal como uma droga sulfa, 2-tiazolalanina, ácido aamino-p-hidroxivalérico ou os semelhantes; uma bactéria que tem auxotrofia para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina ou Ltriptofano em adição a resistência a 2-tiazolalanina (Patente Japonesa Nãoexaminada No. 54-44096); uma bactéria que é resistente a ácido 25 cetomalônico, ácido fluoromalônico ou ácido monofluoroacético (Patente Japonesa Não-examinada No. 57-18989); uma bactéria que é resistente a argininol (Patente Japonesa Não-examinada No. 62-24075); uma bactéria que é resistente a X-guanidina (X representa um derivado de ácido graxo ou cadeia alifática, Patente Japonesa Não-examinada No. 2-186995), e os semelhantes.

Adicionalmente, bactérias corineformes produtoras de Larginina podem ser criadas para serem resistentes a 5-azauracil, 6-azauracil, 2-tiouracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-azacitosina, 6-azacitosina e assim 5 por diante; para serem resistentes a hidroxamato de arginina e 2-tiouracil; para serem resistentes a hidroxamato de arginina e 6-azauracil (Patente Japonesa Não-examinada No. 49-126819); para serem resistentes a um análogo de histidina ou análogo de triptofano (Patente Japonesa Nãoexaminada No. 52-114092); para serem auxotróficas para pelo menos um de 10 metionina, histidina, treonina, prolina, isoleucina, lisina, adenina, guanina ou uracil (ou precursor de uracil) (Patente Japonesa Não-examinada No. 52- 99289); para serem resistentes a hidroxamato de arginina (Publicação de Patente Japonesa No. 51-6754); para serem auxotróficas para ácido succínico ou resistentes a um análogo de base de ácido nucléico (Patente Japonesa Não15 examinada No. 58-9692); para serem incapazes de metabolizar arginina e para serem resistentes a um antagonista de arginina e canavanina e para serem auxotróficas para lisina (Patente Japonesa Não-examinada No. 52-8729); para serem resistentes a arginina, hidroxamato de arginina, homoarginina, Darginina e canavanina, ou resistentes a hidroxamato de arginina e 6-azauracil 20 (Patente Japonesa Não-examinada No. 53-143288); para serem resistentes a canavanina (Patente Japonesa Não-examinada No. 53-3586) e assim por diante.

Exemplos de bactérias corineformes produtoras de L-arginina incluem as cepas seguintes:

Brevibacterium flavum AJl 1169 (FERM BP-6892)

Brevibaeterium lactofermentum AJl 2092 (FERM BP-6906) Brevibaeterium flavum AJl 1336 (FERM BP-6893) Brevibacteriumflavum AJl 1345 (FERM BP-6894) Brevibacterium lactofermentum AJ12430 (FERM BP-2228) Além disso, a cepa deficiente no repressor de arginina, ArgR (Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana No. 2002/0045223) ou a cepa cuja atividade intracelular de glutamina sintetase é aumentada (Pedido de Patente Norte-Americana No. 2005/0014236) pode ser usado.

As vias biossintéticas de L-citrulina e L-omitina são comuns

àquelas de L-arginina, e capacidades de produzi-las podem ser fornecidas aumentando atividades enzimáticas de N-acetilglutamato sintase (argA), Nacetilglutamil fosfato redutase (argC), omitina acetiltransferase (argJ), Nacetilglutamato quinase (argB), acetilomitina transaminase (argD) ou 10 acetilomitina deacetilase (argE) (Publicação de Patente Internacional No. 2006-35831).

A parte de um gene que codifica uma enzima de biossíntese inerente, um gene que está envolvido em absorção de açúcar, metabolismo de açúcar (sistema glicolítico), e metabolismo energético pode ser acentuado nas bactérias produtoras de L-aminoácido usadas na presente invenção.

Exemplos dos genes envolvidos em metabolismo de açúcar incluem genes que codificam enzimas ou proteínas glicolíticas que absorvem açúcar, tal como genes codificando glicose-6-fosfato isomerase (pgi; Patente Internacional 01/02542), fosfoenolpiruvato sintase (pps; Patente Européia 20 877090), fosfoglicomutase (pgm\ Patente Internacional 03/04598), frutosebifosfato aldolase (fba\ Patente Internacional 03/04664), piruvato quinase (pykF; Patente Internacional 03/008609), transaldolase (talB; Patente Internacional 03/008611), fumarase (fum; Patente Internacional 01/02545), fosfoenolpiruvato sintase (pps; Patente Européia 877090), os sistemas de 25 absorção de sacarose não PTS (csc; Patente Européia 149911), e genes de assimilação de sacarose (operon scrAB; Patente Internacional 90/04636).

Exemplos dos genes envolvidos em metabolismo energético incluem o gene de transidrogenase (pntAB; Patente Norte-Americana No. 5.830.716) e o gene de citocromo tipo bo oxidase (cyoABCD', Patente Européia 1070376).

Além disso, quando glicerol é usado como uma fonte de carbono, a fim de melhorar a assimilabilidade de glicerol, expressão do gene glpR pode ser atenuada (Patente Européia 1715056), ou expressão dos genes 5 do metabolismo de glicerol tal como genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR,fsa e talC pode ser acentuada (Patente Européia 1715055A).

<l-2> Acentuação de atividade de α-cetoglutarato sintase O microorganismo da presente invenção é um microorganismo que tem capacidade de produzir ácido L-glutâmico e que foi modificado para aumentar a atividade de α-cetoglutarato sintase. A frase “modificado para aumentar a atividade de α-cetoglutarato sintase” significa que a bactéria foi modificada de uma maneira tal que a atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada se comparada com uma cepa parental, por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou uma cepa não modificada. Como descrito acima, quando um microorganismo não tem inerentemente atividade de α-cetoglutarato sintase, um microorganismo modificado de forma que ele tenha a atividade enzimática mostra atividade de α-cetoglutarato sintase aumentada se comparado com uma cepa não modificada.

A "α-cetoglutarato sintase" referida na presente invenção

significa uma enzima catalisando uma reação gerando ácido α-cetoglutárico a partir de succinil-CoA e CO2 na presença de um doador de elétrons, por exemplo, ferredoxina (EC 1.2.7.3) como descrito acima, a-cetoglutarato sintase também pode ser referida como α-cetoglutarato oxidorredutase, a25 cetoglutarato ferredoxina oxidorredutase, 2-oxoglutarato sintase, 2- oxoglutarato oxidorredutase ou 2-oxoglutarato ferredoxina oxidorredutase. Como o doador de elétrons, ferredoxina ou flavodoxina podem ser usadas.

Cepas parentais a serem sujeitas a tal modificação daquela atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada podem ser cepas que inerentemente têm um gene endógeno codificando α-cetoglutarato sintase. Alternativamente, as cepas parentais podem ser cepas que não têm inerentemente um gene codificando α-cetoglutarato sintase, mas que podem ser fornecidas com a atividade da enzima por introdução de um gene de a5 cetoglutarato sintase e que mostra capacidade de produzir ácido L-glutâmico melhorada.

A cepa parental pode ser modificada primeiro de forma que a atividade enzimática de α-cetoglutarato sintase é aumentada, e então fornecida com capacidade de produzir ácido L-glutâmico. Alternativamente, 10 a cepa parental pode ser fornecida primeiro com capacidade de produzir ácido L-glutâmico, e então modificada de forma que a atividade enzimática de acetoglutarato sintase é aumentada. A acentuação da atividade de acetoglutarato sintase pode ser atingida acentuando expressão do gene descrito acima. Isto é, a acentuação pode ser baseada em acentuação de expressão de 15 um gene de α-cetoglutarato sintase endógeno por modificação de uma região de controle de expressão tal como modificação de um promotor ou os semelhantes, ou acentuação de expressão de um gene de a-cetoglutarato sintase exógeno por introdução de um plasmídeo contendo gene de acetoglutarato sintase ou os semelhantes.

Acentuação de atividade de α-cetoglutarato sintase pode ser

confirmada preparando soluções de enzima bruta do microorganismo antes da modificação e do microorganismo depois da modificação, e comparando atividade de α-cetoglutarato sintase destes. A atividade de a-cetoglutarato sintase pode ser medida, por exemplo, pelo método de Yun et al. (Yun, N.R. 25 et al. 2001. Biochem. Biophy. Res. Commum. 282:589-594). Por exemplo, a atividade pode ser medida usando o metilviologênio oxidado como um aceptor de elétrons, CoA e uma solução de enzima bruta e medindo espectroscopicamente a quantidade do metilviologênio reduzido que é aumentada pela reação de descarboxilação de ácido α-cetoglutárico mediante adição de ácido cetoglutárico. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como uma atividade de reduzir 1 μπιοί de metilviologênio por 1 minuto. Grau da acentuação de atividade de α-cetoglutarato sintase não é particularmente limitado contanto que ele aumente se comparado com aquele 5 de uma cepa tipo selvagem. Entretanto, quando a cepa parental tem atividade de α-cetoglutarato sintase, ele desejavelmente aumenta, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, preferivelmente 2 vezes ou mais, mais preferivelmente 3 vezes ou mais, se comparado com aquele da cepa parental. Quando a cepa parental não tem atividade de α-cetoglutarato sintase, embora seja suficiente que a10 cetoglutarato sintase seja produzida pela introdução do gene de acetoglutarato sintase, a modificação é preferivelmente realizada de uma forma tal que a atividade enzimática pode ser medida, e a atividade é preferivelmente 0,001 U ou mais, mais preferivelmente 0,005 U ou mais, ainda mais preferivelmente 0,01 U ou mais, por mg da proteína celular.

Como o gene codificando α-cetoglutarato sintase, genes de a

cetoglutarato sintase de bactérias Chlorobium, Desulfobacter, Aquifex, Hydrogenobaeter, Thermoproteus ou Pyrobaeulum, que são bactérias tendo o ciclo TCA redutor ou homólogos destes podem ser usados. Exemplos específicos incluem genes de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepídum, 20 Hydrogenobaeter thermophilus, e assim por diante. Um gene que é estimado como sendo um gene de α-cetoglutarato sintase está presente em Blastopirellula marina pertencendo à Ordem Planctomycetes, que é uma bactéria marinha (Schlesner, H. et al. 2004. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1567-1580). Além disso, foi encontrado que os genomas de Sulfurimonas 25 denitrifiean pertencendo a e-proteobactérias, que são bactérias oxidantes de enxofre (Brinkhoff, T. et al. 1999. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:875-879), bactérias produtoras de metano tal como Methanococcus maripaludis pertencendo a arehaebaeteria (Jones, W. J. et al. Arch. Microbiol. 1983. 135: 91-97), e os semelhantes incluem genes com homologias altas com o gene de α-cetoglutarato sintase, e é possível selecionar o gene de a-cetoglutarato sintase a partir dos mesmos.

α-cetoglutarato sintase é conhecida por funcionar como um complexo de dois ou mais peptídeos. A seqüência genômica de Chlorobium 5 tepidum já foi determinada (No. de Acesso de GenBank NC_002932, Eisen, J.A. et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:9509-9514), e exemplos do gene de α-cetoglutarato sintase incluem as seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1 e 3. SEQ ID NO:l é a seqüência de nucleotídeos do gene de subunidade α de α-cetoglutarato sintase, que se localiza nos números de 10 nucleotídeos 170164 a 172047 (fita complementar) da seqüência genômica de Chlorobium tepidum, e SEQ ID NO:3 é a seqüência de nucleotídeos de gene de subunidade β, que se localiza nos números de nucleotídeos 169132 a 170160 (fita complementar) da seqüência genômica de Chlorobium tepidum. SEQ ID NO:2 é a seqüência de aminoácidos de subunidade α de a15 cetoglutarato sintase (No. de Acesso de GenBank NP_661069), e SEQ ID NO:4 é a seqüência de aminoácidos da subunidade β da mesma (No. de Acesso de GenBank NP_661068). A seqüência genômica de Blastopirellula marina (No. de Acesso de GenBank AANZ00000000) foi determinada (Fuchsman, C. A., e Rocap, G. Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72: 6841- 20 6844), e exemplos do gene de α-cetoglutarato sintase incluem as seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 57 e 59. SEQ ID NO:57 mostra uma seqüência de nucleotídeos de um gene de subunidade α de acetoglutarato sintase se localizando nos números de nucleotídeos 3180 a 5045 (fita complementar) da seqüência genômica de Blastopirellula marina, e SEQ 25 ID NO:59 mostra uma seqüência de nucleotídeos de um gene de subunidade β se localizando nos números de nucleotídeos 2089 a 3108 (fita complementar) da seqüência genômica de Blastopirellula marina. SEQ ID NO:58 é a seqüência de aminoácidos da subunidade α de α-cetoglutarato sintase, e SEQ ID N0:60 é a seqüência de aminoácidos da subunidade β de a-cetoglutarato sintase.

O gene de α-cetoglutarato sintase de Hydrogenobacter thermophilus (No. de Acesso de GenBankAB046568) já foi clonado (Yun, N.R. et al. 2001. Biochem. Biophy. Res. Commum. 282:589-594), e a 5 subunidade α (No. de Acesso de GenBank BAB21494) e a subunidade β (No. de Acesso de GenBank BAB21495) foram identificadas. Exemplos do gene incluem adicionalmente o gene de α-cetoglutarato sintase consistindo de quatro genes, HP0588, HP0589, HP0590 e HP0591, se localizando nos números de nucleotídeos de 620219 a 623070 da seqüência genômica de 10 Helieobacter pylori (No. de Acesso de GenBank NC_00091), e o gene de acetoglutarato sintase consistindo de dois genes, SS02815 e SS02816, se localizando nos números de nucleotídeos de 2575303 a 2578105 da seqüência genômica de Sulfolobus solfatarieus (No. de Acesso de GenBank NC_002754). Além disso, o gene de α-cetoglutarato sintase pode ser aqueles 15 clonados a partir de bactérias Chlorobium, Desulfobaeter, Aquifex, Hydrogenobaeter, Thermoproteus, Pyrobaeulum, Sulfurimonas, Methanoeoeeus ou as semelhantes com base em homologia com os genes exemplificados acima.

É preferível que os genes de subunidade α e subunidade β da 20 α-cetoglutarato sintase sejam aqueles derivados do mesmo organismo. Entretanto, cada um dos genes pode ser derivado de organismo diferente contanto que uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase possa ser constituída. Combinações preferíveis incluem subunidade α consistindo da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou sua variante conservativa e 25 subunidade β consistindo da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ou sua variante conservativa, e subunidade α consistindo da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:58 ou sua variante conservativa e subunidade β consistindo da seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:60 ou sua variante conservativa. Entretanto, as combinações não são limitadas a estas. A frase “variante conservativa” será explicada abaixo.

O microorganismo da presente invenção pode ser um microorganismo que foi modificado para aumentar atividade para reciclar doador de elétrons requerida para a atividade de α-cetoglutarato sintase do 5 tipo oxidado para o tipo reduzido se comparada com a cepa parental, por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou uma cepa não modificada, através do que a atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada. Exemplos da atividade para reciclar o tipo oxidado do doador de elétrons para o tipo reduzido incluem as atividades de ferredoxina NADP+ redutase e piruvato 10 sintase. Além disso, o microorganismo da presente invenção pode ser um microorganismo que foi modificado de forma que expressão do gene de acetoglutarato sintase é aumentada em adição a isto a atividade de reciclagem de doador de elétrons é acentuada. A cepa parental mencionada acima pode ser uma cepa que inerentemente tem um gene endógeno codificando a 15 atividade de reciclagem de doador de elétrons. Alternativamente, a cepa parental pode ser uma cepa que não tem inerentemente um gene codificando a atividade de reciclagem de doador de elétrons, mas que pode ser fornecida com a atividade por introdução de um gene codificando a atividade, e que mostra capacidade de produzir ácido L-glutâmico melhorada.

A "ferredoxina NADP+ redutase" significa uma enzima que

reversivelmente catalisa a reação seguinte (EC 1.18.1.2).

Ferredoxina reduzida + NADP+ —> Ferredoxina oxidada + NADPH + H+

Esta reação é uma reação reversível, e pode gerar a ferredoxina reduzida na presença de NADPH e da ferredoxina oxidada. Ferredoxina é substituível por flavodoxina, e a enzima tem uma função equivalente àquela 25 da enzima designada flavodoxina NADP+ redutase. Existência de ferredoxina NADP+ redutase é confirmada em uma ampla variedade de organismos variando de microorganismos a organismos superiores (se referir a Carrillo, N. e Ceccarelli, E.A. 2004. Eur. J. Biochem. 270:1900-1915; Ceccarelli, E.A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698:155-165), e algumas das enzimas também são denominadas ferredoxina NADP+ oxidorredutase ou NADPHferredoxina oxidorredutase.

Acentuação da atividade de ferredoxina NADP+ redutase pode 5 ser confirmada preparando soluções de enzima bruta do microorganismo antes da modificação e do microorganismo depois da modificação, e comparando a atividade de ferredoxina NADP+ redutase destes. A atividade de ferredoxina NADP+ redutase pode ser medida, por exemplo, pelo método de Blaschkowski et al. (Blaschkowski, H.P. et al. 1989. Eur. J. Biochem., 10 123:563-569). Por exemplo, a atividade pode ser medida usando ferredoxina como um substrato para medir espectroscopicamente diminuição da quantidade de NADPH. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como atividade para oxidar 1 μηιοί de NADPH por 1 minuto. Quando a cepa parental tem a atividade de ferredoxina NADP+ redutase, e a atividade da cepa 15 parental é suficientemente alta, não é necessário acentuar a atividade. Entretanto, a atividade enzimática é desejavelmente aumentada preferivelmente 1,5 vezes ou mais, mais preferivelmente 2 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 3 vezes ou mais, comparada com aquela da cepa parental.

Genes codificando a ferredoxina NADP+ redutase são

encontrados em muitas espécies biológicas, e qualquer deles mostrando a atividade na cepa produtora de L-aminoácido objetiva pode ser usado. Como para Escherichia eoli, o gene fpr foi identificado como um gene para flavodoxina NADP+ redutase (Bianchi, V. et al. 1993. 175:1590-1595). Além 25 disso, sabe-se que, em Pseudomonas putida, um gene de NADPHputidaredoxina redutase e um gene de putidaredoxina existem como um operon (Koga, H. et al. 1989. J. Biochem. (Tokyo), 106:831-836).

Exemplos do gene de flavodoxina NADP+ redutase de Escheriehia eoli incluem o gene fpr que se localiza nos números de nucleotídeos 4111749 a 4112495 (fita complementar) da seqüência genômica da cepa K-12 de Escherichia eoli (No. de Acesso de GenBank U00096) e que tem a seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:5. A seqüência de aminoácidos de Fpr é mostrada em SEQ ID NO:6 (No. de Acesso de 5 GenBank AAC76906). Além disso, um gene de ferredoxina NADP+ redutase (No. de Acesso de GenBank BA00036) também é encontrado nos números de nucleotídeos 2526234 a 2527211 da seqüência genômica de Corynebaeterium glutamicum (No. de Acesso de GenBank BAB99777).

A "piruvato sintase" significa uma enzima que reversivelmente catalisa a reação seguinte que gera ácido pirúvico a partir de acetil-CoA e CO2 (EC 1.2.7.1).

Ferredoxina reduzida + Acetil-CoA + CO2 —» Ferredoxina oxidada f

+ Acido pirúvico

Esta reação é uma reação reversível, e pode gerar a ferredoxina reduzida na presença de ácido pirúvico e ferredoxina oxidada. Esta enzima também pode ser designada piruvato oxidorredutase, piruvato ferredoxina 15 (flavodoxina) redutase ou piruvato ferredoxina oxidorredutase. Combinando esta atividade enzimática com atividade de α-cetoglutarato sintase, se toma possível regenerar a ferredoxina reduzida consumida por atividade de acetoglutarato sintase pela atividade da reação reversa de piruvato sintase.

Acentuação da atividade de piruvato sintase pode ser 20 confirmada preparando soluções de enzima bruta do microorganismo antes da acentuação e do microorganismo depois da acentuação, e comparando a atividade de piruvato sintase destes. A atividade de piruvato sintase pode ser medida, por exemplo, pelo método de Yoon et al. (Yoon, K.S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167:275-279, 1997). O princípio de medida é o mesmo que 25 aquele da medida de atividade de α-cetoglutarato sintase mencionada acima, e a atividade pode ser medida, por exemplo, usando ácido pirúvico como um substrato e medindo espectroscopicamente a quantidade do metilviologênio que é reduzido durante a reação de descarboxilação de ácido pirúvico. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como uma atividade de reduzir

1 μηιοί de metilviologênio por 1 minuto. Quando a cepa parental tem a atividade de piruvato sintase, a atividade desejavelmente aumenta, por 5 exemplo, 1,5 vezes ou mais, preferivelmente 2 vezes ou mais, mais preferivelmente 3 vezes ou mais, comparada com aquela da cepa parental. Quando a cepa parental não tem a atividade de piruvato sintase, embora seja suficiente que piruvato sintase seja produzida pela introdução do gene de piruvato sintase, a atividade é preferivelmente acentuada de uma forma tal 10 que a atividade enzimática pode ser medida, e a atividade é preferivelmente 0,001 U/mg ou maior, mais preferivelmente 0,005 U/mg ou maior, ainda mais preferivelmente 0,01 U/mg ou maior.

Como o gene codificando a piruvato sintase, é possível usar aqueles genes de bactérias tendo o ciclo TCA redutor tal como os genes de piruvato sintase de Chlorobium tepidum e Hydrogenobaeter thermophilus.

Exemplos específicos incluem um gene tendo a seqüência de nucleotídeos se localizando nos números de nucleotídeos 1534432 a 1537989 da seqüência genômica de Chlorobium tepidum (No. de Acesso de GenBank NC_002932) e mostrada em SEQ ID NO:7, como o gene de piruvato sintase 20 de Chlorobium tepidum. A seqüência de aminoácidos codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO:8 (No. de Acesso de GenBank AAC76906). Além disso, sabe-se que a piruvato sintase de Hydrogenobacter thermophilus forma um complexo de quatro subunidades, subunidade δ (No. de Acesso de GenBank BAA95604), subunidade α (No. de Acesso de GenBank 25 BAA95605), subunidade β (No. de Acesso de GenBank BAA95606) e subunidade γ (No. de Acesso de GenBank BAA95607) (Ikeda, T. et al. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340:76-82). Exemplos do gene incluem adicionalmente o gene de piruvato sintase consistindo de quatro genes, HPl 108, HPl 109, HPlllO e HPl 111, se localizando nos números de nucleotídeos de 1170138 a 1173296 da seqüência genômica de Helicobacter pylori (No. de Acesso de GenBank NC 000915), e o gene de piruvato sintase consistindo de quatro genes, SS01208, SS07412, SS01207 e SS01206, identificados pelos números de nucleotídeos de 1047593 a 1044711 na 5 seqüência genômica de Sulfolobus solfatarieus (No. de Acesso de GenBank NC 002754). Além disso, o gene de piruvato sintase pode ser aqueles clonados de bactérias Chlorobium, Desulfobacter, Aquifex, Hydrogenobaeter, Thermoproteus, Pyrobaeulum ou as semelhantes com base em homologia com os genes exemplificados acima.

Para a atividade de α-cetoglutarato sintase, presença de

ferredoxina ou flavodoxina como um doador de elétrons é requerida. Portanto, o microorganismo da presente invenção pode ser um microorganismo que foi modificado de forma que a atividade de acetoglutarato sintase é aumentada modificando de forma que a capacidade de 15 produzir ferredoxina ou flavodoxina é melhorada. Além disso, em adição a modificar de forma que a atividade de α-cetoglutarato sintase, da flavodoxina NADP+ redutase ou piruvato sintase seja acentuada, ela também pode ser modificada de forma que a capacidade de produzir ferredoxina ou flavodoxina seja aumentada.

Na presente invenção, a "ferredoxina" se refere a uma proteína

contendo átomos de ferro não-heme (Fe) e átomos de enxofre, ligados com um grupo ferro-enxofre chamado de grupo 4Fe-4S, 3Fe-4S ou 2Fe-2S, e funcionando como um carreador de um elétron. A "flavodoxina" se refere a uma proteína contendo FMN (mononucleotídeo de flavina) como um grupo 25 prostético e funcionando como um carreador de um ou dois elétrons. Ferredoxina e flavodoxina são descritas na referência de McLean et al. (McLean K.J. et al., Biochem. Soc. Trans. 33:796-801, 2005).

As cepas parentais a serem sujeitas à modificação podem ser cepas que inerentemente têm um gene endógeno codificando ferredoxina ou flavodoxina. Alternativamente, as cepas parentais podem ser cepas que não têm inerentemente um gene codificando ferredoxina ou flavodoxina, mas que podem ser fornecidas com a atividade por introdução de um gene de ferredoxina ou flavodoxina, e que mostram capacidade de produzir ácido Lglutâmico melhorada.

Melhora de capacidade de produzir ferredoxina ou flavodoxina comparada com a cepa parental tal como uma cepa tipo selvagem ou não modificada pode ser confirmada, por exemplo, comparando quantidade de mRNA para ferredoxina ou flavodoxina com aquela de uma cepa tipo 10 selvagem ou cepa não modificada. Exemplos do método para confirmar a quantidade de expressão incluem hibridização Northern e RT-PCR (Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.). Grau do aumento da expressão não é particularmente limitado contanto que ele 15 aumente se comparado com aquele de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, ele desejavelmente aumenta, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, preferivelmente 2 vezes ou mais, mais preferivelmente 3 vezes ou mais, se comparado com aquele de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada.

Melhora da capacidade de produzir ferredoxina ou flavodoxina

comparada com uma cepa parental, por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou uma cepa não modificada, pode ser detectada por SDS-PAGE, eletroforese bidimensional, ou Western blotting usando anticorpos (Sambrook J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring 25 Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). Grau da melhora da produção não é particularmente limitado contanto que ele aumente se comparado com aquele de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, ele desejavelmente aumenta, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, preferivelmente 2 vezes ou mais, mais preferivelmente 3 vezes ou mais, se comparado com aquele de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada.

As atividades de ferredoxina e flavodoxina podem ser medidas adicionando-as a um sistema de reação de oxirredução adequado. Por exemplo, um método compreendendo reduzir ferredoxina produzida com 5 ferredoxina NADP+ redutase e quantificar redução de citocromo C pela ferredoxina reduzida produzida é descrito por Boyer et al. (Boyer, M.E. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94:128-138). Além disso, a atividade de flavodoxina pode ser medida pelo mesmo método usando flavodoxina NADP+ redutase.

Genes codificando ferredoxina ou flavodoxina são

amplamente distribuídos, e qualquer um deles pode ser usado contanto que ferredoxina ou flavodoxina codificada pelos genes possa ser utilizada por acetoglutarato sintase e um sistema de reciclagem de doador de elétrons. Por exemplo, em Escherichia eoli, o gene fdx existe como um gene codificando 15 ferredoxina que tem um grupo 2Fe-2S (Ta, D.T. e Vickery, L.E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125), e o gene yfliL é esperado como um gene codificando ferredoxina que tem um grupo 4Fe-4S. Além disso, como o gene de flavodoxina, o gene fldA (Osbome C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173:1729- 1737) e o gene fldB (Gaudu, P. e Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788- 20 1793) são conhecidos. Na seqüência genômica de Corynebaeterium glutamicum (No. de Acesso de GenBank BA00036), o gene fdx (No. de Acesso de GenBank BAB97942) foi encontrado nos números de nucleotídeos de 562643 a 562963, e o gene fer foi encontrado nos números de nucleotídeos de 1148953 a 1149270 (No. de Acesso de GenBank BAB98495). Além 25 disso, na Chlorobium tepidum, existem muitos genes de ferredoxina, e ferredoxina I e ferredoxina II foram identificadas como genes de ferredoxina para o tipo 4Fe-4S que serve como o aceptor de elétrons de piruvato sintase (Yoon, K.S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:44027-44036). Gene de ferredoxina ou flavodoxina de bactérias tendo o ciclo TCA redutor tal como o gene de ferredoxina de Hydrogenobacter thermophilus também podem ser usado.

Exemplos específicos do gene de ferredoxina de Escherichia eoli incluem o gene fdx se localizando nos números de nucleotídeos de 5 2654770 a 2655105 (fita complementar) da seqüência genômica da cepa K-12 de Eseheriehia eoli (No. de Acesso de GenBank U00096) e mostrada em SEQ ID NO:9, e o gene yfliL se localizando nos números de nucleotídeos de 2697685 a 2697945 da mesma e mostrada em SEQ ID NO: 11. As seqüências de aminoácidos de Fdx e YfhL são mostradas em SEQ ID NOS: 10 e 12 (Nos. 10 de Acesso de GenBank AAC75578 e AAC75615, respectivamente). Exemplos do gene de flavodoxina de Eseheriehia eoli incluem o gene fldA se localizando nos números de nucleotídeos de 710688 a 710158 (fita complementar) da seqüência genômica da cepa K-12 de Eseheriehia eoli (No. de Acesso de GenBank U00096) e mostrada em SEQ ID NO: 13, e o gene fldB 15 se localizando nos números de nucleotídeos 3037877 a 3038398 da mesma e mostrada em SEQ ID NO: 15. As seqüências de aminoácidos codificadas pelo gene fldA e o gene fldB são mostradas em SEQ ID NOS: 14 e 16 (Nos. de Acesso de GenBank AAC73778 e AAC75933, respectivamente).

Exemplos do gene de ferredoxina de Chlorobium tepidum 20 incluem o gene de ferredoxina I se localizando nos números de nucleotídeos de 1184078 a 1184266 na seqüência genômica de Chlorobium tepidum (No. de Acesso de GenBank NC_002932) e mostrada em SEQ ID NO: 17, e o gene de ferredoxina II se localizando nos números de nucleotídeos de 1184476 a 1184664 do mesmo e mostrado em SEQ ID NO: 19. As seqüências de 25 aminoácidos de Ferredoxina I e Ferredoxina II são mostradas em SEQ ID NOS: 18 e 20 (Nos. de Acesso de GenBank AAM72491 e AAM72490, respectivamente). Exemplos incluem adicionalmente o gene de ferredoxina de Hydrogenobaeter thermophilus (No. de Acesso de GenBank BAE02673) e o gene de ferredoxina de Sulfolobus solfatarieus indicado com os números de nucleotídeos de 2345414 a 2345728 na seqüência genômica de Sulfolobus solfataricus. Além disso, o gene pode ser aqueles clonados de bactérias Chlorobium, Desulfobacter, Aquifex, Hydrogenobaeter, Thermoproteus, Pyrobaeulum ou as semelhantes com base em homologia com os genes 5 exemplificados acima, ou aqueles clonados de γ-proteobactérias tal como aquelas do gênero Enterobaeter, Klebsiella, Serratia, Erwinia e Yersinia, bactérias corineformes tal como Corynebaeterium glutamicum e Brevibaeterium lactofermentum, bactérias Pseudomonas tal como Pseudomonas aeruginosa, bactérias Mycobacterium tal como Mycobacterium 10 tuberculosis, e assim por diante.

Estes genes codificando α-cetoglutarato sintase, ferredoxina NADP+ redutase, piruvato sintase, ferredoxina, e flavodoxina (de agora em diante genericamente chamado o gene da presente invenção) podem ser aqueles codificando uma variante conservativa das proteínas tendo seqüências 15 de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácidos em uma ou diversas posições, contanto que as atividades das proteínas codificadas, i.e., as funções destas, não sejam degradadas. Embora o número do(s) “um ou diversos” resíduos de aminoácidos referido neste lugar possa diferir dependendo de posições na 20 estrutura tridimensional ou tipos de resíduos de aminoácidos das proteínas, ele é preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, particularmente preferivelmente 1 a 5.

Estas alterações nas variantes são mutações conservativas que preservam a função da proteína. Uma mutação conservativa é uma mutação 25 caracterizada pelo fato de que substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição é um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Vai, se o sítio de substituição é um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se ele é um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se ele é um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se ele é um aminoácido acídico; e entre Ser e Thr, se ele é um aminoácido tendo um grupo hidroxila.

Exemplos específicos de mutações conservativas incluem: substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gin, His ou Lys por Arg; substituição de Glu, Gin, Lys5 His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Glu 5 ou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gin; substituição de Gly, Asn, Gin, Lys ou Asp por Glu; substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr por His; substituição de Leu, Met, Val ou Phe por Ile; substituição de Ile, Met, Val ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg por Lys; 10 substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala for Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ou Trp por Tyr; e substituição de Met, He ou Leu por Vai. A substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de aminoácido mencionada acima pode 15 ser um resultado de uma mutação naturalmente ocorrente (mutante ou variante) devido a uma diferença individual, ou uma diferença de espécie de uma bactéria abrigando o gene da presente invenção.

Além disso, um gene com substituições de códons que pode ser facilmente usado em um hospedeiro no qual o gene da presente invenção é 20 introduzido pode ser usado. Similarmente, contanto que o gene da presente invenção mantenha sua função, o gene pode ser estendido ou encurtado ou no término N e/ou término C. O comprimento da extensão ou encurtamento é, por exemplo, 50 ou menos, preferivelmente 20 ou menos, mais preferivelmente 10 ou menos, particularmente preferivelmente 5 ou menos, 25 em termos do número de resíduos de aminoácidos.

Um gene codificando uma tal variante conservativa pode ser obtido, por exemplo, modificando a seqüência de nucleotídeos por mutagênese sítio específica de forma que resíduos de aminoácidos de sítios específicos da proteína codificada inclui substituições, deleções, inserções ou adições de resíduos de aminoácidos. Além disso, ele também pode ser obtido pela mutagênese convencionalmente conhecida. Exemplos da mutagênese incluem tratar o gene da presente invenção com hidroxilamina ou os semelhantes in vitro, e irradiar ultravioleta para um microorganismo tal como uma bactéria Escherichia contendo o gene, ou tratar o microorganismo com um mutagênico usado para mutagênese usual tal como N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina (NTG) ou etil metanossulfonato (EMS). Além disso, tais substituições, deleções, inserções, adições e inversões de resíduos de aminoácidos como descrito acima incluem aquelas causadas por uma mutação naturalmente ocorrente ou variação baseada em diferença de indivíduos ou espécie do microorganismo contendo o gene da presente invenção. Se este gene codifica α-cetoglutarato sintase, ferredoxina NADP+ redutase, piruvato sintase, ferredoxina, ou flavodoxina funcional pode ser confirmado, por exemplo, introduzindo cada gene em um microorganismo, e medindo a atividade de cada produto de gene.

O gene da presente invenção pode ser um DNA que é capaz de hibridizar com um DNA tendo qualquer uma das seqüências de nucleotídeos mencionadas acima ou uma sonda preparada a partir de um DNA que tem qualquer uma destas seqüências de nucleotídeos em condições estringentes e 20 que codifica α-cetoglutarato sintase, ferredoxina NADP+ redutase, piruvato sintase, ferredoxina, ou flavodoxina.

O termo “condições estringentes” se refere a condições onde um assim chamado híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. É difícil definir claramente as condições por valor numérico, 25 mas exemplos destas incluem condições onde DNAs tendo alta homologia, por exemplo, pelo menos 70%, preferivelmente 80%, mais preferivelmente 90%, e ainda mais preferivelmente 95% de homologia, hibridizam uns com os outros e DNAs tendo homologia menor do que o valor não hibridizam uns com os outros; e especificamente incluem condições correspondendo a concentração salina e temperatura de condições de lavagem típicas de hibridização Southern, e.g., lavagem a 60°C, lxSSC, SDS a 0,1%, preferivelmente 60°C, 0,1><SSC, SDS a 0,1%, mais preferivelmente 68°C, 0,1><SSC, SDS a 0,1%, uma vez ou preferivelmente duas vezes ou três vezes.

No relatório, o termo “homologia” algumas vezes pode significar “identidade”.

Como uma sonda, uma seqüência parcial do gene da presente invenção também pode ser usada. Uma tal sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos preparados baseados na seqüência de nucleotídeos 10 de cada gene como iniciadores de acordo com um método bem conhecido por uma pessoa versada na arte, e um fragmento de DNA contendo cada gene como um molde. Quando um fragmento de DNA de um comprimento de cerca de 300 bp é usado como a sonda, as condições de lavagem depois de hibridização consistem de, por exemplo, 50°C, 2><SSC, e SDS a 0,1%.

A descrição mencionada acima concernente à variante

conservativa também é aplicada às enzimas e genes descrito acima para fornecimento de capacidade de produzir L-aminoácido.

A modificação para acentuar expressão do gene da presente invenção pode ser realizada da mesma maneira que aquela do método para 20 acentuar expressão de um gene alvo descrito para o fornecimento da capacidade de produzir L-aminoácido. O gene da presente invenção pode ser obtido por PCR usando um DNA genômico de um microorganismo tendo ele como um molde.

Por exemplo, o gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum pode ser obtido por PCR usando iniciadores preparados com base nas seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1 e 3, por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 21 e 22, e o DNA genômico de Chlorobium tepidum como um molde.

O gene de flavodoxina NADP+ redutase de Eseherichia eoli pode ser obtido por PCR usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:5, por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 32 e 33, e o DNA genômico de Escherichia eoli como um molde.

O gene de piruvato sintase de Chlorobium tepidum pode ser

obtido por PCR usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:7, por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 23 e 24, e o DNA genômico de Chlorobium tepidum como um molde.

O gene de ferredoxina fdx de Eseherichia eoli pode ser obtido

por PCR usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:9, por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 38 e 39, e o DNA genômico de Eseheriehia eoli como um molde, e o gene de ferredoxina yfhL da mesma pode ser obtido por PCR 15 usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:ll, por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 40 e 41, e o DNA genômico dos mesmos como um molde.

O gene de flavodoxina fldA de Eseheriehia eoli pode ser obtido por PCR usando iniciadores preparados com base na seqüência de 20 nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 34 e 35, e o DNA genômico de Eseheriehia eoli como um molde, e o gene de flavodoxina fldB da mesma pode ser obtido por PCR usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 36 e 37, 25 e o DNA genômico de Eseheriehia eoli como um molde.

Além disso, o gene de ferredoxina I de Chlorobium tepidum pode ser obtido por PCR usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17, por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 25 e 26, e o DNA genômico de Chlorobium tepidum como um molde.

O gene da presente invenção de outros microorganismos também pode ser obtido por PCR a partir do DNA genômico ou uma biblioteca de DNA genômico do microorganismo usando, como iniciadores, 5 oligonucleotídeos preparados baseados nas seqüências conhecidas dos genes como descrito acima, ou dos genes do microorganismo escolhido; ou hibridização usando um oligonucleotídeo preparado baseado na seqüência como uma sonda. Um DNA genômico pode ser preparado a partir de um microorganismo que serve como um doador de DNA pelo método de Saito e 10 Miura (Saito H. e Miura K. 1963. Biochem. Biophys. Acta 72:619-629), Experiment Manual for Biotechnology, editado pela The Society for Biotechnology, Japão, p97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992) ou os semelhantes.

Acentuação de expressão do gene da presente invenção pode ser atingida aumentando número de cópias do gene da presente invenção 15 realizando transformação ou recombinação homóloga ou modificando uma seqüência de controle de expressão do gene da presente invenção de maneiras tais como descritas acima. Além disso, acentuação de expressão do gene da presente invenção também pode ser atingida amplificando um ativador que aumenta expressão do gene da presente invenção, e/ou eliminando ou 20 atenuando um regulador que reduz expressão do gene da presente invenção.

Quando número de cópias do gene é aumentado, número de cópias aumentado não é particularmente limitado contanto que atividade do produto do gene alvo possa ser acentuada. Entretanto, quando o microorganismo tem inerentemente o gene alvo, o número de cópias é 25 preferivelmente 2 ou mais. Além disso, quando o microorganismo não tem originalmente o gene da presente invenção, o número de cópias do gene introduzido pode ser 1, ou 2 ou mais.

Quando a substância alvo consiste de múltiplas subunidades como α-cetoglutarato sintase, expressões de genes codificando as subunidades podem ser individualmente acentuadas, ou podem ser simultaneamente acentuadas como um policistron. Além disso, quando os genes são introduzidos em um microorganismo usando um vetor, os genes codificando as subunidades podem ser simultaneamente carregados por uma única 5 molécula de vetor, ou podem ser separadamente carregados por diferentes moléculas de vetor. Também quando os genes codificando as subunidades são inseridos em um cromossomo, os genes podem ser simultaneamente inseridos no mesmo sítio no cromossomo, ou podem ser separadamente inseridos em diferentes sítios.

Além disso, no microorganismo da presente invenção, é

preferido que atividade de α-cetoglutarato desidrogenase seja reduzida, em adição a isto atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada. Um tal microorganismo pode ser obtido transformando um microorganismo cujo gene codificando α-cetoglutarato desidrogenase é interrompido com um vetor 15 recombinante contendo o gene da presente invenção, por exemplo, pelos métodos descritos acima.

Na presente invenção, a atividade de a-cetoglutarato desidrogenase (de agora em diante também referida como "a-KGDH") significa uma atividade de catalisar a reação descarboxilando oxidativamente 20 ácido α-cetoglutárico (ácido 2-oxoglutárico) para gerar succinil-CoA. A reação mencionada acima é catalisada por três tipos de enzimas, a-KGDH (Elo, a-cetoglutarato desidrogenase, EC: 1.2.4.2), di-hidrolipoamida Ssucciniltransferase (E2o, EC: 2.3.1.61), e di-hidrolipoamida desidrogenase (E3, EC: 1.8.1.4). Isto é, estes três tipos de subunidades catalisam as reações 25 descritas abaixo, respectivamente, e a atividade para catalisar uma reação consistindo de uma combinação destes três tipos de reações é chamada de atividade de α-KGDH. A atividade de α-KGDH pode ser confirmada por medida de acordo com o método de Shiio e Ujigawa-Takeda (Shiio I. e Ujigawa-Takeda, K. 1980. Agric. Biol. Chem., 44:1897-1904). Elo: 2-oxoglutarato + [resíduo de di-hidrolipoil-lisina suceiniltransferase] lipoilisina —> [resíduo de di-hidrolipoil-lisina succiniltransferase] S-succinil-di-hidrolipoil-lisina + CO2 E2o: CoA + enzima N6-(S-succinil-di-hidrolipoil)lisina —> succinilCoA + enzima N6-(di-hidrolipoil)lisina

E3: proteína N6-(di-hidrolipoil)lisina + NAD+ —► proteína N6- (Iipoil)Iisina + NADH + H+

α-KGDH também é chamada de oxoglutarato desidrogenase ou 2-oxoglutarato desidrogenase.

Em bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae tal como Pantoea ananatis, as subunidades protéicas tendo estes três tipos de atividades enzimáticas, respectivamente, formam um complexo. Como subunidades são codificadas por sue A, sueB e Ipd, respectivamente, e os genes sueA e sucB se localizam depois do gene de proteína ferro-enxofre succinato desidrogenase (sdhB) (Patente Norte-Americana No. 6.331.419). Embora estes genes sejam descritos como genes de Enterobacter agglomerans AJ13355 na patente mencionada acima, esta cepa foi posteriormente reclassificada em Pantoea ananatis.

Como genes codificando α-KGDH de enterobactérias, a seqüência de nucleotídeos de um fragmento de Pantoea ananatis contendo os genes sucA e sueB, uma parte do gene sdhB se localizando antes destes genes, e o gene sucC se localizando depois destes genes é mostrada em SEQ ID NO:46. As seqüências de aminoácidos codificadas pela parte do gene sdhB, e os genes sueA, sueB, e sucC são mostradas em SEQ ID NOS: 47 a 50, respectivamente. Além disso, sueA e sucB codificando α-KGDH de Escherichia eoli foram descritos como Genbank NP_415254 e NP_415255, respectivamente.

Em bactérias corineformes, a subunidade Elo é codificada pelo gene odhA (registrado como NCgl 1084 de No. de Acesso de GenBank NC_003450, que também é chamado de gene sueA), e a subunidade E3 é codificada pelo gene Ipd (No. de Acesso de GenBank Yl 6642). Por outro lado, é estimado que a subunidade E2o seja codificada pelo gene odhA junto com a subunidade Elo como uma proteína bifuncional (Usuda Y. et al. 1996.

Microbiology 142:3347-3354), ou codificada pelo gene registrado como NCgl2126 de No. de Acesso de GenBank NC_003450, que é diferente do gene odhA. Portanto, na presente invenção, embora o gene odhA seja um gene codificando a subunidade Elo, ele pode adicionalmente codificar E2o.

A seqüência de nucleotídeos do gene odhA de Brevibacterium 10 lactofermentum e a seqüência de aminoácidos da subunidade Elo codificada através desta (NCgll084 de No. de Acesso de GenBank NC_003450, Patente Internacional 2006/028298) são mostradas em SEQ ID NOS: 51 e 52. Além disso, a seqüência de nucleotídeos do NCgl2126 mencionado acima de No. de Acesso de GenBank NC_003450 e a seqüência de aminoácidos da subunidade 15 E2o codificada através desta são mostradas em SEQID NOS: 53 e 54.

Quando o microorganismo da presente invenção é cultivado em condições anaeróbicas ou microaeróbicas, ele pode ser um microorganismo que foi modificado de forma que ele não produza qualquer ácido orgânico ou etanol nas condições anaeróbicas ou microaeróbicas, em 20 adição a isto atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada. Exemplos do ácido orgânico referido aqui incluem ácido láctico, ácido fórmico e ácido acético. Exemplos do método para modificar de forma que qualquer ácido orgânico ou etanol não seja produzido incluem um método de interromper o gene codificando lactato desidrogenase (Verumi, G.N. et al. 2002. J. 25 Industrial Microbiol. Biotechnol. 28:325-332; Patente Japonesa Nãoexaminada No. 2005-95169).

<2> Método para produzir ácido L-glutâmico da presente

invenção

O método da presente invenção é um método para produzir um L-aminoácido compreendendo cultivar um microorganismo que é capaz de produzir um ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-omitina, L-citrulina e L-arginina e que foi modificado para aumentar a atividade de a5 cetoglutarato sintase em um meio para produzir e acumular o L-aminoácido no meio ou nas células do microorganismo, e coletar o L-aminoácido do meio ou das células. No método da presente invenção, a cultura pode ser realizada em condições aeróbicas, ou pode ser realizada em condições anaeróbicas ou microaeróbicas. Condições aeróbicas normalmente podem ser obtidas 10 borbulhando o meio com um gás contendo oxigênio ou agitando o meio. Se aeração ou agitação não é realizada, ou taxa de aeração ou agitação é diminuída, condições anaeróbicas ou microaeróbicas normalmente podem ser obtidas.

Para a cultura do microorganismo em um meio, embora o 15 microorganismo cultivado em um meio sólido tal como meio de ágar como cultura inclinada possa ser diretamente inoculado em um meio líquido, é preferível inocular o microorganismo cultivado em um meio líquido antecipadamente (cultura de inoculação) em um meio para cultura principal (meio de fermentação).

Como o meio usado para a cultura, um meio normalmente

usado para cultura de microorganismos e compreendendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos assim como micronutrientes orgânicos tal como aminoácidos e vitaminas, se necessário, podem ser usados. Por exemplo, um meio comum tendo uma composição 25 consistindo de sais minerais tal como sulfato de amônio, fosfato de potássio e sulfato de magnésio, adicionado com nutrientes naturais tal como extrato de carne, extrato de levedura e peptona pode ser usado.

Como as fontes de carbono, qualquer fonte de carbono que pode ser utilizada pelo microorganismo e permite produção de ácido Lglutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-omitina, L-citrulina ou L-arginina pode ser usada sem qualquer limitação particular. Entretanto, normalmente, carboidratos tal como galactose, lactose, glicose, frutose, sacarose, sacarose, amido, celulose, e ácidos alifáticos são usados. Adicionalmente, açúcares 5 alcoólicos tal como glicerol, manitol, xilitol, ribitol e etanol também são usados. Dentre estes, glicose, frutose, sacarose, glicerol e etanol são preferidos, e glicose e glicerol são especialmente preferidos. E preferível usar glicerol bruto produzido em produção de combustível biodiesel. As fontes de carbono podem consistir de um tipo ou dois ou mais tipos de fonte de 10 carbono.

Além disso, solução de amido sacarificada, melaços, glicerol bruto e assim por diante contendo os sacarídeos mencionados acima também são usados. Embora concentração da fonte de carbono mencionada acima não seja particularmente limitada, é vantajoso tomá-la tão alta quanto possível em 15 um intervalo tal que a produção de L-aminoácido não seja inibida, e a fermentação normalmente é realizada em uma concentração das fontes de carbono no intervalo de 5 a 30% (W/V), preferivelmente 10 a 20% (W/V). Além disso, em conformidade com redução das fontes de carbono mencionadas acima acompanhando prosseguimento da fermentação, as fontes 20 de carbono podem ser adicionadas de forma suplementar.

Como as fontes de nitrogênio, qualquer fonte de nitrogênio que pode ser utilizada pelo microorganismo e permite produção de Laminoácido pode ser usada sem qualquer limitação particular. Exemplos específicos incluem vários tipos de compostos nitrogenados orgânicos e 25 inorgânicos tal como sais de amônio, nitratos, uréia, hidrolisado de soja, produto de decomposição de caseína, peptona, extrato de levedura, extrato de came e água de maceração de milho. Como os sais inorgânicos, vários fosfatos, sulfatos, e sais de metais tal como magnésio, potássio, manganês, ferro e zinco são usados. Além disso, fator promotor de crescimentos, por exemplo, vitaminas tal como biotina, ácido pantotênico, inositol e ácido nicotínico, nucleotídeos, aminoácidos e assim por diante são adicionados, se necessário. Além disso, a fim de suprimir espumação no momento de cultura, é desejável adicionar uma quantidade apropriada de antiespumantes 5 disponíveis comercialmente ao meio.

pH do meio de cultura pode ser ajustado adicionando gás amônia, amônia aquosa, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, hidróxido de magnésio, ou os semelhantes. Uma 10 vez que é preferível manter pH na cultura principal normalmente como sendo 5 a 10, preferivelmente 6 a 9,5, pH do meio de cultura é ajustado também durante a cultura para estar dentro do intervalo mencionado acima com uma substância alcalina, carbonato, uréia ou os semelhantes, como requerido.

Como o meio usado para a presente invenção, um meio que compreende a fonte de carbono mencionada acima, e íons de carbonato, íons de bicarbonato ou dióxido de carbono, e permite cultura em condições anaeróbicas, microaeróbicas ou aeróbicas é preferido. Embora íons de carbonato ou íons de bicarbonato sejam fornecidos como sais de carbonato ou sais de bicarbonato tal como carbonato de magnésio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio ou bicarbonato de potássio, que também podem ser usados como um neutralizador, eles também pode ser fornecidos a partir de dióxido de carbono, se necessário. íons de carbonato e íons de bicarbonato são adicionados em uma concentração de 0,001 a 5 M, preferivelmente 0,1 a 3 M, mais preferivelmente 1 a 2 M. Quando dióxido de carbono está contido, ele está contido em uma quantidade de 50 mg a 25 g, preferivelmente 100 mg a 15 g, mais preferivelmente 150 mg a 10 g, por I L da solução.

No momento de cultura de um microorganismo, normalmente é preferível realizar a cultura em condições aeróbicas fornecendo oxigênio por aeração ou agitação. Entretanto, no método da presente invenção, a cultura pode ser realizada em condições anaeróbicas ou microaeróbicas sem realizar aeração e fornecer oxigênio. Várias condições de concentração de oxigênio dissolvido podem ser atingidas, por exemplo, diminuindo taxa de aeração ou 5 agitação, realizando a reação sem aeração em um recipiente vedado, borbulhando um gás inerte contendo dióxido de carbono, ou os semelhantes.

Temperatura de cultura normalmente é 25 a 40°C, preferivelmente 30 a 37°C. Período de cultura é preferivelmente 1 a 168 horas, mais preferivelmente 3 a 72 horas.

O período de cultura pode ser dividido em um período para

proliferação do microorganismo e um período para produção de Laminoácido, e a cultura pode ser realizada para os períodos em diferentes meios ou em diferentes condições. Por exemplo, o microorganismo pode ser proliferado com aeração ou agitação, e então o microorganismo pode ser 15 deixado para produzir um L-aminoácido em condições anaeróbicas ou microaeróbicas.

Além disso, a cultura também pode ser realizada precipitando ácido L-glutâmico no meio usando um meio líquido ajustado para estar em tais condições que ácido L-glutâmico é precipitado no meio. Exemplos das 20 condições nas quais ácido L-glutâmico precipita incluem pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particularmente preferivelmente pH 4,0.

Coleta de L-aminoácido do meio depois da cultura pode ser realizada por um método de coleta conhecido. Por exemplo, a coleta é 25 atingida removendo células do meio, e então causando cristalização por concentração, cromatografia de troca iônica, ou os semelhantes. Quando a cultura é realizada precipitando ácido L-glutâmico, ácido L-glutâmico precipitado no meio pode ser coletado por centrifugação ou filtração. Neste caso, ácido L-glutâmico dissolvido no meio pode ser precipitado e então separado junto.

Exemplos

A seguir, a presente invenção será especificamente explicada com referência a exemplos. Entretanto, a presente invenção não é limitada aos exemplos seguintes.

Exemplo 1: Construção de um plasmídeo para expressar genes codificando α-cetoglutarato sintase, piruvato sintase e ferredoxina de Chlorobium tepidum

Chlorobium tepidum é uma bactéria auxotrófica meso10 termofílica cuja temperatura de crescimento ótima é 48°C, e a seqüência genômica da cepa TLS foi elucidada por Eisen et al. (Eisen, J.A. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:9509-9514). O gene de a-cetoglutarato sintase, o gene de piruvato sintase e o gene de ferredoxina foram isolados desta cepa, e foi construído um plasmídeo para expressar simultaneamente 15 estes três genes.

<1-1> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa TLS de C. tepidum (ATCC 49652) como um molde e os oligonucleotídeos de SEQ ID 20 NOS: 21 e 22 para amplificar um fragmento de gene contendo genes para a subunidade α e subunidade β de α-cetoglutarato sintase. O fragmento de gene obtido foi digerido com BamHl e inserido em sítio BamHl de pSTV28 (Takara Bio) para construir um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase, que foi designado pSTV-KGS. O gene de a25 cetoglutarato sintase se localiza depois do promotor Iac derivado de pSV28 no plasmídeo resultante, e pode ser expresso a partir do promotor.

<l-2> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase e gene de piruvato sintase de C. tepidum

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa TLS de C. tepidum (ATCC 49652) como um molde e os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 23 e 24 para amplificar o fragmento de gene de piruvato sintase. O fragmento de gene obtido foi digerido com Xbal e ligado a pSTV-KGS digerido com Xbal para construir um plasmídeo para expressar o gene de a5 cetoglutarato sintase e o gene de piruvato sintase, que foi designado pSTVKGS-PS.

<l-3> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase, gene de piruvato sintase e gene de ferredoxina de C. tepidum

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa TLS de C.

tepidum (ATCC 49652) como um molde e os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 25 e 26 para amplificar o fragmento de gene de ferredoxina I. O fragmento de gene foi digerido com Smal e inserido em pSTV-KGS-PS digerido com Smal para construir um plasmídeo para expressar o gene de a15 cetoglutarato sintase, o gene de piruvato sintase e o gene de ferredoxina I, que foi designado pSTV-Fdl-KGS-PS. O gene de α-cetoglutarato sintase, o gene de piruvato sintase e o gene de ferredoxina I se localizam depois do promotor Iac de pSV28 no plasmídeo resultante, e podem ser expressos a partir do promotor.

Exemplo 2: Construção de cepa deficiente em a-cetoglutarato

desidrogenase de Eseheriehia eoli

<2-l> Construção de um plasmídeo para interromper gene sucA de Escherichia eoli

A partir da cepa MGl655 de E. eoli, uma cepa cujo gene sueA 25 codificando a subunidade El de α-cetoglutarato desidrogenase foi interrompido foi construída. Iniciadores foram sintetizados com base na seqüência de nucleotídeos do gene sueA se localizando nos números de nucleotídeos 757929 a 760730 da seqüência genômica (No. de Acesso de GenBank U00096) e usados para PCR usando o DNA genômico da cepa MGl 655 de E. eoli como um molde para amplificar fragmentos NeCterminais do gene suc A. A seqüência de nucleotídeos do gene sucA de Eseherichia eoli é mostrada em SEQ ID NO:55 e a seqüência de aminoácidos de subunidade El codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO:56. Como 5 os iniciadores de PCR para amplificação do fragmento N-terminal, os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 42 e 43 foram usados, e como os iniciadores de PCR para amplificação do fragmento C-terminal, os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 44 e 45 foram usados. Sítio MwdIII e sítio Xbal foram desenhados no oligonucleotídeo de SEQ ID NO:42 e no 10 oligonucleotídeo de SEQID NO:45, respectivamente.

Cada um dos fragmentos de DNA amplificados obtidos depois de PCR foi purificado usando QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen), e o fragmento de DNA N-terminal e fragmento de DNA C-terminal purificados, e os iniciadores de SEQ ID NOS: 42 e 45 foram usados em crossover PCR 15 (Link, AJ. et al. 1997. J. Bacteriol. 179:6228-6237) para obter um fragmento de sucA do tipo deficiente. O fragmento de DNA foi purificado, então digerido com Hinálll e Xbal (Takara Bio), e clonado no plasmídeo sensível a temperatura pMAN997 (Matsui, H. et al. 2001. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:570-578; Patente Internacional 99/03988) similarmente digerido com 20 Hinálll e Xbal para construir um plasmídeo para ruptura de suc A, que foi designado pMANAsucA.

<2-2> Construção de cepa deficiente em a-cetoglutarato desidrogenase derivada de cepa MG 165 5 de E. eoli

A cepa MG 165 5 de E. eoli foi transformada com o plasmídeo 25 pMANAsucA, e colônias foram selecionadas a 30°C em uma placa de LB + ampicilina (placa de ágar LB contendo 25 μg/mL de ampicilina). Os clones selecionados foram cultivados durante a noite a 3O0C em um meio líquido, então o meio foi diluído 1000 vezes e inoculado em uma placa de LB + ampicilina, e colônias foram selecionadas a 42°C. Os clones selecionados foram espalhados em uma placa de LB + ampicilina e cultivados a 30°C, e então as células correspondendo a 1/8 da placa foram suspensas em 2 mL de meio LB, e cultivadas a 42°C por 4 a 5 horas com agitação. O meio de cultura celular diluído 10000 vezes foi inoculado em uma placa de LB, 5 diversas centenas de colônias dentre as colônias obtidas foram inoculadas em uma placa de LB e uma placa de LB + ampicilina, e cepas sensíveis a ampicilina foram selecionadas confirmando crescimento. PCR de colônia foi realizado para diversas cepas dentre as cepas sensíveis a ampicilina para confirmar deficiência do gene sueA. Desta maneira, uma cepa deficiente em 10 sueA derivada de cepa MGl655 de E. eoli, cepa MG 1655AsucA, foi obtida.

Exemplo 3: Construção de uma cepa deficiente em lactato desidrogenase de E. eoli

A lactato desidrogenase é uma enzima catalisando uma reação que gera ácido láctico a partir de ácido pirúvico usando NADH como 15 uma coenzima. A fim de suprimir geração de ácido láctico em cultura de E. eoli sob oxigênio limitado, uma cepa deficiente no gene IdhA codificando lactato desidrogenase foi construída. Este gene foi deletado usando o método desenvolvido por Datsenko e Wanner chamado de "integração dirigida por Red" (Datsenko, K.A. e Wanner5 B.L. 2000. Proc. Natl. Acad. 20 Sei. USA 97:6640-6645) e um sistema de excisão de fago λ (Cho, E.H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184:5200-5203). Usando este método, uma cepa com gene interrompido pode ser construída em uma etapa usando um produto de PCR obtido usando oligonucleotídeos sintéticos como iniciadores nos quais uma parte de um gene alvo é desenhada no lado de extremidade 5' do 25 oligonucleotídeo sintético, e uma parte de um gene de resistência a antibiótico é desenhada no lado de extremidade 3' do mesmo. Combinando posteriormente o sistema de excisão derivado de fago λ, o gene de resistência a antibiótico incorporado na cepa com gene interrompido pode ser eliminado. <3-l> Construção de cepa deficiente em gene IdhA codificando lactato desidrogenase

De acordo com a descrição de Patente Internacional 2005/010175, oligonucleotídeos sintéticos foram usados como iniciadores, nos quais cada um dos oligonucleotídeos teve uma seqüência correspondendo a uma parte do gene IdhA na extremidade 5’, e uma seqüência correspondendo a cada uma das extremidades de attL e attR de fago λ na extremidade 3', respectivamente, e o plasmídeo pMWl 18-attL-Cm-attR como um molde para realizar PCR. As seqüências dos oligonucleotídeos sintéticos usados para os iniciadores são mostradas em SEQ ID NOS: 27 e 28. O produto de PCR amplificado foi purificado com gel de agarose, e introduzido na cepa MG1655AsucA de E. eoli abrigando o plasmídeo pKD46 tendo capacidade de replicação sensível a temperatura por eletroporação. Então, uma cepa sensível a ampicilina cujo plasmídeo pKD46 foi eliminado foi obtida, e a deleção do gene IdhA foi confirmada por PCR. Além disso, a fim de remover o gene att-cat introduzido no gene IdhA, a cepa foi transformada com o plasmídeo ajudante pMW-intxis-ts, e uma cepa resistente a ampicilina foi selecionada. O pMW-intxis-ts é um plasmídeo tendo o gene de integrase (Int) e o gene de excisionase (Xis) de fago λ, cuja replicação é sensível a temperatura.

Então, cepas com IdhA interrompido nas quais att-cat e pMWintxis-ts foram eliminados foram obtidas com base em sensibilidades para ampicilina e cloranfenicol. A partir de cada uma das cepas deficientes em IdhA candidatas obtidas, um DNA genômico foi preparado e usado com os 25 oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 29 e 30 para realizar PCR, seguido por análise de eletroforese. Uma cepa deficiente em IdhA que mostrou uma banda menor em cerca de 1,0 kbs comparada com a banda obtida em PCR realizado usando o DNA genômico preparado a partir da cepa MG 1655 AsucA como um molde foi designada cepa MG1655AsucAAldhA. Exemplo 4: Mensuração de atividade de a-cetoglutarato sintase de uma cepa expressando gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum

A fim de confirmar que o gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum expressa a atividade em E. eoli, um vetor para expressar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum foi construído e introduzido em MG1655AsucA, e a atividade foi medida.

<4-l> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa TLS de C. tepidum (ATCC 49652) como um molde e os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOS: 21 e 22 para amplificar o fragmento de gene de a-cetoglutarato sintase. O fragmento de gene obtido foi digerido com BamHl, e inserido no sítio BamHl de pUC18 (Takara Bio) para construir um plasmídeo para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase, que foi designado pUC-KGS. O gene de α-cetoglutarato sintase se localiza depois do promotor Iac de pUC18 no plasmídeo resultante, e ele pode ser expresso a partir do promotor. Além disso, uma vez que o número de cópias de pUC18 é maior do que aquele de pSTV28, detecção da atividade enzimática é fácil.

<4-2> Preparação de solução de enzima bruta de uma cepa expressando gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum

pUC-KGS e o vetor pUC18 como controle para comparação foram introduzidos cada em MG1655AsucA por eletroporação, e transformantes foram obtidos com base em resistência a ampicilina. Depois de confirmar introdução dos plasmídeos, a cepa expressando gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum e a cepa de controle foram designadas MG1655AsucA/pUC-KGS e MG1655AsucA/pUC18, respectivamente.

Cada uma das cepas acima foi inoculada em meio LB contendo I mM de IPTG, e cultivada durante a noite a 37°C como précultura. Células foram coletadas de 10 ml do meio por centrifugação, e suspensas em 300 μΐ de 50 mM de tampão HEPES (pH 8,0). A suspensão foi sujeita a ruptura ultra-sônica e centrifugada a 15000 rpm por 15 minutos, e o sobrenadante obtido foi usado como uma solução de enzima bruta.

<4-3 > Mensuração de atividade de α-cetoglutarato sintase de solução de enzima bruta obtida de uma cepa expressando gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum

Uma reação foi realizada adicionando 50 μΐ da solução de enzima bruta a 1 ml da solução de reação mostrada abaixo. Primeiro, a solução de reação contendo todos os componentes exceto por ácido acetoglutárico servindo como um substrato foi adicionada a uma célula para espectrometria, e a célula foi vedada com um tampão de borracha e uma tampa de alumínio. Gás argônio foi ventilado na célula por 5 minutos usando uma seringa para diminuir a concentração de oxigênio na célula. A célula foi colocada em um espectrofotômetro (Espectrofotômetro U-3210, Hitachi, Ltd.), e uma solução de ácido α-cetoglutárico foi adicionada usando uma seringa para iniciar a reação. A reação foi deixada a 37°C por 30 minutos, e absorbância foi periodicamente medida a 578 nm para monitorar alteração de quantidade de metilviologênio reduzido.

[Mistura de reação]

MgCl2 1 mM

Ditiotreitol 1 mM

Metilviologênio 5 mM

CoA 0,25 mM

f

Acido α-cetoglutárico IOmM

(adicionado imediatamente antes do início da medida)

HEPES (pH 8,0) 50 mM

Os resultados são mostrados em Tabela I. Na tabela, KGS indica α-cetoglutarato sintase. No sistema de reação mencionado acima, metilviologênio reduzido aumenta devido à descarboxilação de ácido acetoglutárico por α-cetoglutarato sintase. O coeficiente de extinção de metilviologênio reduzido a 578 nm, ε578, é 9,8/mM/cm, e I U da atividade 5 enzimática foi definida como uma atividade para reduzir 1 μηιοί de metilviologênio por 1 minuto. Ao passo que atividade de a-cetoglutarato sintase não foi observada para a cepa de controle MG1655AsucA/pUC18, 0.1 U/mg da atividade foi confirmada para a cepa MG1655AsucA/pUC18-KGS expressando o gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum.

Tabela 1

Cepa Atividade de KGS (U/mg) MG 165 5AsucA/pUC 18 0,00 MG 165 5AsucA/pUC-KGS 0,10 Exemplo 5: Efeito em capacidade de produzir ácido Lglutâmico em uma cepa expressando gene de a-cetoglutarato sintase, gene de piruvato sintase e gene de ferredoxina de C. tepidum sob concentração limitada de oxigênio com glicose como fonte de carbono

A fim de examinar influência de expressão de atividade de acetoglutarato sintase na produção de ácido L-glutâmico sob concentração limitada de oxigênio, o plasmídeo mencionado acima pSTV-KGS-PS-Fdl para expressar gene de α-cetoglutarato sintase, gene de piruvato sintase e gene 20 de ferredoxina de C. tepidum foi introduzido em MG1655AsucAAldhA, e cultura foi realizada.

Cada de pSTV-Fdl-KGS-PS e o vetor pSTV28 como um controle para comparação foram introduzidos em MG1655AsucAAldhA por eletroporação, e transformantes foram obtidos com base em resistência a 25 cloranfenicol. Depois de confirmar introdução dos plasmídeos, a cepa expressando o gene de α-cetoglutarato sintase, o gene de piruvato sintase e o gene de ferredoxina de C. tepidum foi designada MG1655AsucAAldhA/pSTV-FdI-KGS-PS, e a cepa de controle foi designada MG1655AsucAAldhA/pSTV28. As cepas preparadas acima foram cultivadas para examinar capacidade de produzir ácido L-glutâmico destas.

MG1655AsucAAldhA/pSTV-FdI-KGS-PS e a cepa de controle MGl 655AsucAAldhA/pSTV28 foram todas inoculadas no meio LB, e cultivadas durante a noite a 37°C como pré-cultura. Células correspondendo a 1/6 da placa foram inoculadas em 50 ml de um meio de glicose tendo a composição seguinte em um frasco cônico de 500 ml de volume, e cultivadas a 37°C por 31 horas. A fim de limitar oxigênio, a cultura foi realizada em uma taxa de agitação de 100 rpm. Depois da cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Chemical Industry).

[Composição de meio de glicose]

Glicose 40 g/L MgSO4 *7H20 1,0 g/L (NH4)2SO4 20 g/L KH2PO4 1,0 g/L Extrato de levedura 2,0 g/L FeSO4 *7H20 0,01 g/L MnSO4‘5H20 0,01 g/L Tiamina HCl 0,01 g/L Cloranfenicol 25 mg/L Carbonato de cálcio 50 g/L pH 7,0 (ajustado com KOH) Condição de esterilização: 120°C, 20 minutos Os resultados são mostrados em Tabela 2. Rendimento de ácido L-glutâmico com respeito à glicose consumida foi melhorado em 0,6% em MG1655AsucAAldhA/pSTV-FdI-KGS-PS introduzida com o vetor para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase, o gene de piruvato sintase e o gene de ferredoxina de C. tepidum comparado com o controle, MGl 655AsucAAldhA/pSTV28.

Tabela 2

Cepa OD620 Glicose Rendimento de residual Ácido L(g/L) glutâmico (%) MGl 655AsucAAldhA/pSTV28 14,0 2,1 1,05 MG 1655AsucAAldhA/pSTV-FdI-KGS-PS 13,3 3,6 1,65 Exemplo 6: Efeito em capacidade de produzir ácido Lglutâmico em uma cepa expressando gene de α-cetoglutarato sintase, gene de piruvato sintase e gene de ferredoxina de C. tepidum com glicerol como fonte de carbono

A cepa MGl 655AsucAAldhA/pSTV-FdI-KGS-PS expressando o gene de α-cetoglutarato sintase, o gene de piruvato sintase e o gene de ferredoxina de C. tepidum e a cepa de controle 10 MG 1655AsucAAldhA/pSTV28 foram usadas para examinar capacidade de produzir ácido L-glutâmico destas observada com glicerol como uma fonte de carbono.

Cada uma das MG1655AsucAAldhA/pSTV-FdI-KGS-PS e a cepa de controle MG1655AsucAAldhA/pSTV28 foi inoculada no meio LB, e 15 cultivadas durante a noite a 37°C como pré-cultura. Células correspondendo a 1/2 da placa foram inoculadas em 20 ml de um meio de glicerol tendo a composição seguinte em um frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas a 37°C por 29 horas em uma condição aeróbica em uma taxa de agitação de 120 rpm. Depois de conclusão da cultura, ácido L-glutâmico 20 acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Chemical Industry).

[Composição de meio de glicerol]

Glicerol 50 g/L

MgSO4-7H20 1,0 g/L

(NH4)2SO4 20 g/L

KH2PO4 1,0 g/L

Extrato de levedura 2,0 g/L FeSO4 *7H20 0,01 g/L MnSO4 ·5Η20 0,01 g/L Tiamina HCl 0,01 g/L Cloranfenicol 25 mg/L Carbonato de cálcio 30 g/L pH 7.0 (ajustado com KOH) Condição de esterilização: 120°C, , 20 minutos Os resultados são mostrados em Tabela 3. Rendimento de Ácido L-glutâmico com respeito a glicerol consumido foi melhorado em 6% 10 em MGl655AsucAAldhA/pSTV-FdI-KGS-PS introduzida com o vetor para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase, o gene de piruvato sintase e o gene de ferredoxina de C. tepidum comparado com o controle, MG1655AsucAAldhA/pSTV28.

Tabela 3

Cepa OD620 Glicerol Rendimento de residual Ácido L(g/L) glutâmico (%) MG1655AsucAAldhA/pSTV28 29,4 0,0 31,3 MG1655AsucAAldhA/pSTV-FdI-KGS-PS 23,6 0,0 37,2 Exemplo 7: Construção de um plasmídeo para expressar gene

de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e gene de ferredoxina ou flavodoxina de E. eoli

Como um sistema de regeneração para uma coenzima requerida para atividade de α-cetoglutarato sintase, o gene de flavodoxina 20 NADP+ redutase de E. eoli e o gene de ferredoxina ou flavodoxina de E. eoli foram usados para construir um plasmídeo expressando simultaneamente os três genes. Como o gene de ferredoxina NADP+ redutase de E. eoli, o gene fpr foi usado, como o gene de flavodoxina de E. eoli, o gene fldA e o gene fldB foram usados, e como o gene de ferredoxina, o gene fdx e o gene yfhL 25 foram usados. <7-l> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum

pSTV-KGS construído em Exemplo 1 foi digerido com BamHl, e o fragmento de gene de α-cetoglutarato sintase obtido foi inserido no sítio 5 BamHl de pMWPthr para construir o vetor pMWPthr-KGS para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase. pMWPthr corresponde ao vetor pMW118 (Nippon Gene) tendo a região promotora (Pthr) do operon de treonina (thrABC) se localizando nos números de nucleotídeos de 183 a 330 da seqüência genômica da cepa K-12 de E. eoli (No. de Acesso de GenBank U00096) 10 mostrada em SEQ ID NO:31 entre os sítios Hindlll e Xbal, e este plasmídeo pode expressar um gene quando o gene é clonado depois de tal promotor.

<7-2> Construção de um vetor para amplificar gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa MG 165 5 15 de E. eoli como um molde e os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOS: 32 e 33 para amplificar o fragmento de gene de flavodoxina NADP+ redutase. O fragmento de gene obtido foi digerido com Smal, e inserido no sítio SmaI de pMWPthr para construir um plasmídeo para amplificar o gene de flavodoxina NADP+ redutase, que foi designado pMWPthr-fpr.

<7-3 > Construção de um vetor para amplificar gene de

flavodoxina (fldA) de E. eoli

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa MG 165 5 de E. eoli como um molde e os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOS: 34 e 35 para amplificar o fragmento de gene de flavodoxina {fldA). O 25 fragmento de gene foi digerido com EcoRl, e inserido no sítio EcoKL de pMWPthr para construir um plasmídeo para amplificar o gene de flavodoxina (fldA), pMWPthr-fldA.

<7-4> Construção de um plasmídeo para amplificar gene de lavodoxina (fldB) de E. eoli PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa MG 165 5 de E. eoli como um molde e os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOS: 36 e 37 para amplificar o fragmento de gene de flavodoxina (fldB). O fragmento de gene foi digerido com EeoRl, e inserido no sítio .EcoRI de 5 pMWPthr para construir um plasmídeo para amplificar o gene de flavodoxina (fldB), pMWPthr-fldB.

<7-5> Construção de um plasmídeo para amplificar gene de ferredoxina (fdx) de E. eoli

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa MG 1655 10 de E. eoli como um molde e os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOS: 38 e 39 para amplificar o fragmento de gene de ferredoxina (fdx). O fragmento de gene foi digerido com EcoRL, e inserido no sítio EcoRl de pMWPthr para construir um plasmídeo para amplificar o gene de ferredoxina (fdx), pMWPthr-fdx.

<7-6> Construção de um plasmídeo para amplificar gene de

ferredoxina (yfliL) de E. eoli

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa MG 1655 de E. eoli como um molde e os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOS: 40 e 41 para amplificar o fragmento de gene de ferredoxina (yfhL). O 20 fragmento de gene foi digerido com EeoRl, e inserido no sítio EeoRl de pMWPthr para construir um plasmídeo para amplificar o gene de ferredoxina (yfhL), pMWPthr-yfhL.

<7-7> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum e amplificar gene de ferredoxina NADP+ redutase e gene de flavodoxina (fldA) de E. eoli

pMWPthr-fldA foi digerido com EeoRl, e o fragmento de gene fldA obtido foi ligado com pMWPthr-KGS tratado com EeoRl para obter pMWPthr-KGS-fldA. Então, pMWPthr-fpr foi digerido com Smal, e o fragmento de gene fpr obtido foi ligado com pMWPthr-KGS-fldA tratado com Smal para construir um plasmídeo para expressar o gene de acetoglutarato sintase e acentuar expressão do gene de flavodoxina NADP+ redutase e do gene de flavodoxina (fldA) de E. eoli, pMWPthr-KGS-fpr-fldA.

<7-8> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum e amplificar o gene de flavodoxina NADP+ redutase e gene de flavodoxina (fldB) de E. eoli

O fragmento de gene fldB obtido digerindo pMWPthr-fldB com EeoRl foi ligado com pMWPthr-KGS tratado com EeoRl para obter pMWPthr-KGS-fldB. Então, pMWPthr-fpr foi digerido com Smal, e o 10 fragmento de gene fpr obtido foi ligado com pMWPthr-KGS-fldB tratado com Smal para construir um plasmídeo para acentuar expressão do gene de acetoglutarato sintase, do gene de flavodoxina NADP+ redutase e do gene de flavodoxina (fldB), pMWPthr-KGS-fpr-fldB.

<7-9> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum e amplificar gene de flavodoxina NADP+ redutase e gene de ferredoxina (fdx) de E. eoli

O fragmento de gene fdx obtido digerindo pMWPthr-fdx com EeoRl foi ligado com pMWPthr-KGS tratado com EcoRI para obter pMWPthr-KGS-fdx. Então, pMWPthr-fpr foi digerido com Smal, e o 20 fragmento de gene fpr obtido foi ligado com pMWPthr-KGS-fdx tratado com Smal para obter um vetor para acentuar expressão do gene de a-cetoglutarato sintase, do gene de flavodoxina NADP+ redutase e do gene de ferredoxina (fdx), pMWPthr-KGS-fpr-fdx.

<7-10> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum e amplificar gene de flavodoxina NADP+ redutase e gene de ferredoxina (yfhL) de E. eoli

O fragmento de gene yfhL obtido digerindo pMWPthr-yfhL com EcoRI foi ligado com pMWPthr-KGS tratado com EeoRl para obter pMWPthr-KGS-yfhL. Então, pMWPthr-fpr foi digerido com Smal, e o fragmento de gene fpr obtido foi ligado com pMWPthr-KGS-yfhL tratado com Smal para construir um plasmídeo para acentuar expressão do gene de acetoglutarato sintase, do gene de flavodoxina NADP+ redutase e do gene de ferredoxina (yfhL), pMWPthr-KGS-fpr-yfhL.

Nos plasmídeos mencionados acima, o gene de a-cetoglutarato

sintase de C. tepidum é transcrito a partir de Pthr, e os outros genes também são transcritos por leitura de Pthr.

Exemplo 8: Efeito em capacidade de produzir ácido Lglutâmico em uma cepa na qual expressão de gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. eoli são acentuadas com glicerol como fonte de carbono

A fim de examinar influência de acentuação de atividade de acetoglutarato sintase derivada de C. tepidum obtida por amplificação do gene 15 de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e o gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. eoli na produção de ácido L-glutâmico sob concentração limitada de oxigênio, os plasmídeos mencionados acima para acentuar expressão do gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, o gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e o gene de flavodoxina ou 20 ferredoxina de E. eoli foram introduzidos cada em MG1655AsucAAldhA, e cultura foi realizada.

<8-l> Introdução de plasmídeo para amplificar gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. eoli em cepa MG165 5Asuc AAldhA

O vetor para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, pMWPthr-KGS, e os plasmídeos para aumentar expressões do gene de α-cetoglutarato sintase, o gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e o gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. eoli, pMWPthr-KGS-fpr-fldA, pMWPthr-KGS-fpr-fldB, pMWPthr-KGS-fpr-fdx, pMWPthr-KGS-fpr-yfhL, o plasmídeo pMWPthr como um controle para comparação, e o plasmídeo para amplificar o gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli, pMWPthrfpr, foram introduzidos cada em MG 1655AsucAAldhA por eletroporação, e 5 transformantes foram obtidas com base em resistência a canamicina. Depois de confirmar introdução dos plasmídeos, as cepas introduzidas com plasmídeo foram designadas MG1655AsucAAldhAypMWPthr-KGS,

MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA, MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldB,

MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx,

MGl 655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL,

MG 1655Asuc AAldhA/pMWPthr e MGl 655AsucAAldhA/pMWPthr-fpr, respectivamente.

<8-2> Efeito em capacidade de produzir ácido L-glutâmico em cepas nas quais expressão de gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. eoli são acentuadas com glicerol como fonte de carbono

As cepas preparadas em <8-1>, a cepa na qual o gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum foi expresso, 20 MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS, as cepas nas quais expressões do gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, do gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e do gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. eoli foram acentuadas, MG 165 5AsucAAldhA7pMWPthr-KGS-fpr-fldA,

MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldB,

MGl 655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx,

MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL, as cepas de controle MG1655AsucAAldhA/pMWPthr, e a cepa na qual o gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli foi amplificado, MG1655AsucAAldhA/pMWPthrfpr, foram usadas para examinar capacidade de produzir ácido L-glutâmico destas observada com glicerol como uma fonte de carbono em condições aeróbicas.

Células de cada cepa cultivadas durante a noite a 37°C no meio LB foram inoculadas em uma quantidade correspondendo a 1/2 da placa 5 em 20 mL de um meio (o meio de glicerol descrito em Exemplo 6 contendo 40 mg/L de canamicina ao invés de cloranfenicol) em um frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas a 37°C por 29 horas em uma taxa de agitação de 120 rpm. Depois de conclusão da cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Chemical Industry). 10 Os resultados são mostrados em Tabela 4. Comparadas com

as cepas de controle, MG1655AsucAAldhA/pMWPthr, e MGl 655AsucAAldhA/pMWPthr-fpr nas quais gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli foi amplificado, o rendimento de ácido L-glutâmico foi melhorado em 3% com respeito ao glicerol consumido na cepa expressando o 15 gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS, e melhoras da mesma em 8 a 9% foram observadas em todas as cepas nas quais expressões do gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum, do gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. eoli e do gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. eoli foram 20 acentuadas, MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA,

MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldB,

MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx e

MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL.

Tabela 4

Cepa OD620 Glicerol Rendimento de residual (g/L) Ácido Lglutâmico (%) MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr 31,8 0,0 37,9 MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr-fpr 33,9 0,0 37,2 MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS 27,6 0,0 40,2 MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA 20,1 3,8 46,5 MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldB 20,1 2,3 46,7 MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx 22,8 0,0 46,5 MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL 19,7 2,5 46,8 Exemplo 9: Efeito em capacidade de produzir ácido Lglutâmico em uma cepa na qual gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. coli são acentuados com glicose como fonte de carbono sob oxigênio limitado

As cepas construídas em Exemplo 8, o controle, MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr, e as cepas nas quais expressões do gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, do gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e do gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. coli foram acentuadas, MG1655AsucAAldhA7pMWPthr-KGS-fpr-fldA,

MG 165 5 Asuc AAldhAYpM WPthr-KGS-fpr-fldB,

MGl 655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx e

MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL foram cultivadas cada durante a noite 37°C no meio LB como pré-cultura. Células de cada cepa 15 correspondendo a 1/6 da placa foram inoculadas em 50 mL de um meio (o meio de glicose descrito em Exemplo 5 contendo 40 mg/L de canamicina ao invés de cloranfenicol) em um frasco cônico de 500 ml de volume, e cultivadas a 37°C por 38 horas. A fim de restringir oxigênio, a cultura foi realizada em uma taxa de agitação de 100 rpm. Depois de conclusão da 20 cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Chemical Industry).

Os resultados são mostrados em Tabela 5. Comparado com o controle, MG 165 5 Asuc AAldhA/pM WPthr, o rendimento de ácido Lglutâmico foi melhorado em todas as cepas nas quais expressões do gene de 25 α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, do gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e do gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. coli foram acentuadas, MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA,

MG 1655AsucAAldhA/pM WPthr-KGS-fpr-fldB,

MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx e MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL.

Tabela 5

Cepa OD620 Glicose Rendimento de residual (g/L) Ácido Lglutâmico (%) MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr 13,8 0,0 0,91 MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA 13,8 0,0 1,34 MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldB 12,8 0,0 1,38 MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fdx 13,8 0,0 1,48 MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-yfhL 13,0 0,0 1,43 Exemplo 10: Efeito em capacidade de produzir ácido L

glutâmico em cepa na qual expressões de gene de α-cetoglutarato sintase de 5 C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e gene de flavodoxina de E. coli são acentuadas com glicerol como fonte de carbono

A cepa preparada em Exemplo 8, a cepa na qual expressões do gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, do gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e do gene de flavodoxina de E. coli foram 10 acentuadas, MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA, e a cepa de controle, MGl 655AsucAAldhA/pM WPthr foram usadas para examinar capacidade de produzir ácido L-glutâmico destas em uma condição aeróbica com glicose como uma fonte de carbono.

Células de cada cepa cultivadas durante a noite a 37°C no 15 meio LB foram inoculadas em uma quantidade correspondendo a 1/4 da placa em 20 mL de um meio de glicose + metionina (o meio de glicose descrito em Exemplo 5 contendo 40 mg/L de canamicina ao invés de cloranfenicol e posteriormente adicionado com 0,2 g/L de DL-metionina) em um frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas a 37°C por 25 horas em uma 20 taxa de agitação de 120 rpm. Depois de conclusão da cultura, ácido Lglutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Chemical Industry).

Os resultados são mostrados em Tabela 6. Comparada com o controle, MG 165 5Asuc ΑΔ1dhA/pMWPthr, melhora do rendimento em cerca de 6% foi observada para a cepa na qual expressões do gene de acetoglutarato sintase de C. tepidum, do gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e do gene de flavodoxina de cepa de E. coli foram acentuadas, MG 1655Asuc AAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA.

Tabela 6

Cepa OD620 Glicose Rendimento de residual (g/L) Ácido Lglutâmico (%) MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr 24,6 0,0 40,6 MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA 24,1 0,0 46,8 Exemplo 11: Efeito em capacidade de produzir ácido L

glutâmico em Pantoea ananatis na qual expressões de gene de a-cetoglutarato sintase de C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e gene de flavodoxina de E. coli são acentuadas com glicerol como fonte de carbono

A fim de examinar efeito de acentuação de atividade de a10 cetoglutarato sintase em produção de ácido L-glutâmico em P. ananatis, o plasmídeo para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, o gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e o gene de flavodoxina de E. coli preparados em Exemplo 7, pMWPthr-KGS-fpr-fldA, e o plasmídeo de controle, pMWPthr, foram introduzidos cada em uma cepa de P. ananatis 15 produtora de ácido L-glutâmico, e cultura foi realizada.

<11-1> Construção de cepa de P. ananatis produtora de ácido

L-glutâmico

O plasmídeo RSFCPG carregando o gene de citrato sintase (gltA), o gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) e o gene de glutamato 20 desidrogenase (gdhA) de E. coli (se referir a Publicação de Patente Européia No. 1233068) teve extremidades cegas por digestão com BgUl e Kpnl e então ligado para eliminar o gene gltA. A cepa JMl09 de E. coli foi transformada com o plasmídeo obtido. Um plasmídeo foi extraído de um transformante resultante, e designado pRSF-ppc-gdhA. Este plasmídeo pRSF-ppc-gdhA foi 25 introduzido na cepa NP 106 de P. ananatis, que é uma cepa produtora de ácido L-glutâmico, para construir a cepa, NP106/pRSF-ppc-gdhA.

A cepa NP 106 foi obtida como segue. A cepa AJ13601 de P. ananatis descrita acima foi cultivada durante a noite a 34°C no meio líquido LBGM9 com agitação, e então o meio foi diluído de forma que 100 a 200 colônias apareceram por cada placa e aplicadas a uma placa LBGM9 contendo 12,5 mg/L de tetraciclina. As colônias que apareceram foram 5 replicadas para uma placa LBGM9 contendo 12,5 mg/L de tetraciclina e 25 mg/L de cloranfenicol, e uma cepa que se tomou sensível a cloranfenicol foi selecionada para obter uma cepa cujo pSTVCB foi eliminado, que foi designado G106S. A cepa G106S foi posteriormente cultivada durante a noite a 34°C no meio líquido LBGM9 com agitação, e o meio foi diluído de forma 10 que 100 a 200 colônias apareceram por cada placa, e aplicadas a uma placa LBGM9 não contendo nenhum fármaco. As colônias que apareceram foram replicadas para uma placa LBGM9 contendo 12,5 mg/L de tetraciclina e uma placa LBGM9 não contendo nenhum fármaco, e uma cepa que se tomou sensível a tetraciclina foi selecionada para obter uma cepa cujo RSFCPG foi 15 eliminado, que foi designada NP 106. A NP 106 obtida como descrito acima não contém ambos os plasmídeos RSFCPG e pSTVCB, que são abrigados pela cepa AJ13 601.

<11-2> Introdução de um plasmídeo para expressar gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase e gene de flavodoxinafldA de E. coli em cepa NP 106/pRSF-ppc-gdhA

Em NPl 06/pRSF-ppc-gdhA, cada um dos plasmídeos para aumentar expressões do gene de α-cetoglutarato sintase, do gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e do gene de flavodoxina ou ferredoxina de E. coli, pM WPthr-KG S-fpr-fldA, e o plasmídeo de controle 25 para comparação, pMWPthr, foi introduzido por eletroporação, e transformantes foram obtidos com base em resistência a canamicina e tetramicina. Depois de confirmar introdução dos plasmídeos, as cepas introduzidas com plasmídeo foram designadas NP106/pRSF-ppcgdhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA e NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr, respectivamente.

<ll-3> Cultura de uma cepa introduzida com plasmídeo para amplificar gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, gene de flavodoxina NADP+ redutase e gene de flavodoxina fldA de E. coli com glicerol como fonte de carbono em condição aeróbica

Duas das cepas construídas em <11-1> foram cultivadas cada durante a noite 37°C no meio LBMG (meio LB adicionado com 0,5 g/L de glicose, 2 mM de MgSO, 3g/L de ΚΗΡΟ , 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl e 6 g/L de NaHPO.). Células correspondendo a 1/4 da placa foram inoculadas em 10 20 ml de um meio de glicerol para Pantoea tendo a composição seguinte em um frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas a 34°C por 48 horas a 120 rpm. Depois de conclusão da cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Chemical Industry).

[Composição de meio de glicerol para Pantoea]

Glicerol 40 g/L MgSO4 ·7Η20 1,0 g/L (NH4)2SO4 20 g/L KH2PO4 2,0 g/L Extrato de levedura 2,0 g/L FeSO4’7H20 0,02 g/L MnSO4-5H20 0,02 g/L Tiamina HCl 0,01 g/L L-Iisina 0,2g/L r 0,2g/L Acido DL-diaminopimérico L-metionina 0,2g/L Canamicina 40 mg/L Tetraciclina 2,5 mg/L Carbonato de cálcio 20 g/L pH 7,0 (ajustado com KOH) Condição de esterilização: 120°C, 20 minutos

Os resultados são mostrados em Tabela 7. Comparada com o controle, NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr, melhora do rendimento de ácido L-glutâmico em cerca de 3% foi observada na cepa 5 na qual expressões do gene de α-cetoglutarato sintase de C. tepidum, do gene de flavodoxina NADP+ redutase de E. coli e do gene de flavodoxina de E. coli foram acentuadas, NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA.

Tabela 7

Cepa OD620 Glicose Rendimento de residual (g/L) Ácido Lglutâmico (%) NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pM WPthr 8,7 0,0 40,8 NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr-KGS-fpr-fldA 1,5 0,0 44,1 Exemplo 12: Efeito em capacidade de produzir ácido L

glutâmico em uma cepa na qual expressão de gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum é acentuada com glicose como fonte de carbono em condições aeróbicas

As cepas preparadas em Exemplo 8, a cepa na qual expressão apenas do gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium 15 tepidum foi acentuada, MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS, e a cepa de controle MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr, foram usadas para examinar capacidade de produzir ácido L-glutâmico destas observada com glicose como uma fonte de carbono em condições aeróbicas.

Células de cada cepa pré-cultivadas durante a noite a 37°C no

meio LB foram inoculadas em uma quantidade correspondendo a 1/4 da placa em 20 mL de um meio de glicose + metionina (o meio de glicose descrito em Exemplo 5, com um teor de glicose ajustado para 35,0 g/L, adicionado com 40 mg/L de canamicina ao invés de cloranfenicol, e adicionalmente 25 suplementado com 0,2 g/L DL-metionina) em um frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas a 37°C por 23 horas em uma taxa de agitação de 120 rpm. Depois de conclusão da cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (fabricado por Asahi Kasei Corporation).

Os resultados são mostrados em Tabela 8. Se comparado com o controle, MG 165 5Asuc AAldhA/pMWPthr, o rendimento foi melhorado em cerca de 6% em MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS, a cepa na qual expressão apenas do gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum foi acentuada.

Tabela 8

Cepa OD620 Glicose Rendimento de residual ácido L(BdL) glutâmico (%) MG 1655Asuc AAldh/pMWPthr 27,3 0,0 35,5 MG 1655AsucAAldh/pMWPthr-KGS 26,5 0,0 42,1 Exemplo 13: Efeito em capacidade de produzir ácido L

glutâmico em Pantoea ananatis na qual gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum é acentuado com glicerol como fonte de carbono em condições aeróbicas

A fim de examinar efeito de acentuação apenas de atividade de α-cetoglutarato sintase em produção de ácido L-glutâmico em Pantoea 15 ananatis, os plasmídeos preparados em Exemplo 7, o plasmídeo para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum, pMWPthr-KGS, e o plasmídeo de controle, pMWPthr, foram introduzidos cada em uma cepa de Pantoea ananatis produtora de ácido L-glutâmico, e cultura foi realizada.

Em NPl 06/pRSF-ppc-gdhA preparado em Exemplo 11, cada

um dos plasmídeos para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase preparados em Exemplo 7, pMWPthr-KGS, e o plasmídeo de controle, pMWPthr, foram introduzidos por eletroporação, e transformantes foram obtidos com base em resistência a canamicina e tetramicina. Depois de 25 confirmar introdução dos plasmídeos, as cepas introduzidas com plasmídeos de pMWPthr-KGS e pMWPthr foram designadas NP106/pRSF-ppcgdhA/pMWPthr-KGS e NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr, respectivamente. A NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr-KGS e NP106/pRSFppc-gdhA/pMWPthr foram cada pré-cultivadas durante a noite a 37°C no meio LBMG. Células correspondendo a 1/4 da placa foram inoculadas em 20 ml de um meio de glicerol para Pantoea tendo a composição seguinte em um 5 frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas a 34°C por 66 horas a 100 rpm. Depois de conclusão da cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Kasei Corporation).

[Composição de meio de cultura de glicerol para Pantoea]

Glicerol 30 g/L

MgSO4-7H20 0,5 g/L

(NH4)2SO4 20 g/L

KH2PO4 2,0 g/L

Extrato de levedura 2,0 g/L

FeS04-7H20 0,02 g/L

MnSO4 SH2O 0,02 g/L

r

Acido pantotênico Ca 18 mg/L

TiaminaHCl 0,01 g/L

L-Iisina 0,2 g/L

r

Acido DL-diaminopimélico 0,2 g/L

L-metionina 0,2 g/L

Canamicina 40 mg/L

Tetraciclina 12,5 mg/L

Carbonato de cálcio 20 g/L

pH 7,0 (ajustado com KOH) condição esterilizante: 115°C, 10

minutos

Os resultados são mostrados em Tabela 9. Se comparado com o controle, NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr, o rendimento foi melhorado em cerca de 8% em NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr-KGS, a cepa na qual expressão do gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum foi acentuada.

Tabela 9

Cepa OD620 Glicerol Rendimento de residual ácido L(g/L) glutâmico (%) NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pM WPthr 8,4 0,0 47,9 NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr-KGS 6,9 0,0 56,2 Exemplo 14: Efeito em capacidade de produzir ácido L

glutâmico em Pantoea ananatis na qual gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum é acentuado sob concentração limitada de oxigênio com glicerol como fonte de carbono

A fim de examinar efeito de acentuação apenas de atividade de α-cetoglutarato sintase em produção de ácido L-glutâmico em Pantoea ananatis em condições microaeróbicas, NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pM WPthr10 KGS e NP106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr preparados em Exemplo 13 foram cultivados com glicerol como uma fonte de carbono em condições microaeróbicas.

A NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr-KGS e NP106/pRSFppc-gdhA/pMWPthr foram cada pré-cultivadas durante a noite a 37°C no 15 meio LBMG. Células correspondendo a 1/4 da placa foram inoculadas em 20 ml de um meio de glicerol para Pantoea tendo a composição seguinte em um frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas a 34°C por 90 horas a 100 rpm. Depois de conclusão da cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Kasei Corporation).

[Composição de meio de cultura de glicerol para Pantoea]

Glicerol 30 g/L

MgSO4-7H20 0,5 g/L

(NH4)2SO4 20 g/L

KH2PO4 2,0 g/L

Extrato de levedura 2,0 g/L

FeSO4-7H20 0,02 g/L

MnSO4 SH2O 0,02 g/L 10

Tiamina HCl Canamicina Tetraciclina Carbonato de cálcio

0,01 g/L 40 mg/L 12,5 mg/L 20 g/L

pH 7.0 (ajustado com KOH) condição esterilizante: 115°C, 10

minutos

Os resultados são mostrados em Tabela 10. Comparado com o controle, NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pMWPthr, o rendimento de ácido Lglutâmico foi melhorado em cerca de 30% em NP106/pRSF-ppcgdhA/pMWPthr-KGS, a cepa na qual expressão do gene de a-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum foi acentuada.

Tabela 10

Cepa OD620 Glicerol Rendimento de residual ácido L(g/L) glutâmico (%) NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pM WPthr 3,5 0,0 1,1 NP 106/pRSF-ppc-gdhA/pM WPthr-KGS 6,1 0,0 31,1 15

20

25

Exemplo 15: Efeito em capacidade de produzir ácido Lglutâmico em E. coli expressando gene de α-cetoglutarato sintase de Blastopirellula marina com glicerol como fonte de carbono

A fim de examinar efeito de expressão de atividade de acetoglutarato sintase de B. marina em produção de ácido L-glutâmico com glicerol como uma fonte de carbono, um plasmídeo para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase de B. marina foi construído e introduzido em E. coli MG 165 5AsucAAldhA, e cultura foi realizada.

<15-1> Construção de um plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de B. marina

PCR foi realizado usando o DNA genômico da cepa DSM3645 de B. marina (ATCC 49069) como um molde e os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOS: 61 e 62 para amplificar um fragmento de gene contendo a subunidade α e subunidade β de α-cetoglutarato sintase. O fragmento de gene obtido foi digerido com KpnI e EcoRI e inserido em pMWPthr digerido com KpnI e EcoRI para construir um plasmídeo para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase de B. marina, que foi designado pM WPthr-BlaKGS.

<15-2> Cultura de uma cepa expressando gene de acetoglutarato sintase de B. marina com glicerol como fonte de carbono em condições aeróbicas

Em MG 1655AsucAAldhA, cada de pMWPthr-BlaKGS e o vetor de controle pMWPthr foi introduzido por eletroporação, e transformantes foram obtidos com base em resistência a canamicina. Depois 10 de confirmar introdução dos plasmídeos, a cepa expressando o gene de acetoglutarato sintase de B. marina e a cepa de controle foram designadas MGl 655AsucAAldhA/pMWPthr-BlaKGS e MG 165 5Asuc AAldhA/pMWPthr, respectivamente.

MGl 65 5 Asuc AAldhA/pM WPthr-BlaKGS e a cepa de controle 15 MG 165 5AsucΑΔ1 dhA/pMWPthr foram inoculadas no meio LB e précultivadas durante a noite a 37°C. Células correspondendo a 1/2 da placa foram inoculadas em 20 mL de um meio de glicerol tendo a composição seguinte em um frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas aerobicamente a 37°C por 22 horas em uma taxa de agitação de 120 rpm. 20 Depois de conclusão da cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (Asahi Kasei Corporation).

[Composição de meio de cultura de glicerol]

Glicerol 30 g/L

MgS04-7H20 1,0 g/L

(NH4)2SO4 20 g/L

KH2PO4 1,0 g/L

Extrato de levedura 2,0 g/L

FeSO4-7H20 0,01 g/L

MnSO4SH2O 0,01 g/L TiaminaHCl 0,01 g/L

Canamicina 40 mg/L

Carbonato de cálcio 30 g/L

pH 7,0 (ajustado com KOH) condição esterilizante: 120°C, 20

minutos

Os resultados são mostrados em Tabela 11. Se comparado com o controle MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr, rendimento de ácido Lglutâmico com respeito a glicerol consumido foi melhorado em cerca de 8% em MG 165 5Asuc AAldhA/pM WPthr-BlaKGS introduzido com o vetor de expressão incluindo apenas o gene de α-cetoglutarato sintase de B. marina.

Tabela 11

Cepa OD620 Glicerol Rendimento de residual ácido L(g/L) glutâmico (%) MG 1655 AsucAAIdh/pM WPthr 20,4 0,0 40,6 MG 1655AsucAAIdh/pMWPthr-B IaKGS 24,0 0,0 48,7 Exemplo 16: Efeito em capacidade de produzir ácido L

glutâmico em uma cepa na qual expressão de gene de α-cetoglutarato sintase de B. marina é acentuada com glicose como fonte de carbono em condições aeróbicas

A cepa na qual expressão do gene de α-cetoglutarato sintase de B. marina foi acentuada e preparada em Exemplo 15, MG1655AsucAAldhA/pMWPthr-BlaKGS, e a cepa de controle MG1655AsucAAldhA/pMWPthr, foram usadas para examinar capacidade de 20 produzir ácido L-glutâmico destas observada com glicose como uma fonte de carbono.

Células de cada cepa pré-cultivadas durante a noite a 37°C no meio LB foram inoculadas em uma quantidade correspondendo a 1/2 da placa em 20 mL de um meio de glicose + metionina (o meio de glicose descrito em 25 Exemplo 5, com um teor de glicose ajustado para 30,0 g/L, suplementado com 40 mg/L de canamicina ao invés de cloranfenicol, e adicionalmente suplementado com 0,2 g/L de DL-metionina) em um frasco Sakaguchi de 500 ml de volume, e cultivadas a 37°C por 24 horas em uma taxa de agitação de 120 rpm. Depois de conclusão da cultura, ácido L-glutâmico acumulado no meio foi medido usando um Biotech Analyzer (fabricado por Asahi Kasei Corporation).

Os resultados são mostrados em Tabela 12. Comparado com o

controle, MG 165 5AsucAAldhA/pMWPthr, o rendimento foi melhorado em cerca de 6% em MG 1655AsucAAldhA/pMWPthr-KGS, a cepa na qual expressão apenas do gene de α-cetoglutarato sintase de B. marina foi acentuada.

Tabela 12

Cepa OD620 Glicose Rendimento de residual ácido L(S/L) glutâmico (%) MG 1655AsucAAldh/pMWPthr 18,9 0,0 34,3 MG1655AsucAAldh/pMWPthr-BlaKGS 14,5 0,0 40,4 Exemplo 17: Construção de cepa 2256AldhAsucA a partir de

cepa tipo selvagem de B. Iactofermentum

Uma cepa que é deficiente em um gene sueA (odhA) codificando a subunidade Elo de α-cetoglutarato desidrogenase foi construída a partir de cepa 2256Aldh (veja Patente Internacional 2005/113744) que havia sido obtida a partir de cepa deficiente em IdhA de Brevibaeterium lactofermentum (Corynebaeterium glutamicum), a cepa 2256 (ATCC13869).

Um fragmento de gene com uma deleção em ORP de subunidade Elo de gene de α-cetoglutarato desidrogenase derivado de cepa B. 20 lactofermentum 2256 (daqui por diante, abreviado como gene sucA) foi obtido por crossover PCR usando DNAs sintéticos desenhados baseados na seqüência de nucleotídeos descrita do gene de C. glutamicum ATCC13032 (No. de Acesso de Banco de Dados GenBank NC_003450) (SEQ ID NO:51) como iniciadores. Especificamente, PCR foi realizado em conformidade com 25 um método convencional usando o DNA genômico de cepa 2256 de B. lactofermentum como um molde e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 63 e 64 como iniciadores para obter um produto amplificado do término N do gene sucA. Por outro lado, a fim de obter um produto amplificado do término C do gene sucA, PCR foi realizado em conformidade com um método convencional usando o DNA genômico de cepa 2256 de B. lactofermentum como um molde e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 65 e 66 como iniciadores. SEQ ID 5 NOS: 64 e 65 são complementares um ao outro.

Subseqüentemente, os produtos de genes do término N e término C de sucA foram misturados em uma quantidade perto de equimolar e usados como um molde em PCR em conformidade com um método convencional usando os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 63 e 66 como 10 iniciadores para obter um produto amplificado de gene sucA onde uma mutação foi introduzida. Assim, um fragmento amplificado de gene sucA com uma deleção de seqüência quase interna. O produto de PCR resultante foi purificado em conformidade com um método convencional e digerido com BamHl, seguido por inserção no sítio Sall de pBS3 descrito em Patente 15 Internacional 2005/113744. O DNA foi transformado em células competentes de E. coli JMl09 (TAKARA BIO INC.), e as células foram aplicadas a meio LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 μg/mL de X-Gal, e 25 μg/mL de Km e cultivadas durante a noite. Depois disso, colônias brancas sendo geradas foram separadas, e uma única colônia foi então isolada, com isso obtendo um 20 transformante. Plasmídeos foram extraídos do transformante obtido, e um plasmídeo onde um produto de PCR de interesse foi inserido foi designado pAsucA56-l.

O pAsucA56-l não inclui uma região que permite que bactérias corineformes se repliquem autonomamente em células, e no caso 25 onde uma bactéria corineforme é transformada com o plasmídeo, uma cepa tendo o DNA genômico integrado com o plasmídeo por recombinação homóloga aparece como um transformante, embora em uma freqüência extremamente baixa. Cepa 2256 de B. lactofermentum foi transformada com um alto nível do plasmídeo pAldh56-l pelo método de pulso elétrico e aplicada ao meio CM-Dex contendo 25 μ§/ιη1 de canamicina, e cultura foi realizada a 31,5°C por cerca de 30 horas. A cepa cultivada no meio é uma cepa tendo o genoma onde um gene resistente a canamicina e gene sacB derivado do plasmídeo foi inserido por recombinação homóloga entre um 5 fragmento de gene Idh do plasmídeo e o gene no genoma de cepa 2256 de B. lactofermentum.

[Meio de cultura CM-Dex]

Glicose 5 g/L Polipeptona 10g/L Extrato de levedura 10 g/L KH2PO4 lg/L MgSO4-7H20 0,4 g/L FeSO4-7H20 0,01 g/L MnS04-7H20 0,01 g/L Uréia 3 g/L Hidrolisado de soja 1,2 g/L Biotina 10 μg/L pH 7,5 (ajustado com NaOH) condição esterilizante: 120°C, 20 minutos

Então, o primeiro recombinante foi cultivado no meio líquido

CM-Dex não contendo nenhuma canamicina a 31,5 0C durante a noite e apropriadamente diluído, e o resultante foi aplicado ao meio Dex-SlO contendo 10% de sacarose não contendo canamicina (meio CM-Dex contendo 10 g/L de sacarose ao invés de glicose) e cultivadas a 31,5°C por cerca de 30 25 horas. Como um resultado, cerca de 60 cepas, que foram consideradas como se tomando insensíveis a sacarose devido à eliminação do gene sacB por segunda recombinação homóloga, foram obtidas.

As cepas assim obtidas incluem uma cepa na qual o gene sucA foi substituído pelo tipo deficiente -derivado de pAsucA56-l e uma cepa na qual o gene sucA foi revertido para o tipo selvagem. Se o gene sucA é o tipo mutante ou o tipo selvagem pode ser facilmente confirmado sujeitando diretamente as células obtidas cultivando em meio de ágar Dex-SlO para PCR e detectando seu gene sucA. Em análise de PCR usando os iniciadores (SEQ 5 ID NOS: 63 e 66) para amplificar gene sucA, uma cepa que rendeu um produto de PCR tendo um tamanho menor do que o tamanho de um produto obtido por PCR usando um DNA genômico da cepa 2256 como um molde foi definida como uma cepa deficiente em sucA e usada nos experimentos seguintes. Como um resultado da análise das cepas insensíveis a sacarose 10 pelo método mencionado acima, uma cepa contendo apenas o gene sucA foi selecionada e designada cepa 2256AldhAsucA.

Exemplo 18: Efeito em capacidade de produzir ácido Lglutâmico em B. lactofermentum expressando gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum sob concentração limitada de oxigênio com glicerol como fonte de carbono

A fim de examinar efeito de expressão de atividade de acetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum em produção de ácido Lglutâmico em B. lactofermentum com glicose como uma fonte de carbono, um plasmídeo para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium 20 tepidum foi construído e introduzido em cepa 2256AldhAsucA de B. lactofermentum, e cultura foi realizada.

<18-1> Construção de plasmídeo para expressar gene de acetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum

Um fragmento de gene de KGS com substituição de um promotor de tuf pelo anterior do gene foi obtido por crossover PCR usando, como iniciadores, DNAs sintéticos desenhados baseado nas seqüências de nucleotídeos descritas ao redor do gene tuf e gene KGS de C. glutamicum ATCC13032 (No. de Acesso de Banco de Dados GenBank NC_003450).

Especificamente, um fragmento de KGS foi amplificado por PCR usando pMWPthr-KGS-fpr-fldA, o plasmídeo para expressar o gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum e para acentuar expressão do gene de ferredoxina-NADP+ redutase e gene de flavodoxina (fldA) de E. coli construída em Exemplo 7, como um molde, e usando os iniciadores 5 mostrados em SEQ ID NOS: 67 e 68, e o resultante foi tratado com Pstl e Xbal, seguido por inserção nos sítios Pstl e Xbal de pVK9 para construir um plasmídeo pVKKGS carregando KGS. Se o plasmídeo é tratado com Pstl e Aatll, é possível remover uma parte do ORF de KGS.

Um fragmento (A) incluindo a seqüência N-terminal de KGS é amplificado por PCR usando o plasmídeo pMWPthr-KGS-fpr-fldA construído em Exemplo 7 como um molde e usando os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 69 e 70. Por outro lado, um fragmento de promotor de tuf

(B) foi amplificado por PCR usando o DNA do plasmídeo pVKPtuf como um molde e usando os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 71 e 72. SEQ ID NOS 69 e 72 são complementares um ao outro.

Subseqüentemente, crossover PCR foi realizado usando os fragmentos (A) e (B) como moldes e usando os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 73 e 74 para construir um fragmento contendo a seqüência Nterminal de KGS no qual o promotor inerente é substituído pelo promotor de 20 tuf Os produtos de PCR resultantes foram purificados em conformidade com um método convencional e tratados com Pstl e Aatll, seguido por inserção nos sítios Pstl e Aatll de pVKKGS para construir um plasmídeo p VKPtufKGS para amplificar KGS com substituição de um promotor de gene tuf pelo promotor inerente.

O pVK9 é um vetor de transferência inserido com

fragmentos obtidos: cegando a extremidade do sítio AvaII de pHSG299 (TAKARA BIO INC.); e removendo uma região que está em pHK4 (Patente Japonesa 05-007491 A) e é autonomamente replicável em bactérias corineformes com BamHl e Kpnl e cegando a extremidade dos sítios. Por enquanto, pVKPtuf para comparação é um plasmídeo construído inserindo um fragmento de promotor de tuf amplificado por PCR usando o genoma de cepa MJ-233 de B. flavum (FERM BP-1497) como um molde e os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 75 e 76 no 5 sítio Pstl de pVK. A seqüência de promotor de tuf de cepa MJ-233 de B. flavum é mostrada em SEQ ID NO:77. Similarmente, o fragmento de promotor de tuf também pode ser obtido usando DNA genômico de cepa ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum como um molde.

<18-2> Introdução de gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum em cepa 2256AldhAAsucA

Em 2256AldhAAsucA, cada de pVKPtuf-KGS e o vetor de controle pVKPtuf foi introduzido por eletroporação, e transformantes foram obtidos com base em resistência a canamicina. Depois de confirmar introdução dos plasmídeos, a cepa expressando o gene de α-cetoglutarato sintase de 15 Chlorobium tepidum e a cepa de controle foram designadas 2256AldhAAsucA/pVKPtuf-KGS e 2256AldhAAsucA/pVKPtuf,

respectivamente.

<18-3> Cultura de uma cepa expressando gene de acetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum com glicerol como fonte de carbono em condição anaeróbica

As cepas construídas em <18-2>, a cepa expressando o gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum, 2256AldhAAsucA/pVKPtuf-KGS, e a cepa de controle 2256AldhAAsucA/pVKPtuf, foram usadas para examinar capacidade de 25 produzir ácido L-glutâmico destas observada com glicose como uma fonte de carbono em condições anaeróbicas de cultura. Células pré-cultivadas no meio de ágar CM-Dex a 31,5 0C durante a noite foram inoculadas em 3 ml de um meio de inseminação e cultivadas com agitação em um tubo de teste a 31,5°C por cerca de 16 horas em condições aeróbicas. [Meio de cultura de inoculação]

Glicose 10 g/L (NH4)2SO4 2,5 g/l KH2PO4 0,5 g/L MgSO4VH2O 0,25 g/L Uréia 2 g/L FeSO4YH2O 0,01 g/L MnS04-7H20 0,01 g/L Biotina 50 μg/L VBl HCl 100 pg/L Ácido protocatecóico 15 mg/L CuSO4 0,02 mg/L CaCl2 10 mg/L pH 7,0 (ajustado com KOH) condição esterilizante: 115°C, 10 minutos]

A 3 mL de um caldo de cultura de inoculação foi adicionado com 3 mL de um meio principal, e um tubo de teste foi tampado com uma tampa de silicone para inibir ventilação, seguido por agitar a cultura a 31,5°C. 66 horas depois, cultura foi interrompida, e ácido L-glutâmico acumulado no 20 meio foi medido usando um Biotech Analyzer (fabricado por Asahi Kasei Corporation).

[Meio de cultura principal]

Glicose 60 g/L (NH4)2SO4 30 g/l KH2PO4 4 g/L Uréia 6 g/L FeS04-7H20 0,02 g/L MnSO4-7H20 0,02 g/L Biotina 400 pg/L VBl-HCl 400

MgCO4 50 g/L

ρΗ 6,8 (ajustado com NaOH) condição esterilizante: 115°C, 10 minutos Os resultados são mostrados em Tabela 13. Comparado com o controle 2256AIdhAsucA/pVKPtuf, rendimento de ácido L-glutâmico com respeito à glicose consumida foi melhorado em cerca de 0,6% em 2256AIdhAsucA/pVKPtuf-KGS introduzida com o vetor de expressão incluindo apenas o gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum.

Tabela 13

Cepa OD620 Glicose Rendimento de residual ácido L(g/L) glutâmico (%) 2256AIdhAsuc A/p VKPtuf 7,6 0,48 3,1 2256AIdhAsuc A/p VKPtuf-KGS 6,6 6,02 3,7 [Explicação de Listagem de Seqüências]

SEQ ID NO:l: seqüência de nucleotídeos de gene de subunidade α de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:2: seqüência de aminoácidos de subunidade α de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum SEQ ID NO:3: seqüência de nucleotídeos de gene de

subunidade β de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:4: seqüência de aminoácidos de subunidade β de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:5: seqüência de nucleotídeos de gene fpr de Escherichia coli

SEQ ID NO:6: seqüência de aminoácidos codificada por gene fpr de Escherichia coli

SEQ ID NO:7: seqüência de nucleotídeos de gene de piruvato sintase de Chlorobium tepidum SEQ ID NO:8: seqüência de aminoácidos de piruvato sintase

de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:9: seqüência de nucleotídeos de gene fdx de Escherichia coli

SEQ ID NO: 10: seqüência de aminoácidos codificada por gene fdx de Escherichia coli

SEQ ID NO:ll: seqüência de nucleotídeos de gene yfhL de Escherichia coli

SEQ ID NO: 12: seqüência de aminoácidos codificada por gene yfhL de Escherichia coli

SEQ ID NO: 13: seqüência de nucleotídeos de gene fldA de Escheriehia coli

SEQ ID NO: 14: seqüência de aminoácidos codificada por gene

fldA de Escherichia coli

SEQ ID NO: 15: seqüência de nucleotídeos de gene fldB de Escherichia coli

SEQ ID NO: 16: seqüência de aminoácidos codificada por gene fldB de Escherichia coli

SEQ ID NO: 17: seqüência de nucleotídeos de gene de ferredoxina I de Chlorobium tepidum

SEQID NO: 18: seqüência de aminoácidos codificada por gene de ferredoxina I de Chlorobium tepidum SEQ ID NO: 19: seqüência de nucleotídeos de gene de

ferredoxina II de Chlorobium tepidum

SEQ ID N0:20: seqüência de aminoácidos codificada por gene de ferredoxina II de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:21: iniciador 1 para amplificação de gene de acetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:22: iniciador 2 para amplificação de gene de acetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:23: iniciador 1 para amplificação de gene de piruvato sintase de Chlorobium tepidum SEQ ID NO:24: iniciador 2 para amplificação de gene de piruvato sintase de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:25: iniciador 1 para amplificação de gene de ferredoxina I de Chlorobium tepidum SEQ ID NO:26: iniciador 2 para amplificação de gene de

ferredoxina I de Chlorobium tepidum

SEQID NO:27: iniciador 1 para deleção de IdhA SEQID NO:28: iniciador 2 para deleção de IdhA SEQ ID NO:29: iniciador 1 para confirmação de deficiência de

I0 IdhA

SEQ ID N0:30: iniciador 2 para confirmação de deficiência de

IdhA

SEQ ID NO:31: seqüência de promotor do operon de treonina SEQ ED NO:32: iniciador 1 para amplificação de gene de flavodoxina NADP+ redutase de Escherichia coli

SEQ ID NO:33: iniciador 2 para amplificação de gene de flavodoxina NADP+ redutase de Escherichia coli

SEQ ID NO:34: iniciador 1 para amplificação de gene fldA de Escherichia coli

SEQ ID NO:35: iniciador 2 para amplificação de gene fldA de

Escherichia coli

SEQ ID NO:36: iniciador 1 para amplificação de gene fldB de Escherichia coli

SEQ ID NO:37: iniciador 2 para amplificação de gene fldB de Escherichia coli

SEQ ID NO:38: iniciador 1 para amplificação de gene fdx de Escherichia coli

SEQ ID NO:39: iniciador 2 para amplificação de gene fdx de Escherichia coli SEQ ID N0:40: iniciador 1 para amplificação de gene yhfL de Escherichia coli

SEQ ID NO:41: iniciador 2 para amplificação de genQyftiL de Eseheriehia coli

SEQ ID NO:42: iniciador de PCR para amplificação de

fragmento de término N de gene sucA

SEQ ID NO:43: iniciador de PCR para amplificação de fragmento de término N de gene sucA

SEQ ID NO:44: iniciador de PCR para amplificação de fragmento de término C de gene sucA

SEQ ID NO:45: iniciador de PCR para amplificação de fragmento de término C de gene sucA

SEQ ID NO:46: seqüências de nucleotídeos de gene de subunidade α-KGDH de Pantoea ananatis e genes vizinhos sdhB: 2 a 121

sucA: 322 a 3129 sueB: 3145 a 4368 sueC: 4437 a 4556

SEQ ID NO:47: seqüência de aminoácidos de proteína ferroenxofre succinato desidrogenase (seqüência parcial)

SEQ ID NO:48: seqüência de aminoácidos de subunidade aKGDH Elo de Pantoea ananatis

SEQ ID NO:49: seqüência de aminoácidos de subunidade aKGDH E2o de Pantoea ananatis SEQ ID N0:50: parte de subunidade β de succinil-CoA

sintetase de Pantoea ananatis

SEQ ID NO:51: seqüência de nucleotídeos de gene odhA de Brevibaeterium lactofermentum

SEQ ID NO:52: seqüência de aminoácidos de subunidade Elo codificada por odhA de Brevibacterium lactofermentum

SEQ ID NO:53: seqüência de nucleotídeos de gene codificando subunidade E2o de Brevibacterium lactofermentum (NCgl2126 de No. de Acesso de GenBank NC_003450)

SEQ ID NO:54: seqüência de aminoácidos de subunidade E2o

de Brevibacterium lactofermentum codificada por NCgl2126

SEQ ID NO:55: seqüência de nucleotídeos de gene sucA de Escherichia coli

SEQ ID NO:56: seqüência de aminoácidos de subunidade aKGDH El codificada por gene sucA de Escherichia coli

SEQ ID NO:57: seqüência de nucleotídeos de gene de subunidade α de α-cetoglutarato sintase de Blastopirellula marina

SEQ ID NO:58: seqüência de aminoácidos de subunidade α de α-cetoglutarato sintase de Blastopirellula marina SEQ ID NO:59: seqüência de nucleotídeos de gene de

subunidade β de α-cetoglutarato sintase de Blastopirellula marina

SEQ ID NO:60: seqüência de aminoácidos de subunidade β de α-cetoglutarato sintase de Blastopirellula marina

SEQ ID NO:61: iniciador 1 para amplificação de gene de acetoglutarato sintase de Blastopirellula marina

SEQ ID NO:62: iniciador 2 para amplificação de gene de acetoglutarato sintase de Blastopirellula marina

SEQ ID NO:63: iniciador de PCR 1 para amplificação de fragmento de término N de gene sucA de Brevibacterium lactofermentum SEQ ID NO:64: iniciador de PCR 2 para amplificação de

fragmento de término N de gene sucA de Brevibacterium lactofermentum

SEQ ID NO:65: iniciador de PCR 1 para amplificação de fragmento de término C de gene sucA de Brevibacterium lactofermentum

SEQ ID NO:66: iniciador de PCR 2 para amplificação de fragmento de término C de gene sucA de Brevibacterium lactofermentum

SEQ ID NO:67: iniciador 1 para amplificação de gene de acetoglutarato sintase inteiro de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:68: iniciador 2 para amplificação de gene de acetoglutarato sintase inteiro de Chlorobium tepidum

SEQ ID NO:69: iniciador 1 para amplificação de fragmento de término N de gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum

SEQ ID N0:70: iniciador 2 para amplificação de fragmento de término N de gene de α-cetoglutarato sintase de Chlorobium tepidum SEQ ID NO:71: iniciador 1 para amplificação de promotor de

tuf de Brevibacterium flavum

SEQ ID NO:72: iniciador 2 para amplificação de promotor de tuf de Brevibaeterium flavum

SEQ ID NO:73: iniciador 1 para amplificação de fragmento

Ptuf-KGS

SEQ ID NO:74: iniciador 2 para amplificação de fragmento

Ptuf-KGS

SEQ ID NO:75: iniciador 3 para amplificação de promotor de tuf de Brevibaeterium flavum SEQ ID NO:76: iniciador 4 para amplificação de promotor de

tuf de Brevibaeterium flavum

SEQ ID NO:77: seqüência de nucleotídeos de promotor de tuf de Brevibaeterium flavum

Aplicabilidade Industrial Aminoácidos da família de ácido L-glutâmico podem ser

eficientemente produzidos por fermentação usando o microorganismo da presente invenção. Além disso, o método da presente invenção é um método ambientalmente correto, que pode diminuir emissão de dióxido de carbono suprimindo descarboxilação e usando uma reação de fixação de dióxido de carbono.

Claims (14)

1. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que é capaz de produzir um ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-omitina, L-citrulina e L-arginina, e que a bactéria foi modificada para aumentar atividade de α-cetoglutarato sintase.

2. Microorganismo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada aumentando expressão de um gene codificando a-cetoglutarato sintase e/ou aumentando tradução do gene.

3. Microorganismo de acordo com reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a atividade de α-cetoglutarato sintase é aumentada aumentando número de cópias do gene codificando a acetoglutarato sintase ou modificando uma seqüência de controle de expressão do gene.

4. Microorganismo de acordo com reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o gene codificando α-cetoglutarato sintase codifica um polipeptídeo selecionado a partir de (A) a (D) e um polipeptídeo selecionado a partir de (E) ou (H): (A) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, (B) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos aminoácidos em SEQ ID NO:2, e constitui uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase com o polipeptídeo selecionado a partir de (E) a (H), (C) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:58, (D) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos aminoácidos em SEQ ID NO:58, e constitui uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase com o polipeptídeo selecionado a partir de (E) a (H), (E) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO:4, (F) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos aminoácidos em SEQ ID NO:4, e constitui uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase com o polipeptídeo selecionado a partir de (A) a (D), (G) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:60, (H) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos aminoácidos em SEQ ID N0:60, e constitui uma proteína tendo atividade de α-cetoglutarato sintase com o polipeptídeo selecionado a partir de (A) a (D).

5. Microorganismo de acordo com reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o gene codificando α-cetoglutarato sintase compreende um DNA selecionado a partir de (a) a (d) e um DNA selecionado a partir de (e) ou (h): (a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, (b) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:l ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência em condições estringentes, e codifica um polipeptídeo que constitui uma proteína tendo atividade de acetoglutarato sintase com um polipeptídeo codificado pelo DNA selecionado a partir de (e) a (h), (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO:57, (d) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:57 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência em condições estringentes, e codifica um polipeptídeo que constitui uma proteína tendo atividade de acetoglutarato sintase com um polipeptídeo codificado pelo DNA selecionado a partir de (e) a (h), (e) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:3, (f) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:3 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência em condições estringentes, e codifica um polipeptídeo que constitui uma proteína tendo atividade de acetoglutarato sintase com um polipeptídeo codificado pelo DNA selecionado a partir de (a) a (d), (g) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO:59, (h) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:59 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência em condições estringentes, e codifica um polipeptídeo que constitui uma proteína tendo atividade de acetoglutarato sintase com um polipeptídeo codificado pelo DNA selecionado a partir de (a) a (d).

6. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ter sido modificado para aumentar atividade de ferredoxina NADP+ redutase.

7. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações I a 6, caracterizado pelo fato de ter sido modificado para aumentar atividade de piruvato sintase.

8. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ter sido modificado para aumentar uma atividade para produzir ferredoxina ou flavodoxina.

9. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ter sido modificado para diminuir atividade de α-cetoglutarato desidrogenase.

10. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser uma bactéria pertencendo a um gênero selecionado a partir do grupo consistindo dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, e Serratia.

11. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser uma bactéria corineforme.

12. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender cultivar o microorganismo como definido em qualquer uma das reivindicações I a 11 em um meio para produzir e acumular um ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-omitina, Lcitrulina e L-arginina no meio ou nas células do microorganismo, e coletar o L-aminoácido do meio ou das células.

13. Método de acordo com reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é cultivado em condições aeróbicas.

14. Método de acordo com reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio contém íons de carbonato, íons de bicarbonato ou dióxido de carbono, e o microorganismo é cultivado em condições anaeróbicas ou microaeróbicas.